Nguyên lý và ứng dụng của

phương pháp PCR trong phát

hiện và chẩn đoán bệnh ở động
vật thủy sản
 Chẩn đoán bệnh ở thủy sản

Kết quả chẩn đoán bệnh phụ thuộc rất lớn vào:

2. tính sẵn có của phương pháp chẩn đoán đang

được áp dụng ở phòng thí nghiệm

3. lảnh vực nghiên cứu của người chẩn đoán

4. những phép chẩn đoán được phát triển trên cơ

sở các loài địa phương.
 Chẩn đoán bệnh ở thủy sản

Nắm vững nguyên tắc của các kỹ thuật

đoán và cách đọc kết quả một cách chuẩn
xác có ý nghĩa rất quan trọng.
Sự đồng nhất trong thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu

1. thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu là một trong những yếu tố quan
trọng ảnh hưởng đến kết quả của các phép chẩn đoán bệnh
2. thời gian thu mẫu, khoảng cách giữa các lần thu mẫu, phương pháp cố
định mẫu, nhiệt độ bảo quản mẫu, chất lượng của môi trường phân
lập, thời gian sử dụng của các dung dịch hoá chất sau khi chuẩn bị, vv,
cần được cân nhắc trong quá trình phân tích mẫu.
3. số lần mẫu được đông lạnh rồi rả đông cũng ảnh hưởng đến kết quả
phân tích

→ Giữa các phòng thí nghiệm và các phép phân tích được sử dụng phải
đồng nhất thì kết quả đạt được mới có ý nghĩa về mặt so sánh.
 Các vấn đề khác

Cần phải thiết lập những giá trị giới hạn cho những phép
phân tích mà kết quả thu được có tính định lượng để xác
định kết quả âm tính và dương tính.

Giá trị giới hạn này sẽ ảnh hưởng đến kết quả âm tính và
dương tính giả cũng như kết quả âm và dương tính thật.
 Tính hiệu lực của phương pháp

Một phương pháp phân tích có tính hiệu lực là phương pháp có
thể cho ra kết quả phân biệt rỏ ràng giữ kết quả dương tính và âm
tính hoặc giữa cá thể bị nhiễm bệnh và không bị nhiệm bệnh.

Tính hiệu lực của phương phá biểu hiệu qua hai đặc điểm:
– Tính nhạy (khả năng xác định chính xác mẫu có nhiễm hay
không)
– Tính chuyên biệt (khả năng phát hiện mẫu không có nhiễm bệnh)

Tính hiệu lực của phương pháp được xác định bằng cách so sánh
các cá thể cùng loài trong cùng một mẫu. Trong trường hợp khác
kết quả phải được kiểm định bằng các kỹ thuật mô học.
 Tính ổn định của phương pháp

Một phương pháp được gọi là ổn định khi phương

pháp đó cho ra kết quả tin cậy và giống nhau sau nhiều
lần lập lại.

Hai yếu tố quyết định cho tính ổn định của phương

pháp là:

- biến động giữa các cá thể phân tích

- biến động giữa các lần đọc kết quả
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Giải Nobel hóa học

(1993)

Kary Mullis
 Phương pháp PCR là gì?

PCR là phương pháp khuếch đại nhanh

và nhạy có chọn lọc môt trình tự
DNA/RNA nhất định từ một mạch khuôn
axit nucleic
 Nguyên tắc
 
Tất cả các ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới từ
mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt (một mồi xuôi và
một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen).

Mồi là những đoạn ADN ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của
mạch khuôn, và ADN polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới.

Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN thì
chỉ đoạn ADN nằm giữa hai mồi được tồng hợp. Hai mồi này gồm mồi xuôi và
mồi ngược theo chiều phiên mã gen.

PCR.EXE
 Các giai đoạn của PCR
Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung
dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho
sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ
cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng,
thường là ở 92-95 oC trong vòng 30 giây đến 1 phút.

