Vibrio

I HC THI NGUYN TRNG I HC S PHM
-------------------------------
PHM TH V
NGHIN CU NG DNG MT S K THUT CHN ON NHANH VIBRIO CHOLERAE GY DCH TIU CHY CP TI TNH THI NGUYN NM 2008
LUN VN THC S SINH HC
THI NGUYN - 2009
S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn
http://www.lrc-tnu.edu.vn
I HC THI NGUYN TRNG I HC S PHM -------------------------------
PHM TH V
NGHIN CU NG DNG MT S K THUT CHN ON NHANH VIBRIO CHOLERAE GY DCH TIU CHY CP TI TNH THI NGUYN NM 2008
LUN VN THC S SINH HC

Chuyn ngnh: Sinh hc thc nghim M s:
60.42.30
GIO VIN HNG DN KHOA HC: TS. LU TH KIM THANH
THI NGUYN - 2009
Li cam oan
Ti xin cam oan y l cng trnh nghin cu ca ring ti, cc s liu, kt qu nghin cu trong lun vn l trung thc v cha c ai cng b trong mt cng trnh no khc.
Tc gi
Phm Th V
Li cm n
hon thnh lun vn ny ti xin by t lng bit n su sc ti cc thy c: Khoa Sau i hc, Khoa sinh - KTNN Trng i hc S phm Thi Nguyn, Vin V sinh Dch t Trung ng, Vin Khoa hc Cng ngh Vit Nam. - TS. Lu Th Kim Thanh tn tnh hng dn gip giao ti, trc tip hng dn ti hon thnh lun vn ny. - Bs. Nguyn L Minh gim c Trung tm Y t D phng Thi Nguyn gip ng vin v to mi iu kin cho ti v tinh thn cng nh vt cht trong qu trnh hc tp. - NCVC.Ts. Nghim Ngc Minh Vin Khoa hc Cng ngh Vit Nam tn tnh gip trong qu trnh thc hin lun vn Ti xin cm n ti : - Cn b khoa xt nghim Trung tm Y t D phng Thi Nguyn, c bit nhm cn b xt nghim vi sinh khng qun ngy, m cng nh cc ngy ngh gip ti thu thp mu bnh phm, phn lp vi khun t, pha ch cc loi mi trng, x l sy hp dng c ... - Cc Bc s, k thut vin khoa ly, khoa xt nghim ca cc bnh vin trc thuc tnh Thi Nguyn (Bnh vin a khoa Trung ng, Bnh vin A, Bnh vin C, Bnh vin Gang thp, Trung tm y t cc huyn thnh) cng tham gia thu php mu khi c bnh nhn nhp vin. Thi nguyn, ngy 30 thng 9 nm 2009 Tc gi Phm th V
MC LC
Trang T VN 1. L do chn ti 2. Mc tiu nghin cu 3. Nhng ng gp mi ca ti 4. Gii hn nghin cu 5. Cu trc ca lun vn Chng 1. TNG QUAN TI LIU 1.1. Tnh hnh dch t trn th gii v Vit Nam 1.1.1. Tnh hnh dch t trn Th gii 1.1.2. Tnh hnh bnh t Vit Nam 1.2. Cn nguyn gy bnh 1.2.1. cha v ngun bnh 1.2.2. Tc nhn gy bnh 1.2.3. Phng thc ly truyn 1.2.4. Tnh cm nhim 1.2.5. Din bin bnh 1.2.6. Khng nguyn v cu trucas lp vi khun 1.2.7. c t ca vi khun t 1.2.8. Mt s phng php pht hin Vibrio cholerrae trong phng th nghim 4 4 8 11 11 11 12 13 13 14 16 18 1 3 3 3 3
Chng 2. I TNG V PHNG PHP NGHIN CU 2.1. a im, thi gian nghin cu 2.2. Nguyn liu nghin cu 2.3. Ha cht thit b 2.4. i tng v phng php nghin cu 2.4.1. i tng nghin cu 2.4.2. C mu v cch chn mu 2.4.3. Phng php nghin cu 2.4.3.1. Cc k thut ly mu v vn chuyn bnh phm 2.4.3.2. Cc phng php chn on Vibrio cholerrae 2.4.3.3. Tiu chun nh gi Vibrio cholerrae dng tnh trong nghin cu Chng 3. KT QU V BN LUN 3.1. c im chung ca cc i tng nghin cu 3.1.1. Phn b i tng nghin cu theo gii, tui 3.1.2. Phn b ly mu bnh phm theo a im ly mu 3.2. nh gi phng php nghin cu pht hin Vibrio cholerae O1 3.2.1. Nhn bit vi khun di ng bng k thut soi ti 3.2.2. Nhn bit hnh th v tnh cht bt maufcuar vi khun bng k thut nhum Gram 3.2.3. Pht hin Vibrio cholerrae bng k thut nui cy 3.2.4. Nhn bit Vibio cholerrae bng phng php test nhanh 38 52 34 37 29 29 33 35 19 19 20 21 21 21 22 22 24 27
3.2.5. Chn on Vibio cholerrae bng k thut PCR 3.3. nh gi cc k thut chn on Vibrio cholerae O1 3.3.1. K thut soi ti vi khng huyt thanh c hiu 3.3.2. K thut soi ti v k thut nhum Gram 3.3.3. K thut soi ti vi k thut nui cy 3.3.4. K thut nhum Gram vi k thut nui cy 3.3.5. Phng php test nhanh vi k thut nui cy 3.3.6. K thut nui cy vi phng php PCR 3.4. Tng hp kt qu cc phng php v thi gian KT LUN NGH TI LIU THAM KHO
54
56 57 58 58 59 60 61 66 68 69
NHNG CH VIT TT TRONG LUN VN
CT RNA DNA E.coli KIA N.A.G PCR RAPD
Cholerae Toxi ( c t t ) Acid deroxy ribonucleic Acid deoxy nucleic Escherichia coli (Vi khun Ecoli ) Kligler Iron Agar ( Mi trng song ng ) Non Aglutinable Vibrios Polymerase Chain Reaction ( Pht hin c t V.cholerae) Random Amplified Polymorphic DNA
TCBS
Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose ( Mi trng chn lc nui cy vi khun t )
V.cholerae
Vibriocholerae (Vi khun t )
DANH MC CC BNG 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Bng 1.1 Bng 1.2 Bng 2.1 Bng 3.1 Bng 3.2 Bng 3.3 Bng 3.4 Bng 3.5 Bng 3.6 Bng 3.7 Bng 3.8 Bng 3.9 Bng 3.10 Bng 3.11 Bng 3.12 Bng 3.13 Bng 3.14 Tnh hnh dch t Vit Nam t thng 10/2007 n thng 5/2008 Phn lp V.cholerae typ c in v typ Eltor Danh mc mt s dng c, ha cht Phn b i tng nghin cu theo gii, tui T l bnh nhn theo tui Phn b bnh nhn dng tnh Vibrio cholerrae theo gii tnh T ln thu thp mu cc a im nghin cu T l vi khun di ng quan st trn lam knh T l vi khun Gram m quan st di knh hin vi Phn nh gi chung trong vic xc nh cc vi khun T l Vbrio cholerrae dng tnh bng k thut nui cy Nhn xt tnh cht khun lc trn mi trng TCBS Nhn xt tnh cht khun lc trn mi trng thch kim Thi gian mc khun lc trn 2 loi mi trng nui cy Bng c kt qu trn mi trng sinh vt ha hc Phn ng Oxidase c im nui cy trn mi trng peptone kim 9 15 20 29 31 33 34 36 37 38 39 41 43 44 45 47 49
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
Bng 3.15 Bng 3.16 Bng 3.17 Bng 3.18 Bng 3.19 Bng 3.20 Bng 3.21 Bng 3.22 Bng 3.23 Bng 3.24 Bng 3.25 Bng 3.26 Bng 3.27 Bng 3.28
Phn bit vi khun t vi cc phy khun khc thuc nhm N.A.G trn 3 loi ng Kt qu ngng kt khng huyt thanh a gi v n gi Pht hin Vibrio cholerrae O1 bng k thut test nhanh T l Vibrio cholerrae O1 bng k thut PCR nh gi k thut soi ti vi khng huyt thanh c hiu So snh k thut soi ti v k thut nhum Gram Bng so snh k thut soi ti vi k thut nui cy Bng so snh k thut nhum Gram vi k thut nui cy Bng so snh phng php test nhanh vi k thut nui cy nh gi kt qu ca phng php th Oxidase vi k thut soi ti Bng so snh phng php nui cy v PCR Tng hp kt qu cc phng php v thi gian c p dng Mt s phng php c th p dng chn on nhanh Vibrio cholerrae Bng so snh k thut nui cy vi (bng 3.27)
51 52 54 55 57 57 58 59 59 60 61 61 62 64
DANH MC CC HNH 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Hnh 1.1 Hnh 2.1 Biu 3.1 Biu 3.2 Biu 3.3 Hnh 3.4 Hnh 3.5 Biu 3.6 Hnh 3.7 Hnh 3.8 Hnh 3.9 Hnh 3.10 Hnh 3.11 Hnh 3.12 Biu 3.13 Biu khu tr vi khun t rut non S phn lp chn on Vibrio cholerrae O1 nh gi tui trong thu thp mu Phn b i tng nghin cu theo gii tnh 17 24 30 32
S mu thu thp ti 6 bnh vin trong qu trnh thu 35 thp mu Hnh th Vibrio cholerrae soi ti Hnh th vi khun nhum Gram T l dng tnh Vibrio cholerrae bng k thut nui cy Hnh nh khun lc Vparaheamoliticus v Vibrio cholerrae Hnh nh khun lc Vibrio cholerrae trn mi trng thch kim Cc mi trng sinh vt ha hc trong chn on Vibrio cholerrae Hnh nh phn ng oxidase Hnh nh test nhanh Crystan VC Phn ng PCR Tng hp cc phng php chn on Vibrio cholerrae 36 37 40 42 42 45 47 53 56 63
M U
1. L DO CHN TI Dch tiu chy cp ang c chiu hng gia tng cc a phng, tnh t 23/10/2007 min Bc xy ra ba t dch tiu chy cp nguy him, s bnh nhn tiu chy cp ln n 1.335 ngi, c 136 trng hp dng tnh vi phy khun t ti 18 tnh / thnh ph trong c nc trong c tnh Thi Nguyn [13]. Khng ch dch t l mc tiu ln trong chng trnh quc gia phng chng bnh tiu chy ca Vit Nam. Vi nhng thnh tu v kinh nghim phng chng dch t trong nhiu nm qua, ngy nay bnh t khng cn l ni khip m ca mi ngi dn, ca cc t chc chnh quyn v x hi. Cc iu kin chun mc v kim sot mi trng nc ta cn lc hu. Cc vn cung cp nc, v sinh thc phm, dinh dng an ton v vn x l v sinh cht thi cha lm c bao nhiu, nhiu ni cn b bung lng hoc qun lng. Trong thi k giao lu pht trin kinh t v ngoi giao trong quan h hp tc gia cc nc trong khu vc v ton cu ngy cng c m rng th bn cnh l nhng iu kin rt d bng pht cc v dch ni chung, trong c dch t ni ring [30]. Thi Nguyn l tnh min ni pha Bc tip gip vi cc tnh: Lng Sn, Bc Giang, Bc Kn, Tuyn Quang, Vnh Phc, H Ni, l ca ng giao lu Kinh t - Vn ho X hi thun li gia cc tnh min ni pha Bc vi ng bng Bc B, l trung tm o to quan trng ng th 3 trong c nc. Trng i hc Thi Nguyn vi 6 trng i hc thnh vin v trn 20 trng cao ng trung hc dy ngh. Ton tnh hin c gn 4000 c s sn xut kinh doanh v ch bin dch v phc v, trong s 1.150 c s sn xut kinh doanh cng nghip c hng ngn bp n tp th ca cng nhn, hc sinh, sinh vin Hi t nhiu iu kin thun li nh vy tuy nhin vn cn rt
nhiu kh khn nu khng c qun l cht ch s l ngun ly nhim gy ng c thc phm hoc ngun cha mm gy nn bnh dch. Thc hin cng in khn ca Cc Y t d phng v Mi trng, B y t gi cc Trung tm y t D phng cc tnh thnh trong c nc Tng cng gim st v sinh an ton thc phm trn a bn, gim st cht ch v pht hin sm nht cn nguyn gy tiu chy, x l khoanh vng dch v trin khai iu tr kp thi, khng bnh nhn t vong [30]. Cn phi bo co khn cp khi c t nht mt ca bnh (k c ca xc nh hoc nghi ng), d khu vc dch xm nhp hay bnh lu hnh, y t c s ni pht hin phi bo co ngay theo ch bo co khn cp ca B Y t. Bnh nhn mc bnh t nu khng c pht hin sm v iu tr kp thi s b mt nc v cht in gii dn n t vong. Bnh t ly truyn rt nhanh qua ng tiu ho v mi trng (nc, cht nn, phn, rc...) do vy vic pht hin sng lc mu m tnh ngay ti c s c ngha ht sc quan trng, khng nhng gip bnh nhn c ngay phc iu tr m cn gip cc nh dch t c hng x l khoanh vng, ch ng trong phng chng dch, khng dch ly lan rng trong cng ng [4], [6]. p ng vi tnh hnh thc tin k trn, chng ti tin hnh ti: " Nghin cu ng dng mt s k thut chn on nhanh Vibrio cholerae gy dch tiu chy cp ti tnh Thi Nguyn nm 2008"
2. MC TIU NGHIN CU - Xc nh t l bnh nhn dng tnh vi Vibrio cholerae (V. cholerae ) trong giai on t thng 3 nm 2008 n thng 7 nm 2008. - nh gi hiu qu cc k thut pht hin Vibrio cholerae (soi ti, nhum soi, test nhanh, nui cy, PCR) - La chn nhng k thut ph hp p dng sng lc chn on nhanh Vibrio cholerae ti labo tuyn huyn khi c dch tiu chy cp. 3. NHNG NG GP MI CA TI - ti nghin cu nh gi cc k thut pht hin Vibrio cholerae trn mu phn ca bnh nhn mc bnh tiu chy cp ti tnh Thi Nguyn. - p ng tnh ng dng v hiu qu ti labo tuyn huyn. 4. GII HN NGHIN CU - Thi gian nghin cu ngn nn ng dng nh gi hiu qu sau phn tch cha c s liu nh gi c th. 5. CU TRC CA LUN VN Ngoi phn m u v kt lun, lun vn c 3 chng: Chng 1: Tng quan ti liu Chng 2: Nguyn liu v phng php nghin cu Chng 3: Kt qu v bn lun
CHNG I TNG QUAN TI LIU

