Professional Documents
Culture Documents
vn
LI CM N hon thnh ti ny, em xin by t lng bit n su sc ti c gio - TS. Vi Th oan Chnh - ngi nh hng nghin cu, tn tnh gip em trong qu trnh thc hin ti. Em xin by t lng bit n ti ThS. Trnh Ngc Hong, CN. Th Tuyn cng ton th cc thy c gio, cc anh ch k thut vin Phng th nghim Khoa Khoa hc s sng - Trng i hc Khoa hc tn tnh gip , to mi iu kin tt nht em hon thnh ti ny. Qua y, em cng xin gi li cm n chn thnh ti gia nh, ngi thn, cng ton th cc bn lp Cng ngh sinh K6 ng vin v gip em rt nhiu trong qu trnh thc hin ti ny.
Ch thch Colony Forming Unit Cht khng sinh Gram dng Gram m H si kh sinh Hot tnh Hot tnh khng sinh Khng sinh Vi khun Vi sinh vt Vi sinh vt kim nh X khun
B Tn bng n g 1 Khng sinh c pht hin qua cc nm . 1 2 Cc chng VSV kim nh . 1 3 S phn b ca x khun t cc mu t khc nhau . 1 3 S lng v s phn b ca x khun theo nhm mu . 2 3 HTKS ca x khun theo nhm mu . 3 3 Kh nng c ch cc nhm VSV kim nh . 4 3 Ph khng sinh ca cc chng XK phn lp . 5 3 HTKS ca 5 chng XK la chn trn mi trng thch . 6 3 HTKS ca dch ln men 5 chng XK la chn . 7 3 HT khng nm gy bnh trn ch ca 3 chng XK la chn . 8 3 Hot tnh enzyme ca 5 chng x khun la chn . 9
Trang
19
26
27
29
30
32
33
34
36
37
39
3.10 Kh nng chu nhit ca Cellulase 3.11 Kh nng chu nhit ca Amylase 3.12 Kh nng chu nhit ca Protease 3.13 Vng phn gii c cht ca enzyme sau khi x l vi nhit trong thi gian 20 pht
vc ni Pho - i T - Thi Nguyn c dng tuyn chn v nghin cu hot tnh sinh hc.
3.
Mc tiu
Tuyn chn v nghin cu mt s chng x khun c hot tnh khng sinh c nhiu trin vng ng dng trong thc t.
Tuyn chn v nghin cu mt s chng x khun c hot tnh enzyme ngoi bo.
4. Kt qu chnh
Kho st s phn b ca x khun trong cc mu t thu ti khu vc ni Pho, x H Thng, huyn i T, tnh Thi Nguyn l khu vc v ang chu nh hng ca hot ng khai thc khong sn nhiu nm.
Phn lp v thun khit c 70 chng x khun t cc mu t khc nhau: t trng ch, t trng keo, t trng mu, t trng la, t vn, t i trc. Kim tra hot tnh khng sinh ca cc chng x khun vi cc vi sinh vt kim nh bao gm: vi khun Gram dng, vi khun Gram m, nm mc, c bit c s dng cc chng nm gy bnh trn cy ch l loi cy trng ch o tnh Thi Nguyn.
Kim tra hot tnh enzyme: amylase, protease v cellulase ca cc chng x khun v tuyn chn c 2 chng c hot tnh enzyme cao c k hiu l: HT12.7 v HT10.6. ng thi nghin cu c kh nng chu nhit ca cc enzyme.
Hnh 1.1. Khun lc x khun [43] Khun ty trong mi lp c chc nng sinh hc khc nhau. Cc sn phm trong qu trnh trao i cht nh: CKS, c t, enzyme, vitamin, axit hu c c th c tch ly trong sinh khi ca t bo x khun hay c tit ra mi trng. * Khun ty Trn mi trng c cht c, h si ca x khun pht trin thnh 2 loi: mt loi cm su vo trong mi trng gi l h si c cht (khun ty c cht - substrate mycelium) vi chc nng ch yu l dinh dng. Mt loi pht trin trn b mt thch gi l h si kh sinh (khun ty kh sinh - aerial mycelium) vi chc nng ch yu l sinh sn. Nhiu loi ch c h si c cht nhng cng c loi (nh chi Sporichthya) li ch c h si kh sinh. Khi HSKS va lm nhim v sinh sn va lm nhim v dinh dng [8]. 1.1.3. S hnh thnh bo t ca x khun Bo t x khun c hnh thnh trn cc nhnh phn ha ca khun ty kh sinh - gi l cung sinh bo t. y l c quan sinh sn c trng cho x khun. Trn mi cung sinh bo t mang 30 - 100 bo t, i khi c th mang ti 200 bo t. Hnh thi, cung sinh bo t v bo t l cc c im quan trng nht trong phn loi x khun.
i nht nh khi nui cy trn mi trng c ngun nit khc nhau [14].
