5.

øng dông s¾c kÝ

 5. øng dông

(2)
(1) (3)
Thö
ĐÞnh tÝnh ĐÞnh l­îng
t¹p chÊt
 5.1. §Þnh tÝnh

- SK khai triÓn:
So s¸nh vÞ trÝ
Morfin trªn pha tÜnh
chuÈn cña chÊt thö vµ
Papaverin chÊt chuÈn
chuÈn
trong cïng ®k
MÉu thö
s¾c kÝ.
 5.1. §Þnh tÝnh

MÉu
chuÈn
- S¾c KÝ röa
gi¶i:
So s¸nh thêi
gian l­u cña
MÉu thö
chÊt thö víi
chÊt chuÈn
trong cïng §k
s¾c kÝ.
 5.1. §Þnh tÝnh
- So s¸nh phæ UV-VIS cña chÊt thö víi chÊt
chuÈn (Detector DAD).

- KÕt hîp s¾c ký - phæ IR hoÆc s¾c ký -

 5.2. Thö tinh khiÕt

• Dïng chÊt ®èi chiÕu t¹p chÊt

pha trong dung m«i cã nång ®é ë
møc giíi h¹n cho phÐp trong mÉu
thö.
• Ch¹y s¾c ký trong cïng ®iÒu kiÖn s¾c
kÝ.
 5.2. Thö tinh khiÕt

Trªn SK ®å mÉu
thö:
S pic cña t¹p MÉu thö ChÊt chuÈn
t¹p
chÊt nhá h¬n S
pic cña chÊt
chuÈn t¹p chÊt.
• Nång ®é t¹p
chÊt trong mÉu
thö < giíi h¹n cho
phÐp.
 5.3. ĐÞnh l­îng

Ph­¬ng Ph­¬ng Ph­ Ph­

ph¸p ph¸p ¬ng ¬ng
chuÈn thªm ph¸p ph¸p
ngo¹i chuÈn chuÈn chuÈn
néi ho¸
diÖn
tÝch.
 5.3. §Þnh l­îng
ChiÒu cao DiÖn tÝch
pic pic
S=h.
ChiÒu
- cao w
pic vµ S=h.w1/
diÖn tÝch 2

pic tØ lÖ
thuËn víi
n«ng ®é
cña chÊt
ph©n
tÝch.
 5.3.1. Ph­¬ng ph¸p chuÈn
ngo¹i
a. ChuÈn ho¸ 1 ®iÓm?
- Chän nång ®é cña mÉu thö xÊp xØ víi
nång ®é cña mÉu chuÈn.
MÉu thö MÉu chuÈn
- Ch¹y SK trong cïng
®iÒu kiÖn.
- TÝnh nång ®é chÊt thö:
SX SC

SX
CX =CS
SS
 5.3.1. Ph­¬ng ph¸p chuÈn
ngo¹i
b. ChuÈn ho¸ nhiÒu ®iÓm?
- ChuÈn bÞ mét d·y chuÈn víi c¸c nång ®é
t¨ng dÇn (th­êng 5-7 ®iÓm). TiÕn hµnh
ch¹y s¾c kÝ.

S1 S2 S3 S4 S5
5.3.1. Ph­¬ng ph¸p chuÈn
ngo¹i
S Y=aX+b

SX

0 1 2 3 4 5 6 C
CX
 B¶ng Sè liÖu

N§ C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 Cx
A
mox
S 1 29,0 77,4 135, 258, 433, 563, Sx
A 3,9 2 2 2 5
mox
 §å thÞ
600,000

500,000
y =35041x - 4542.2
2
R =0.9972
400,000

300,000

200,000

100,000

0
0 5 10 15 20
 5.3.1. Ph­¬ng ph¸p chuÈn
ngo¹i
- ChÊt chuÈn ngo¹i lµ chÊt:
+ Cã b¶n chÊt lµ chÊt cÇn ph©n
tÝch.
+ §¹t yªu cÇu chÊt chuÈn lµ tinh
khiÕt.
- Nh­îc ®iÓm khi ph©n tÝch:
+ C¸c mÉu ph¶i xö lý phøc t¹p (chiÕt
t¸ch...)
+ C¸c mÉu cã hµm l­îng thÊp.
 5.3.2. Ph­¬ng ph¸p thªm chuÈn
(Standard addition)

a. Kü thuËt thªm 1 ®iÓm:

- ChuÈn bÞ mÉu thö.
- Thªm vµo mÉu thö mét l­îng ®· biÕt cña
chÊt chuÈn.
- TiÕn hµnh xö lý mÉu vµ s¾c ký trong cïng
®iÒu kiÖn.
- Nång ®é ch­a ΔC
CX =SX CX cña mÉu thö ®­îc
biÕt
ΔS
tÝnh theo c«ng thøc:
 5.3.2. Ph­¬ng ph¸p thªm chuÈn
(Standard addition)

b. Kü thuËt thªm ®­êng chuÈn:

- ChuÈn bÞ mét d·y hçn hîp gåm c¸c l­
îng mÉu thö gièng nhau vµ c¸c chÊt
chuÈn ngo¹i víi l­îng t¨ng dÇn.
- Xö lý mÉu råi tiÕn hµnh s¾c ký.
- Dùng ®­êng chuÈn t­¬ng quan gi÷a
diÖn tÝch (chiÒu cao) pic tæng (thö+
chuÈn) víi l­îng hoÆc nång ®é cña chÊt
chuÈn thªm (∆C).
- Giao ®iÓm cña ®­êng chuÈn kÐo dµi
 5.3.3. Ph­¬ng ph¸p chuÈn
néi
- Thªm vµo mÉu chuÈn vµ mÉu thö mét l­
îng nh­ nhau cña mét chÊt tinh khiÕt thø
hai (chuÈn néi).

