TRNG I HC M TP.

H CH MINH
KHOA CNG NGH SINH HC
---oOo---






Gio trnh thc tp
CNG NGH
T BO NG VT
(p dng cho sinh vin nm 3, cng ngh sinh hc)


Ph trch
PGS.TS Trnh Hu Phc
CN. Lao c Thun












TP. HCM, nm 2011
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
2

NI QUY THC HNH
---oOo---

1- Sinh vin khi i hc thc hnh phi i ng theo gi quy nh, nu i hc tr 15 pht so
vi quy nh th xem nh vng bui hc ngy hm .
2- Sinh vin khi i thc hnh phi c k cc bi thc hnh trc khi n lp. Sinh vin cn
phi c k v nm c cc thao tc trong phn hng dn th nghim, ghi nhn li kt
qu thu c trong sut qu trnh thc tp
3- Khi n phng th nghim, sinh vin phi mc o Blouse v tun th tt c cc quy tc
ca phng th nghim, tun th theo s hng dn ca thy c hng dn. Sinh vin
khng mc o Blouse s khng c tham gia bui hc.
4- Sau mi bi thc hnh, sinh vin cn phi nm r cc thao tc c bn, ngha ca cc th
nghim cng nh kt qu th nghim t c.
5- Trong qu trnh thc hnh, sinh vin khng c t iu chnh cc thit b my mc
nh cn in t, my ly tm, bp n nhit v chuyn di v tr ca chng. Khi s dng,
cn phi hi kin ca thy c ph trch. Cc dng c ha cht khng c s dng mt
cch ln ln, phi c k trc khi s dng, khng c t di di ra ch khc. Cc l
ha cht sau khi s dng phi ng np y kn cn thn.
6- Sau khi lm thc hnh, phi dn dp v sinh ch ngi, ra ton b dng c th nghim
7- Bi tng trnh mi nhm vit v np vo ngy cui cng ca chng trnh hc thc tp.
Trong bi tng trnh cn ghi r kt qu thu nhn v gii thch bin lun kt qu thu c.
8- iu kin thi kim tra cui kha, sinh vin phi tham gia y cc bui thc hnh v
np y cc bi tng trnh. i vi trng hp vng, phi c giy php xin ngh v
hc b vo mt bui khc. Vng mt bui hc thc tp khng php, khng hc b s
khng c tham gia thi kt thc mn hc.
9- Tt c mi thc mc lin quan n mn hc lin h vi thy c ph trch c gii
p.
PTN SINH L NG VT


Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
3

NI DUNG THC HNH
---oOo---
Bi 1. Thu nhn t bo gan t m gan.
Bi 2. nh gi cht lng tinh dch.
Bi 3. p sut thm thu, nh sc bn hng cu.
Bi 4. Kho st tc dng dc ca thuc Furosemid.
Bi 5. M phng s vn chuyn ion qua mng.

Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
4

BI 1. THU NHN T BO GAN T M GAN
---oOo---

I. I CNG
Tch t bo l giai on u tin ca qu trnh nui cy s cp t bo ng vt c
tch ra t m hay c quan. Vic tch t bo l tch chng thnh cc t bo ring r t
nhng mnh m v cho chng bm vo gi th ph hp.
Vic tch t bo c th thc hin bng phng php c hc hay enzyme to thnh
mt dch huyn ph t bo. Hu ht cc t bo bnh thng (tr t bo mu) u cn gi
th bm, sng v pht trin vi hiu qu cao nht. Tuy nhin, nhng t bo ung th c
th pht trin trng thi l lng trong mi trng.
C nhiu loi enzyme s dng tch t bo nh: collagenase, elastase,
hyaluronidase, pronase nhng trypsin c s dng hiu qu nht v ph bin nht v
hiu qu tch t bo cao, v gi thnh r.
Trypsin l mt enzyme c bn tnh l protease, c kh nng tch hon ton t bo t
m bng cch thy phn cc protein lin kt cc t bo vi nhau, cc ni peptide gia cc
amino acid vi nhau. Cng do c tnh ny nn trypsin cng c th lm tn thng mng
t bo trong qu trnh tch, lm gim s lng t bo n thu nhn c, do t
c hiu qu cao trong qu trnh tch th cn phi xc nh nng enzyme v thi gian
tch ti u.

Hnh 1. V tr tc ng ca Trypsin
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
5

II. MC CH TH NGHIM
Ti u ha iu kin tch t bo gan bng trypsin trn hai ch tiu kho st: nng
trypsin v thi gian .
- Nng trypsin: 0.10%; 0.25%; 0.40%.
- Thi gian : 30 pht; 60 pht; 90 pht.
III. I TNG, HA CHT, DNG C TH NGHIM
1- i tng: mu m gan heo.
2- Ha cht: dung dch PBS (Phosphate Buffer Saline), dung dch Trypsin 1%.
Dung dch PBS 20X (1 lt)
- KCl 4 g
- KH
2
PO
4
4 g
- NaCl 160 g
- Na
2
HPO
4
.12H
2
O 57.7 g
- nh mc nc ct 1 lt.
3- Dng c th nghim: knh hin vi, my lc, bung m, lammelle, pipetman,
erlen, bercher (50 mL, 100 mL), ko, pippette (1 mL, 2 mL, 5mL), qu bp cao su,
giy bc, ko, kp
IV. THC HNH
- Tin hnh cn ba mu m gan c trng lng 5 gram.
- Cho 3 mu gan vo 2 becher, tin hnh ra vi dung dch PBS (2 n 3 ln)
cho sch mu.
- Tin hnh dng ko ct tht nhuyn m gan, sau tin hnh ra vi dung
dch PBS nhiu ln cho n mu chuyn sang mu trng nhm loi ht ton b
t bo mu trong mu.
- Chuyn 3 mu ct vo 3 erlen c nh s t 1 n 3, tng ng vi nng
0.10%; 0.25%; 0.40%. c c nng kho st, tin hnh pha dung dch
PBS v Trypsin theo t l di y:
o Erlen 1: 18 mL dung dch PBS + 2 mL dung dch Trypsin 1%
o Erlen 2: 15 mL dung dch PBS + 5 mL dung dch Trypsin 1%
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
6