Hnh 1.2. Hnh dng cung sinh bo t v b mt bo t ca chng Streptomyces cinereoruber subp [6]
Nm 1944, streptomycin c pht hin t x khun t Streptomyces griseus. Sau n chloramphenicol, tetracyclin, cc khng sinh thuc nhm macrolide v glycopeptide [11]. Vo nm 1962, cc khng sinh tng hp nh nalidixic acid, thuc chng VSV c bn cht quinolone cng c to ra. Vic ci tin trong tng lp khng sinh tip tc thu c ph khng VSV rng hn, hot tnh khng VSV cao hn, v d nh cc khng sinh lactam. Vic pht hin, pht trin v s dng cc khng sinh trong iu tr th k 20 lm gim ng k t l cht do nhim khun. Tuy nhin t nm 1980 s khng sinh mi c a vo iu tr gim hn do chi ph pht trin v th nghim thuc mi ngy cng ln. Bn cnh , mt hin trng ng bo ng l ngy cng tng cc VSV gy bnh khng vi cc khng sinh hin c. Do vy, cc nghin cu cn phi tp trung vo lm th no vt qua tnh khng thuc khng sinh cng nh pht hin cc khng sinh mi c c ch hot ng khc nhau [29].
16
18
Nc my va 1 lt;
X =
1 n Xi n i =1
n i
(X
i =1
X )2
n 1
S lng S chng phn XK/g (CFU/g) lp c 6 1,5 x 10 5 6 2,3 x 10 4 6 5,5 x 10 8 6 2,0 x 10 1 6 8,7 x 10 40
Kt qu trn bng 3.2 cho thy nh thng l, x khun thuc 2 nhm mu xm v trng vn chim u th. T l x khun thuc nhm xm chim
26
27
Hnh 3.2. Mt s chng x khun thun khit 3.2. Hot tnh khng sinh ca x khun phn lp 3.2.1. Hot tnh khng sinh ca x khun phn b theo nhm mu nghin cu v tuyn chn ra cc chng x khun c hot tnh khng sinh cao, trc ht, chng ti kim tra s b hot tnh ca 70 chng x khun phn lp c bng phng php thi thch. Kt qu c 43 chng trong tng s 70 chng c hot tnh khng sinh, chim t l 61,4%. ng thi s lng v t l cc chng c hot tnh cng c s sai khc gia cc nhm mu (bng 3.3 v hnh 3.3) Bng 3.3. HTKS ca x khun theo nhm mu STT 1 2 3 4 5 6 Nhm mu Xm (Grey) Trng (White) Xanh (Blue) Nu (Brown) Hng (Pink) Vng (Yellow) Tng cng S chng X khun c HTKS phn lp S T l c lng (%) 29 16 37,2 23 18 41,9 10 2 4,7 5 5 11,6 2 1 2,3 1 1 2,3 70 43 100 T l chng c HTKS so vi tng s (%) 22,9 25,7 2,9 7,1 1,4 1,4 61,4
So snh vi kt qu cng b trc [16, 18], kt qu ca chng ti cho thy t l x khun c hot tnh khng sinh l tng i cao. iu ny chng t, s lng x khun c kh nng sinh cht khng sinh t Thi
28
Hnh 3.3. T l cc chng XK c HTKS phn theo nhm mu Tuy nhin, nu xt ring tng nhm mu, cc nhm mu nu, vng v hng, mc d x khun phn b rt t nhng t l chng c hot tnh li rt cao. ng ch l nhm mu nu, ch c 5 chng nhng tt c cc chng u c hot tnh. y l kt qu rt ng phi quan tm. 3.2.2. Ph khng sinh ca cc chng x khun phn lp
29
S lng 9
Trong tng s 70 chng c hot tnh, nh thng l, s chng c hot tnh vi nhm VK G (+) l cao nht, c 31 chng (chim 72,09%), tip theo l hot tnh vi nm mc, c 27 chng (chim 62,79%) v thp nht l hot tnh vi nhm VK G (-), ch c 12 chng (chim 27,9%). ng ch , trong s c 9 chng (chim 20,93%) c hot tnh vi c 2 nhm VK G(+) v G(-) v c bit l c 3 chng (chim 6,97%) c hot tnh vi c 3 nhm VSV kim nh.
