Kl thult khang sinh dl N!

C
XC DJNH NONG D KHNG SINH TI THIEU
UC CHE VI KHUAN
(Minimum Inhibitory Concentration - IC)
1s. L 1H AAH HOAC
C LC
I. C DICH V NGUYN L
II. TRANG THI ET BJ V DNG C
III. I TRUNG V SINH PHA
3.1. trung
3.2. Cc lo khng snh v t duc
IV. CHUNG VI KHUAN
4.1. Cc chung v khun chun quc t
4.2. Chung v khun cn xc d|nh IC
V. KY THUAT
5.1. Cch pha khng snh
.1.1. Pha dung dch khng sinh dm dc (dung dch "m")
.1.2. Pha cc dm d khng sinh
5.2. K thut xc d|nh nng d khng snh t thu c ch v khun
trong m trung d}c
5.3. K thut xc d|nh nng d khng snh t thu c ch v khun
trong m trung long
VI. PH LC
6.1. Dung d|ch dm phosphat dng d pha dung d|ch khng snh ~m
6.2. Dung d|ch dm phosphat d pha long khng snh v v khun
(PBS)
6.3. ng mu c Farland 0.5
6.4. Bang mu gh kt qua
6.5. G tr| IC cua cc chung chun quc t

I. MUC CH V NGUYN L
c dch: thut nay nhm muc dich xac dinh chinh xac nng d nho nht cua khang
sinh co tac dung uc ch su phat trin cua mt chung vi khun trong mi truong nui cy
(phuong phap dinh luong).

Nguyn l: Nng d khang sinh tng dn trong mi truong nui cy, khi dat dn mt
nng d nht dinh no s uc ch duoc su phat trin cua vi khun, va bng mt thuong d
co th xac dinh duoc diu nay.
II. TRANG THIT B[ V DUNG CU
Ni cach thuy
Cn din chinh xac (0,000g)
Tu lanh
Tu dng lanh 20
o
C
Tu m 37
o
C
B cy phin ban 32 chn dinh (bng thep khng ri), mi du chua 2 3l.
Pipet Pasteur
Ong dong khc vach 25 ml hoc 50 ml
Cac loai pipet khc vach: 0,1 ml, 0,2 ml, 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml.
Micropipet: 0,5 10 3l, 10 - 100 3l.
Cac loai ng nghim duong kinh: 12 mm, 16 mm, 18 mm.
Binh cu hoc binh non: 25 ml, 50 ml, 100 ml, 300 ml, 500 ml, 1000 ml
Hp lng duong kinh 90 mm.
III. MI TRUNG V SINH PHAM

3.1. trung

Thach Mueller - Hinton (MH).

Canh thang MH.
Canh thang thuong hoc BHI (Brain Heart InIusion).
Thach mau co ban (Blood agar base).
Mau cuu hoc mau tho d loai Iibrin, ly mau va dung ngay, co th giu o tu
lanh nhung khng duoc qua 48h.
NAD (nicotin adenin dinucleotid).

3.2. Cc lo khng snh v ha duc

Cac loai khang sinh bt dung cho phong thi nghim, hoc khang sinh bt dung d
tim truyn tinh mach.
Dung dich dm dung d pha cac khang sinh:
O Dm phosphat dung d pha dung dich 'me: pH 6, pH 7, pH 8.
O Dm phosphat dung d pha long khang sinh.
O Nuoc ct v trung.
Hoa cht
O NaCl
O Cl
O Na
2
HPO
4
.H
2
0
O H
2
PO
4

O H
2
SO
4

O BaCl
2

O Dung dich NaOH 2M

O Dung dich HCl 0,5 N
O Cn tuyt di Methanol va Ethanol.
IV. CHNG VI KHUAN
Cac chlng vi khuln chuln qulc tl

Hemophilus influen:ae NCTC 8468

$9aphylococcus aureus ATCC 25923
scherichia coli ATCC 25922
$9rep9ococcus faecalis ATCC 29212
!seudomonas aeruginosa ATCC 27853