o Erlen 3: 12 mL dung dch PBS + 8 mL dung dch Trypsin 1%
- y np cc erlen bng giy bc v t trn my lc.
- Sau 30, 60, 90 pht, ly mu mi erlen v xc nh mt t bo trong dung
dch bng bung m hng cu. Lu : cn phn bit t bo gan v t bo mu.
- Tin hnh xc nh mt t bo bng bung m hng cu Neubeuer (Tin
hnh m mt t bo trong 5 vng ln A, B, C, D, E ca bung m).
- Cng thc tnh mt t bo/ mL
D = A/5 x 10
4

D: mt t bo trn 1 mL (T bo/ mL).
A: Tng s t bo m c trong 5 vng.
- Tin hnh xy dng th tng quan gia nng v thi gian tch v xc
nh iu kin ti u.

Hnh 2. T bo gan quan st di knh hin vi.
V. YU CU
- Xc nh c mt t bo n sau khi tch cc ch tiu tch khc nhau.
- So snh, nh gi mi tng quan gia mt t bo thu c vi nng
Trypsin v thi gian khc nhau.
- Xc nh c iu kin tch ti u.

Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
7

BI 2. NH GI CHT LNG TINH DCH
---oOo---

I. I CNG
ng vt hu nh, vic th tinh l s kt hp gia giao t c (tinh trng) v giao
t ci (trng) ti v tr 1/3 ngoi vi t cung to thnh hp t, hp t pht trin thnh
phi, phi pht trin thnh c th mi. Ngy nay, mt trong nhng cng ngh mi, hin
i trong lnh vc h tr sinh sn c quan tm n l Th tinh trong ng nghim (In
vitro fertilization IVF). IVF l qu trnh ht hp gia tinh trng v trng to thnh
hp t c thc hin bn ngoi c th m, ti phng th nghim. Tuy xy ra ngoi c
th nhng cc iu kin cho qu trnh IVF nh mi trng, nhit , m,
nhtcng cc ch s sinh hc khc phi ging nh trong c th m.
Vic thu nhn s lng ln cc t bo sinh dc gm t bo trng v tinh trng l mt
yu t thit yu v l giao on u tin trong lnh vc th tinh nhn to trn ngi v
ng vt. Cc t bo sinh dc thu nhn phi m bo cc yu cu thit yu v cht lng
nhm t kt qu tt cho th tinh in vitro.
Trong bi thc hnh ny, sinh vin tin hnh nh gi mt s ch tiu c bn ca tinh
dch.
1- S lc v sinh l cu to tinh trng
Cu to tinh trng gm 3 phn: u, thn v ui.
- Phn u: cha th nh acrosome, y l ni gii phng cc enzyme gip cho
tinh trng c th xm nhp vo trng.
- Phn thn: cha ty th, c lin quan n cc hot ng chuyn ha cht v
nng lng.
- Phn ui: gip tinh trng vn ng.
S lng tinh trng: chim 5% th tch tinh dch (95% dch tit: Cht dch l mt hn
hp bao gm dch t ng dn tinh (60%), dch t ti tinh (30%), dch t tuyn tin lit
(10%) v mt phn rt nh do mo tinh hon, tuyn hnh niu o sn xut). ngi,
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
8

trung bnh c 3 mL cho mt ln xut tinh, s lng tinh trng t t 60 120 triu t bo/
mL, t l sng phi trn 80%...
S sinh tinh xy ra gn nh sut i sng c th c.

Hnh 3. Cu to tinh trng
2- Thu nhn v nh gi cht lng tinh dch
Phng php ly mu tinh dch phi tun theo hng dn c th. Tinh dch phi c
ly sau khi giao hp t nht 48 ting v khng qu 7 ngy, gim thiu nhng thay i
trn kt qu phn tch. Tt nht l mu tinh dch c tin hnh ly trong phng ring
nm cnh phng xt nghim, nu khng th c th c ly ti nh (nhng phi m bo
iu kin v trng), sau em n phng xt nghim trong vng 60 pht. Nhit thch
hp cho vic gi mu mang t nh n phng xt nghim khong t 20 40
o
C. Tinh
dch phi c ly y cho n khi xut tinh hon tt.
Mu tinh dch c tin hnh thu nhn bng cch th dm v cho xut thng vo mt
l thy tinh hay l nha c ming rng v c gi m trong khong nhit trn. Trong
mt s trng hp yu cu v xt nghim vi trng trong mu, ngi n ng phi i tiu
trc sau ra tay v dng vt sch mi c th cho xut tinh vo l.
Trong mt s trng hp c th dng bao cao su c bit chuyn dng cho vic ly
tinh thay th cho l thy tinh, lu rng khng c s dng bao cao su thng thng
ly tinh v s lm cht mt lng ln tinh trng.
Vic nh gi tinh trng cn tin hnh nhanh chng, chnh xc v cn thn. Cc ni
dung ch yu nh gi cht lng tinh dch:
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
9