Hnh 3.4. T l XK c HT vi cc nhm VSV kim nh Kt qu ny mt ln na cho thy, khng ch x khun c hot tnh khng sinh chim t l cao m x khun c hot tnh khng nm cng kh cao so vi nhiu nghin cu trc y [16, 21].
30
31
E.co: Escherichia coli VTCC-B-883; P.a: Pseudomonas aeruginosa VTCC-B481; F.o: Fusarium oxysporum VTCC-F-1301; F.s: Fusarium solani VTCC-F1302; A.ni: Aspergillus niger VTCC-F-001.
3.2.3. Tuyn chn cc chng x khun c HTKS cao Cn c vo kt qu kim tra s b hot tnh khng sinh, chng ti chn ra 5 chng x khun c hot tnh mnh nht tip tc sng lc bc 2. Cc chng ny k hiu l: HT12.2, HT19.2, HT19.1, HT17.8, HT17.18. Trn bng 3.6 v hnh 3.6 l kt qu kim tra s b hot tnh khng sinh ca 5 chng la chn. Bng 3.6. HTKS ca 5 chng XK la chn trn mi trng thch
32
VK G (-)
10,2 0,3 10,5 0,3 10,20,1 10,7 0,1 + 6,2 0,1 8,9 0,1 +
Nm mc
Hnh 3.6. HTKS ca 5 chng XK la chn S.aureus: Staphylococcus aureus ATCC 25923; B.subtilis: Bacillus subtilis VTCC-B-888 Bc tip theo, cc chng x khun ny c nui lc trong mi trng dch th kim tra hot tnh ca dch ln men. Kt qu kim tra c th hin trn bng 3.7. Bng 3.7. HTKS ca dch ln men 5 chng XK la chn
33
VK G (-)
Nm mc
Ch thch: (-) : Khng c hot tnh Kt qu trn cho thy, c 5 chng x khun la chn u vn gi c hot tnh khng sinh tng i n nh khi chuyn t mi trng thch sang mi trng dch th. C 3 chng l HT17.8, HT19.1, v HT12.2 c hot tnh cao vi tt c cc VSV kim nh, c bit l c hot tnh khng nm kh mnh (hnh 3.7). Tuy nhin, tt c cc chng u khng c hot tnh vi nm Aspergillus niger VTCC-F-001.
34
Hnh 3.7. Hot tnh khng sinh ca cc chng x khun la chn 1: HT17.8 ; 2. HT18.4 ; 3. HT19.1 ;
S.aureus: Staphylococcus aureus ATCC 25923; VTCC-B-888;
4. HT18.5
Vi hng nghin cu tuyn chn ra cc chng c hot tnh khng sinh cao, c hot ph rng v c bit l c hot tnh khng nm gy bnh thc vt, 3 chng x khun HT17.8, HT19.1 v HT12.2 c la chn tip tc nghin cu. Tip theo, tm hiu kh nng ng dng ca 3 chng x khun la chn, chng ti tin hnh kim tra hot tnh khng nm ca 3 chng ny vi 4 chng nm gy bnh trn ch - l cc chng 1, N2, PL3 v TB4. Kt qu cho thy, c 3 chng x khun u c hot tnh vi t nht 1 trong 4 chng nm gy bnh trn ch (bng 3.8). Bng 3.8. HT khng nm gy bnh trn ch ca 3 chng XK la chn K hiu chng nm gy bnh trn ch 1 N2 PL3 TB4 Hot tnh khng sinh (D-d, mm) HT19.1 HT17.8 HT12.2 22,2 0,1 23,1 0,5 16,2 0,1 15,1 0,1 10,2 0,2 + 10,3 0,1 + + +
Hnh 3.8. HT khng nm gy bnh ch ca 3 chng x khun Bnh m xm v m nu l nhng bnh gp rt ph bin trn cc vng trng ch nc ta, trong c cc vng ch Thi Nguyn. Khi ch b dch hi ny th khng nhng nh hng n nng sut m cht lng ch cng b nh hng. Chnh v vy, cc kt qu nghin cu ny l nhng kho st bc u lm c s cho hng nghin cu ng dng tip theo, c th m rng hn na kh nng ng dng ca chng HT17.8 v HT19.1 vo thc tin. 3.3. Tuyn chn x khun c hot tnh enzyme 3.3.1. Hot tnh enzyme ca x khun Trong qu trnh sng, x khun cn phi tng hp nn cc enzyme. Cc enzyme c hnh thnh trong t bo v mt s c tit ra mi trng xung quanh. Trong sn xut enzyme t x khun ch yu l thu nhn cc enzyme ngoi bo. Khng phi tt c cc VSV u c kh nng sinh enzyme nh nhau, v vy, khi tuyn chn chng ging phi tin hnh phn lp, kim tra v la chn cc chng c hot tnh enzyme mnh, sinh nhiu enzyme mong mun theo tng mc ch.