4.2.Chung v khun cn xc d|nh IC:

Nht thit phai la cac chung d duoc dinh danh va thun khit.
V. KY THUAT
5.1. Cch pha khng snh

.1.1. Pha dung dch khng sinh dm dc (dung dch "m")

5.1.1.1. Nu su dung khang sinh bt dung cho phong thi nghim: dua trn hoat luc cua
khang sinh (duoc ghi trn cac nhn lo), ta s tinh d pha dung dich me theo cng thuc
sau:
Vi du: hang sinh chloramphenicol co hoat luc 99,13, nu cn pha 10 ml dung dich
khang sinh me co nng d 1600 3g/ml, s phai cn Xg khang sinh:
hang sinh bt sau khi duoc cn, s pha voi dung dich dm thich hop (xem 6.1.),
tuy theo mi loai khang sinh khac nhau s co nhung dung mi va dung dich dm khac
nhau (phu thuc tung hng san xut loai khang sinh).
Nhiu loai khang sinh co th hoa tan va duoc pha long trong nuoc ct. Mt s
khac cn phai hoa tan trong cac dung mi dc bit, sau do moi duoc pha long trong
nuoc ct. Vi du:
Khng snh Cht ha tan Cht pha long
Ampicillin Dung dich dm phosphat pH 8 Dung dich dm phosphat pH 6
Cephalosporin Dung dich dm phosphat pH 6 Nuoc ct
Tetracyclin Cn methanol Nuoc ct
Trimethoprim Cn methanol Nuoc ct
SulIamethoxazol NaOH 2M Nuoc ct
Chloramphenicol Cn ethanol 100 Nuoc ct
RiIampycin Cn ethanol 100 Nuoc ct
Erythromycin Cn ethanol 100 Nuoc ct
Acid Iusidic Cn ethanol 100 Nuoc ct
Dung dich khang sinh gc sau khi pha xong, chia nho ra cac ng nghim, bao quan
trong lanh - 20
0
C. Mt khi d ly ra, chi dung trong pham vi mt ngay.
5.1.1.2. Nu su dung khang sinh bt dung cho tim truyn tinh mach: la bt khang sinh
khng tinh khit, vi d co ta duoc hoa ln trong bt khang sinh d d hoa tan voi dung
dich hi chinh hoc nuoc ct khi tim, s khng co chi s hoat luc cua khang sinh. Vi vy
s khng th cn bt khang sinh d pha dung dich khang sinh me duoc (vi s khng chinh
xac). Vy mun co dung dich me: pha toan b lo khang sinh do voi mt luong nuoc hi
chinh hoc nuoc ct theo chi dn (co trn nhn cua lo khang sinh), tu do tinh duoc nng
d cua dung dich me.
Vi du: 1 lo khang sinh Ampicillin dung cho tim truyn co 1g bt hoa voi 5 ml
nuoc ct, nhu vy nng d khang sinh cua dung dich me nay la: 200.000 3g/ml, tip tuc
pha long trong dung dich dm phosphat pH 6 hoc nuoc ct dn khi co nng d cn
thit. Chia nho vao cac ng nghim, bao quan trong lanh - 20
0
C. Mt khi d ly ra d tan
bng, chi dung trong pham vi mt ngay.
.1.2. Pha cc dm d khng sinh
Dung d|ch ~m
Dung d|ch dm
PBS `
(ho}c nuc ct)