- Ly tinh: ngy thng nm ly tinh, phng php ly tinh, nhit khng kh,
qu trnh vn chuyn, bo qun
- nh gi i th: lng xut tinh, mu sc, mi, keo dnh, pH, t l d
dng
- nh gi vi th: mt tinh trng, tinh trng k hnh, sc khng ca tinh
trng, t l tinh trng sng cht, sc hot ng ca tinh trng (thng tinh dch
c kim tra ngay di knh hin vi).
- Nhng nh gi khc dng trong nghin cu: tnh trng acrosome, p sut
thm thu, nht t trng
- Ging di truyn, th trng con vt.
-
II. MC CH
Tin hnh kho st mt s cc ch tiu sinh l ca mu tinh dch.
- Ch tiu nh gi i th: pH, keo dnh.
- Ch tiu nh gi vi th: mt tinh trng, t l tinh trng sng cht, t l tinh
trng k hnh.
Tin hnh ng lnh tinh trng, gii ng, kho st t l tinh trng sng/ cht sau khi
gii ng.
III. I TNG, DNG C, HA CHT
1- i tng: Mu tinh dch heo.
2- Ha cht: dung dch NaCl 3%, dung dch pha long tinh trng, thuc nhum
Eosin 1%, Nigrosin 10%
Dung dch m tinh trng 1X (1 lt)
- NaHCO
3
50 g
- Formol 10 mL
- Xanh methylene rt t
- nh mc nc ct 1 lt.
3- Dng c th nghim: bercher, erlen, eppendorf, micropipette, u tip, cryotube,
bung m neubeuer, lamelle, lame, knh hin vi
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
10

IV. THC HNH
1- nh gi pH
pH c tin hnh nh gi ngay sau khi xut tinh mt ting. Ly mt git tinh
dch c pht u trn giy pH. Sau 30 giy, ni b thm s him mu u. Tin hnh so
snh mu ny vi bng mu pH, t xc nh c pH ca mu tinh dch.
- Ch tiu pH i vi tinh trng ngi: 7.2 8.0 (Theo WHO)
- Ch tiu pH i vi tinh trng heo: 6.8 8.1 (Theo Greenfeel VN)
2- nh gi keo dnh ( nhy, qunh)
keo dnh ca mu s c c lng bng cch ht nh tinh dch vo pippet 5 mL,
sau nh 1 git t do v ghi nhn di ca si. Mt tinh dch bnh thng keo
dnh khng c qu 2 cm ngha l di si khng c ko di qu 2 cm. Mt phng
php khc cng c p dng l dng a thy tinh quy nh trong tinh dch, sau ko
nh que ln, quan st di ca si, di cng khng c ko di trn 2 cm.
3- Xc nh mt tinh trng (C)
Mt tinh trng (C) c nh ngha l s lng tinh trng trong 1 mL tinh dch.
- Ch tiu mt tinh trng ngi: > 20 x 10
6
TB/ mL.
- Ch tiu mt tinh trng heo: 100 300 triu TB/ mL.
Tin hnh th nghim
- Thc hin vic m tinh trng heo bng phng php m hng cu. Ngi ta
tin hnh pha long tinh dch 20 ln.
- Tin hnh pha long bng ng trn bch cu: tin hnh ht tinh dch ln ti
vch 0.5, sau ht tip dung dch pha long tinh trng ti vch s 11.
- Sau tin hnh lc u.
- t lamelle ln bung m.
- Nh mt git tinh dch pha long trn vo bung m (Lu : nh b 2 3
git u).
- Tin hnh quan st v m s lng tinh trng hin din trong 400 nh ca
25 ln (vng E ca bung m hng cu).
- Mt tinh trng c tnh theo cng thc sau:
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
11

C = N x 10
4
x pha long
C: mt tinh trng trong 1 mL tinh dch (t bo/ mL)
N: s t bo tinh trng c trong 400 nh ca 25 ln (t bo)

Hnh 4. Hnh nh tinh trng quan st di knh hin vi
4- Xc nh t l sng cht, k hnh
Tin hnh nh gi t l tinh trng sng cht thng qua phng php nhum tinh
trng bng thuc nhum Eosin, Nigrosin. Khi nhum, tinh trng sng th u tinh trng
khng bt mu. Ngc li, nu tinh trng cht th u tinh trng bt mu hng ca thuc
nhum.
- Ch tiu t l tinh trng sng/ cht:
o ngi: > 75%
o heo: > 70%
- Ch tiu t l k hnh:
o ngi: <15%
o heo: < 10%
Tin hnh th nghim
- Thc hin nhum trn a ng h.
- Trn mt git tinh trng vi 2 git Eosin 1%, trn u.
- Sau 30 giy, b sung thm 3 git Nigrosin 10%, trn u, yn trong 30 giy.
- Nh 1 git hn hp trn ln lame mt pha lame. S dng lame th 2 ko tri
dn u trn lame 1 thnh mt lp mng.
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
12

- Quan st di knh hin vi quang hc (X40)
T l % t i n h t r ng sng =
S t i nh t r ng sng
Tn g s t i nh t r ng
x 100
T l % t i nh t r ng k h nh =
S t i nh t r ng k hnh
Tn g s t i n h t r ng
x 10 0