36
Bc tip theo, 5 chng la chn trn c nui lc trn mi trng dch th kim tra hot tnh enzyme ca dch ln men. Kt qu kim tra c trnh by trong bng 3.10 cho thy, nhn chung, cc chng gi c c 3 hot tnh enzyme ni trn, nhng mc biu hin hot tnh c s khc nhau. Hot tnh protease biu hin mnh nht v yu nht l hot tnh amylase. Bng 3.10. Hot tnh enzyme ca dch ln men 5 chng XK la chn K hiu chng HT10.6 HT12.7 HT12.5 HT17.15 HT18.8 Hot tnh enzyme (D - d, mm) Amylase Cellulase Protease + 12,5 0,1 + + + 10,2 0,1 16,1 0,1 + 8,0 0,1 + 12,2 0,3 16,2 0,3 4,9 0,1 12,2 0,7 +
Hnh 3.9. HT enzyme ca 5 chng x khun la chn 1: HT17.15 2: HT12.7 3: HT12.5 4: HT10.6 5: HT18.8.
Cn c t kt qu trn, chng ti la chn chng HT12.7 tip tc nghin cu kh nng chu nhit ca enzyme. 3.3.2. Kh nng chu nhit ca enzyme Cc enzyme ngoi bo c ng dng nhiu trong cng tc bo v mi trng x l cc rc thi hu c. Chnh v vy, kh nng chu nhit ca enzyme l mt trong cc c im cn phi c nghin cu. xc nh kh nng chu nhit ca enzyme t chng HT12.7, chng ti tin hnh nui lc chng x khun ny trong mi trng dch th thu dch enzyme th. Tin hnh x l dch enzyme th cc mc nhit : 40 0C; 500C; 600C; 700C v 800C trong thi gian 20, 40, v 60 pht. Hot tnh enzyme c xc nh bng phng php khuch tn trn a thch. Kt qu c trnh by trn bng 3.11. Bng 3.11. Kh nng bn nhit ca dch enzyme chng HT12.7
38
i chng (dch enzyme cha x l nhit ): Amylase: 17,2 0,1; Cellulase: 22,1 0,3; Protease: 24,8 0,5; ( -) : Khng c hot tnh Kt qu trn cho thy, hot tnh enzyme ca chng HT12.7 tng i bn vng vi nhit , hot tnh c s thay i khi tng dn thi gian x l cng mt mc nhit . Kh nng phn gii 3 ngun c cht c s khc nhau. Hot tnh ca 3 loi enzyme u tng i n nh 2 mc nhit 40 0C v 500C. Hot tnh gim rt nhanh cc mc nhit 600C, 700C v 800C. Cc enzyme cellulase v protease c kh nng chu nhit tt hn, 80 0C hot tnh enzyme vn khng b mt, trong khi , vi enzyme amylase, hu nh khng cn hot tnh 700C v 800C.
39
40
Hnh 3.13. Vng phn gii c cht ca enzyme sau khi x l vi nhit trong thi gian 20 pht
41
KIN NGH
1. Nghin cu cc c im sinh l, sinh ha, phn loi v kh nng tng hp cht khng sinh ca 3 chng x khun la chn: HT17.8, HT19.1, HT12.2. 2. Nghin cu tnh cht l ha ca cht khng sinh t 3chng x khun la chn.
42
43
Thajuddin,
nnamalai
Panneerselvam,
47
48
Khun lc chng 1
Khun lc chng N2
49