D pha
Dm d trung
gan (3g/ml)
Dm d cu
cng (3g/ml)``
2,5 ml (1280 3g/ml)
2 ml
1 ml
0,5 ml
0,5 ml
-
2ml
3 ml
3,5 ml
7,5 ml
-
1/2
1/4
1/8
1/16
1280
640
320
160
80
128
64
32
16
8
2ml (80 3g/ml)
1 ml
0,5 ml
0,5
2 ml
3ml
3,5 ml
7,5 ml
1/2
1/4
1/8
1/16
40
20
10
5
4
2
1
0,5
2ml (5 3g/ml)
1 ml
0,5 ml
0,5 ml
2 ml
3ml
3,5 ml
7,5 ml
1/2
1/4
1/8
1/16
2,5
1,25
0,64
0,32
0,25
0,125
0,064
0,032
2ml (0,32 3g/ml)
1 ml
2 ml
3ml
1/2
1/4
0,16
0,08
0,016
0,008
!$ Dung dch dm phospha9 dung d pha long khang sinh (xem 6.2.).
m d cui cung duoc 9Jnh 9heo 9% l 9rn 2,5 ml dung dch 9rung gian 22,5 ml
9hch MH, hoc 0,2 ml dung dch 9rung gian 1,8 ml canh 9hang MH (pha long
1/10).
5.2. K thut xc d|nh nng d khng snh t thu c ch v khun trong m
trung d}c
Ngy 1:
- Tt ca cac chung cn thu MIC va cac chung chun quc t, du duoc cy trong canh
thang thuong (hoc trn mi truong thich hop cua tung loai), dt o 37
0
C/18h d co
duoc vi khun non. Chu y diu kin khi truong theo yu cu cua tung loai vi
khun: H. influen:ae, $. pneumoniae, $. pyogenes d trong khi truong co 5
CO
2
(trong diu kin khng co tu m CO
2
, tao CO
2
bng cach cho dia thach vao mt
binh thuy tinh lon, dt nn, dy np tht kin).
- Chun bi thach MH: Cn thach theo cng thuc (ghi trn hp), dun si cho tan ht
thach, hp thach o 121
o
C/15 phut. Di voi mt s chung cn mi truong co cht dinh
dung cao phai cho thm: 5-10 mau (cho cac chung $. pneumoniae), 5-10 mau va
hp cach thuy 80
o
C/20 phut, lc du trong sut thoi gian hp cach thuy, sau do cho
thm NAD (di voi chung H. influen:ae). D thach ngui con khoang 40-50
0
C, dung
ng dong khc vach dong 22,5 ml thach cho vao binh non d co sn 2,5 ml dung dich
khang sinh theo cac nng d nhu trong bang pha khang sinh, lc k va d vao hp
lng, khi thach ngui ct bao quan trong tu lanh 4 - 8
0
C (co th bao quan duoc trong
2 tun). Mi ln lam MIC cn 2 dia mi truong MH khng co khang sinh d lam dia
chung (cho thm 2,5 ml PBS hoc nuoc ct).
Ngy 2:
- Cy vi khun thun khit tu canh khun non (canh khun d cy qua dm 18h) hoc
nht mt s khun lac tu mi truong thach thich hop hoa vao 3 ml dung dich dm
PBS (hoc nuoc ct) d co d duc bng d duc cua ng Mc Farland 0,5 tuong
duong 1-1,5 x 10
8
vi khun/ml (xem 6.3.). Tip tuc pha long 1/100 d co dm d vi
khun 1-1,5 x 10
6
/ml bng cach dung micropipet hut 20 3l cho vao 2 ml dm PBS
(hoc nuoc ct).
- Dung pipet Pasteur hut khoang 0,5 ml huyn dich (1-1,5 x 10
6
/ml) cho vao mi
ging, theo so d d ghi s cua cac chung:

1 2 3 4

5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15 16
17 18 19 20 21 22
23 24 25 26 27 28