Hnh 5. Tinh trng sng cht v k hnh.
Tinh trng sng (x) v cht (i). Cc loi tinh trng k hnh nh: u to, u nh, hai u,
hai ui, d hnh u, ui gy, bt thng phn c
5- Xc nh t l tinh trng sng cht sau khi ng lnh gii ng
a. Quy trnh ng lnh
- Chuyn 0.5 1.0 mL tinh trng vo cryotube h nhit mu xung 10
15
o
C trong vng 30 pht Tip tc h nhit xung -20
o
C trong vng 1 gi
ng h Chuyn ng cryotube tinh dch vo bnh cha nit lng (-196
o
C).
b. Quy trnh gii ng
- Gii ng nhanh: tinh dch ang c tr lnh, t ngt c chuyn vo nc
m 37
o
C, trong vng 2 pht.
- Gii ng chm: tinh dch ang c tr lnh, nhng vo nc 5
o
C trong
vng 1 pht, tip tc chuyn tinh dch vo nc m 37
o
C, trong vng 1 pht.
c. nh gi t l tinh trng sng cht sau khi gii ng
- Tin hnh th nghim nh gi tinh trng sng cht theo th nghim phn 3.
V. YU CU
- Nm r c thao tc th nghim nh gi cht lng tinh dch.
x
i
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
13

- Phn bit c tinh trng sng cht, nhn dng c tinh trng k hnh. V li
tinh trng sng cht, tinh trng k hnh quan st c di knh hin vi.
- Xc nh t l % tinh trng k trc trc khi trc khi ng lnh.
- Xc nh t l % tinh trng sng cht trc v sau khi gii ng lnh.
- Gii thch, kt qu nh gi tinh dch heo.

Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
14

BI 3. P SUT THM THU NH SC BN HNG CU
---oOo---

I. I CNG
1- Sc bn hng cu
bn hng cu l mt trong nhng ch tiu sinh l quan trng ca mu, c nh
gi qua sc chu ng ca mng t bo hng cu di tc dng ca p sut thm thu.
Nu cho hng cu vo trong dung dch ng trng (dung dch c p sut thm thu bng
vi p sut thm thu ca hng cu) th th tch ca n khng thay i. Nu cho hng cu
vo trong dung dch u trng (dung dch c p sut thm thu ln hn hng cu) th
hng cu s b mt nc nn th tch ca n nh li, mng t bo hng cu s b nhn
nheo (co nguyn sinh). Ngc li nu cho hng cu vo trong dung dch nhc trng
(dung dch c p sut thm thu thp hn hng cu) th nc s b ht vo lm cho hng
cu n phnh to (trng nguyn sinh). Hng cu b trng ti mt mc no mng
hng cu khng chu ni s b v (hin tng tiu huyt). Nng nhc trng lm
nhng hng cu u tin b v gi l im bt u tiu huyt, nng nhc trng lm
ton b hng cu u v gi l im tiu huyt hon ton.

Dung dch ng trng Dung dch u trng Dung dch nhc trng
Hnh 6. Hnh dng t bo hng cu trong cc dung dch c p sut thm thu khc nhau
Ngi ta c th xc nh bn hng cu theo phng php gin tip thng qua
lng hemoglobin c gii phng ra khi dung dch b v, hoc xc nh trc tip thng
qua lng hng cu cn li trong dung dch.
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
15

Khi hng cu v, huyt cu t c gii phng lm cho dung dch c mu . Nh
vy, khi cho hng cu vo trong dung dch NaCl c p sut thm thu gim dn (tng
ng vi nng mui gim dn), nu p sut thm thu ca dung mi c cha hng cu
gim ti im bt u tiu huyt th s lng hng cu bt u gim dn cho n khi
im bt u tiu huyt hon ton th hng cu b v ht. Do , trong khong ny, ta
quan st thy c hai dy dung dch c mu sc c trong khc nhau, ranh gii gia hai
dy c trong l dung dch ng trng (thng ly ng c u tin l ng c nng
ng trng vi t bo hng cu).
2- p sut thm thu xc nh p xut thm thu ca mt dung dch X bt k
xc nh p sut thm thu ca mt dung dch X bt k, ngi ta tin hnh pha
long dung dch X cc nng khc nhau, sau xc nh nng ng trng vi
hng cu, t gi tr nng c th suy ngc li tnh nng ca dung dch X cn
xc nh da vo pha long ca dung dch X.
II. MC CH
Kho st bn hng cu thng qua lng huyt cu t c gii phng trong dung
dch, xc nh gi tr im tiu huyt hon ton, im bt u tiu huyt.
Xc nh p sut thm thu ca mt dung dch X bt k.
III. I TNG, HA CHT, DNG C TH NGHIM
1- i tng: Mu chng ng, dung dch X.
2- Ha cht: dung dch NaCl 1%, nc ct.
3- Dng c th nghim: ng nghim, pippet (10 mL, 1 mL), gi ng nghim, vit lng,
mng mng, knh hin vi.
IV. THC HNH
1- Kho st sc bn hng cu
- Chun b 10 ng nghim sch v kh, nh du s th t t 1 n 10.
- T dung dch NaCl 1%, tin hnh pha 10 ng dung dch NaCl c nng t
0.1 % n 1% theo bng sau, mi ng 10 mL


Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
16

ng s
Dung dch NaCl 1%
(mL)
Nc ct
(mL)
Nng dung dch cn pha
(%)
1 1.0 9.0 0.10
2 2.0 8.0 0.20
3 3.0 7.0 0.30
4 4.0 6.0 0.40
5 5.0 5.0 0.50
6 6.0 4.0 0.60
7 7.0 3.0 0.70
8 8.0 2.0 0.80
9 9.0 1.0 0.90
10 10.0 0.0 1.00
- Cho vo mi ng 2 git mu chng ng.
- Ct mng nha bt kn ming ng nghim, gi ngn tay ci bn trn v lc nh
nhng cho mu ha u trong dung dch, yn 3 pht, sau quan st mu
sc c trong ca cc ng, ranh gii gia hai dy c trong l dung dch
ng trng (thng ly ng c u tin l ng c nng ng trng vi t
bo hng cu).
- Ghi nhn li kt qu v gii thch.