1.1.Tnh hnh dch t trn th gii v Vit Nam 1.1.1. Tnh hnh dch t trn th gii Bnh t c cho l xut hin cch y hng th k ti ng bng sng Hng ca cc tiu lc a n . Th k th XI nhng t dch t lan trn ti nhiu vng trn th gii t Nam theo con ng bun bn, hnh hng v di tn. Trong thi gian c i dch, nhiu v dch ln c t l t vong cao xy ra khp thnh th chu u, chu M. Nm 1849, c mt cuc iu tra ni ting ca John Snow (Bc s ngi Anh) chng minh nc l mi trng truyn bnh t [48], [51]. Nm 1817 bnh xut hin ti Chu u v M. n u th k 20 c 6 "ln sng bnh t" lan khp th gii, tip n nhng nm 60 phm vi "tung honh" ca vi khun t c "khoanh vng" v cho n nhng nm gn y ch yu bnh xut hin ng nam . Nm 1961 tp "El Tor" gy dch ti Philippin v to "ln sng th by". T tr i tp vi khun ny tip tc gy nhng v dch ti chu , vng Trung ng, chu Phi v mt phn chu u [2], [5], [10], [57]. Nm 1883, Robert Koch (nh vi sinh vt ngi c) phn lp thnh cng vi khun t phn ca bnh nhn biu hin cc triu chng ca bnh ny. C ti liu cho rng trc 30 nm nh gii phu hc ngi pht hin ra phy khun l nguyn nhn gy bnh [43]. Cc v i dch u bt ngun t chu , sau lan ti cc chu lc khc nhiu nc, trong nhiu nm. Qua cc v dch, c mt s ghi nhn ng ch v dch t hc, sinh bnh hc, iu tr v phng chng bnh t c tm tt nh sau:
- V i dch th nht: Ln u tin ghi nhn bnh t xy ra di dng mt i dch, v i dch ny bt u vo nm 1817 ti khu vc chu th sng Hng, sau lan ti nhiu nc thuc chu v chu Phi [5]. - V i dch th hai: Ln u tin bnh t gy dch Bc M nm 1832 ti khu vc Quebec ( Canada), New York, Philadelphia, Washington. Trong v i dch ny, u nhng nm 1930, OShaughnessy l ngi u tin chng minh phn ca bnh nhn b bnh t c tnh kim v c nng in gii rt cao. sau pht hin c ngha ny, Latta iu tr thnh cng mt s bnh nhn t mt nc nng bng phng php tim tnh mch dung dch cha mui v in gii [5], [47]. - V i dch th 3: Dch t lan ti nc Anh, ti Lun n, John Snow pht hin rt quan trng v dch t hc l bnh t lan truyn theo ng nc sinh hot b nhim v t ra bin php chng dch hiu qu l loi b ngun nc sinh hot khng hp v sinh [17], [27], [61]. - V i dch th 4: Dch t honh hnh d di New Orleans v cc thnh ph, th trn dc theo trin sng Missippi, Missouri v Ohio ca nc M [1], [5], [62]. - V i dch th 5: Dch t lan ti vng trung cn ng, sau lan ti Nam M, gy ra cc v dch ln vi t l t vong cao cc nc Argentina, Chil v Peru. Ti Ai Cp v Calcutta (n ), Robert Koch phn lp c vi khun t t phn ca bnh nhn b bnh t , ch mt nm sau khi Koch phn lp c vi khun t, Ferran l ngi u tin gy min dch d phng t bng vaccin [12], [45]. - V i dch 6: Gy ra cc v dch ln vng Trung Cn ng v bn o Ban Cng, t nm 1921 n nm 1961, ngoi mt v dch t ln xy ra Ai Cp nm 1961 vi 32.978 trng hp t, gy t vong 20.472 ngi, dch t ch yu lu hnh cc nc thuc khu vc ng Nam v chu , trong 6 v i dch u tin tc nhn gy bnh l V. cholerae O1, typ sinh hc c in
do Pacini m t u tin phn lp c nm 1854 v c nh vi trng hc ngi c Robert Koch khng nh li nm 1883[5], [46], [59]. - V i dch th 7: Tc nhn gy bnh l V. cholerae O1, tp sinh hc El Tor, do Goschlich ln u tin phn lp c nm 1905 c chia lm 4 giai on sau: T nm 1961-1962 dch t khu tr cc o thuc Indonesia v cc nc ng Nam , vi tng s 13.393 ngi mc, t vong 1.977 ngi [49], [55]. Nm 1963-1969 ch trong thi gian ngn dch xut hin nhiu nc chu : n , Pakistan, Lin X c, I-Rc, Vit Nam bt u c dch t El Tor vo thng 1 nm 1964. Giai on tip theo t nm 1970-1990 theo s liu ca T chc Y t Th gii c 36 nc c dch t, iu ng ch l ti Li Bng, Syri chng gy dch l El Tor Ogawa, trong khi cc nc lin k nh rp-X t, Israel chng gy dch li l El Tor Inaba.Tip theo nhng nm 1991 n nay iu ng ch nc Trung M v Nam M 21/23 nc c bnh t, nm 1994 chu M La Tinh chim 50% s bnh nhn t trn ton th gii.Thng 7/1994 xy ra mt v dch t thm khc ti tri t nn Uganda vi 58.057 trng hp b bnh t, t vong 23.800 ngi, nm 1996 s ngi mc t chu Phi chim 60% tng s cc trng hp mc t trn th gii [58], [60]. Thng 12 nm 1992 mt v dch ln li sy ra nc ny. Vi khun gy bnh c xc nh l V. cholerae O139 "Bengal". V mt di truyn, O139 "Bengal" hnh thnh t El Tor nhng cu trc khng nguyn ca chng cng bin i. Tt c mi la tui (k c trong vng c dch ) u c th b nhim. Chng O139 gy bnh ti t nht 11 nc ng nam (tnh n nm 2005). Khng c s liu chnh xc s ngi b bnh do O139 v cc nc khng thng bo c th cc trng hp bnh do O1 hay O139 ring r. Trong nhng nm cui th k 20 dch t ngy cng tr nn nghim trng, bnh t xy ra tt c cc chu lc, tp trung ch yu nhng nc ang pht trin, mc d y hc c nhng hiu bit ng k v sinh bnh hc v iu
tr bnh t nhng t l t vong do bnh t vn mc cao, c bit l khu vc chu Phi [3], [8], [53]. Nhng c im ca tp El Tor gip n khng nh kh nng "tip tc gy nguy him" bao gm: T l nhim El Tor thp hn nhiu so vi t l nhim tp c in, thi gian mang trng sau khi b bnh do El Tor di hn so vi trng hp nhim tp c in, El Tor c kh nng tn ti ngoi mi trng tt hn, di hn tp c in. Chnh v vy El Tor c kh nng gy dch ti c nhng ni Tp c in tng "tung honh" [7], [36], [50]. Thng 4 nm 1997, dch bng pht trong cng ng 90 ngn ngi t nn Ruana Cng Ho Cng g. Ch trong 22 ngy u c 1.521 ngi cht. a s cc trng hp cht u do khng c can thip kp thi. Ti M, dch t xut hin vo nhng nm 1800 sau c khng ch do m bo v sinh ngun nc sinh hot. Tuy vy, giao thng v du lch to iu kin bnh xut hin l t. a s trng hp do i du lch ti cc nc M La tinh, chu Phi, chu . Mt s trng hp nhim bnh do n thc n mang v t cc quc gia cn lu hnh bnh [44], [52]. Theo Nguyn Anh Dng, tnh n nm 1991, i dch t ln th 7 c 91 nc c dch [6], n nm 1992 theo T chc Y t th gii c t nht 98 nc c dch t. Nh nhng hiu bit ng k v cn nguyn gy bnh, v iu tr v c ch min dch bnh t m t l t vong do t gim xung mt cch ng k ch cn 1% - 3% [6]. Phy khun V. cholerae O1 bao gm hn 60 nhm huyt thanh, nhng ch c mt nhm huyt thanh O1 l gy c bnh t, V. cholerae O1 li gm 2 sinh tp l sinh tp c in v sinh tp El-Tor, mi sinh tp li gm 2 tp huyt thanh (Ogawa v Inaba) [8], [22]. Sinh tp El-Tor gy nn hu ht cc v dch t gn y, tuy vn cn nhiu v dch xy ra tiu lc a n l do sinh tp c in. Sinh tp El-
Tor c th sng kt hp vi mt sinh vt di nc, lm cho nc tr thnh mt kho tng lu tr gy nhim [31], [54]. T cui nm 1992, dch t do V. cholerae O139 xut hin mt s ni thuc ng nam n , sau nhanh chng lan ti ng Bc nc ny thuc vnh Belgan.Thng 3/1993 dch ln sy ra Bangladesh, tip xut hin Miama, Trung Quc (Tn Cng,7/1993), Thailand (8/1993) n thng 9 cng nm c nhiu trng hp mc t V. cholerae O139 Malaysia [34]. Ngi ta phn lp c V. cholerae non O1 cc bnh nhn tiu chy nng thuc 2 cng ng Florida.Tnh gy bnh ng tiu ho ngi v s ng nht ho ca nhng chng ny lm ny sinh nhng cu hi v s tng quan ca nhng chng V. cholerae O1 c v khng c dc b bin Gulf ca hoa K [39], [56]. Mt nh gi kho st trn tt c cc bnh vin t nhn Recife cho kt qu trong 1.435 mu ch c 1 mu dng tnh vi V. chlerae El-Tor Inaba (0.07%), 17 mu dng tnh (1.2%) gm V. cholerae non O1, V. fluvialis, V. fumissii, V. parahaemolyticus, V. spp. v rt t gp nhng ngi c iu kin x hi kh, ngay c khi dch ang xy ra [49]. 1.1.2.Tnh hnh bnh t Vit Nam Bnh t l nguyn nhn quan trng gy tiu chy cp Vit Nam t hn mt th k qua vi 2 triu trng hp mc bnh t c thng bo. Nm 1937-1938 dch t t Hng Kng theo ng bin xm nhp vo cc tnh min Bc l Hi Phng, Mng Ci, t dch lan sang theo ng st v ng b ti nhiu tnh ng bng Bc B v Trung B. S ngi mc ln ti 20.678 ngi, trong s cht l 14.992 ngi, t l t vong ti 70%. Bnh t Eltor ln u tin xut hin min Nam nm 1964 vi 20.009 ngi mc bnh, trong 821 ngi t vong. T n nay, min Trung v min Nam bnh t xy ra di dng lu hnh, hng nm c hng trm bnh nhn b bnh t c thng bo. Nm 1994 sau hng chc nm vng bng, bnh t xut
hin li khu vc Ty Nguyn ( cc tnh c Lc, Lm ng, Gia Lai ) vi 1.459 bnh nhn mc bnh t c thng bo [5], [11], [16]. Dch t hin nay vn l gnh nng i vi ngnh y t v ton x hi. nm 1993 dch xy ra 21 tnh vi 3.460 ngi mc bnh. Nm 1994 dch xut hin c min Bc, Trung, Nam v Ty Nguyn vi 4.123 trng hp b bnh. Nm 1995 c 29 tnh, thnh ph bo co c bnh nhn mc t vi 6.088 trng hp mc bnh t. Nm 1996, c nc c 630 trng hp mc bnh t ElTor 19 tnh, thnh ph. Vi nm gn y t 2001-2002 nc ta vn c cc trng hp t xy ra, tuy nhin bnh khng bng pht thnh cc dch ln m ch yu l nhng ca l t khp c nc [5]. Bng 1.1. Tnh hnh dch t Vit Nam t 10/2007 - 5/2008 t 1 Ngy xut hin Tng s mc S dng tnh (+) vi t S tnh/thnh c t (+) Tp trung nhiu nht ti S t vong Ngy kt thc 23/10/2007 1.907 295 14 H Ni 0 06/12/2007 t 2 24/12/2007 58 32 1 H Ni 0 5/2/2008 t 3 5/3/2008 3.480 581 18 H Ni 0 22/5/2008 0 5.445 908 Tng
(Ngun s liu: Cc Y t D phng v Mi trng Vit Nam) Nguyn Ph Qu (1993) thng bo v nhng c im sinh hc ca V. cholerae O139 v quy trnh k thut phn lp xc nh mm bnh vi khng huyt thanh c hiu ca Vin V sinh Dch t Trung ng [36].
Kt qu xt nghim phn lp c V. cholerae El-Tor c s dao ng ln gia cc tc gi, thp nht l 1,52 % v cao nht l 45,70 %. Phan o v cng s cho rng thi gian nh ca v dch t l phn lp cao trn 50% [9]. Mt s tc gi cn a ra t l phn lp theo nhm tui, t l phn lp vi khun t dng tnh nhm tui 6-16 tui l 15,08 %, 17-50 tui l 44,56 %, iu ny cng chng t di 50 tui c t l mc t cao [6], [7]. T l ngi lnh mang trng, khi phn lp vi khun t nhng ngi lnh trong cc v dch, cc tc gi trong nc cho thy rt thp l 1% v cao nht l 15% [9], [14]. So vi nhiu dch bnh mi xut hin v ang din bin phc tp hin nay, bnh tiu chy cp nguy him khng phi l bnh kh kim sot, dch bnh c th bng pht khi c ba mt xch lin kt vi nhau (ngun bnh, ng ly, sc cm th), c 3 mt xch ny c xc nh rt r bi cc nh dch t hc. Mc d cha khng nh c nguyn nhn gy bnh, nhng qua s liu nghin cu ca Vin V sinh Dch t Trung ng, c th khng nh vi khun t xut pht t thc phm. Cha bao gi c mt v dch no phc tp nh by gi, gn nh ng lot tt c cc Qun huyn ca H Ni u c dch. Trong khi cc dch li khng lin quan n nhau, cc bnh nhn khng sng cng nhau, khng n cng nhau [13]. Ti tnh Thi Nguyn, sau nhiu nm khng xut hin bnh t, n ngy 13/11/2007 c 23 bnh nhn mc bnh tiu chy cp trong c 01 bnh nhn dng tnh vi V. cholerae O1. Dch bnh xut hin sau khi c pht hin ti nhiu tnh ln cn, hu ht cc trng hp mc bnh l do n cc vng c dch n ung phi thc n nhim khun sau v a phng v pht bnh, tuy vy dch c khng ch thnh cng khng lan rng thm v khng trung hp no t vong.
1.2. Cn nguyn gy bnh 1.2.1. cha v ngun bnh Ngi l cha vi khun t quan trng v cng l ngun bnh, bao gm ngi mc bnh th in hnh hoc cc th nh, khng in hnh v ngi mang mm bnh khng triu chng (cn gi l ngi lnh mang trng). Sau v dch t c mt t l nh (khong 3-5%) bnh nhn cc th c kh nng mang vi khun t ko di mt vi thng, i khi ko di hng nm nu khng c iu tr c hiu ng quy nh. Vi khun t c th tn ti lu di mt s loi nhuyn th (trai, s, ngao...) vng ca sng hay ven bin. y l cha thin nhin ca vi khun t ngoi cha quan trng l ngi [15], [24]. 1.2.2. Tc nhn gy bnh Tc nhn gy bnh t l V. cholerae ln u tin c Pacini ngi m t nm 1854 khi ng tm thy rt nhiu vi khun hnh cong trong rut ca bnh nhn b t. Nm 1883 Robert Koch cng tm thy tc nhn c hnh th tng t khi ng nghin cu bnh t Ai Cp, ng m t vi khun c hnh du phy v Koch t tn l Vibrio comma, tn ny c dng my chc nm trc khi ngi ta i tn l V. cholerae, tng nh ng Pacini, V. cholerae c xc nh rt r thng qua cc tnh cht sinh vt, ho hc v s ng nht ca DNA, tuy nhin chng khng ng nht v kh nng gy bnh, iu ny c bit quan trng v cc chng gy bnh mi c kh nng sinh c t rut v gy dch. Mt s phn bit n gin trong y t cng ng l V. cholerae thuc nhm huyt thanh O1 c kh nng sinh c c t, cn li tt c cc nhm khc th khng c kh nng gy bnh hoc rt him khi gy bnh. V. cholerae O1 thuc nhm huyt thanh O1 c kh nng sinh c t v gy thnh i dch t, tuy nhin c mt s t chng khng sinh ra c t v khng c gen m ho c t. Cc chng mi sinh khng c kh nng sinh c t v khng gy bnh, ngoi l c mt s chng V. cholerae O1 phn lp c mt s bnh nhn tiu chy hoc nhim trng ngoi ng tiu ha,
V. cholerae O1 gm 3 tp huyt thanh l Inaba, Ogawa v Hikojima v bao gm hai sinh tp khc nhau l sinh typ c in v sinh tp El tor [23], [35]. Nhng nm gn y, khi cc v dch t do V.cholerae O139 gy ra, vic nh danh tt c cc chng V. cholerae u da trn tnh cht sinh vt ho hc, sau nu chng no khng ngng kt vi O1 th c gi l Vibrio cholerae - khng O1, sau ny c i thnh Vibrio khng gy t hoc nhm Vibrio khng ngng kt. Hin nay cc nhm ny thuc cc nhm huyt thanh t O2 - O138, khng c kh nng gy dch t. Nhm Vibrio ny i khi gy tiu chy do lin quan n n hi sn, hoc cc nhim trng ngoi ng tiu ho nh vt thng... V dch t xy ra vo u nm 1993 ti n v Bangladaesh do mt loi Vibrio non O1 gy ra, l V. cholerae O139 cn gi l Vibrio Bengal. Nhn chung y l mt chng lai gia V. cholerae O1 v Vibrio cholerae non O1 v iu quan trng l c lc ca n l c t rut v khng nguyn nhung mao ng iu ho c t, tuy nhin chng O139 ging vi sinh tp ElTor hn [38], [41]. Da vo c tnh vi khun V. cholerae O1 c th chia thnh 2 nhm chnh theo huyt thanh (serogroups) l O1 v O139. Nhm O1 c hai tp sinh hc (biotype) ElTor v c in, El Tor l tn ca mt trm y t Ai cp ni m tp vi khun ny c pht hin trong i dch nm 1907, hin nay Eltor l th phm chnh ca cc trn dch t trn th gii. Mi tp sinh hc Eltor hay c in c th chia thnh 3 nhm nh theo huyt thanh l Ogawa, Inaba, Hikojima, mi nhm cn c th chia thnh nhm nh hn da vo khng nguyn (antigen) A, B hay C [21], [33], [40]. 1.2.3. Phng thc ly truyn Bnh t ly theo ng tiu ha, ch yu qua n ung. Vi khun t xm nhp vo ng tiu ha ca ngi lnh t 2 ngun chnh: Thc n, nc
ung nhim phn c vi khun t v thc n c ngun gc thy hi sn ca sng, ven bin c cha cc th tim sinh lu di ca vi khun t. Bnh t ly mnh nht giai on ton pht ca bnh. Thi gian thi vi khun thng ko di khong 1 tun sau khi ht tiu chy cp. Mt s t bnh nhn c th gy nhim sau mc bnh nhiu tun, thm ch nhiu thng do kh nng o thi vi khun t tng t theo phn. Cc yu t ly truyn vi khun t l nc, thc phm ti sng, thc phm qua ch bin, bn tay, dng c n ung, dng c nhn v rui nhng b nhim phy khun t. Nhng yu t nguy c lm tng kh nng lan truyn bnh t l mt dn c ng c, i sng kinh t, x hi v dn tr thp, iu kin v sinh an ton thc phm khng m bo, ngun nc sinh hot khan him, thiu nh v sinh hp tiu chun, v sinh mi trng khng tt, thc hnh v sinh c nhn km, khu vc b l lt v sau l lt [32], [41]. 1.2.4. Tnh cm nhim Mi ngi u c th nhim vi khun t. C th sau khi mc bnh t hoc nhim khun khng triu chng c min dch c hiu vi chng t gy nhim nhng thi gian min dch thng ngn, trung bnh 6 thng, khng c min dch cho gia nhm V. cholerae O1 vi nhm O139. Nhng nhm ngi c nguy c cao vi t l nhng ngi tip xc gn gi (cng n, ung, sinh hot) vi bnh nhn t, dn c ti vng c tp qun n ung khng hp v sinh, s dng thc n ng ph, hi sn cha chn, nc cha qua kh trng, dng phn ti trong trng trt, khu vc ng bng ca sng, ven bin, vng b ngp lt [31]. 1.2.5. Din bin bnh Thi k bnh t vi gi ti 5 ngy, thng t 2-3 ngy, thi k khi pht rt ngn, bnh nhn bt u cm thy y bng v si bng; tip theo tiu chy, lc u c phn, sau ch ton nc v kit sc nhanh chng. Bnh nhn thng ch nn sau khi tiu chy nhiu ln, thi k ton pht thng
c cc triu chng tiu chy lin tc, nhiu ln, phn ton nc, nc phn l l c nh nc vo go, trong c nhng vy mng mu trng (l mnh t bo thng b nim mc rut ln phy khun t). Bnh nhn khng au bng, mt rn v khng c nhy mu mi. S ln tiu chy v s lng nc mt thay i ty tng trng hp nng nh khc nhau nh nn d dng, lc u nn ra thc n, sau ch ton nc trong hoc vng nht, tip theo cc triu chng khc bnh nhn khng st, ngi mt l, c th b chut rt, biu hin tnh trng mt nc t I n III nh kht nc, da kh, nhn nheo, hc hc, mt trng, mch nhanh, huyt p h, c khi khng o c, tiu tin t hoc v niu, chn tay lnh... Ngoi ra bnh nhn c th b ri lon thng bng in gii nh h kali mu [5], [19]. 1.2.6. Khng nguyn v cu trc lp v vi khun S thay i tnh cht khng nguyn l yu t quan trng trong nghin cu dch t v c lc ca vi khun. i vi vi khun t, kh nng gy thnh dch ca chng Bengal ni trn l mt v d minh ho. Nhiu loi vi khun khc trong mi trng nc cng c khng nguyn roi nh vi khun t v vy khng th cn c vo loi khng nguyn ny phn bit. Tp huyt thanh phy khun c phn bit da trn c im vo khng nguyn O ( khng nguyn v). Hu ht cc chng vi khun t u khng c c tnh. Chng Bengal gy thnh dch c nh danh l O1. Tuy vy c ti 3 tp sinh hc ca O1 c gi tn Ogawa, Inaba v Hikojima. Mi chng trong 3 loi ny c kh nng th hin c tnh ca chng c in hay ca El Tor. Chng Bengal O139 l chng huyt thanh mi c khng nguyn O c th. c tnh khng nguyn c th ca Bengal O139 c th gip chng ta gii thch v sao c th khng c min dch sau khi b bnh [5]. Cc khng nguyn v ca phy khun gm: Tp Ogawa c khng nguyn A v B; Tp Inaba c khng nguyn A v C;
Tp Hikojima c khng nguyn A, B, C. Tp sinh vt: Chng V. cholerae O1 c chia thnh 2 tp sinh vt l tp c in v tp ElTor. Bng 1.2. Phn lp V. cholerrae tp c in v tp Eltor Tnh cht Lm tan hng cu cu Ngng kt hng cu g Polymixin B 50v Phage IV
V. cholerae tp c in Nhy Nhy
V. cholerae tp Eltor Khng + + Khng
Ni c t c mt trong phy khun cng nh trong cc vi khun Gram m khc. Chng ta cn bit t v cu trc lp v liposaccharide ca phy khun. Tuy nhin, mt s c im c th ca lp v phy khun cng c nghin cu. iu quan trng nht l s thay i cu trc lp v c th xy ra trong c iu kin in vitro ln in vivo. y c th l mt nguyn nhn dn n s bin i ca cc chng khng c c lc trong t nhin thnh chng c in c kh nng gy thnh dch v ngc li. Phn nhm V. cholerae O1 l cc vi khun gy dch t v V. cholerae khng phi nhm O1 / khng phi O139 ( gi tt V. cholerae non O1 / non O139) hay nhm N.A.G ( Non Aglutinable Vibrios ) cc phy khun khng ngng kt, gm cc vi khun c tnh cht sinh vt ho hc ging V. cholerae nhm O1, nhng khng ngng kt vi khng huyt thanh O1, nhm ny c th gy bnh nh khng thnh dch. c im ch yu ca nhng chng ny l khng sn xut c t t v khng lin quan ti dch tiu chy. Nhng chng ny c phn lp tnh c t nhng trng hp tiu chy do n tm cua hoc t nhng nhim trng ngoi rut khc nh: Vt thng, tai, m,
nc tiu, dch no tu. Phy khun thuc nhm ny c tm thy ca sng, cc nhim trng do cc chng ny thng bt ngun t ngoi cnh, V. cholerae O139 ( chng Bengal ) lc u, vi khun gy v dch ny lin quan ti vi khun t non-O1 v n khng ngng kt vi khng huyt thanh O1 nhng triu chng lm sng rt d di v ging t. Chng V. cholerae O139 c cho l chng lai ca chng V. cholerae O1 v chng non ( c tnh cht sinh vt ho hc ging V.cholerae nhm O1, nhng khng ngng kt vi khng huyt thanh O1). CcVibrio khc: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, cc Vibrio nhm F.V. parahaemolyticus c coi l mt trong nhng nguyn nhn quan trng gy ng c thc phm do n hi sn sng hoc cha c nu k vi cc triu chng vim rut v tiu chy cp tnh [5], [44]. 1.2.7. c t ca vi khun t V. cholerae sinh ra rt nhiu sn phm ngoi t bo. c im tiu chy mt nhiu nc l do c t rut gy ra c gi l c t t cholerae toxin (CT). Nhng nghin cu trn ngi tnh nguyn cho thy CT l nguyn nhn ch yu gy bnh t, tuy nhin cc chng t nu loi b gen m ho CT vn c th xy ra tiu chy nh hoc va nhiu c th. iu ny c th suy ra cn c nhng yu t no hay loi c t no khc ngoi CT. c t t c Robert Koch m t t nm 1884 khi ng cho l mt cht c c bit tc ng ln t bo biu m rut. Nm 1959 c hai nh khoa hc nghin cu c lp ti n l De v Dutta a canh khun t vo rut th v 10 nm sau Finkelstein v LoSpalluto tinh ch c c t ny cho php nhiu nh khoa hc nghin cu v lnh vc cu trc, th th bm v c ch tc dng ca CT [43]. Cu trc c t t bao gm hai tiu phn A v B, tiu phn B c tc dng bm dnh vo th th c hiu ca t bo biu m rut, tiu phn A c chc nng enzym c hiu c kh nng chui vo t bo ch. c t CT bao
gm 5 tiu phn B v mt tiu phn A, tiu phn B trng thnh c 103 acid amin v c trng lng phn t 11.5 KDa, tiu phn A c trng lng phn t 29 KDa gm 2 chui polypeptide (A1 c trng lng phn t 23.5.KDa v A2 c trng lng phn t 5.5 Kda), hai tiu phn ni vi nhau bng cu disulfit. Bn cht min dch hc ca c t t CT ging ht c t rut khng chu nhit ca E.coli sinh c t [5].
Hnh 1.1. Biu khu tr ca vi khun trong rut nonhttp://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/H%C3%ACnh:Vib.chor.in.rabit1.jpg (Phy khun t tip xc v gn vi cc t bo nim mc rut th qua th nghim quan st di knh hin vi in t). Khi theo nc ung hay thc n vo trong d dy, vi khun chu tc ng ca dch d dy c pH thp ( mi trng axit ). Nhng vi khun sng xt s tip tc xung rut non. rut non, vi khun c kh nng tn ti rt
tt. Phy khun c kh nng khng tc ng ca mui mt, xm nhp qua lp mng nhy trn nim mc rut. Qu trnh xm nhp c h tr bi men tan nhy v cc men phn ct protein thnh cc peptide. Do kh nng "t bi", vi khun c th chuyn ng ngc chiu vi nhu ng rut tip cn vi nim mc rut nh c im ho hng ng ca chng. Kh nng gn kt v c nh vo t bo nim mc c th c h tr bi cc "si lng" ca chng kt li thnh b mt u vi khun. Cc si ny c gi l toxin coregulated pili l cc si phi hp iu ho c t. Biu hin cc gene ca cc lng ny lin quan n gene quyt nh c t ca vi khun. Chng ta cha c hiu bit y v tc ng qua li gia cc toxin coregulated pili vi t bo vt ch. Cc th quan trn v mt t bo tip nhn cc si ny cng cha c xc nh. Chui amino acid ca coregulated pili tng t nh N-methylphenylalamine pili ca Pseudomonas v Neisseria. Men tan nhy ca phy khun gip chng phn gii cc protein nh fibronectin, lactoferrin v phn gii chnh c t ca n. Vai tr ca men trong c ch gy c vn cn l cu hi v t bin gene ca men ny vn khng lm gim c lc ca vi khun. C gi thuyt cho rng men tan nhy c tc dng gip vi khun tch khi t bo ch khng h tr qu trnh gn kt v vi khun c xu hng tch khi cc t bo trn tm n nhng t bo khc mi [26]. 1.2.8. Mt s phng php pht hin V. cholerae trong phng th nghim Phng php soi knh hin nn en; Phng php nui cy; K thut min dch hunh quang dng khng huyt thanh O1; Phn ng ng ngng kt dng khng th n dng khng khng nguyn O1; Phn ng ELISA dng ht nhim t tm CT; Kt chn on nhanh Cholera Screen; Chn on bng phng php sinh hc phn t ( PCR);
Phng php Real-time PCR.
CHNG II NGUYN LIU V PHNG PHP NGHIN CU