29 30
Chung
chun*
Chung
chun*

* Tuy theo loai vi khun cn xac dinh MIC d chon chung chun sao cho thich
hop: Voi cac chung vi khun duong rut co th dung chung . coli ATCC
25922, $. aureus 25923 lam chung chun, voi chung H. influen:ae, $.
pneumoiae co th dung chung H. influen:ae NCTC 8468 lam chung chun.
- Dung b phin ban 32 chn dinh chm vao ging sau do dt ln dia thach MH co cac
nng d khang sinh khac nhau (nu khng co b cy phin ban, co th dung
micropipet nho 2 3l/chung ln mt dia thach theo so d).
Luu y:
O Cac dia thach cn duoc d se mt thach trong tu m 37
o
C/ 30 phut truoc
khi cy vi khun.
O Danh du vi tri trn duoi hoc trai phai cua dia thach d tranh nhm ln
khi doc kt qua.
O Dt vao dia thach MH chung (khng co khang sinh) truoc va sau khi dt
vao cac dia thach co khang sinh.
O Dt tu dia thach co nng d khang sinh thp nht dn nng d cao hon.
O Chu y cn nhe nhang khng d cac chn dinh n su vao trong thach.
- Sau khi dt ln cac dia thach, cho cho dia thach kh (cac giot nuoc tai cac chn
duong cy thm vao thach (khoang 15 phut- 20 phut) ct vao tu m 37
o
C/18 gio, lt
up dia thach. Di voi mt s chung cn thit phai dt cac dia thach trong diu kin co
CO
2
($. pneumoniae, H. influen:ae, ranhamella ca9arrhalis).
Ngy 3:
- Truoc tin doc kt qua o cac dia thach chung khng co khang sinh d kim tra su
thun khit cua chung vi khun va dam bao khng bi cht truoc khi tin hanh, nu cac
chung dam bao thun khit va phat trin tt moi doc tip.
- Doc kt qua o cac chung chung (chung chun quc t), so sanh kt qua MIC cua cac
chung nay voi bang mu (xem 6.5.), nu nhung kt qua nay nm trong gioi han, sai s
cho phep la mt bc nho hon hoc mt bc lon hon, diu do noi ln rng cac diu
kin cua thi nghim d dat duoc chun thuc: pH, nng d khang sinh, nhit d, dinh
dung cua mi truong, mt d cua vi khun. Nhu vy co th tip tuc doc kt qua o
nhung chung cn xac dinh MIC. Nu khng dat duoc nhu trn, bt buc phai lam lai
thi nghim, dng thoi phai kim tra lai cac diu kin cua thi nghim sao cho dung
chun thuc.
- Doc kt qua, ln luot doc tu dia thach co nng d khang sinh thp nht. Nng d
MIC duoc xac dinh o dia mi truong ma o do cac vi khun bi uc ch phat trin, nn
mt d vi khun giam hn chi con 1-3 khun lac moc.
- t qua MIC cua cac chung voi mi khang sinh duoc ghi theo bang mu (xem 6.4.)
trn mt to giy.
- O nng d thp nht, khng co vi khun moc thi kt qua duoc ghi nhn la: nho hon
hoc bng nng d do (A). Trong truong hop dn nng d cao nht ma vn thy vi
khun moc thi kt qua duoc ghi nhn la lon hon nng d do ().
- t qua MIC cua cac chung s duoc so sanh voi nng d ranh gioi khang (xem 6.6.) d
phn bit thanh 3 muc d nhay cam, khang hay o muc d trung gian: nhay cam
(Susceptible - vit tt S), trung gian (Intermediate - vit tt I) hoc d khang (Resistante -
vit tt R).