Hnh 7. S b tr th nghim
2- Quan st t bo hng cu trong mi trng u trng, nhc trng, ng
trng.
- Chun b 3 ng nghim sch vi cc dung dch sau:
o ng 1: 5 mL nc ct.
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
17

o ng 2: 5 mL dung dch NaCl 1%.
o ng 3: 5 mL dung dch NaCl 0.5%
- Tin hnh b sung 0.05mL mu chng ng vo mi ng.
- Ct mng nha bt kn ming ng nghim, gi ngn tay ci bn trn v lc nh
nhng cho mu ha u trong dung dch, yn 3 pht, lc u li ri chuyn
1 git ln lame knh, quan st s thay i hnh dng t bo hng cu di knh
hin vi 40X.
- Quan st, v v nhn xt hnh dng t bo hng cu trong 3 dung dch trn
3- Kho st sc bn hng cu
xc nh nng dung dch X, pha long X v lp li th nghim phn 2, tm
nng ng trng vi hng cu, t gi tr nng suy ngc li tnh nng ca
dung dch X da vo cch pha long dung dch X.
V. YU CU
- Quan st v v t bo hng cu trong mi trng nhc trng, u trng,
ng trng di knh hin vi.
- Xc nh gi tr p sut thm thu ca dung dch X.

Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
18

BI 4. KHO ST TC DNG DC L CA THUC FUROSEMID
---oOo---

I. I CNG
Chc nng ch yu ca thn l to ra nc tiu v bi xut nc tiu. Khi mt ngi
ung mt lng ln nc, thn s bi xut ra nhiu nc, nc tiu s long. Trong khi
, mt ngi n thc n rt mn, th thn s gi li nc nhm cn bng vi nng
mui cao. Thuc li tiu c nh ngha l nhm thuc c kh nng lm cho thn tng
bi tit nc tiu c km theo nhng cht cn b v nhng cht khng cn thit i vi
c th. Thuc c tc dng lm tng kh nng lc ca thn hay gim s ti hp thu ng
thn. Tt c cc loi thuc li tiu u tc dng ln thn, ni gi vai tr quan trng trong
vic iu ha lng nc trong c th.
Phn loi thuc li tiu, thuc li tiu c chia lm 3 nhm chnh sau:
- Nhm thuc li tiu thiazid: Gi l thiazid v trong cu trc ha hc ca cc
thuc thuc nhm ny c nhn thiazid, gm c cc thuc: clorothiazid,
hydroclorothiazid, indapamid, metolazon, clorthalidon... V tr tc ng ca
nhm thuc ny l ng un xa nm v thn lm tng bi tit mui, do s
lm tng thi nc tiu. y l nhm thuc li tiu c s dng u tin trong
iu tr tng huyt p do hiu qu h p cao hn cc nhm li tiu khc. Bin
chng c th gp khi dng nhm thiazid l h kali mu do tng s bi tit kali
vo trong nc tiu.
- Nhm thuc li tiu tc ng quai Henl: Nh tn gi, v tr tc ng ca
nhm thuc l nhnh trn ca quai Henl nm trn vng ty thn. y l nhm
thuc c tc dng li tiu rt mnh v lm mt natri nhanh hn nhm thiazid
nn thch hp dng trong trng hp suy tim v ph nng. Thuc loi ny gm
c: furosemid, acid ethacrynic, bumetamid... Nhm ny cng gy h kali mu.
- Nhm thuc li tiu tit gi ion kali: Nhm thuc ny tc ng ln on cui
ca ng un xa, gm c: spironolacton, triamteren, amilorid... Tc dng li
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
19

tiu ca nhm ny yu nhng do c kh nng gi kali nn thng c phi
hp vi thuc thuc nhm thiazid hoc li tiu quai Henl.
C ch tc dng ca thuc Furosemid: Furosemid tc dng nhnh ln ca quai
Henle (Hnh 1) nn c xp vo nhm thuc li tiu quai. Furosemid c ch h thng
ng vn chuyn Na+, K+, Cl- on dy nhnh ln ca quai Henle, t lm tng thi
tr cht in gii ny ko theo nc.
Furosemid c hp thu tt qua ng ung, c tc dng nhanh sau 1/2 gi, t nng
ti a sau 1-2 gi, duy tr tc dung n 6 gi v b thi tr hon ton sau 24 gi.
II. MC CH
Tin hnh kho st tc dng dc l ca thuc Furosemid trn chut nht trng Mus
musculus var.Albino.
III. I TNG, HA CHT, DNG C TH NGHIM
1- i tng: Chut nht trng.
2- Ha cht: thuc Furosemid 40 mg.
3- Dng c th nghim: ng nghim, h thng o nc tiu, kim tim 16G.
IV. THC HNH
1- Pha thuc Furosemid
Mt vin cha 40mg Furosemid dng cho 60 kg trng lng c th (ngi) 1 con
chut nng 20g cn 0,267mg Furosemid (Ty thuc vo trng lng chut m c s thay
i lng thuc cho ung).
Tin hnh pha thuc trong 10 mL nc ct (hm lng: 40mg/ 10 ml dung dch thuc)
xc nh lng dung dch cho chut ung.
2- B tr th nghim
Cho chut ung thuc: s dng kim tim 16G (u kim mi nhn) cho chut ung
trc tip vo bao t chut. Mt tay bt gi chut ( phn c chut) v ui chut, tay cn
li a kim tim vo vo d dy chut (t ming chut thc qun d dy), a kim
xung vo khong 80% kim tim, sau bm thuc nh nhng vo bao t chut.
S b tr th nghim: Chia thnh hai l th nghim
- L i chng: cho chut ung nc ct.
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
20