Giai đoạn lai (hybridization): Nhiệt độ dược hạ thấp

hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với
khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động
trong khoảng 37-65 oC tùy thuộc Tm của các mồi sử
dụng và kéo dài từ 30 giây - 1phút.

Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (extension):

Nhiệt độ được tăng lên đến 70-72 oC giúp cho ADN
polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian tùy thuộc
độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo
dài từ 30 giây đến nhiều phút.
 
Chu kỳ gồm ba giai đoạn nói trên sẽ được lặp đi lặp
lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng gấp đôi lượng
ADN của lần trước. Sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ
là 106 so với lượng bản mẫu ban đầu. PCR.EXE
 Giai đoạn Biến tính

90
80
70
60
50
40
 Giai đoạn lai

90
80
70
60
50
40
 Giai đoạn kéo dài

90
80
70
60
50
40
Sản phẩm PCR đầu tiên
Khuếch đại trình tự mong muốn
 Thành phần của PCR

• Mạch khuôn (template)

• Mồi (Primers)
• dNTPs: dATP, dCTP, dGTP and dTTP
• Thermostable DNA polymerase (enzym chịu
nhiệt xúc tác quá trình tổng hợp DNA)
• PCR buffer (dung dịch PCR): có chứa Mg2+
cần cho hoạt động của men DNA polymerase
CD
 Mạch khuôn

• Hệ gen DNA
• Hệ gen RNA, mRNA
• Máu (huyết tương)
• Các mô cơ thể (i.e. nơi bị nhiễm)
 Thiết kế mồi

• Mồi thường được thiết kế có trình tự 3’ 5’

bổ sung với mạch khuộn DNA T A C A G
A T G T C
• Chiều dài đoạn mồi khoảng 20-30 nt 5’ 3’

• Nhiệt độ nóng chảy khoảng 55-65°C

và tương thích giữa mồi xuôi và mồi
ngược
• Mồi cần phải có xấp xỉ số bazơ nitơ
A, T, G,C và tránh các vùng
5’ 3’
polypurines hay polypyrimidines
• Tránh sự tạo thành hairpin loop
• Trình tự phần đầu 3’ kết thúc (3’-end) 5’ OH 3’

của mồi không bổ sung nhau 3’HO 5’

(để giảm “primer

dimer”)
 Web thiết kế mồi

• GenomeWeb Primer Design at MRC

http://www.hgmp.mrc.ac.uk/GenomeWeb/nuc-primer.html

• Primer 3 at the MTI Whitehead Institute

http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-
bin/primer/primer3_www.cgi

• GeneFisher at Bielefeld University, Germany

http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/

• Standford University’s Web Primer

http://seq.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer
• NetPrimer by Premier Biosoft International
http://www.premierbisoft.com/netprimer.html
Nhiệt độ nóng chảy (Melting Temperature-Tm)

Mồi ngắn hơn 20 nucleotides

Tm = 2(A+T) + 4(G+C)

Mồi từ 14-70 nucleotides

Tms = 81.5 + 16.6 (log10 [J+] + 0.41 (%G+C) - (600/l)

Mồi từ 20-35 nucleotides

Tm = 22 + 1.46 [2(G+C)+ (A+T)]
 Chu kỳ nhiệt

Bước 1
Biến tính Biến tính (92oC - 95oC)
93°C - 95°C tách hai mạch AND
xoắn kép thành 2 mạch đơn
Bước 2
Biến tính
92°C- 95°C Lai (37oC - 65oC) Mồi
lai với trình tự bổ sung trên
mạch khuộn DNA
25-35 CYCLES Bước 3
Kéo dài (70oC- 72oC)
Kéo dài Lai polymerase tổng hợp DNA
70°C-72°C 37°C- 65°C
mới
Exponential amplification
(khuếch đại theo cấp số nhân)
 Plateau Effect

1013 Sảm phẩm theo lý thuyết

Số bản sao được tạo ra

Sản phẩm thực tế

10 11

109

107

105 “Exponential phase” “Plateau phase”

