Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS.

Trần Xuân Ngạch

BÀI 1
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ α-AMYLAZA THEO
PHƯƠNG PHÁP HEINXEL

1.1. Chiết tách dịch enzym từ chế phẩm nấm mốc và từ malt.
Cân 20-100 g môi trường nuôi cấy bề mặt (chế phẩm nấm mốc) hoặc
malt, nghiền nhỏ cẩn thận, cho vào bình tam giác, thêm 500-1000 ml dung
dịch NaCl 1%, đặt trên máy lắc liên tục trong 1-2 h. Lọc hoặc ly tâm ở 6000
vòng/phút để được dung dịch enzym trong suốt.
1.2. Nguyên tắc :
Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ
giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dich iốt.
Đơn vị hoạt độ ezim là lượng enzym có khả năng phân giải 1mg tinh
bột sau 30 phút ở 30 0C.
1.3. Cách tiến hành và tính kết quả :
Cho vào ống nghiệm 1mg dung dịch tinh bột 1%, 1 mg dung dịch NaCl
0,1% và 2 ml dung dịch đệm phosphat 0,05M pH 6.0, lắc đều, giữ ở 30 0C
trong 15-20 phút để dung dịch đạt đến 30 0C. Thêm vào hỗn hợp 1 ml dung
dịch enzym đã đạt đến 30 0C. Lắc đều, tiếp tục giữ ở 30 0C đúng 30 phút lấy
ống nghiệm ra khỏi tủ ấm, cho ngay vào 5 ml dung dịch axít sunfosalisilic 20
% để làm ngừng phản ứng sau vài phút lọc.
Song song với mẫu thí nghiệm làm mẫu kiểm tra cũng tương tự như
trên nhưng cho dung dịch axít sunfosalisilic vào trước rồi mới cho dung dịch
enzym.
Lấy 1ml dịch lọc của mẫu thí nghiệm cũng như mẫu kiểm tra cho vào
ống nghiệm, thêm 9 ml dung dịch iốt pha loãng 150 lần. So màu ở bước sóng
560 nm. Lấy hiệu số số đọc trên máy giữa mẫu kiểm tra và thí nghiệm, đối
chiếu với đường cong tiêu chuẩn, tính số mg tinh bột đã bị phân giải.
Hoá chất sử dụng :
- Dung dịch NaCl 0,1%
- Dung dịch axít sunfosalisilic 20%
- Dung dịch iốt : hoà tan 1g iốt vào 5ml dung dịch có chứa 2 g KI, thêm
nước cất vào đến 300ml. Khi dùng pha loãng dung dịch này 150 lần.
- Dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 6.0

62
Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch

- Dung dich tinh bột 1% trong dung dịch đệm phosphat 0,05 M pH = 6.0.
Cân 1g tinh bột trộn với khoảng 10ml dung dịch đệm, thêm vào 80ml
dung dịch đệm đang sôi, để nguội, thêm dung dich đệm vào cho đến
100ml.
Để bảo quản dung dịch tinh bột có thể thêm 1g benzoat natri.
- Dung dịch tinh bột tiêu chuẩn 1% : Cân 1 g tinh bột trộn với 10 ml
nước cất, thêm 80 ml nước cất đang sôi, khuấy đều và nếu cần tiếp tục
đun để nhận được dung dịch trong suốt, để nguội cho vào bình định
mức 100 ml và thêm nước cất đến vạch mức.
Từ dung dịch này chuẩn bị các dung dịch có chứa 2, 4, 6, 8 và 10 mg
tinh bột trong 1 ml bằng cách lấy 2, 4, 6, 8 ml dung dịch tinh bột 1% và thêm
nước cất vào cho đến 10 ml.
Lập đồ thị tiêu chuẩn : Lấy 0,1 ml dung dịch tinh bột đã chuẩn bị như
trên, thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 0,1 %; 0,2 ml dung dịch đệm; 0,1 ml nước
cất; 0,5 ml dung dịch axít sunfosalisilic 20%, lắc đều, thêm 9 ml dung dịch iốt
đã pha loãng 150 lần, so màu ở bước sóng 560 nm. Vẽ đồ thị tiêu chuẩn, trên
trục hoành ghi số mg tinh bột, trục tung ghi số đọc được trên máy tương ứng.

63
Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch

BÀI 2
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ AMYLAZA DỰA VÀO
LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ TẠO THÀNH.