- L th nghim: cho chut ung dung dch thuc Furosemid tnh hm lng.
Tin hnh kho st lng nc tiu (mL) sau 15 pht, 30 pht, 45 pht, 60 pht, 75
pht, v 90 pht. Ghi nhn vo bng kt qu sau:
15 pht 30 pht 45 pht 60 pht 75 pht 90 pht
L i chng
L th nghim
X l kt qu, so snh v v th so snh lng nc tiu thi ra gia l i chng
v l th nghim.

Hnh 8. H thng thu nhn nc tiu
IV. YU CU
- Hiu r c c ch tc dng ca thuc.
- Nm c cc thao tc th nghim.
- Thu nhn v x l kt qu th nghim.


Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
21

BI 5. M PHNG S VN CHUYN ION QUA MNG
---oOo---

I. I CNG
1- Vn chuyn ion qua mng
Nu hai dung dch in phn c nng khc nhau c ngn cch bi 1 mng cho
php cc ion i qua ty theo s khc bit tnh thm ca cation (P+) v anion (P-) m hnh
thnh mt in th mng (V
m
) theo cng thc sau:
V
m
=
P
+
/ P
-
-1
P
+
/ P
-
+1
.
RT
F
. l n
[ C]
o
[ C]

(1)
Trong :
V
m
: in th mng
P
+
/P
-
: T s tnh thm cation/ tnh thm anion
R: Hng s kh
T: Nhit K
F: Hng s Faraday
V nhit 20
o
C, (RT/F)lnx = 58.21logx, nn cng thc (1) chuyn sang logarit
thp phn c dng:
I
m
=
P
+
/ P
-
-1
P
+
/ P
-
+1
. 58 .2log
[ C]
c
[ C]
i
(2)
Trong cng thc (2), in th mng tng quan logarit vi t s nng bn trong
[C]i v bn ngoi [C]o . Nu dng th bn logarit theo t s nng ta c ng
thng c h s gc tng quan vi tnh thm ca cc ion theo biu thc sau:
csogoc =
P
+
/ P
-
-1
P
+
/ P
-
+1
. 58 .2 (3)
Da vo biu thc ny, ngi ta tin hnh tm t s P+/P- qua thc nghim sau khi
xc nh c h s gc (3)
Nu mng thm tt i vi cation th t s P+/P- dao ng t 1 1000, cn i vi
mng thm tt i vi anion th t s P+/P- dao ng t 0.0001 1.
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
22

- Trong trng hp t s P
+
/P
-
>> 1 (mng chn lc cation) th in th mng
c quyt nh bi cation:
+ E = 58 .2 log
u
c
+
u
i
+
(4)
Trong : a
o
v a
i
l lc ion bn trong v bn ngoi mng.
- Trong trng hp t s P+/P- << 1 (mng chn lc anion) th in th mng
c quyt nh bi anion:
E = 58 .2 log
u
c
-
u
i
-
(5)
Trong : a
o
v a
i
l lc ion bn trong v bn ngoi mng.
2- in th ngh, in th hot ng
in th mng c hnh thnh v pht trin ph thuc vo s ng m cc knh
chn lc ion ca mng. Nng ion K
+
trong t bo cao gp hng chc ln nng bn
ngoi t bo. i vi ion Na
+
th ngc li, nng bn ngoi cao hn bn trong. Trong
trng thi ngh ngi, knh chn lc ion cho ion K
+
thm tt qua mng cn Na
+
th hu
nh khng thm. Hu qu vic ny lm cho bn ngoi tha cation cn bn trong t bo
th tha anion, to nn in th mng. Qu trnh thm ion K
+
dng li khi c s cn bng
gia gradient nng v gradient in trng.
trng thi ngh, th P
Na
/P
K
dao ng trong khong t 0.0001 1 (t khi t bo cht).
Khi mng chuyn sang trng thi hot ng, th tnh thm ion Na
+
tng ln rt nhiu, v
kt qu l P
Na
/P
K
dao ng trong khong t 1 n 1000. S thm t ca ion Na
+
lm
cho mng c s o cc in th thnh trong dng ngoi m.
Tng qut cho s hnh thnh in th mng trong trng hp ngh cng nh in hot
ng, Goldman-Hogkin-Katz a ra biu thc:
I
m
=
R1
P
ln |
[ K]
c
+P
Nc
/ P
K
[ Nu]
c
[ K]
i
+P
Nc
/ P
K
[ Nu]
i
| (5)
Trong : Vm: in th mng; P
Na
, P
K
ln lt l tnh thm ion Na
+
v K
+
; R: hng s
kh; T: nhit Ko; F: hng s Faraday.
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
23