0 10 20 30 40 50 60

Số chu kỳ
 Tối ưu hóa PCR

• DNA template concentration

– Hàm lượng: 5-100 ng
– Tinh sạch
• Nồng độ MgCl2 : 1.0 - 6.0 mM
• Taq DNA polymerase: 1-5 units
• Nhiệt độ lai
• Số chu kỳ PCR: 25-40 cycles
• Thể tích PCR: 13-100 µl
 Các dạng PCR

• PCR một bước (one steo PCR): thao tác cơ bản

• PCR 2 bước (PCR tổ-Nested PCR): sử dụng hai cặp
mồi
• PCR phức (Multiplex PCR): khuếch đại đồng thời
hai hay nhiều đoạn DNA mục tiêu trong một mẫu
• PCR phiên mã ngược (RT-PCR): định tính biểu hiện
gen hoặc phát hiện vi-rút RNA
• PCR thời gian thật (RealTime PCR)
 Nested PCR

Mồi F1

Mạch khuôn
Mồi R1
Mồi F2

Sản phẩm PCR thứ nhất

Mồi R2

Sản phẩm PCR tổ

 Ưu và khuyết điểm của nested-PCR

• Tăng tính đặc hiệu (do sử dụng 2 cặp mồi)

• Tăng độ nhạy (khuếch đại 2 lần)

• Sử dụng để phát hiện sinh vật hiện diện ở

mức thấp

Rủi ro do ngoại nhiễm cao

 Multiplex PCR

• Phương pháp phát hiện nhanh cùng lúc nhiều

đoạn AND trong cùng một phản ứng

• Hổn hợp PCR có nhiều cặp mồi

– Từ nhiều sinh vật

– Từ nhiều gen của cùng một sinh vật

• Ưu điểm quan trọng là giảm thời gian phân tích

mẫu
Multiplex PCR
Multiplex PCR of WSSV & HPV

M N 1 2 3 4 5

262 bp HPV
232 bp WSSV
122 bp nội chuẩn
 Nguyên lý của RT-PCR

mRNA 5’ AAAAAA 3’
TTTTTT
Reverse transcriptase Tổng hợp mạch cDNA thứ nhất

mRNA 5’ AAAAAA 3’
1st stranded cDNA 3’ TTTTTT 5’

RNaseH
Cắt mạch khuôn RNA

5’ AAAAAA 3’
3’ TTTTTT 5’

DNA polymerase
Tổng hợp mạch cDNA thứ 2

5’ AAAAAA 3’
3’ TTTTTT 5’
Double stranded
cDNA
 Phương pháp PCR bao gồm các bước:

2. Ly trích DNA/RNA từ vật chủ để sử dụng làm mạch

khuôn
3. Chuẩn bị các thành phần của phản ứng (PCR mix)
4. Khuếch đại bằng máy chu kỳ nhiệt
5. Điện di
6. Đọc kết quả
 Đối chứng
Một xét nghiệm PCR tiêu chuẩn phải có những đối chứng sau:
• Không có ADN/ARN (chung am) phản ứng PCR không có
mạch khuôn ADN để kiểm soát trường hợp bị tạp nhiễm
• ADN/mRNA của vật chủ: (noi chuan) để chắc chắn axit
nucleic mẫu cũng được khuếch đại và mồi không đặc hiêu
với hệ gen của vật chủ
• Đối chứng dương: phản ứng PCR có mạch khuôn ADN
đặc hiệu với mồi
 Giếng 1-2 là sản phẩm khuếch đại bước 1
Giếng 4 là mẫu đối chứng dương
Giếng 5, 6 và 7 là những mẫu dương tính với WSSV
Giếng 8 là mẫu đối chứng âm.