2.1. Thi gian v a im nghin cu ti c tin hnh t thng 3 nm 2008 n thng 9 nm 2009. Thu thp mu nghin cu t nhng bnh nhn mc bnh tiu chy cp nghi ng mc t ti cc khoa ly ca 6 bnh vin trn a bn tnh Thi Nguyn. Chn on xc nh V. cholerae ti phng th nghim vi sinh Trung tm Y t D phng Thi Nguyn. Thc hin k thut PCR ti phng vi khun ng rut Vin V sinh Dch t Trung ng. 2.2. Nguyn liu nghin cu Gm cc chng V. Cholerae phn lp c t bnh nhn trong qu trnh nghin cu. Bao gm cc dng c thng thng c s dng trong phng th nghim vi sinh v sinh hc phn t (n cn, tm bng, que cy, hp petri, pipette pasteur, ng nghim, pipette man, u col cc loi, ng eppendorf cc c, dung dch glycerin, nc mui sinh l, l ng mu 100ml v trng, gng tay cao su, khu trang, ti ninol cc loi, hp bo qun mu, phch lnh) 2.3. Ha cht thit b Cc loi ha cht s dng trong th nghim khi thc hin lun vn l cc sn phm ca cc cng ty ha cht c uy tn trn th gii v c tinh khit cao.
Bng 2. 1. Danh mc mt s dng c, ha cht s dng trong nghin cu
TT (1) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Tn ha cht, mi trng (2) Mi trng Carry-blair Mi trng TCBS Mi trng Thch kim pH 8,5-9,5 Kligler Iron Agar ( KIA) Mi trng mannit - di ng Mi trng Ure - Indol Mi trng basikow Thuc th Kovacs Khng huyt thanh a gi O1, O139 Khng huyt thanh n gi (Ogawa, Inaba) Thuc nhum Gram Knh hin vi My PCR My o pH B chy in di My chp nh gel My trn vortex My ly tm L vi sng My lc n nhit
Hng sn xut (3) Mecrk c Mecrk c Mecrk c Mecrk c Mecrk c Mecrk c Mecrk c Mecrk c Anh Anh Mecrk c c M Mettler Thy S c M Anh Anh Sanyo Anh
21 22 23 24 25
T lnh su Cn phn tch T cy v trng Ni kh trng T m 37oC
Sanyo Mettler Thy S Vit Nam M Memmect c
2.4. i tng v phng php nghin cu. 2.4.1. i tng nghin cu: Bnh nhn tiu chy cp nghi ng mc bnh t c h thng gim st bnh truyn nhim ghi nhn trc khi tin hnh ly mu. 2.4.2. C mu v cch chn mu Tnh c mu : p dng cng thc tnh c mu cho nghin cu m t p x (1-p) n = Z(1-/2) -------------d2 n: c mu = 0,05 ; tin cy 95% z1-/2 : h s tin cy. Vi tin cy l 95% th h s tin cy z(1-/2) = 1,96 p = 0,5 : T l bnh nhn b tiu chy cp phi nm vin (gi nh). d : sai s tuyt i chp nhn = 6 % = 0,06 Thay vo cng thc (1) c n = 266 C mu thu thp c l: 270 Chn mu c ch ch l nhng bnh nhn b bnh tiu chy cp c triu chng lm sng nghi mc bnh t.
X l s liu bng phn mm SPSS 12.0 vi cc test thng k thng dng trong y t, gm: tn xut, t l %, t sut chnh OR, so snh s khc nhau gia cc phng php bng test 2. 2.4.3. Phng php nghin cu - Phng php dch t hc m t ct ngang: Nhm nh gi tnh hnh dch t lin quan n yu t mc bnh ca bnh nhn, m t hin tng sc khe v cc yu t nguy c c lin quan n sc khe mt cch chnh xc tin hnh thu thp mu bnh phm, iu tra ct ngang s phn b tnh trng mc bnh ti thi im ang xy ra dch [37]. - Nghin cu thc nghim labo nh gi t l pht hin V.cholerae O1 ng thi phn tch nh gi hiu qu ca cc phng php nghin cu a ra tnh u vit, ph hp nhm p dng thc tin ti c s [37]. 2.4 3.1. Cc k thut ly mu v vn chuyn bnh phm * K thut ly mu Thu thp v vn chuyn bnh phm l mt bc quan trng trong qu trnh phn lp v pht hin cc vi khun gy bnh ng rut. Thu thp v vn chuyn bnh phm khng ng cch s nh hng n kt qu chn on tc nhn gy bnh v iu tr, mu bnh phm l phn hoc cht nn, thc n, cht cha trong rut non, rut gi sau khi m t thi, v ngi tip xc vi bnh nhn, mu c thu thp cng sm cng tt trc khi iu tr khng sinh. Mu bnh phm l phn phi c ly cng sm v vi khun trong phn rt nhiu trong nhng ngy u ca bnh v trc khi bt u iu tr khng sinh, sau khi ly cho vo l khng c cht kh khun hoc cht ty ra, nt l c y cht chng r r, c th ly phn bng ng thng trc trng hoc tm bng v trng, bnh phm cn c gi nhit 4 oC - 8oC v a ngay n phng xt nghim trong vng 2 gi, nu dch xa phng xt nghim, bnh phm cn ly bng tm bng v trng sau cho vo l c
cha mi trng vn chuyn Carry - Blair v a v phng xt nghim sm trong iu kin khng cn gi lnh [4], [20]. Mu thc phm cn m bo tnh i din, thu thp mu ti nhiu v tr trn thc phm, khi lng mi mu khong 25 gam, mu c chuyn v phng xt nghim sm. Mu nc thu thp c tnh i din cho khi nc cn kim nghim, chn nhiu v tr mu khc nhau, trnh gy tp nhim mu trong lc thu thp, ly nc vo bnh thu tinh v trng 500-1000ml, nu ly sng cn chn ni nc chy gia dng su 20-30 cm. Gim st ngi lnh mang trng trong mt v dch t, tt c nhng ngi tip xc gn gi vi bnh nhn t u c coi l c th mang mm bnh v v vy cn c theo di sc khe lin tc trong vng 5 ngy k t ln tip xc cui cng, kp thi pht hin ca bnh mi. Vi nhng ngi tip xc u v dch cn c ly phn xt nghim tm vi khun t. Nhng ngi tip xc gn v ngi lnh mang vi khun t (pht hin qua xt nghim phn) phi c iu tr d phng bng khng sinh. Mu bnh phm l huyt thanh c ly 2 ln trong giai on cp tnh v giai on hi phc. * Bo qun bnh phm Cn c gi vo mi trng bo qun v vn chuyn khi xa phng xt nghim v bnh phm khng c lm xt nghim sau 2 gi (tnh t khi thu thp mu). Mi trng vn chuyn Carry-Blair l mi trng tt nht bo qun v vn chuyn, c th dng dung dch m glyxerin, mi trng vn chuyn thu thp mu c chuyn sm ti phng xt nghim hoc gi t lnh 4oC ( nu cha c xt nghim ngay ). Trong v dch t nguy him mu bnh phm cn c lu gi trong hp st kn trnh ly lan trong qu trnh vn chuyn [34].
2.4.3.2. Cc phng php chn on V. cholerae S cc phng php chn on V. cholerae trong phng th nghim [13].
Bnh phm
370C/3-6 gi
Soi T-i
Pepton kim TCBS, Thch Kim