• ChÊt chuÈn néi?

- Cã cÊu tróc ho¸ häc t­¬ng tù nh­ chÊt
thö .
- Cã nång ®é xÊp xØ víi nång ®é cña
chÊt thö .
- Kh«ng ph¶n øng víi bÊt kú thµnh phÇn
 5.3.3. Ph­¬ng ph¸p chuÈn
néi
a. Ph­¬ng ph¸p chuÈn 1 ®iÓm:
- ChuÈn néi ®­îc thªm 1 l­îng nh­ nhau vµo
c¶ mÉu chuÈn vµ mÉu thö.
MÉu MÉu thö
chuÈn
SES SX
RS = RX = ChuÈn
ChuÈn
néi
ChuÈn néi

SIS SIS ngo¹i ChÊt thö

- Nång ®é cña chÊt thö

:
RX
CX =CS
RS
 5.3.3. Ph­¬ng ph¸p
chuÈn néi
* Ph­¬ng ph¸p chuÈn hãa nhiÒu
®iÓm:
- ChuÈn bÞ mét d·y chuÈn cã chøa nång
®é chÊt chuÈn tõ C1-C5 nh­ng chøa cïng
mét l­îng chuÈn néi.

R R R R R
1 2 3 4 5
 5.3.3. Ph­¬ng ph¸p chuÈn néi
* S¾c ký mÉu thö ®­îc thªm chuÈn néi víi
l­îng nh­ thang chuÈn.

RX

RX

0 1 2 3 4 5 6

CX C
 5.3.3. Ph­¬ng ph¸p chuÈn
néi
* Yªu cÇu víi chÊt chuÈn néi:
- Trong cïng ®iÒu kiÖn s¾c ký:
+ ChÊt chuÈn néi t¸ch hoµn toµn khái
chÊt thö (Rs>1,25)
+ ChÊt chuÈn néi cã tR gÇn víi tR cña chÊt
thö .
 N§ 0,5 1 2 4 8 12 16 Cx
Amox

IS 5 5 5 5 5 5 5 5

S. 13,9 29,0 77,4 135, 258, 433, 563, Sx

Amo 2 2 2 5
x
S. IS 381, 349, 391, 335, 410, 397, 366, 39
1 2 9 6 4 5 3 3
R 0,03 0,08 0,19 0,40 0,62 1,08 1,53 Rx
6 3 7 2 9 9 8
18000

16000
y =1122x - 2567
14000 2
R =1
12000

10000

8000

6000

4000

2000

0
0 5 10 15 20
-2000

-4000
 3. Thö t¹p chÊt
- Tr­êng hîp cã chuÈn cña t¹p chÊt,
pha ®ung dÞch chuÈn vµ thö. Ch¹y
Sk thu ®­îc diÖn tÝch chÊt chuÈn vµ
chÊt thö.

- Tr­êng hîp kh«ng cã chuÈn cña t¹p sÏ

sö dông ph­¬ng ph¸p chuÈn ho¸
diÖn tÝch.
 5.3.4. Ph­¬ng ph¸p chuÈn ho¸
diÖn tÝch
* Nguyªn t¾c:
+ Hµm l­îng phÇn tr¨m cña mét chÊt trong
hçn hîp b»ng tû lÖ phÇn tr¨m diÖn tÝch pic
cña nã so víi tæng diÖn tÝch cña tÊt c¶ c¸c
pic thµnh phÇn trªn s¾c ®å .

SA SA
%A= ×100% = n x100%
S1 + S2 +...+ Sn
∑ Si
i=1
 5.3.4. Ph­¬ng ph¸p chuÈn ho¸
diÖn tÝch

• Yªu cÇu tÊt c¶ c¸c thµnh phÇn:

+ §­îc röa gi¶i
+ §­îc ph¸t hiÖn vµ cã hÖ sè ®¸p øng trªn
detector nh­ nhau.
5.3.4. Ph­¬ng ph¸p chuÈn ho¸
diÖn tÝch
* øng dông:
- Sö dông nhiÒu trong s¾c ký khÝ v×
th­êng cã ®¸p øng nh­ nhau ë detector
ion ho¸ ngän löa (FID).
- Trong HPLC bÞ h¹n chÕ v×:
+ §¸p øng cña Detector víi c¸c chÊt PT
kh«ng gièng nhau.
5.3.4. Ph­¬ng ph¸p chuÈn ho¸
diÖn tÝch
• HÖ sè ®¸p øng cña detector ®èi víi tõng
thµnh phÇn trong mÉu ®­îc x¸c ®Þnh
b»ng c¸ch:
• Ch¹y s¾c ký mét dung dÞch chuÈn cã
nång ®é ®· biÕt (CC) vµ ®o diÖn tÝch cña
nã (SC): fi =
CC
SC
C x = f i .Sx

SA .f A
%A= .100%
S1f1 + S2 f 2 +...+ Sn f n