Quy trình chẩn đoán bệnh vi-rút đốm trắng trên các loài thuộc họ tôm
He bằng kỹ thuật PCR tiêu chuẩn ngành (28 TCN202:2004) do Bộ
Thủy sản ban hành năm 2004. (nguồn: http://www.fistenet.gov.vn/standard.asp)
 Gel chuẩn dùng chẩn đoán WSSV kit IQ2000

Cột 1: Mẫu nhiễm WSSV nặng

Cột 2: Mẫu nhiễm WSSV trung bình
Cột 3: Mẫu nhiễm WSSV nhẹ
Cột 4: Mẫu nhiễm WSSV rất nhẹ
Côt 5: Mẫu không nhiễm WSSV
Cột 6: Nước cất
Cột 7: Mẫu chuẩn một, 2000 bản sao/phản ứng
Cột 8: Mẫu chuẩn hai, 200 bản sao/phản ứng
Cột 9: Mẫu chuẩn3, 20 bản sao/phản ứng
Cột M: Trọng lượng phân tử được đánh dấu, 848, 630, 333 bp
Những mẫu WSSV âm tính chỉ hiện lên vạch 848 bp là DNA của tôm.
Gel chuẩn dùng chẩn đoán YHV/GAV theo kit IQ2000

Cột 1: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 2000 bản sao/phản ứng

Cột 2: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 200 bản sao/phản ứng
Cột 3: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 20 bản sao/phản ứng
Cột 4: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 2000 bản sao/phản ứng
Cột 5: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 200 bản sao/phản ứng
Cột 6: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 20 bản sao/phản ứng
Cột 7: Mẫu nhiễm YHV nặng
Côt 8: Mẫu nhiễm YHV nhẹ
Cột 9: Mẫu nhiễm GAV nặng
Côt 10: Mẫu nhiễm GAV nhẹ
Cột 11: Mẫu âm tính YHV/GAV
Cột M: Trọng lượng phân tử được đánh dấu, 848, 630, 333 bp
Gel chuẩn dùng chẩn đoán YHV/GAV theo kit IQ2000

Phương pháp chẩn đoán

Cột 1: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 2000 bản sao/phản ứng
2. CộtNhững mẫu YHV/GAV
2: Mẫu chuẩn nhiễm YHV 200 âmbảntính chỉ hiện
sao/phản ứng vạch 848 bp là RNA thông tin
Cộtcủa tôm.chuẩn nhiễm YHV 20 bản sao/phản ứng
3: Mẫu
3. CộtNếu
4: Mẫu chuẩn
mẫu hiệnnhiễm
lên GAV
vạch2000 bảnứng
tương sao/phản
với ứng
vạch 277 bp và vạch 777 bp thì
Cột 5: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 200 bản sao/phản ứng
mẫu nhiễm YHV nặng.
Cột 6: Mẫu chuẩn nhiễm GAV 20 bản sao/phản ứng
4. CộtNếu mẫu
7: Mẫu chỉYHV
nhiễm hiệnnặng
vạch tương ứng vạch 277 bp thì mẫu nhiễm YHV nhẹ.
5. CôtNếu mẫu
8: Mẫu hiệnYHV
nhiễm lênnhẹ
vạch tương ứng với vạch 406 bp và vạch 777 bp thì
Cộtmẫu
9: Mẫu nhiễmGAV
nhiễm GAV nặng
nặng.
Côt 10: Mẫu nhiễm GAV nhẹ
6. CộtNếu mẫu chỉ hiện vạch tương ứng vạch 406 bp thì mẫu nhiễm GAV nhẹ.
11: Mẫu âm tính YHV/GAV
7. CộtNếu mẫu lượng
M: Trọng chỉ hiện
phânvạch tương
tử được ứng848,
đánh dấu, vạch 680
630, 333bp
bp thì mẫu âm tính
YHV/GAV.
Các hạn chế của phương pháp PCR

1. Phương pháp PCR thông thường không hoạt động

được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb (kết quả
tốt với các đoạn DNA dưới 1.5 kb)

2. Sự ngoại nhiễm do sản phẩm khuếch đại của những

lần thao tác trước

3. Các sai sót gây ra do taq polymerase (khoảng

10.000 nucleotic thì enzym gắn sai 1 nucleotic)