370C/3-6 gi
370C/3-6 gi
TCBS, Thch Kim
Pepton kim
370C/ 24 gi Oxidaza (+) KIA: Glucoza(+); Lactoza (-); Hi(-); H2S (-) Mannit (+); di ng (+) Urea (-); Indol (+) LDC: (+) Saccaroza: (+) Arabinoza:(-) Mannoza: (+)
Tnh cht sinh ho
Ng-ng kt khng huyt thanh
a gi O1 a gi O139
n gi Ogawa n gi Inaba
Hnh 2.1. S phn lp chn on V. cholerae
* K thut soi ti trc tip Ha mu phn vo nc mui sinh l, nh mt git ln lam knh, y la men, soi tiu bn trc tip bng knh hin vi ( Hnh 3.4 ) kt qu cho thy vi khun di ng rt nhanh theo nhng ng thng t u n cui vi trng, soi tiu bn trn knh hin vi nn en, phy khun di ng nh sao i ngi. Tin hnh soi ti trc tip mu phn v cht nn ca bnh nhn nhm pht hin vi khun di ng. Soi tiu bn trn knh hin vi nn en vi khun t c mt lng u nn kh nng di ng rt mnh nh sao i ngi. Trong qu trnh nghin cu chng ti thc hin cc bc nh sau: - Lam knh 1: Ho mu phn vo nc mui sinh l, nh 1 git ln lam knh, y phin knh mng (lamen) ln trn. Soi tiu bn trc tip trn kinh hin vi nu nghi ng V. cholerae vi khun di ng rt nhanh theo nhng ng thng t u n cui vi trng (tuy nhin c mt s vi khun ng rut khc cng di ng khi soi ti trn knh hin vi). - Lam knh 2: Nh mt git huyn dch phn ln lam knh, nh mt git khng huyt thanh t a gi. Phng php soi tiu bn trc tip trn knh hin vi nn en c s dng t lu, nhng khng c ph hp vi iu kin ca cc phng xt nghim tuyn huyn, trn knh hin vi nn en phy khun t di ng nh sao i ngi.
Lam knh
Lamen
Hnh 2.2. Hnh v lam knh v la men soi ti bng knh hin vi
Phng php soi ti trn knh hin vi nn en hoc phn pha dng pht hin tnh di ng ca V. cholerae, c bit khi phn ca bnh nhn cha >105 vi khun/gam phn. Hn na k thut ny cn dng kt hp khng huyt thanh V. cholerrae c ch s di ng trn nn khi soi v ch trong vng t 3 - 5 pht khong 50% vi khun V. cholerae b t li, v vy k thut ny c gi tr chn on nhanh trong vng c dch, nhy v c hiu ca k thut ny ty thuc vo kinh nghim ca k thut vin. * K thut nhum Gram K thut nhum Gram pht hin hnh th v tnh cht bt mu ca vi khun, vi thnh phn thuc nhum gm c tm gentian, dung dch lugol, Fucsin kim bng cch c nh tiu bn sau nh thuc nhum tm gentian ln trong 2 pht, ra nc, sau nh dung dch lugol ln trong 2 pht, ht i, ty mu bng cn 90o ti khi bc mu, ra nc, nh dung dch Fucsin kim ( pha long t l 1/10 ) ln trong 1/2 pht, ra nc, tiu bn kh trong khng kh hoc dng giy thm, soi tiu bn bng vt knh du. Nhn bit vi khun Gram m bt mu , c hnh th mnh, cong, hnh du phy, khng c v, khng sinh nha bo, khi nui cy lu ngy s c s thay i v hnh th so vi ban u. * Phng php dng kt nhanh Da trn nguyn l sc k min dch, mng nitrocellulose c gn vi khng th n dng c hiu vi V. cholerae O1 v O139 thnh hai bng ring bit, khi mu th i qua mng nitrocellulose, Colloidal Gold (cht keo vng) cp i vi khng th n dng, cp i ny gn vi khng nguyn ca mu th. Hn hp khng nguyn - khng th s thm qua mng nitrocellulose v gn vi khng th khng V. cholerae O1 v O139 v hnh thnh cc bng mu .
* K thut nui cy Chn lc nhng khun lc thun khit qua cc bc cy chuyn khc nhau do vy tnh cht mi trng nui cy phi c tnh chn lc c ch loi vi khun ny nhng li ph hp vi loi vi khun kia, phng php nui cy c coi l tiu chun vng tuy nhin vn c mt hn ch l thi gian tr li kt qu khng nh lu phi mt thi gian t 24 gi - 48 gi v khng pht hin c V. cholerae nu bnh nhn dng thuc khng sinh. * K thut PCR ( Polymerase Chain Reaction ) Dng pht hin gen ctx, k thut ny c nhy v c hiu cao hn cc k thut khc, ngoi ra p dng k thut PCR tm c t CT trong thc phm, PCR l mt k thut c s dng ph bin trong cng ngh sinh hc hin i v ng gp rt ln cho nhng tin b v sinh hc phn t, nh du mt bc tin v cng quan trng tng ng vi vic khm ph ra cc enzyme hn ch v k thut Southern blot. K thut PCR da trn c s phn ng m rng primer nh Taq polymerase khch i in vitro cc nucleic acid c trng. PCR cho php khch i theo hm m ln n hng triu ln cc on DNA c chiu di t 200 3000 bp. on DNA c khch i ( DNA ch ) c nhn din nh cp primer c trng thng c chiu di khong 20 nucleotide. Taq polymerase l mt loi enzyme chu nhit c dng tng hp cc on DNA mi trong mi trng c 4 loi deoxy nucleotide (dATP, dCTP, dGTP v dTTP) v hai primer, trn c s khun mu ca mt on DNA nht nh bit hoc cha bit trnh t. Cc on DNA mi hnh thnh li c s dng lm khun mu. Sau nhiu chu k, s lng on DNA ni trn c nhn ln gp nhiu ln, nh vy c th s lng tch ra, phn tch trnh t hoc to dng [21], [25]. 2.4.3.3. Tiu chun nh gi V. cholerae dng tnh trong nghin cu * Soi ti : Hnh th nh, di ng nhanh trn lam knh; * Nhum Gram: Gram m, hnh cong du phy;
* Nui cy: + Trn mi trng pepton kim mn, mc c 3-6 h, c vng ni mt mi trng; + Trn mi trng thch kim khun lc nh, trong, trn, b u, vi khun mc sau 6-24 gi; + Trn mi trng thchTCBS nu nghi ng V. cholerae khun lc mu vng, nh, trong, thi gian mc khun lc 12 24 gi; + Phn ng Oxidaza : Dng tnh khi chuyn mu xanh tm; + Sinh vt ho hc: Ln men ng Mannoza, Sacaroza, Arabinoza; + Ngng kt KHT a gi v n gi; * Test nhanh : Xut hin 2 vch l vch chng v vch mu th; * Phng php PCR dng tnh.
CHNG III
KT QU V BN LUN
3.1. c im chung ca i tng nghin cu 3.1.1. Phn b i tng nghin cu theo gii, tui Gii tnh v la tui l mt trong nhng c im c chng ti quan tm kt hp vi yu t dch t khi tin hnh ly mu xem kh nng b mc bnh t gii no hoc tui bao nhiu. Nn trong qu trnh tin hnh thu thp mu bnh phm trn bnh nhn, chng ti thu thp c mt s thng tin v s phn b theo gii tnh v nhm tui nh sau: Bng 3.1. Phn b i tng nghin cu theo gii, tui
Gii N Nam Tng
n 164 106 270
X SD 34,214,5 31,815,5 33,314,9
Trung v 34(24-45) 34(17-44) 34(21-45)
min - max 8 - 67 P> 0,05 5 - 68 5 - 68
Bng phn b i tng nghin cu ( Bng 3.1; bng 3.2; biu 3.1) cho thy nhm tui thp nht i vi n l 8 v i vi nam l 5; tui cao nht i vi n l 67 i vi nam l 68. Kt qu cho thy s khc bit v tui gia cc bnh nhn nam v n khng c ngha thng k ( P > 0,05 )
S mu thu thp tnh theo tui