2.1. Chiết tách dịch enzym.

Tiến hành giống như ở phần 1.1 của bài 1 ở trên.
2.2. Xác định hoạt độ amylaza theo phương pháp Nelson.
- Nguyên tắc : Sau khi cho enzym thuỷ phân tinh bột ở những điều kiện
xác định, đun hỗn hợp phản ứng với dung dịch đồng (II), tạo thành kết tủa
Cu2O.
Hoà tan kết tủa trong thuốc thử arseno-molypden sẽ nhận được màu
xanh da trời. So màu ở bước sóng 660nm, đối chiếu với đồ thị tiêu chuẩn để
tính lượng đường.
- Đơn vị hoạt độ enzym là lượng enzym mà trong 30 phút ở 300C có thể
phân giải tinh bột tạo thành lượng đường khử tương ứng với 1 micromol
glucoza.
2.3. Cách tiến hành và tính kết quả :
- Chuẩn bị 2 ống nghiệm khô, sạch, cho vào mỗi ống 0,5 ml dung dịch
enzym có độ pha loãng thích hợp. Cho vào ống thứ 1 (ống kiểm tra) 1 mol
thuốc thử 5 và 0,5 ml dung dịch tinh bột 1 %. Ống thứ 2 (ống thí nghiệm) đặt
vào tủ ấm 30 0C trong 10-15 phút. Thêm 0,5 ml dung dịch tinh bột 1 % (đã
đạt 30 0C) lắc đều, giữ đúng 30 phút ở 30 0C. Sau đó cho 1 ml thuốc thử 5 lắc
đều. Đặt cả 2 ống nghiệm vào nồi cách thuỷ đang sôi trong 20 phút rồi lấy ra
làm nguội dưới vòi nước chảy. Thêm vào mỗi ống 1 ml thuốc thử arseno-
molypden, lắc liên tục cho đến khi ngừng tạo thành bọt khí CO2 và hoà tan
hoàn toàn kết tủa Cu2O. Thêm nước cất đến 10 ml. Lắc đều, so màu ở bước
sóng 660 nm đối với mẫu trắng.
Mẫu trắng : Cho 1 ml nước cất, 1 ml thuốc thử 5, đun sôi 20 phút trong
nồi cách thuỷ đang sôi, làm lạnh, thêm 1ml thuốc thử arseno-molypden và
tiếp tục làm như trên.
- Tính kết quả : Lấy hiệu số đọc trên máy giữa mẫu thí nghiệm và mẫu
kiểm tra (ETN - EKT). Đối chiếu với đồ thị tiêu chuẩn để tính ra số micromol
glucoza tương ứng, nhân với độ pha loãng dung dịch enzym, tính số đơn vị
hoạt độ trên 1 g môi trường nuôi cấy bề mặt (chế phẩm nấm mốc) hoặc malt.

64
Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch

- Hoá chất :
1- Dung dịch enzym : chuẩn bị giống như phần 1.1 của bài 1.
2- Dung dịch tinh bột 1 % trong dung dịch đệm phosphat 0,05M pH = 6.0.
3- Thuốc thử đồng (I) : Hoà tan 200 g Na2SO4 khan hoặc 356 g
Na2SO4.10H2O vào 600 ml nước cất đang sôi. Chuẩn bị 100 ml dung
dịch có chứa 25g muối Seignet. Cho cả hai dung dịch trên vào bình
định mức 1 lít. Thêm vào 20 g NaHCO3 và 25 g Na2CO3 khan (hoặc 50
g tinh thể). Sau khi hoà tan thêm nước cất vào đến vạch. Nếu dung dịch
đục cần phải lọc. Giữ dung dịch ở 30-37 0C. Nếu sau đó dung dịch có
tinh thể cần phải đun cách thuỷ nhẹ trước khi dùng.
4- Thuốc thử đồng (II) : Hoà tan 15 g CuSO4.5H2O trong ít nước cất, thêm
1-2 giọt H2SO4 đặc, thêm nước cất đến 100 ml.
5- Thuốc thử hỗn hợp : Trộn lẫn thuốc thử đồng (I) và (II) theo tỷ lệ 25:1
ngay trước khi dùng.
6- Thuốc thử arseno-molypden : Hoà tan 25 g molypdat amonium trong
400 ml nước cất, thêm 31 ml H2SO4 đặc. Chuẩn bị 25 ml dung dịch có
chứa 3 g Na2HAsO4.7H2O. Trộn lẫn 2 dung dịch trên giữ ở 30-37 0C
trong 24-48 h hoặc ở 55 0C trong 24 phút trong lọ có màu nâu để dung
dịch có màu vàng bền.
7- Dung dịch glucoza tiêu chuẩn : Trong 1 ml chứa 1 µM glucoza, từ dung
dịch này chuẩn bị các dung dịch có chứa 0,20; 0,25; 0,30; 0,40; 0,50;
0,60 µM trong 1ml. Lấy 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm thêm 1ml
thuốc thử 5, đun sôi 20 phút trong nồi cách thuỷ, làm lạnh, thêm 1ml
thuốc thử arseno-molypden, lắc đều, so màu.