5.3. K thut xc d|nh nng d khng snh t thu c ch v khun trong m
trung long
Ngy 1:
- Tt ca cac chung cn thu MIC va cac chung chun quc t, du duoc cy trong canh
thang thuong hoc BHI d co duoc canh khun non, theo ty l sau: truc khun Gram
m: cy 0,1 ml; Lin cu D, tu cu va truc khun mu xanh: cy 0,3 ml; Cac lin cu
khac: 0,6 ml (hoc trn mi truong thach thich hop cua tung loai). Dt o 37
o
C/ 18 gio
d co duoc vi khun non. Chu y diu kin khi truong theo yu cu cua tung loai vi
khun: H. influen:ae, $. pneumoniae, $. pyogenes d trong khi truong co 5
CO
2
(trong diu kin khng co tu m CO
2
, tao CO
2
bng cach cho dia thach vao mt
binh thuy tinh lon, dt nn, dy np tht kin).
Ngy 2:
- Pha long 0,1 ml (100 3l) canh khun non (sau khi d 37
o
C/18 gio s co dm d
tuong duong 1-1,5 x 10
8
vi khun ml) trong 9,9 ml canh thang MH (pha long 100
ln d co dm d tuong duong 1-1,5 x 10
6
vi khun/ml), chia 1,8 ml vao cac ng
nghim duong kinh 12 mm. Nu nui cy qua dm bng mi truong thach, ly vi
khun thun khit tu mi truong thach thich hop hoa vao 3 ml dung dich dm PBS
(hoc nuoc ct) d co d duc bng d duc cua ng Mc Farland 0,5 tuong duong 1-
1,5 x 10
8
vi khun/ml (xem 6.3.), sau do lai pha long 1/100 trong canh thang MH va
chia vao cac ng nghim nhu trn.
- Thm 0,2 ml nuoc ct hoc nuoc mui sinh ly v trung vao 1 ng nghim (chung
m).
- Thm 0,2 ml khang sinh d pha theo bang pha cac dm d khang sinh o trn vao mi
ng nghim, phn phi tu nng d khang sinh thp nht dn nng d cao nht. Lc k
tung ng nghim.
- Dt vao tu m 37
o
C/18 gio.
Ngy 3.
- Lc k tung ng nghim truoc khi doc kt qua.
- Doc kt qua o ng chung m truoc d kim tra xem chung vi khun co phat trin tt
hay khng, nu vi khun phat trin tt moi tip tuc doc kt qua, nu khng moc tt
phai lam lai thi nghim.
- Doc kt qua o cac chung chung (chung chun thuc quc t), so sanh kt qua MIC cua
cac chung nay voi bang mu (xem 6.5.), nu nhung kt qua nay nm trong gioi han,
sai s cho phep la mt bc nho hon hoc mt bc lon hon, diu do noi ln rng cac
diu kin cua thi nghim d dat duoc chun thuc: pH, nng d khang sinh, nhit d,
dinh dung cua mi truong, mt d cua vi khun. Nhu vy co th tip tuc doc kt
qua o nhung chung cn xac dinh MIC. Nu khng dat duoc nhu trn, bt buc phai
lam lai thi nghim, dng thoi phai kim tra lai cac diu kin cua thi nghim sao cho
dat duoc diu kin chun thuc.
- Xac dinh nng d MIC: Doc kt qua bt du tu ng nghim co nng d khang sinh
thp nht. Nng d MIC duoc tinh o ng nghim co nng d khang sinh thp nht co
th uc ch duoc su phat trin cua vi khun (bng mt thuong khng nhin thy vi
khun moc - canh thang trong).
- t qua MIC cua cac chung voi mi khang sinh duoc ghi theo bang mu (xem 6.4.)
- O nng d thp nht, khng thy vi khun moc thi kt qua duoc ghi nhn la : nho hon
hoc bng nng d do (A). Trong truong hop dn nng d cao nht ma vn thy vi
khun moc thi kt qua duoc ghi nhn la lon hon nng d do ().
- t qua MIC cua cac chung s duoc so sanh voi nng d ranh gioi (xem 6.6.) d phn
bit 3 muc d nhay cam, khang hay o muc d trung gian: nhay cam (Susceptible - vit tt
S), trung gian (Intermediate - vit tt I), khang (Resistante - vit tt R).
6. PH LC

6.1. Dung d|ch dm phosphat dng d pha dung d|ch khng snh ~ m

Dung dich A: Na
2
HPO
4
.2 H
2
O 11,867 g/l
Dung dich B: H
2
PO
4
9,078 g/l
Dung dich dm phosphat pH 6: 20 ml dung dich A 80 ml dung dich B
Dung dich dm phosphat pH 7: 70 ml dung dich A 30 ml dung dich B
Dung dich dm phosphat pH 8: 95 ml dung dich A 5 ml dung dich B
im tra lai d pH, nu cn thit cho thm dung dich A hoc B. Hp v trung 121
0
C/15`.