95 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 5-10 Tui > 50 Tui 11-20 Tui 41 - 50 Tui 31-40 Tui 21-30 Tui 10 18 22 46 79
Biu 3.1. nh gi tui trong thu thp mu Nghin cu ca Nguyn ng Hin v cng s (2008 ) cho kt qu trong tng s 1.808 tr em nhp vin do tiu chy c ti 1.018 tr tiu chy cp do virut Rota v hu ht cc trng hp ny thng xut hin ch yu trong 3 nm u khi tr mi sinh [12]. Trong nghin cu chng ti khng nh gi tc nhn do virut Rota, ch tham kho qua iu tr ca thy thuc, ch yu da vo cc biu hin lm sng loi b nguyn nhn gy tiu chy do vi rt nn la tui 5-10 thu thp c 10 bnh nhn chim t l 3,6 % , La tui ny c t l nghi mc t thp cng ph hp vi cc nghin cu khc v s bin ng ca la tui ny khng ln mi sinh hot ph thuc gia nh, nu c thi gian chng ti nh gi thm tc nhn do virut Rota la tui mi sinh n 10 tui th ngha nghin cu s m rng hn. Nghin cu ca M.Ehara v cng s (2004) cho rng nguy c mc bnh t ca tr em di 15 tui thng tng vo u v dch [55]. Nghin cu ca Thm Ch Mc (1994) cho kt qu ngc li cho rng nhm tui ny li tng vo cui v dch [28]. Tuy nhin cc kt qu trn cng ch dng li nh gi mt v dch nhng cng c th l nhng gi m cho cc nghin cu tip theo trong chng trnh phng chng cc bnh tiu chy nhm tui ny.
Bng 3.2. T l bnh nhn theo tui Tui 5 -10 11-20 21 -30 31-40 41-50 >50 Tng cng S mu 10 22 95 79 46 18 270 T l (%) 3,60 8,15 35,17 29,15 17,36 6,57 100
La tui t 21- 30 thu thp c 95 mu chim t l 35,17 % la tui 31- 40 thu thp c 79 bnh nhn chim t l 29,15 % sau n la tui 41 50 chim t l 17,36 % ( Bng 3.2 ). y l nhng la tui lao ng quan trng trong x hi v c t l mc t cao nht so vi cc la tui khc, la tui ny c nhiu mi lin quan v yu t dch t nh i hc, i cng tc, i lmv iu c bit sinh hot n ung qun cm bnh dn nn yu t v sinh khng m bo. Nghin cu Thm Ch Mc (1996) nh gi vai tr ca thc phm v v sinh ca ngi phc v kt qu l 28,7 % s mu thc phm khng t tiu chun v sinh v 20 % mu bn tay nhn vin khng t tiu chun [27]. Phan o v cng s cho rng trong thi gian nh ca v dch t l phn lp c vi khun t cao trn 50% [9]. Vi nghin cu ca chng ti t l phn lp dng tnh vi khun t l 5,93 %. Qua iu tra yu t dch t ca cc bnh nhn trc khi vo vin c 11 bnh nhn mc bnh t c ngun ly nhim mm bnh t H Ni chim t l 68,75 %. Phi chng ti tnh Thi Nguyn cha n im nh ca v dch m t l mc bnh do yu t bn ngoi a n sau c pht hin.
Phn b nhm i tng theo gii tnh
Nam
39.30%
60.70%
Biu 3.2. Phn b i tng nghin cu theo gii tnh Nhn chung bnh t khng phn bit theo gii tnh, mi ngi u c th mc bnh. Nghin cu ca V Minh Hng v cng s (1994 ) cho bit t l dng tnh n l 57,88 % v nam gii l 42,12 % [16]. Theo nghin cu ca Dalsgaard A v cng s (1997) Peru xy ra v dch t tc nhn do V. cholerae O1 c 230 ngi mc tiu chy cp trong t l n mc bnh l 59,24 % v nam gii mc bnh l 40,76 % [54]. Kt qu ( Biu 3.2) cho thy t l n mc tiu chy cp l 60,7 % v nam 39,3 % cng ph hp vi nhn xt ca cc tc gi trn ( Biu 3.2 ).
Bng 3.3. Phn b bnh nhn dng tnh V. cholerae theo gii tnh Gii tnh Nam N Tng Mc t 9 7 16 T l % 56,25 43,75 100
Phn b bnh nhn dng tnh V. cholerae theo gii tnh cho kt qu 9 bnh nhn nam mc chim t l 56,25 % trong khi n c 7 bnh nhn chim t l 43,75 % ( Bng 3.3 ) Tt c cc la tui u c th mc t, nhng c tc gi cho rng la tui tr v tui cao trn 50 tui c t l mc cao [18], [45], nghin cu ca CDC (2004) nhn xt khi khng kim sot yu t dch t dch s lan rng trong cng ng lc la tui t 26-50 t l mc s thp hn so vi la tui t 1-18 tui hoc tui trn 50 [49], phi chng sc khng ca tr em v ngi cao tui yu nn t l mc bnh cao. Hin nay cha c nghin cu no a ra mt thang tui nht nh c tnh cht mu v cc trng hp mc t. Nhn xt ca chng ti cng ph hp vi nhn xt nghin cu ca Thm Ch Mc v nh gi c im dch t hc bnh t qua cc v dch Nam H t l nam gii chim t l 54,38 % [27]. 3.1.2. Phn b ly mu bnh nhn theo a im ly mu Cc mu trong nghin cu c thu thp l ly mu phn ca nhng bnh nhn n iu tr ti 6 khoa ly ca bnh vin trn a bn tnh vi tiu chun la chn l nhng bnh nhn mc bnh tiu chy cp, vi cc triu chng lm sng in hnh nghi mc t, khng st. Kt qu c trnh by ti ( Bng 3.4 )
Bng 3.4. T l thu thp mu cc a im nghin cu
M ha BV1
a im ly mu
T l (%)
Bnh vin a khoa Trung ng Thi Nguyn
45,19
BV2 BV3 BV4 BV5 BV6
Bnh vin a khoa huyn ng H Bnh vin C Bnh vin A Bnh vin a khoa huyn i T Bnh vin a khoa huyn nh Ha Tng:
14,07 12,59 10,74 8,89 8,52 100
Trn 6 bnh vin ly mu cho thy: BV1 l bnh vin trc thuc Trung ng nm trung tm tnh Thi Nguyn, Thnh ph Thi Nguyn c din tch 177 km2, dn s 294.759 ngi vi mt trng i hc Thi Nguyn gm 6 trng i hc thnh vin v hn 20 trng trung cp, cao ng, s ging bnh trn 500 ging do vy s bnh nhn nhn nghi mc t cng chim t l cao. Trong nghin cu ca chng ti cho thy s bnh nhn mc bnh tiu chy cp nghi t BV1 chim t l cao nht 45,19 %. Ngc li BV6 l huyn nh Ha s mc tiu chy cp nghi t chim t l thp 8,52 % iu ny cng ph hp vi tnh hnh mc chung v huyn nh Ha cch trung tm
tnh Thi Nguyn 50 km, c din tch rng 520,75 km2 vi dn s 90.000 ngi, s ging bnh trn 200, phi chng vi din tch rng mt dn c tha yu t dch t khng nhiu nn kh nng ly nhim cng gim.
Phn b i tng nghin cu theo a im ly mu