Nh vy, trong trng hp nng Na
+
v K
+
bn trong v bn ngoi mng khng
thay i nhng thay i tnh thm P
Na
, P
K
th in th mng s thay i. S thay i tnh
thm ny lin quan n cc knh ca ion Na
+
v K
+
trn mng c m hay ng.
II. MC CH KHO ST
S dng chng trnh ARTMEM quan st chn lc ion ca mng nhn to (mng
cation v mng anion). Ghi nhn cc gi tr hiu in th mng v xy dng th nhm
xc nh tnh thm tng i P
K
/P
Cl
ca hai mng ny
S dng chng trnh MEMPOT quan st s hnh thnh in th ngh v in th
hot ng trn mng t bo vi s thay i thnh phn ion ca dung dch v tnh thm
tng i ca mng nghin cu. Cc s liu thu nhn c s tin hnh xy dng cc
th nhm xc nh t s tnh thm P
Na
/P
K

ca mng da trn cc in th o c trn
mng.
III. THC HNH
1- Vn chuyn ion qua mng
a. Lp i gi thuyt

Hnh 9. S mng lp i gi thuyt
- M chy chng trnh ARTMEM, tin hnh th nghim theo s hng dn trn
mn hnh chng trnh.
- Nhn y hay n c hay khng c phn gii thiu ca chng trnh phn
mm (ting anh).
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
24

- Nhn h chn lp i gi thuyt, s xut hin mn hnh s lp i gi
thit.
- Chn kt hp ngu nhin cc knh K
+
v Cl
-
(s knh c th m t 1 5 knh).
- Ghi chp li gi tr in th mng (E
m
) trn mng hnh. Tng s liu phi ghi
nhn c l 15 s liu v ghi vo phn tng trnh s liu kt qu.
- Nhn Esc tr v mng hnh ban u.
b. Mng nhn to cation

Hnh 10. S th nghim o in th mng
- Nhn a chn mng nhn to, nhn 1 chn mng cation, nhn phm
Bar v y
- Dng cc phm di chuyn di chuyn di cc bn tri, cc phm t 1 9
thay i tc di chuyn ca in cc.
- Dng phm di chuyn di chuyn in cc t vo pha ngn bn phi.
- Thay i nng KCl trong ngn tri bng cch nhp gi tr nng , gi tr
nng dao ng t 0.5 5.0 mM (cc gi tr o t chn).
- Bm y thay i nng cho n khi t c nng mnh chn. Bm
n
- S dng cc phm di chuyn a in cc v li pha ngn tri, nhn bar
hai ln lin tip hin th ra hiu in th mng nhn to gc tri (hay gc
phi) mn hnh.
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
25

- Ghi nhn tng cng 12 gi tr o vo bng tng trnh.
- Tin hnh v th bng cch nhn Bar xut hin mn hnh v th,
nhn Bar thay i s liu cKCl
o
, aKCl t ng np vo (do my tnh), np
s liu Vm. Tin hnh np tt c 12 s liu.

Hnh 11. Mn hnh bn v th mng nhn to cation
- Nhn Bar hai ln np h s gc (t 10 58.2), chn h s gc tt nht sao
cho ng th i qua tt c cc im v c gi tr Sy (trung bnh tng bnh
phng cc s o nh nht. Nhn Esc kt thc s la chn.
- Ghi li gi tr h s gc tt nht, trung bnh tng bnh phng, sai s chun ca
nh gi Sy.
- Tnh gi tr t s P
K
/P
Cl
.
c. Mng nhn to anion
- Nhn a chn mng nhn to, nhn 2 chn mng cation, nhn phm
Bar v y.
- Tun t lm cc bc nh phn trn.
- Tnh gi tr t s P
K
/P
Cl
.
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
26

2- Vn chuyn ion qua mng
- M chy chng trnh MEMPOT, tin hnh th nghim theo s hng dn trn
mn hnh chng trnh.
- Nhn y hay n c hay khng c phn gii thiu ca chng trnh phn
mm (ting anh).
a. Lp i gi thuyt
- Nhn h, nhn phm Bar
- Chn m s knh K
+
v Na
+
(s lng cc knh t 0 5), ghi nhn gi tr E
m
. Ghi
nhn 12 s liu vo bng tng trnh.
- Nhn Esc tr v mn hnh ban u.
b. in th ngh

Hnh 12. S dng in cc o in th ngh
- Nhn ln lt cc phm y, n, r: chn in th ngh.
- Nhn 2 ln phm Bar: chn gi tr [K]
o
t 0.5 5.0 mM, nhn Enter np s
liu.
- Dng cc phm di chuyn in cc o ln lt 5 t bo.
- Ghi li gi tr [K]
o
, V
m
, v SEM theo nh bng tng trnh.
- Nhn Esc, nhn Bar, np s liu [K]
o
vo.
- Nhn Esc, Bar v th.
- Nhn Nar np t s P
Na
/P
K
t 0.001 1.0 tm gi tr P
Na
/P
K
tt nht (vi
gi tr ASS tt nht).
- Nhn Bar chn gi tr P
Na
/P
K
khc.
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
27

- Nhn Esc ghi nhn P
Na
/P
K
tt nht, ASS, v Sy trn mn hnh vo bng tng
trnh.
c. in th hot ng
- Nhn ln lt cc phm y, n, r: chn in th ngh.
- Nhn 2 ln phm Bar: chn gi tr [K]
o
t 100 150 mM, nhn Enter np
s liu.
- Dng cc phm di chuyn in cc o ln lt 5 t bo.
- Nhn S tim dng kch thch.
- Nhn Esc v thc hin tng t o nh trong in th ngh.
- Nhn Esc, Bar v th.
- Nhn Nar np t s P
Na
/P
K
t 1 100 tm gi tr P
Na
/P
K
tt nht (vi gi tr
ASS tt nht).
- Nhn Bar chn gi tr P
Na
/P
K
khc.
- Nhn Esc ghi nhn P
Na
/P
K
tt nht, ASS, v Sy trn mn hnh vo bng tng
trnh.
IV. TNG TRNH KT QU
- Ghi nhn cc gi tr o c vo bng tng trnh kt qu (phn cui gio trnh).
- Gii thch cc cu hi sau y:
1- Vn chuyn ion qua mng
a. Lp i gi thuyt
- Thnh phn knh K
+
v Cl
-
m nh hng nh th no i vi du v bin ca
in th mng?
- Ti s s knh K
+
v Cl
-
bng nhau th gi tr in th mng bng 0?
- Ti sao in th mng 3 knh K
+
v 0 knh Cl
-
m ging nhau vi 5 knh K
+
v
0 knh Cl
-
?
b. Mng nhn to Cation v Anion.
- Nhn xt g v tnh thm P
K
/P
Cl
ca mng Cation v Anion.
2- in th ngh, in th hot ng
a. Lp i gi thuyt
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
28