6.2. Dung d|ch dm phosphat d pha long khng snh v v khun (PBS)
NaCl 8 gam
Cl 0,2 gam
Na
2
HPO
4
. 2H
2
0 1,44 gam
H
2
P0
4
0,2 gam
Nuoc ct vua du 1000 ml
Lc du, diu chinh pH 7,4. Hp v trung 121
0
C/15`.

6.3. 6.3. ng mu c Farland 0,5
Dung dich H
2
S0
4
1 9,95 ml
Dung dich BaCl
2
1 0,05 ml
Ong mu Mc Farland 0,5 co d duc tuong duong voi 1-1,5 x10
8
vi khun/ ml

6.4. 6.4. Bang mu gh kt qua:

hang sinh:
Mi truong:
Nhit d va khi truong:

6.5. G tr| IC cua cc chung chun quc t

(Theo Clinical Microbiology and InIection, volume 2 supplement 1, Dec.
1996)
Tn khng snh
scherichia
coli
ATCC
25922
nterococcus
faecalis
ATCC 29212
Pseudomonas
aeruginosa
ATCC 27853
&taphylococcus
aureus
ATCC 25923
Amikacine 0,5 - 4

1 - 4 0,5 - 2
Ampicilline 2 - 8 0,25 - 1

0,03 - 0,.25
Azlocilline 4 - 32 1 - 4 2 - 16

Azotreonam 0,06 - 0,.25

2 - 8

Carbenicilline 4 - 16 16 - 64 16 - 64

Cephalotine 4 - 32

0,06 - 0,25
CeIamandole 0,25 - 1 16 - 64

0,25 - 1
CeIoperazone 0,12 - 0,5 8 - 32 2 - 8 0,25 - 1
CeIotaxime 0,06 - 0,25 ~32 2 - 8

CeIoxitine 1 - 4 ~128

1 - 4
CeItazidime 0,06 - 0,5

1 - 4 4 - 16
CeItriaxone 0,03 - 0,12

8 - 32

Chloramphenicol 2 - 16

2 - 16
CiproIloxacine 0,004 - 0,015

0,25 - 1

Clindamycine

4 - 16

0,006 - 0,25
Colistine 0,2 - 4

0,25 - 1

Erythromycine

0,5 - 4

0,12 - 0,5
Gentamicine 0,25 - 1 0,5 - 2 0,12 - 0,5 0,12 - 0,25
Imipeneme 0,06 - 0,25 0,5 - 2 1 - 4 0,01 - 0,06
anamycine 1 - 4 16 - 64

1 - 4
LatamoceI 0,12 - 0,5 ~128 8 - 32 4 - 16
Lincomycine

16 - 64

0,5 - 2
Mezlocilline 2 - 8 0,5 - 2 8 - 32

Minocycline 0,5 - 2 2 - 8

0,12 - 0,5
Netilmicine A 0,5 - 1 4 - 16 2 - 8 0,25
NitroIurantoine 4 - 32 4 - 16

8 - 64
NorIloxacine 0,03 - 0,12 2 - 8 1 - 4 0,5 - 2
OIloxacine 0,01 - 0,06 2 - 8 1 - 4 0,12 - 0,5
Oxacilline

8 - 32

0,06 - 0,5
Penicilline G

1 - 4

0,03 - 0,12
Piperacilline 1 - 4 1 - 4 1 - 4 1 - 4
Polymyxine B 1 - 4

0,25 - 1 32 - 128
RiIampicine 8 - 32 1 - 4 32 - 64 0,008 - 0,06
Tetracyline 0,5 - 4 8 - 32 8 - 32 0,12 - 2
Ticarcilline 2 - 16 16 - 64 8 - 128

Tobramycine 0,25 - 1 8 - 32 0,5 - 2 0,12 - 1

Trimethoprime 0,5 - 2 A 1 ~ 64 1 - 4
Trimethoprime
SulIamethoxazole
A 0,5 - 9,5

Tn khng snh
scherichia
coli
ATCC
25922
nterococcus
faecalis
ATCC 29212
Pseudomonas
aeruginosa
ATCC 27853
&taphylococcus
aureus
ATCC 25923
Vancomycine

1 - 4

0,5 - 2