140 120 100 80 122
S lung
60 40 20 0 BV1
38
34 29 24 23
BV2
BV3
BV4
BV5
BV6
Khu vc nghin cu
Biu 3.3. S mu thu thp ti 6 bnh vin trong qu trnh nghin cu Kt qu (Biu 3.3 ) cho thy ti BV1 thu thp c mu ca 122 bnh nhn, cc bnh vin cn li thu thp c t 23 38 bnh nhn. 3.2. nh gi phng php nghin cu pht hin V. cholerae 3.2.1. Nhn bit vi khun di ng bng k thut soi ti y l tiu ch nh gi cc phng php trong qu trnh nghin cu, vic pht hin vi khun t di ng trn knh hin vi nn en c p dng t lu, tuy nhin nhiu phng th nghim khng c knh hin vi nn en thc hin phng php ny. Vi l do chng ti trc tip soi ti tm vi khun trn knh hin vi thng xem tnh cht di ng. Bng 3.5. T l vi khun di ng quan st trn lam knh
Soi ti Di ng Khng di ng Tng
n 28 242 270
% 10,37 89,63 100
Vi khun di ng quan st c trn lam knh khi soi trn knh hin vi, y l k thut thc hin u tin trong qu trnh phn tch, c ngha nh gi nh hng ban u. K thut ny tuy n gin nhng i hi k thut vin c kinh nghim cng nh k nng thc hnh. Nghin cu ca chng ti khi quan st soi knh cho thy vi khun di ng ( Hnh 3.4 ) l 28 mu trn 270 mu thu thp chim t l 10,37% ( Bng 3.5 ). Nh vy nu thc hin tt k thut soi ti mu ngay ti c s s gip cho thy thuc c hng iu tr. Thc hin mt k thut n gin kt hp vi tp hun k thut hng nm chng ti ngh rng cc k thut vin s thc hin tt k thut soi ti.
Hnh 3.4. Hnh th V. cholerae soi ti 3.2.2. Nhn bit hnh th v tnh cht bt mu ca vi khun bng k thut nhum Gram
Hnh 3.5. Hnh th vi khun V. cholerae nhum Gram Bng 3.6. T l vi khun Gram m quan st di knh hin vi
Nhum Gram Gram m Gram dng Tng
n 45 225 270
T l % 16,66 94,44 100
Kt qu nghin cu ca chng ti cho thy 45 mu bt mu Gram m chim t l 16,66% ( Bng 3.6 ), k thut nhum cho kt qu nhanh, n gin, thc t gp phn ng k trong vic pht hin nhanh vi khun t ngay ti c s. K thut nhum soi l nhn bit Gram m nhng kt hp nhn bit hnh th l mnh cong, khng c v, iu c bit d nhn bit l c hnh du phy th kh nng pht hin s cao hn, k thut nhum soi c dng sng lc c hng iu tr kp thi sau vn phi chn on khng nh bng phng php nui cy.
3.2.3. Pht hin V. cholerae bng k thut nui cy Qu trnh nhn bit khun lc v xc nh r vi khun trong qu trnh nui cy l rt cn thit, kt qu nghin cu th hin ( Bng 3.7 ) Bng 3.7. Phn nh gi chung trong vic xc nh cc vi khun Nui cy S mu (+) / 270 mu 16 47 4 T l (%) 5,92 17,40 1,49
Cc loi vi sinh vt V. cholerae O1 E. coli N.A.G
Nghin cu ca tc gi inh S Hin v cng s ti 25 x ca huyn T Lim, H Ni vi 2.601 mu trong 5 nm cho thy t l dng tnh ca cc loi vi khun gy tiu chy l 11,54% [11]. Phi chng V. cholerae xut hin khi cc cn nguyn khc pht trin hay V. cholerae l yu t mi t xut hin cc cn nguyn khc. Nghin cu ca L Lan Hng v cng s (1995) nghin cu trn 121 mu phn bnh nhn c 32 mu dng tnh vi mt s vi khun gy tiu chy (V.cholerae O1 , Shigella, Salmonella, E. coli ) chim t l 26,45 % [15], kt qu kho st ca Nguyn Th Th Trm v cng s (1985) ti phng Vnh Phc, Nha Trang cho thy t l dng tnh i vi cc vi khun gy bnh tiu chy l 11,34% [42]. Cn ti cc bnh vin c dch khu vc 5 tnh Duyn Hi min Trung qua kt qu nghin cu ca Nguyn Th Th Trm, Nguyn Th K vi 5.171 mu thu thp cho thy t l dng tnh vi 4 tc nhn gy bnh l 24,34% (V. cholerae O1, Shigella, Salmonella, Echerichia coli ) [42].
nh gi nghin cu ca chng ti v phn lp cc loi vi khun trong qu trnh nui cy mu phn bnh nhn tiu chy cp nghi mc t trn 270 mu bnh phm cho thy i vi chng V. cholerae O1 c 16 mu dng tnh, vi vi khun E. coli c 47 mu dng tnh, cc phy khun khng phi vi khun t (N.A.G) c 4 mu, trong nghin cu chng ti cc vi khun gy tiu chy c t l pht hin dng tnh tng ng vi cc cng b ca cc tc gi khc. Ngoi ra c mt s loa vi khun khc nhng v iu kin v thi gian ngn nn chng ti cha nh gi ht c. Bng 3.8. T l V. cholerae O1 dng tnh bng k thut nui cy
Kt qu m tnh Dng tnh Tng
Nui cy 254 16 270
T l % 94,07 5,93 100
T l V. cholerae O1 pht hin bng k thut nui cy cho kt qu 16 mu dng tnh trn 270 mu chim t l 5,93% ( Bng 3.8; biu 3.6 ), k thut ny cho kt qu rt chnh xc nhng phi qua nhiu bc khc nhau, c bit phi c phng xt nghim vi sinh hp l ng tiu chun, mi trng nui cy, cn b xt nghim phi c kinh nghim phn on c cc hng cy chuyn cn thit tip theo, khu cui cng ca k thut l khng nh bng ngng kt khng huyt thanh a gi, n gi trc khi kt lun.
T l pht hin dng tnh V.cholerae O1bng k thut nui cy 5.93%
m tnh Dng tnh
94.07%
Biu 3.6. T l dng tnh V. cholerae bng k thut nui cy Phng php nui cy c coi l " tiu chun vng tuy nhin vn cn mt hn ch l thi gian tr li kt qu khng nh lu phi mt thi gian t 24 gi - 48 gi v khng pht hin c V. cholerae khi bnh nhn dng khng sinh. K thut nui cy chn lc c khun lc thun khit v c hiu ngoi kinh nghim ca cn b xt nghim th yu t mi trng nui cy ng vai tr rt quan trng, mi trng phi m bo cht lng. Trn mi trng thch kim rt tt cho s pht trin ca V. cholerae nhng ngc li cc loi vi khun khc li khng ph hp do vy tnh cht mi trng nui cy phi c tnh chn lc c ch loi vi khun ny nhng li tt vi loi vi khun khc. Mi trng thch TCBS ( Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose) l mi trng chn lc tt nht phn lp V. cholerae v c dng rng ri trn th trng, mi trng c thng mi ho ng kh nn d pha ch, mi trng c mu xanh sau khi pha ch nhng ch lu gi c mt thi gian ngn (3 - 5 ngy ) nhng khun lc mc trn mi trng ny khng thch hp cho phn ng ngng kt vi phn ng khng huyt thanh, khun lc nghi ng mc sau 12 gi c khun lc trn, hi dt, bng, mu vng do ln men ng
saccharose, nhng vi khun khng ln men saccharose c khun lc mu xanh l c th l V. parahaemolyticus, khun lc nghi ng l V. cholerae cn phi cy trn cc mi trng t cht c ch nh thch thng, mi trng KIA. Chn nhng khun lc nghi ng V. cholerae trn mi trng TCBS xc nh cc tnh cht sinh ho, cc tnh cht sinh ho rt quan trng pht hin v phn bit V. cholerae. Bng 3.9. Nhn xt tnh cht khun lc trn mi trng TCBS Kch thc khun lc nh 2-3 mm nh 1-3 mm Mu sc khun lc vng, bng khng mu
n 67 203
T l % 24,81 75,19
Nghin cu ca chng ti cho kt qu 67 mu c khun lc mu vng trn mi trng TCBS chim t l 24,81 % ( Bng 3.9 ). Mi trng TCBS ( Hnh 3.7 ) l mi trng chn lc rt tt trong vic phn lp V. cholerae tuy nhin khun lc ny khng trc tip thc hin phn ng Oxidase tip theo.
Hnh 3.7. Hnh nh khun lc V. parahemoliticus v V. cholerae O1
Hnh 3.8. Khun lc V. cholerae trn mi trng thch kim
* Nhn xt tnh cht khun lc trn mi trng thch kim: L mi trng thch thng nhng c pH kim ( pH = 9 ) thch hp cho V. cholerae pht trin, khun lc V. cholerae nh, trn, trong, long lanh nh ht sng, c th dng khun lc ny ngng kt phn ng Oxidase.
Bng 3.10. Nhn xt tnh cht khun lc trn mi trng thch kim Kch thc Mu sc khun T l
khun lc nh 1-3 mm
lc Nh, trong, khng mu. 62
% 22,96
nh 1-3 mm
c, hoc c cc mu khc nhau
218
80,74
Tnh cht khun lc trn mi trng thch kim ( Hnh 3.8 ) cho thy mi trng thch kim thch hp cho V. cholerae O1 pht trin, khun lc nh, trn, trong, long lanh nh ht sng, c th dng khun lc ny ngng kt phn ng Oxidase nn khi tin hnh nghin cu chng ti cy c 2 loi mi trng kt hp l TCBS v thch kim v lun u tin cy trn thch kim nhiu hn v mi trng ny V. cholerae O1 mc nhanh hn t 6-24h mc khun lc v khun lc ny c dng thc hin phn ng Oxidase v cc bc tip theo. Trong khi trn mi trng TCBS thi gian mc khun lc mun hn so khun lc mc trn mi trng thch kim, nhng khi mc b sung cho nhau v u im ca mi loi mi trng, trong kt qu nghin cu ca chng ti cho 62 mu quan st khun lc nh trong khng mu chim t l 22,96 % ( Bng 3.10 )
* Thi gian mc khun lc trn 2 loi mi trng nui cy Thi gian mc khun lc ng vai tr quan trng trong nui cy chn on nhanh V. cholerae O1. Nh cp trong phn tng quan, nu c iu kin nn cy trn c 2 loi mi trng l TCBS v thch kim, c bit trn
mi trng thch kim sau 6 gi khun lc mc s c dng trong phn ng Oxidase v ngng kt khng huyt thanh. Bng 3.11. Thi gian mc khun lc trn 2 loi mi trng nui cy
Mi trng
Thi gian mc khun lc
T l %
Mi trng TCBS Mi trng thch kim
< 6h < 6h
0/270 21/270
0 7,78
Theo di thi gian mc khun lc trn mi trng TCBS v mi trng thch kim chng ti nhn thy trn mi trng thch kim khun lc mc 6 gi sau khi cy c 21 mu mc chim t l 7,78 % trong khi trn mi trng TCBS cha c khun lc no mc ( Bng 3.11 ). Trong phn phng php nghin cu chng ti cp vi thi gian mc khun lc trn 2 mi trng khng ging nhau nhng c ngha rt quan trng cho vic khng nh tnh cht sinh ha sau ny. Khun lc nghi ng l V. cholerae c nh hng da vo tnh cht sinh vt ha hc phn bit c cc vi khun thuc nhm vi khun ng rut bng cch chn nhng khun lc nghi ng V. cholerae trn mi trng TCBS xc nh cc tnh cht sinh ho. Cc tnh cht sinh ho rt quan trng pht hin v phn bit cc loi V. cholerae, nh gi tnh cht sinh vt ha hc chng ti chn 31 mu c phn ng Oxidase dng tnh thc hin nui cy tip trn mi trng sinh vt ha hc.
Hnh 3.9. Cc mi trng sinh vt ha hc trong chn on V. cholerae Bng 3.12. Bng c kt qu trn mi trng sinh vt ho hc STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Sinh vt ha hc Oxidaza Glucoza / H2S Lactoza Manit Di ng ur Indol Arabinoza Mannoza Saccaroza Tiu chun nh gi dng tnh + +/+ + + + + + Kt qu 31 24 / 23 21 27 23 22 21 21 20 21
Kt qu thc hin trn mi trng sinh vt ha hc vi 24 mu glucoza dng tnh, 21 mu m tnh ng lactoza, trn mi trng ma nit c 27 mu dng tnh v 23 mu quan st ng cy thy di ng, mi trng Indol c 2 mu dng tnh, c bit trong 3 loi ng th Arabinoza c 21 mu m tnh, mannoza c 20 mu dng tnh, saccaroza c 20 mu dng tnh (Bng 3.12 ) Tnh cht sinh vt ha hc c th phn bit c cc vi khun thuc nhm vi khun ng rut, tuy nhin rt ngn qu trnh chn on ta cn
dng mt s c im chnh phn bit (loi tr ngay cc vi khun m tnh vi oxidase ). * Nhn bit phn ng dng tnh Oxidase Khun lc trn mi trng khng chn lc c dng thc hin phn ng Oxidase, y l phn ng rt quan trng phn bit V. cholerae vi cc vi khun ng rut khc, V. cholerae c phn ng oxidase (+). Cch tin hnh n gin khi c khun lc mc trn mi trng thch kim bng cch nh mt git dung dch Oxidase ln mnh giy lc, dng que cy ly khun lc t ng thch nghing dn u trn giy lc thm thuc th, quan st s i mu trong vi pht, c th coi phn ng Oxidase nh cha kha chn on vi khun t v nu m tnh th s loi tm theo hng khc, nu phn ng dng tnh s thc hin cc bc chn on vi khun t. rt ngn qu trnh chn on chng ti thc hin mt s c im chnh phn bit bng th phn ng Oxidase bng cch nh mt git dung dch Oxidase ln mnh giy lc, dng que cy ly khun lc t ng thch nghing dn u trn giy lc thm thuc th, quan st s i mu trong vi pht kt qu th hin ( Hnh 3.10 )
Bng 3.13. Phn ng Oxidase Kt qu Dng tnh Oxidase 31 T l % 11,48
m tnh Tng cng
239 270
88,52 100
V. cholerae c phn ng Oxidase (+), khng nn ly khun lc trc tip t mi trng TCBS lm phn ng Oxydase t c th cho kt qu khng chnh xc m nn cy chuyn khun lc nghi ng t mi trng TCBS sang mi trng khng chn lc nh thch thng hoc thch mu ri t tip tc lm phn ng Oxidase. Kt qu nghin cu chng ti cho thy c 31 mu dng tnh vi phn ng Oxidase chim t l 11,48 % ( Bng 3.13), nu so k thut soi ti pht hin mu nghi ng dng tnh V. cholerae O1 l 28 mu chim t l 10,37 %. Vn t ra trong thc t nu cc phng th nghim cha hon chnh thc hin cc bc nui cy th c th p dng cy bnh phm t mi trng tng sinh vo mi trng thch kim sau 6 gi ta c th chn khun lc thc hin phn ng Oxidase.
Hnh 3.10. Hnh nh phn ng Oxidase * Nhn bit vi khun mc trn mi trng pepton kim Mi trng pepton kim c dng vn chuyn V. cholerae trong mt thi gian ngn nu khng c mi trng Carry Blair. Khng th dng c lu nu vic vn chuyn chm qu 6 gi v cc vi khun khc nh Pseudomonas s mc ln t V. cholerae. Pepton kim mn l mi trng tng
sinh nn c cy chuyn lin tip 3 ln, mi ln 3 gi nhit 370C. y l mi trng tng sinh tt nht cho s pht trin V. cholerae, v vi khun ny mc rt nhanh trong pepton kim do pH ca n rt thch hp (pH 8,4-9,2). Khi xt nghim mu thc phm hoc mu nc tm V. cholerae trong v dch t ngi ta thng dng hai bc tng sinh bng pepton kim, bc tng sinh th hai nhm loi bt cc tp khun, hn na ngi ta cn dng mi trng Monsur tellurit-taurocholat tng sinh v mi trng ny c nhiu cht c ch hn. Theo di tnh cht mc ca V. cholerae trn mi trng pepton kim (mi trng tng sinh) chng ti c mt s nhn xt v tnh cht mc vng ca V. cholerae trn mi trng pepton kim mn l mi trng tng sinh c ngha quan trng trong cc bc ca qu trnh nui cy v nu trong mu bnh phm c t vi khun t nh mt s mu thc phm th vic cy mi trng tng sinh cng ng vai tr quyt nh nu khng s khng bao gi phn lp c vi khun t trong nc, thc phm, l mi trng c kim cao pH = 8,5 v lng mui mn n 30g trn mt lt mi trng, nn khi cy 2-3 gi u cc vi khun khc b c ch cha mc c th vi khun t mc ln t, do vy nui cy trn mi trng ny c ngha lm tng sinh lng vi khun ln nhiu mt khc lm thun khit ng nht khun lc. Nu b nhim khun trong qu trnh ly mu hoc nui cy b nhim cng nh bnh nhn iu tr bng khng sinh phi sau 3 ln cy chuyn mi ln 3 gi lc mi c th phn lp c vi khun t. Trong nhiu mu phn c mt vi khun cao ( 107-108/ml phn ) vic tng sinh l khng cn thit. Canh thang giu dinh dng thng c s dng phc hi vi khun, nc pepton kim thng c s dng nht, pH ca canh thang t 8,4 - 9,2 thun li cho vi khun pht trin. V. cholerae l vi khun hiu kh, nhit thch hp l 37oC, pht trin tt trong mi trng kim c pH 8,5 - 9,5 v nng mui n 15%.
Bng 3.14. c im nui cy trn mi trng pepton kim
Mi trng tng sinh Pepton 1 Pepton 2 Pepton 3 Tng cng
Mi trng thch kim 1 8 0 0
Mi trng
Mi trng
thch kim 2 thch kim 3
Kt lun 8
6 0 2
6 2 16
Kt qu nghin cu chng ti nhn thy nu bnh nhn no mi vo vin cha iu tr khng sinh th vic nui cy phn lp rt d v tr li kt qu nhanh hn nhiu so vi cc bnh nhn iu tr thuc khng sinh. Qua theo di phiu iu tra v kt qu phn lp trn mi trng pepton kim mn chng ti c mt s nhn xt ( Bng 3.14) vi 8 bnh nhn khi vo vin c ly bnh phm ngay trc khi iu tr bng khng sinh th nhn thy trn mi trng peptone cy ln th nht xut hin vng nghi t hi xm, mng, lc kh tan, sau 4 gi xen ln vi vng ca tp khun, sau 8 gi bng cc phng php khc nhau chng ti tr li dng tnh vi V. cholerae. ng thi c 6 bnh nhn phn lp c vi khun t phi sau 2 ln cy tng sinh v 2 bnh nhn phi sau 3 ln cy tng sinh nh vy mi phn lp c iu hon ton ging cc nghin cu khc v bnh nhn iu tr bng khng sinh nn t l vi khun t do vy kh phn lp hn. Nu ly bnh phm sau 2 ngy s dng khng sinh th kh nng pht hin mm bnh l rt kh. Mt s nhn xt ca Thm Ch Mc, Phm Trng Nm nhn xt v khun lc trn mi trng c v vng ca V. cholerae mc trn mi trng lng s dn ti s nhanh chng chnh xc trong khu tr kt qu. Trong c
a ra trn nhng bnh nhn c bnh cnh lm sng in hnh khng phi cy chuyn giai on 2. Nhng bnh nhn dng khng sinh v ngi lnh trong dch mang vi khun th phi tng sinh n giai on 3 hoc 4 mi pht hin c. Trong qu trnh nui cy nu kt hp quan st vng ca vi khun v khun lc nghi ng trn thch kim th t l pht hin dng tnh rt cao. tuyn huyn ch cn mi trng pepton kim qua cy truyn nhiu ln theo di vng ca vi khun t, ly vng nghi ng lm phn ng ngng kt s b nu ngng kt gi ln tuyn trn xc nh ng thi c bin php chng dch ngay [29]. * Phn bit vi khun t vi cc phy khun khc thuc nhm N.A.G trn 3 loi ng Mannoza, Sacaroza, Arabinoza Th nghim kh nng ln men ng bng cch dng que cy ly khun lc nghi ng V. cholerae cy vo ng mi trng basicop, sau nhit 37oC/ 18-24 gi . i vi V. cholerae th nghim kh nng ln men ca 3 loi ng (saccaroza 30%, mannoza 10%, arabinoza 30%), vi khun ln men ng s lm axt ho mi trng v mi trng chuyn t xanh l cy sang vng. Do vy khi tin hnh c kt qu mi trng chuyn sang mu vng l dng tnh v gi nguyn mu mi trng xanh l cy l m tnh.
Bng 3.15. Phn bit vi khun t vi cc phy khun khc thuc nhm N.A.G trn 3 loi ng Mannoza, Sacaroza, Arabinoza
Nhm I II
Mannoza + -
Sacaroza + +
Arabinoza -
Tng s 16 0
III IV V VI
+ + -
+ + -
+ + -
2 2 0 0
Kt qu phn bit vi khun t vi cc phy khun khc thuc 6 nhm N.A.G trn 3 loi ng vi mc ch phn bit tnh cht ln men trn 3 loi ng Mannoza, Sacaroza, Arabinoza nhm phn bit cc phy khun thuc nhm N.A.G. Vi khun t thuc nhm I, t nhm II n nhm VI thuc cc phy khun nhm N.A.G. C 16 mu dng tnh nhm I, trong 2 mu dng tnh nhm III v 2 mu dng tnh nhm IV ( Bng 3.15). * Kt qu phn ng khng huyt thanh Kt qu nghi ng trn mi trng sinh vt ha hc v kh nng ln men 3 loi ng l 20 mu do vy t khun lc trn mi trng thch kim chng ti thc hin bc nh danh cui cng v quan trng l ngng kt khng huyt thanh a gi v n gi nh sau:
Bng 3.16. Kt qu ngng kt khng huyt thanh a gi v n gi Khng huyt thanh n gi Ogawa 0 Inaba 0
Khng Kt qu huyt thanh a gi m tnh 4
Dng tnh Tng
16 20
16 16
0 0
Phn ng ngng kt trn phin knh xc nh s b l V. cholerae hay khng m khng phi lm th nghim no thm. Tuy nhin vic sng lc bng th nghim sinh ha rt c li trc khi th nghim vi khng huyt thanh. Kt qu nhn c t 2-3 pht sau khi trn khun lc vi khng huyt thanh a gi nu dng tnh cc ht ngng kt s ni ln trn nn nc trong, nu m tnh khng thy ht ni v nc s c. Sau khi ngng kt vi khng huyt thanh a gi chng ti tip tc thc hin vi 2 loi khng huyt thanh n gi l Ogawa v Inaba. Phn ng ngng kt khng huyt thanh l bc nh danh cui cng v quan trng nht l ngng kt vi khng huyt thanh c hiu sau khi s b bng cc tnh cht sinh vt ha hc. ( Bng 3.16) cho thy 16 mu dng tnh vi khng huyt thanh a gi sau ngng kt tip vi khng huyt thanh n gi cho kt qu 16 mu dng tnh Ogawa. 3.2.4. Nhn bit V. cholerae O1 bng phng php test nhanh Chn on nhanh chnh xc bnh t l bc rt quan trng bc u c hng iu tr bnh nhn nhanh chng hiu qu v bin php dch t hp l nhm khng ch bnh t. Kit Crystal VC xc nh khng nguyn lipopolysaccharid (LPS) ca c hai nhm huyt thanh V. cholerae O1 v O139, s dng d dng khng i hi trang thit b phc tp, c kt qu nhanh sau 10 pht, nhy ca kt theo cng b ca nh sn xut l 94% i vi kh nng pht hin ra V. cholerae O1 v 99% i vi kh nng pht hin ra V. cholerae O139. c hiu 84% vi V. cholerae O1 v 96 % vi O139
[23], rt c ngha cho nhng phng xt nghim tuyn huyn, c bit trong thi gian u ca v dch. Vi nguyn l Kit Crystal VC l th nghim nh tnh, da trn nguyn tc min dch sc k k thut rt n gin, cho kt qu nhanh, d c kt qu bng mt thng, thi gian 15-20 pht quan st vch chng dng xut hin mu , nu dng tnh mu th xut hin thm vch th hai ( Hnh 3.11).
* Phn ng m tnh(-): Xut hin mt vch kim chng mu
* Phn ng dng tnh(+): Xut hin 2 vch mu
Hnh 3.11. Hnh nh test nhanh Crystal VC
Bng 3.17. Pht hin V. cholerae bng k thut test nhanh
Kt qu Dng tnh m tnh
Test nhanh 17 253
T l % 6,29 93,71
Tng
270
100
Nghin cu ca chng ti ( Bng 3.17 ) nhn thy trong 270 mu thu thp c 17 mu dng tnh bng test nhanh chim t l 6,29%, kt qu ny ph hp vi cc nghin cu khc v cng ph hp vi nhy ca kt nh cng b. Nguyn Bnh Minh v cng s nh gi kt chn on nhanh V. cholerae cho thy tng s 65 mu thu thp t bnh nhn tiu chy ca Vin Y hc lm sng cc bnh nhit i Quc gia v Bnh vin Bch Mai H Ni so snh gia 2 phng php test nhanh v nui cy cho thy 15 mu dng tnh c hai phng php, 43 mu m tnh, c 6 mu kt qu dng tnh bng phng php nui cy nhng li m tnh vi test nhanh. Do vy test nhanh tuy pht hin nhanh nhng vn cn t l nh m tnh gi nn khng th thay th phng php nui cy xc nh tp huyt thanh [23]. Vic p dng test nhanh c ngha quan trng trong vic chn on nhanh V. cholerae s dng tng i n gin, khng i hi trang thit b phc tp, c kt qu nhanh sau 10 pht, kt bo qun d dng nhit phng th nghim, d vn chuyn, tuy nhin trn th trng cha ph bin rng ri do vy trong nghin cu ny chng ti vn phi cp p dng cc phng php khc ty iu kin c th ca tng phng xt nghim.
3.2.5. Chn on V. cholerae bng k thut PCR K thut PCR dng pht hin gen ctx, k thut ny c nhy v c hiu cao hn nhiu k thut khc. K thut PCR l phng php hin i, nhanh sau 4-5 gi, c nhy v c hiu cao nhng i hi trang thit b hin i sinh phm t tin, k thut PCR u vit hn cc k thut khc c
th pht hin bnh nhn dng tnh vi V. cholerae ngay khi dng thuc khng sinh . * T l V. cholerae O1 dng tnh bng k thut PCR Vic p dng k thut PCR trong chn on bnh t cung cp mt cng c nhiu trin vng p ng nhu cu cp thit phng php chn on nhanh c hiu qu, khc phc nhng nhc im ca phng php nui cy. K thut PCR xc nh vi khun t trc tip trong mu phn nh kh nng sao chp khuch i s lng on trnh t c hiu trn genome ca vi khun, kt qu cui cng ca phn ng PCR l sau n chu k, tnh theo l thuyt t mt on khun mu s c 2n bn sao, t mt on c th ln ti hng t sau 30 n 40 chu k, cc bn sao ny do c cng kch thc phn t v ln v mt s lng nn c th pht hin d dng nh in di trn gel agarose. Bng 3.18. T l V. cholerae O1 dng tnh bng k thut PCR
Kt qu m tnh Dng tnh Tng
PCR 254 16 270
T l % 94,07 5,93 100
Kt qu nghin cu ca chng ti ( Bng 3.18) trn 20 mu nghi ng dng tnh, bng phng php nui cy v k thut PCR cho kt qu 16 mu dng tnh vi V. cholerae O1, cn li 4 mu khng phi l V. cholerae O1. T l V.cholerae O1 dng tnh bng k thut PCR, cho kt qu chnh xc, kt qu mu dng tnh V. cholerae O1 ca k thut PCR ging nh kt qu ca k thut nui cy u l 16 trng hp v t l dng tnh V. cholerae O1 bng k thut PCR chim t l 5,93 % ( Hnh 3.12 )
2 3
6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16 17
Hnh 3.12. Band 2 n 12 l V. cholerae , band 13 n 16 l m tnh 3.3. nh gi cc k thut chn on V. cholerae 3.3.1. K thut soi ti vi khng huyt thanh c hiu So snh k thut soi ti kt hp khng huyt thanh c hiu cho thy vi khun di ng trn vi trng khi soi ti bng knh hin vi, nu kt hp nh khng huyt thanh c hiu vi khun t a gi hoc n gi th kh nng sng lc nhanh V. cholerae hiu qu hn, sau khi tin hnh nh vi git khng huyt thanh ln lam knh vi khun ang di ng, sau quan st vi pht, nu l vi khun t s khng thy di ng na tc vi khun b bt hot bi khng huyt thanh t c hiu.