65
Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch

BÀI 3
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ
ENZYM POLYPHENOLOXYDAZA

3.1. Nguyên tắc :

Khi cho một lượng axít ascorbic tác dụng với pyrocatechin với sự có
mặt của enzym polyphenoloxydaza thì phản ứng sẽ xảy ra trước hết tạo thành
orthoquinon. Sau đó orthoquinon là chất oxy hoá mạnh tác dụng với axít
ascorbic. Căn cứ vào lượng axít ascorbic tiêu tốn trong phản ứng sẽ suy ra
hoạt tính của enzym. Phương trình phản ứng như sau :
Pyrocatechin Polyphenoloxydaza Orthoquinon + H 2O

Orthoquinon + axít ascorbic → Pyrocatechin + axit dehidroascorbic

3.2. Chiết tách enzym Polyphenoloxydaza.
Cân 2-5 g thực vật tươi (lá chè, hạt cacao tươi,...), cắt thành mảnh nhỏ
bỏ vào cối sứ nghiền nhanh với axeton khan và 0,5 g Al2O3. Gạn dung dịch
chiết qua phễu thuỷ tinh xốp số 2, còn cặn tiếp tục nghiền, lọc khoảng 5-6 lần
cho đến khi chlorophyll hoàn toàn được tách hết. Lúc đó ta nhận được loại bột
màu vàng nhạt, đó là chế phẩm enzym-axeton.
3.3. Cách tiến hành và tính toán kết quả.
- Cách tiến hành :
Cân chính xác 50 mg chế phẩm enzym-axeton vào bình nón 100 ml,
cho thêm 10 ml dung dịch đệm phosphat pH =7, thêm 2 ml dung dịch axít
ascorbic 0,2% vừa mới pha và 1 ml dung dịch pyrocatechin 0,5 %. Lắc mạnh
trong đúng 2 phút ở nhiệt độ 20 0C.
Khử hoạt tính enzym bằng cách thêm 2 ml dung dịch H2SO4 10 %.
Tiếp tục thêm vào phản ứng một vài tinh thể KI và 5 giọt hồ tinh bột 1 %.
Tiếp tục chuẩn độ lượng axit ascorbic còn lại bằng dung dịch KIO3
0,001N đến khi xuất hiện màu xanh bền.
Song song với thí nghiệm thực, tiến hành thí nghiệm trắng bằng cách
thêm các hoá chất theo thứ tự : 50 mg chế phẩm enzym-axeton vào bình nón
100 ml, thêm 10 ml dung dịch đệm phosphat pH=7, thêm 2 ml dung dịch
H2SO4 10 %, Lắc mạnh đúng 2 phút ở 20 0C. Tiếp tục thêm 2 ml axit ascorbic
0,2 % vừa mới pha và 1 ml dung dịch pyrocatechin 0,5 %. Thêm vài tinh thể

66
Thí nghiệm Công nghệ enzym Biên soạn : ThS. Trần Xuân Ngạch

KI và 5 giọt hồ tinh bột 1 % rồi chuẩn độ lượng axit ascorbic bằng dung dịch
KIO3 0,01N đến khi xuất hiện màu xanh bền.
- Tính kết quả : Hoạt độ enzym polyphenoloxydaza được thể hiện bằng
hiệu số giữa số ml dung dịch KIO3 0,01N ở mẫu trắng và mẫu thí nghiệm
trong 1g chế phẩm enzym-axeton, được tính theo công thức sau :
(a − b ).1000
χ=
t.C
Trong đó : χ là hoạt độ enzym polyphenoloxydaza trong 1gam chế
phẩm trong 1 phút
a là số ml KIO3 0,01N chuẩn độ ở mẫu trắng
b là số ml KIO3 0,01N chuẩn độ ở bình thí nghiệm
1000 là hệ số chuyển ra gam
C là khối lượng mẫu chế phẩm enzym-axeton
t là thời gian thí nghiệm - phút.
- Dụng cụ và hoá chất :
Cân điện tử, cối chày sứ, phễu xốp số 2, máy hút chân không, buret 10
ml, pipet 1 ml, pipet 2 ml, bình nón 100 ml, tủ lạnh.
Al2O3, axeton khan, axit ascorbic 0,2 %, pyrocatechin 0,5 %, axit
sunphuric 10 %, KI tinh thể, dung dịch KIO3 0,01N.

67