- Thnh phn knh K
+
v Na
+
m nh hng nh th no i vi du v bin ca
in th mng?
- Ti s s knh K
+
v Na
+
bng nhau th gi tr in th mng bng 0?
- Ti sao in th mng 3 knh K+ v 1 knh Na
+
m c gi tr ngc du vi 1
knh K+ v 3 knh Na
+
?
b. in th ngh
- S thay i nng [K]
o
nh hng n in th mng nh th no? S gia tng
[K]
o
lm tng thm s o cc (V
m
dng hn) hay lm n siu cc ha hn (V
m

m hn)?
c. in th hot ng
- S thay i nng [Na]
o
nh hng n in th mng nh th no? S gia tng
[Na]
o
lm tng thm s o cc (V
m
dng hn) hay lm n siu cc ha hn (V
m

m hn?
- Vai tr ca ion K
+
v Na
+
trong qu trnh hnh thnh in th ngh v in th hot
ng?

Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
29

PH LC
---oOo---
1. Bung m hng cu Neubauer
Cc loi phng m mu thng gp c gi chung l huyt cu kt
(Hemocytometer) . Loi phng m thng c dng l bung m Neubauer Vic
thc hin m t bo trn phng m cc nh.
Cu trc ca bung m Neubauer, bung m c cu to t mt knh dy trong
sut, c khc 4 rnh su l ch thot dung dch, ngn khng cho dung dch trn ln b.
Chnh gia hai khu vc cha hai li m ring bit. G gia ca li m thp hn b
bn 0,1 mm ( chnh xc ti 0,001 mm). Do ,khi y lamelle ln, khi dung dch mu
c xc nh c chiu cao l 0,1 mm. V vy, khi cho dung dch mu vo cn phi lau
bung m v lamelle tht sch m bo cho chiu cao ny. Cu trc, kch thch mt
phng m c m t bng hnh 2.

Hnh 13. Cu to bung m Neubauer

A B
C D
E
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
30

Hnh 14. Cu trc ca mt li m.
Li m gm cc vng A, B, C, D. Mi vng c chia l 16 nh, vng c cnh
l 1 mm. Nh vy, th tch ca mi nh l 0,25 x 0,25 x 0,1 mm
3
. (i vi vic m s
lng hng cu ta khng m trong khu vc ny).
Vng m E c chia lm 25 nh, mi nh c chia lm 16 nh hn ( con).
y l vng m trung tm bung m. Nh vy, vng ny cha tt c 400 con. Th
tch ca mi nh l 0,2 x 0,2 x 0,1 = 0,004 mm
3
y c coi l n v m.
Khi ta bit c pha long ca mu, s t bo trong mt vung nht nh, ta
c th tnh c s lng t bo trong 1 mm3 mu cha pha long.
2. ng trn mu (Thoma pipette)
ng trn l dng c pha long mu cho n hng cu, bch cu, tiu cu, ng
trn l mt mao qun c mt bu phnh ra, trong c ht thy tinh mu trn u mu
trong dung dch. Ht thy tinh ny gip phn bit thnh ng trn hng cu (cha ht mu
) v ng trn bch cu (cha ht mu trng).
Ch mao qun c cc vch 0,5 v 1,0, phn trn ch phnh c vch 11 i vi ng
trn bch cu v 101 i vi ng trn hng cu.
i vi ng trn hng cu: nu ly mu n vch 1, ri ht dung dch trn n vch
101 th th tch mu trn vi dung dch m l trong phn bu dc phnh ra, iu ng
lu l t ch vch 1 tr xung ch c dung dch trn ch khng c mu, nh vy t l
pha long s l 1/100.
Nu mun pha long vi t l 1/200 th ch cn ht mu n vch 0,5. Phng thc
tnh t l pha long i vi ng trn bch cu cng tng t.

Hnh 15. ng trn hng cu v ng trn bch cu.
Gio trnh thc tp cng ngh t bo ng vt
31


Hnh 16. Cch cm, lc ng trn v phng thc load t bo vo bung m.
3. Phng php m t bo trong bung m hng cu
m s lng t bo mt cch chnh xc khng b lm ln, ta phi m theo
ng 2 nguyn tc sau y:
- Ta m theo quy tch hnh zigzac, ngha l t trn bn tri m ngang ti
trn cng bn phi, sau i xung, i ngang cho n di cng bn
tay tri.
- m theo quy tc 2 cnh, ngha l ta m cc t bo nm trong m,
cnh trn v cnh bn phi m.

Hnh 17. Quy tc Zigzac v quy tc 2 cnh
(Cc hnh trn mu en tng trng cho cc t bo c m, cc s t 1 n 16 tng
trng cho th t cc m theo quy tc Zigzac)