Bng 3.19. nh gi k thut soi ti vi khng huyt thanh c hiu
Kt qu
m tnh
Dng tnh
T l dng tnh (%)
Phng php Soi ti di ng Bt hot di ng vi khng huyt thanh c hiu 242 252 28 18 10,37 P > 0,05 6,66
S dng khng huyt thanh c hiu bt ng vi khun t, kt qu soi trn knh hin vi thng cng cho kt qu tt ph hp vi nn kinh t ti cc c s. Nghin cu ca chng ti pht hin 28 mu di ng khi soi ti, nhng sau khi nh khng huyt thanh c hiu cho kt qu 18 mu dng tnh ( Bng 3.19). , khng c s khc bit c ngha thng k trong vic chn on vi khun V. cholera gia phng php soi ti di ng kt hp vi bt hot ca khng huyt thanh c hiu ( P > 0,05 ) Tuy nhin khng phi c s no cng c khng huyt thanh chn on vi khun t v hn s dng ngn v phi bo qun 4-8oC iu quan trng l gn 10 nm nay khng c dch t nn vic duy tr lun c khng huyt thanh s gp nhiu kh khn.
3.3.2. K thut soi ti v k thut nhum Gram Bng 3.20. So snh k thut soi ti v k thut nhum Gram
Phng php Soi ti Nhum Gram
Dng tnh 28 45
m tnh 242 225
Tng 270 270 P < 0,05
So snh k thut soi ti v k thut nhum Gram cho thy phng php nhum Gram pht hin 45 mu nghi ng dng tnh, phng php soi ti pht hin 28 mu nghi ng dng tnh ( Bng 3.20). Phng php soi ti kt hp vi bt hot khng huyt thanh t t l sng lc pht hin l 6,66% nu kt hp vi phng php nhum Gram chng ti ngh rng s b tr cc phng php vi nhau s lm tng thm ngha khoa hc cho vic sng lc mu bnh phm, c s khc bit c ngha thng k trong chn on V. cholerae ( P < 0,05 ). 3.3.3. K thut soi ti vi k thut nui cy Nu c iu kin kt hp 2 phng php soi ti vi k thut nui cy ny th hng chn on s c p dng ng theo s phn lp. Nghin cu chng ti ( Bng 3.20) cho kt qu 16 mu dng tnh bng phng php nui cy, trong khi phng php soi ti pht hin 28 mu nghi ng dng tnh, c s khc bit c ngha thng k trong vic chn on V. cholerae gia phng php soi ti v nui cy ( P < 0,05 ).
Bng 3.21. Bng so snh k thut soi ti vi k thut nui cy
Phng php Soi ti Nui cy
Dng tnh 28 16
m tnh 242 254
Tng 270 270 P<0,05
3.3.4. K thut nhum Gram vi k thut nui cy So snh k thut nhum Gram vi k thut nui cy ( Bng 3.22 ) cho thy k thut nhum Gram pht hin 45 mu nghi ng dng tnh trong khi phng php nui cy cho kt qu khng nh dng tnh 16 mu, c s khc bit ngha thng k trong vic chn on vi khun t gia phng php nhum Gram v phng php nui cy ( P < 0,05 ). Bng 3.22. Bng so snh k thut nhum Gram vi k thut nui cy
Phng php Nhum Gram Nui cy
Dng tnh 45 16
m tnh 225 254
Tng 270 270 P < 0,05
3.3.5.Phng php test nhanh vi k thut nui cy Bng 3.23. Bng so snh phng php test nhanh vi nui cy
Phng php Test nhanh Nui cy
Dng tnh 17 16
m tnh 253 254
Tng 270 270 P > 0,05
So snh k thut nui cy vi k thut test nhanh ( Bng 3.23 ) cho thy s khc bit gia 2 k thut khng ng k, k thut nui cy khng nh 16 mu dng tnh, k thut test nhanh pht hin 17 mu nghi ng dng tnh, khng c s khc bit v ngha thng k trong vic chn on V. cholera O1 gia phng php test nhanh v phng php nui cy ( P > 0,05 ). Vn t ra nu ti cc phng xt nghim tuyn huyn cha thc hin phng php nui cy th nn dng phng php test nhanh cho kt qu sng lc nhanh, chnh xc cng tng i chnh xc. Chng ti khng so snh k thut soi ti vi th nghim oxidase nhng trong qu trnh nghin cu chng ti ghi li s liu mang tnh cht tham kho cho thy khng c s khc bit v ngha thng k trong vic chn on V. cholerae gia th nghim oxidase v phng php soi ti ( P > 0,05 ) tuy nhin nu soi ti thy vi khun di ng v k thut nui cy ch dng li mc quan st khun lc mc trn mi trng thch kim th kt qu oxydase dng tnh kt hp vi soi ti cng c ngha trong vic pht hin V. cholerae. K thut nui cy khu u tin l cy trn mi trng tng sinh v khu cui cng l khng nh bng khng huyt thanh c hiu, oxidase l phn ng c trng gia giai on nui cy m oxidaza dng tnh c th a ra ch im trong chn on nhanh V. cholerae c nu cha iu kin thc hin ton b phng php nui cy. Bng 3.24. nh gi kt qu ca phng php th Oxidase vi k thut soi ti
Phng php Oxidase Soi ti
Dng tnh 31 28
m tnh 239 242 P > 0,05
3.3.6. K thut nui cy vi phng php PCR So snh phng php nui cy v phng php PCR( Bng 3.25 ) cho 2 kt qu ging nhau, tuy nhin mi k thut li c mt mnh v yu khc nhau, k thut PCR cho kt qu nhanh trong 4 gi pht hin mm bnh nhng khng ph hp vi tuyn c s v gi thnh cao, trang thit b phc tp, k thut cng nh trnh ca cn b cha p ng c. K thut nui cy cho kt qu khng nh t 24 48 gi mi tr li kt qu v cn mt s mi trng nui cy cng nh trang thit b phng v khun nhng gi thnh ph hp ch cn cn b xt nghim c kinh nghim v c kh nng phn tch kt qu, kt qu nui cy vi k thut PCR cho kt qu dng tnh nh nhau l 16 mu. Bng 3.25. Bng so snh phng php nui cy v PCR
Phng php D-ng tnh m tnh Tng
PCR 16 254 270
Nui cy 16 254 270
3.4. Tng hp kt qu cc phng php v thi gian c p dng cc k thut xt nghim trong chn on V. cholerae
Kt qu phn tch, so snh nh gi cc phng php v thi gian p dng cc k thut chn on V. cholerae chng ti tng hp ( Bng 3.26) Bng 3.26. Tng hp kt qu cc phng php v thi gian thc hin
Phng php XN
nh gi Di ng nhanh
Dng tnh 28 18
T l %
Thi gian thc hin
10,37 20 pht 6,66 15 pht
Soi ti
Bt ng khng huyt thanh
2 3 4 5
Nhum Gram Test nhanh Nui cy PCR
Gram m, hnh cong Dng tnh Ngng kt KHT Dng tnh
45 17 16 16
16,66 20 pht 6,29 5,93 5,93 15 pht 24 48 gi 4 gi
Tng hp kt qu gia cc phng php v thi gian p dng cc k thut xt nghim trong chn on V. Cholera ( Bng 3.26; biu 3.13 ) c ngha quan trng trong vic la chn cc k thut ph hp theo iu kin ca tng phng xt nghim. Vi bng tng hp ny chng ti a ra ch tiu nh gi, t l dng tnh, thi gian thc hin, vi mc ch lm c s cn b xt nghim nghin cu p dng sng lc nhanh nht cc mu nghi ng dng tnh. Nu mu m tnh s c ngay phc iu tr theo hng chn on khc, nu nghi ng s c phc iu tr ngay ng thi phi tm hiu ngay yu t dch t ngun ly bnh. K thut nui cy v k thut PCR c t l pht hin dng tnh l 5,93% sau n k thut test nhanh t l pht hin dng tnh l 6,29%. Bng 3.27. Mt s phng php c th p dng chn on nhanh V. cholerae O1
Phng php XN Soi ti Bt ng KHT Nhum Gram Test nhanh
nh gi Di ng nhanh Khng di ng Gram m, hnh cong Dng tnh
T l 10,37 6,66 16,66 6,29
Thi gian thc hin 20 pht 15 pht 20 pht 15 pht 75 pht
Tng thi gian thc hin:
Bng cc k thut ( Bng 3.27 ) a ra cc cn b xt nghim nghin cu c th p dng, cc k thut n gin, thi gian thc hin nhanh, gi thnh ph hp, nu p dng cc phng php nu trong bng thi gian 1gi cho php a ra kt qu c ngha sng lc mu nghi ng rt tt. Phng php soi ti nh gi dng tnh bng quan st tnh di ng cho thy t l dng tnh l 10,37% thi gian thc hin 20 pht y l k thut n gin d thc hin, dng c l lam knh, knh hin vi l thc hin c. Phng php nhum Gram nh gi dng tnh bng quan st hnh th cong v bt mu Gram m, thi gian thc hin 20 pht, t l pht hin dng tnh 16,66% l k thut d thc hin c ngha trong vic sng lc mu ti c s. Phng php test nhanh c nhy v c hiu tng i cao dng p dng sng lc mu rt tt, trong nghin cu t l pht hin nghi ng dng tnh l 6,29% cho kt qu nhanh sau 15 pht. Tng thi gian thc hin ca 4 phng php xt nghim trn l 75 pht vi t l pht hin cao nht l 6,29 %.
45
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Nui cy PCR Test nhanh Soi ti + Soi ti Khng huyt thanh Nhum Gram
28
16
16
17
18
Biu 3.13. Biu tng hp cc phng php chn on V. cholerae Bng 3.28. Bng so snh k thut nui cy vi bng la chn u tin chn on nhanh V. cholerae O1
Dng Phng php XN n tnh
m tnh
K thut nui cy ( Tiu chun vng ) Bng p dng chn on nhanh (bng 3.27)
270
16
254 P > 0,05
270
17
253
So snh phng php nui cy vi bng ngn gn ca 4 phng php ( Bng 3.27 ) vi P > 0,05 khng c s khc bit ngha thng k trong vic chn on V. cholera gia 2 bng.
Qua nghin cu cho thy mi phng php u c mt mnh nhng vn c mt hn ch, v vy cn phi hp ng thi cc phng php chn on trong phng th nghim nh vy s tng thm hiu qu t l pht hin dng tnh. Trong 10 nm gn y dch t hu nh khng xut hin, i khi c mt vi bnh nhn dng tnh nhng mang tnh ri rc khng thnh dch, nn ti liu tham kho gn nh khng c ti liu mi. Cc ti liu phn ln nh gi v c im dch t ca cc v dch, v nghin cu ng dng cc phng php chn on nhanh V. cholerae p dng thc t ti cc phng xt nghim tuyn huyn th cha c ti no nh gi y , nu c th cng ch a ra s liu nh gi mt phng php nhng ch ph hp vi phng th nghim tuyn Trung ng hoc tuyn tnh. Vi kt qu nghin cu ca chng ti thc hin trn a bn ca phng th nghim tuyn tnh, vic nh gi so snh hiu qu cc phng php c ngha rt quan trng t s la chn c phng php ph hp nht nhm sng lc mu ngay ti c s. Chng ti hy vng trong thi gian ti s ng dng trin khai c nhng phng php nghin cu gip cc phng xt nghim tuyn huyn lm c mt s k thut, t s c s liu nh gi rng hn, p ng thc tin, tit kim chi ph t nht cho n v, gip cho thy thuc c hng iu tr bnh kp thi, c bit gip cc nh dch t c hng x l nhanh v khoanh vng dch gim ly lan trong cng ng.
KT LUN
Nghin cu, nh gi cc phng php pht hin Vibrio cholerae O1 trn 270 mu phn ca bnh nhn mc bnh tiu chy cp c triu chng lm sng nghi mc bnh t thi gian t thng 3 n thng 7 nm 2008, chng ti c mt s kt lun sau: 1. T l bnh nhn dng tnh Vibrio cholerae O1 c chn on xc nh l 5,93 %. 2. nh gi cc k thut pht hin V. cholerae O1 cho thy: 2.1. K thut nui cy (c coi l tiu chun vng ) t l pht hin dng tnh l 5,93% 2.2. K thut PCR t l pht hin dng tnh l 5,93% pht hin kt qu nhanh sau 4 5 gi, c nhy v c hiu cao nhng i hi trang thit b v sinh phm t tin, phng php ny pht hin c c bnh nhn dng tnh khi dng thuc khng sinh. 2.3. K thut test nhanh c nhy v c hiu tng i cao t l pht hin dng tnh 6,29 % nh vy so vi k thut nui cy c sai lch dng tnh l 0,36 %, k thut cho kt qu nhanh, d thc hin, khng i hi trang thit b . 2.4. K thut soi ti nh gi bng di ng t l dng tnh l 10,37 % c sai lch so vi k thut nui cy l 4,44% nhng nu s dng thm khng huyt thanh c hiu bt ng vi khun th t l sai lch gim t 4,44 % xung cn 0,73% rt c ngha trong chn on bnh cng nh hng iu tr. 2.5. K thut nhum soi bng quan st tnh cht bt mu v hnh th vi khun t l pht hin dng tnh l 16,66 % so vi k thut nui cy t l sai lch l 10,73 %
3. La chn nhng k thut hiu qu, ph hp p dng sng lc chn on nhanh V. cholerae O1 ti labo tuyn huyn trong giai on hin nay: 3.1. K thut soi ti kt hp khng huyt thanh c hiu ca V. cholerae O1 cho kt qu pht hin l 6,66 % thi gian kt hp thc hin l 25 pht, s kt hp ca phng php ny c ngha rt cao trong vic pht hin nhanh, ph hp vi phng th nghim tuyn huyn v khng huyt thanh d mua c bn trn th trng v c bit trong nc sn xut, gi thnh r ph hp vi tuyn c s. 3.2. K thut nhum soi thi gian thc hin 15 pht, t l pht hin dng tnh 16,66 % thc hin k thut mang tnh nh hng gip cho cc k thut tip theo 3.3. Test nhanh t l pht hin dng tnh 6,29 % cho kt qu nhanh d thc hin, nhy cng nh c hiu tng i cao. Bng 3.27. a ra s liu nghin cu c th cho tng phng php ( Soi ti, soi ti bt ng khng huyt thanh, nhum Gram, test nhanh ), nn c s phi hp cht ch gia cc phng php gim bt t l sai lch trong pht hin, vi thi gian 55 pht nu thc hin cc phng php theo bng trn th t l pht hin dng tnh Vibrio cholerae O1 l 6,29 % gp phn ng k kp thi iu tr sm cho bnh nhn , mt khc c bin php ngn nga ly lan dch trong cng ng.
NGH
1. Cc phng xt nghim vi sinh cn p dng ng thi cc phng php nng cao t l pht hin Vibrio cholerae O1 trong mu bnh phm. 2. Tng cng nng lc cho phng th nghim: Ha cht, thit b, con ngi. T chc tt mng li nhng cn b lm cng tc xt nghim thng xuyn trao i, thng nht phng php, hc tp v trao i kinh nghim ln nhau.
TI LIU THAM KHO Ting Vit 1. Nguyn Tng m, ng c Trch, Nguyn Duy Thanh (1983), Bnh t El Tor, dch t hc v lm sng, Nxb Y hc, H Ni, tr.7-195. 2.Nguyn nh Bng (1992), Vi khun t, Nxb i hc v Trung hc chuyn nghip, H Ni, tr.169-170. 3. V Thanh Bnh, Phng c Cam (1992), TCP mt thnh phn khng nguyn ca Vcholerae, Tp ch V sinh phng dch, 2(4), tr.87-89. 4. B mn Vi sinh vt (2003), Vibrio. vi sinh Y hc, Trng i hc Y H Ni, Nxb Y hc, H Ni, tr.193-203. 5. Phng c Cam (2003), Vibrio cholerae v bnh dch t, Nxb Y hc, H Ni, tr.53-74. 6. Nguyn Anh Dng (1991), Bnh t v cng tc chun b phng chng dch, Tp ch V sinh phng dch, 5(1), tr.3-7. 7. Bi i (1997), Bnh t dch t hc v iu tr, Hc vin qun y - Vin V sinh Dch t Trung ng, H Ni, tr.58-65. 8. Lng Vn m, Nguyn B Cn, Hong Vn Sinh, V vn Nhung (2003), Mt s nhn xt v cc v dch t ti Thanh Ho, Cng trnh nghin cu khoa hc, Trung tm Y t D phng tnh Thanh Ho, tr.58-65. 9. Phan o, Hong Th Phim, Nguyn nh Sn (1995), Nhn xt kt qu xt nghim vi sinh vt v dch t, Tp ch V sinh phng dch, 5(3), tr.18-22. 10. L Th Hng Hnh (2002), Tm hiu mt s c tnh ca Vibrio cholerae O1 Vit Nam (1991-2002), Lun vn thc s Y khoa, trng i hc Y H Ni, H Ni. 11. inh S Hin (1988), Tm hiu tnh hnh bnh tiu chy cp v hiu qu ca chng trnh CDD th im T Lim, H Ni, B Y t, Vin V sinh Dch t Trung ng, H Ni, tr.7-15.
12. Nguyn ng Hin, Nguyn Th Mai Hng, ng Ngn H (2008), Nghin cu dch t hc bnh tiu chy do virut Rota ti Vit Nam t 20072008, Tp ch Y hc d phng, 5(7), tr.19-20. 13. Nguyn Trn Hin, Phm Ngc nh (2007), Ti liu qui trnh xt nghim, iu tra, gim st, phng chng bnh t, B Y t, Vin V sinh dch t Trung ng, H Ni, tr.1-28. 14. V Quang Huy, Trn Vn Sm, V Chin Thng, Nguyn Thanh Bnh, on Trng Tuyn (1993), Nhn xt c cu v mt s c im ca 117 chng Vibrio phn lp c t bnh nhn tiu chy cp ti thnh ph H Ch Minh, Tp ch V sinh phng dch, 5(3), tr.50-55. 15. L Lan Hng, inh S Hin, Nguyn Th Th Trm, Trn Vn Tng, Nguyn Thanh Vn (1995), Tm hiu s tn ti ca phy khun t mi trng nc ngoi sinh v ngi ti mt a bn nhiu ln xy ra dch t, Tp ch V sinh phng dch, 5(5), tr.347-349. 16. V Minh Hng, Nguyn nh Mun, Nguyn Vn Hiu (1994), Mt s trng hp mc t ti Hi Phng nm 1994, Tp ch V sinh phng dch, 5(2), tr.60-75. 17. Nguyn Gia Khnh (2008), Tr em Vit Nam mc bnh tiu chy cp ng th 3 Chu , Mc Y T sc khe (sggp.org.Vn/y te suc khoe/2008/10). 18. H B Khim (1995), Phy khun t, Tp ch V sinh phng dch, 5(5), tr.715-717. 19. Nguyn c Khin, Nguyn nh Sn, Hong Th Phim, Hong Hu Nam (1992), Kt qu phng chng dch t thng 5/1992 ti tha thin Hu, Tp ch V sinh phng dch, 2(3), tr.22. 20. Hong Thu Long (1991), K thut xt nghim vi sinh vt y hc, Nxb Vn ho, H Ni, tr.65-80.
21. Nguyn Bnh Minh (2003), p dng k thut ADN a dng khch i ngu nhin (RAPD) nghin cu Vibrio cholerae O1, Tp ch Y hc d phng, 13(2), tr.27-30. 22. Nguyn Bnh Minh (2003), S thay i tnh nhy cm khng sinh ca Vcholerae O1 Vit Nam v Lo, Tp ch Y hc d phng, 8(4), tr.27. 23. Nguyn Bnh Minh, Ng Tun Cng, L Thanh Hng, Nguyn Hoi Thu (2008), nh gi kt chun on nhanh Vibrio cholerae O1 gy bnh t, Tp ch Y hc d phng, 18(2), tr.51-56. 24. Nguyn Bnh Minh, Hong Thu Thu, ng c Trch (2003), Min dch d phng bnh t v hiu lc ca vaccine, K yu cng trnh nghin cu khoa hc, Vin V sinh Dch t Trung ng, H Ni, tr.187-193. 25. Nghim Ngc Minh (2008), Vi sinh vt hc phn t, gio trnh ging dy, Vin cng ngh Sinh hc, H ni, tr.62-76. 26. L Th Ngc Minh, Nguyn nh Sn, Hong Th Phim, Diu Th, V Thu Thu (1992), Kt qu xt nghim vi sinh vt ch im cc c s ch bin thc phm ti Tha Thin Hu, 1992 - 1993, Tp ch V sinh phng dch, 5(3), tr.8-11. 27. Thm Ch Mc (1996), c im dch t hc bnh t qua cc v dch Nam H, Lun n Y khoa, Trng i hc Y H Ni, H ni. 28. Thm Ch Mc (1994), Mt s nhn xt v bnh t nm 1976 ti H Nam Ninh (1994), Tp ch Y hc d phng, 4(2), tr.19-84. 29. Thm Ch Mc, Phm Trng Nm (1995), Mt s nhn xt tnh cht mc ca phy khun t trn mi trng lng v mi trng c qua v dch t 1976 v 1980 ti H Nam Ninh, Hi ni khoa Vit Nam, (1), tr.28-30. 30. Nguyn Huy Nga (2008), V vic tng cng phng chng dch tiu chy cp nguy him, Cng in khn gi gim c S Y t, gim c Trung tm Y t D phng tnh / thnh ph, B Y t, Cc Y t d phng v Mi trng.
31. L B Nho (1993), Mt s nhn xt v bnh t ti huyn ng Sn, Thanh Ho, Cng trnh nghin cu khoa hc, Trung tm Y t D phng tnh Thanh Ho, tr.66-68. 32. o Ngc Phong, Dng nh Thin, Nguyn Duy Thit (1997), Bnh dch t, Nxb Y hc, H Ni, 2, tr.309-315. 33. Nguyn Th Kiu Phng, o Qu Anh, Nguyn Vnh Lin (1994), Kt qu xt nghim vi khun ng rut t nm 1975 - 1994, Tp ch V sinh phng dch, 4(3), tr.16. 34. Nguyn Ph Qu (1993), Chn on vi khun hc bnh t do V. cholerae O139, Tp ch V sinh phng dch, 3(3), tr.52. 35. Nguyn Ph Qu, Phng c Cam, Lng Ngc Trm (1991), K thut xt nghim vi sinh vt y hc, Nxb Vn ho, H Ni, tr.78-81. 36. Phm Song, Nguyn Tng m, o nh c (1991), Bnh t, bch khoa th bnh hc, Trung tm bin son t in bch khoa Vit Nam, H Ni, 1, tr.70-75. 37. Nng Thanh Sn, Lng Th Hng Vn (2003), Phng php nghin cu khoa hc, ng dng trong y sinh hc, Nxb Y hc H Ni, H Ni, tr.20-96. 38. Phm Kim Thanh, Nguyn Vn Hiu (1994), Kt qu phn lp Vibrio Eltor t ngoi cnh trong cc v dch t ti Hi Phng, Tp ch V sinh phng dch, 5(3), tr.109-110. 39. Trn Tin (2001), Gim st v phng chng mt s bnh truyn nhim gy dch, B Y t, Vin V sinh Dch t Trung ng, H Ni, tr.19-25. 40. ng c Trch (1993), Dch t do Vibrio cholerae O139, Tp ch V sinh phng dch, 3(3), tr.52. 41. ng c Trch, Gia Cnh, Phm Kim Sc, Thung, Nguyn c Khin (1993), Bnh dch t ti Vit Nam trong nhng nm gn y, Tp ch V sinh phng dch, 3(3), tr.50.
42. Nguyn Th Th Trm, Nguyn Th K (1985), Nguyn nhn vi sinh vt gy bnh tiu chy cc tnh min Trung (1980-1984), Cng trnh nghin cu khoa hc (1981-1985) Vin Paster Nha Trang, tr.23-31. 43. Nguyn ng T, Ng Tun Cng, Nguyn Hoi Thu, L Thanh Hng, Nguyn Bnh Minh, Kim Ninh, Phm Vn Du, Trn Minh Thu (2008), Gim st Vibrio cholerae O1 v Vibrio phage trong mi trng nc ngoi cnh - Cc yu t d bo dch t, Tp ch Y hc d phng, 18(4), tr.1318. 44. Nguyn ng T, Ng Tun Cng, Nguyn Hoi Thu, L Thanh Hng, Nguyn Bnh Minh (2008), Nghin cu thc khun th t phn lp t mu nc ngoi cnh ti Thi Bnh, Tp ch Y hc d phng, 18(4), tr.1923. Ting Anh 45. Adesina H.O. (1984), Ident ification of the Cholerae diffusion process in Ibana, Soc Sci, 18(5), pp.429-440. 46. Akopyanz N., Bukanov N.O., Westblom T.U., Kresovich S. and Berg D.E. (1992), DNA diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori ditected by PCR-based RAPD fingerprinting, Nucleic Acids Res, 20, pp.5137-5142. 47. Binh Minh Nguyen, Dac Cam Phung, Noboru Nakasone, Claudia Toma, Naomi Higa, Sunao Iyoda, and Masaaki Iwanaga (2004), Shiga-Toxin producing Escherichia coli in Vietnam, Japannese J Tropical Medicine and Hygiene, 32(4), pp.339-341. 48. Briko I.I., Bachtarzi T., Ourtani A., Laouar M. (1985), Cholerae morbidity problems in 1 of the departments of the Democratic and Popular Republic of Angeria, Microbiol Epidemiol Immunobiol, 37(5), pp.45-51.
49. CDC (2004), Cholera and other Vibrio illness surveillance summaries: summary of human Vibrio isolates reported to CDC, 2004, Atlanta, GA: US Department of Health and Human Services, CDC, MMWR, 47, pp.654-658. 50. CDC (1992), Cholera associated with international travel 1992, MMWR, 41, pp.664-667. 51. CDC (1991), Cholera -- New York, MMWR, 40, pp.516-518. 52. CDC (1995), Update: Vibrio cholerae O1 -- western hemisphere, 19911994, and Vibrio cholerae O139 Asia, MMWR, 44, pp.215-219. 53. CDC (1995), Update: Vibrio cholerae O1 -- western hemisphere, 1991 1994, and V. cholerae O139 -- Asia, 1994, MMWR, 44, pp.215-219. 54. Dalsgaard A., Skov M.N., Taylor D.N. (1997), Molecular evolution of Vibrio cholerae O1 strains isolated in Lima, Peru, from 1991 to 1995, Journal of Clincal Microbiology, 35(5), pp.1151-1156. 55. Ehara M., Nguyen B.M., Nguyen D.T., Toma C., Higa N. (2004), Drug susceptibility and its genetic basic in epidemic Vibrio cholerae O1 in Vietnam, Epidemiol Infect, 132, pp.595-600. 56. Koch R. (1894), An adress on Cholerae and its bacillus, BMJ, 2, pp.453-459. 57. Macnamara C. (1876), A History of Asiatic Cholerae, London, MacMillan and Co. 58. Morris J.G., Picardi J.L., Lee J.V., Roberts A. (1984),Isolation of nontoxigenic Vibriocholerae Ogoup 1 from a patient with severe gastro intestinal disease, J Clin Microbio, 19(2), pp.297-297. 59. Nato F., Boutonnier A., Rajerison M., Grosjean P., Dartevelle S., Guenolo A., Bhuyan N.A., Sack D.A., Nair G.B., Fournier J.M. and Chanteau S. (2003), One-step immunochromatographic dipstick tests for rapid detection of Vibrio cholerae O1 and O139 in stool samples, Clinical Diagn Lab Immunolo Euphytica, 10, pp.476-478.
60. Peak S.H., Lee S.H.,Cho J.H. and Kim Y.S. (2000), Development of rapid one-step immuno-chromato graphic assay, Methods, 22, pp.53-60. 61. Sinh D.V., Maria H.M., Matte G.R., Jiang S., Sabeena F., Shukla B.N., Sanyal S.C., Huq A. and Colwell R.R. (2001), Molecular Analysis of V. cholerae O1, O139, non - O1, and non - O139 Strains: Clonal Relationships between Clinical and environmental Isolates, Applied and Environmental Microbiology, Rajiv Gandihic entrefor Biotechnology, Jagathy,
Thiruvananthap uram 695014, India, Center for Marine Biotechnology, University of Maryland Biotechnology Institue, Baltimore, Maryland. 62. WHO (1994), Guidelines for cholerae control, Genever, pp.1-47.

Vibrio

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Vibrio

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

I HC THI NGUYN TRNG I HC S PHM

LUN VN THC S SINH HC

THI NGUYN - 2009

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

I HC THI NGUYN TRNG I HC S PHM -------------------------------

LUN VN THC S SINH HC

GIO VIN HNG DN KHOA HC: TS. LU TH KIM THANH

THI NGUYN - 2009

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

NHNG CH VIT TT TRONG LUN VN

CT RNA DNA E.coli KIA N.A.G PCR RAPD

Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose ( Mi trng chn lc nui cy vi khun t )

Vibriocholerae (Vi khun t )

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

CHNG I TNG QUAN TI LIU

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

V. cholerae tp c in Nhy Nhy

V. cholerae tp Eltor Khng + + Khng

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

Phng php Real-time PCR.

CHNG II NGUYN LIU V PHNG PHP NGHIN CU

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

Bng 2. 1. Danh mc mt s dng c, ha cht s dng trong nghin cu

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

T lnh su Cn phn tch T cy v trng Ni kh trng T m 37oC

Sanyo Mettler Thy S Vit Nam M Memmect c

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

Pepton kim TCBS, Thch Kim

TCBS, Thch Kim

Tnh cht sinh ho

Ng-ng kt khng huyt thanh

Hnh 2.1. S phn lp chn on V. cholerae

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

Gii N Nam Tng

n 164 106 270

X SD 34,214,5 31,815,5 33,314,9

Trung v 34(24-45) 34(17-44) 34(21-45)

min - max 8 - 67 P> 0,05 5 - 68 5 - 68

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

S mu thu thp tnh theo tui

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn

Phn b nhm i tng theo gii tnh

S ha bi Trung tm Hc liu i hc Thi Nguyn