You are on page 1of 57

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.

vn
LI CM N hon thnh ti ny, em xin by t lng bit n su sc ti c gio - TS. Vi Th oan Chnh - ngi nh hng nghin cu, tn tnh gip em trong qu trnh thc hin ti. Em xin by t lng bit n ti ThS. Trnh Ngc Hong, CN. Th Tuyn cng ton th cc thy c gio, cc anh ch k thut vin Phng th nghim Khoa Khoa hc s sng - Trng i hc Khoa hc tn tnh gip , to mi iu kin tt nht em hon thnh ti ny. Qua y, em cng xin gi li cm n chn thnh ti gia nh, ngi thn, cng ton th cc bn lp Cng ngh sinh K6 ng vin v gip em rt nhiu trong qu trnh thc hin ti ny.

Thi Nguyn, ngy 23 thng 8 nm 2011 Sinh vin

Lng Th Hng Giang

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


MC LC

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


DANH MC CC CH VIT TT

Ch vit tt CFU CKS G (+) G (-) HSKS HT HTKS KS VK VSV VSVK XK

Ch thch Colony Forming Unit Cht khng sinh Gram dng Gram m H si kh sinh Hot tnh Hot tnh khng sinh Khng sinh Vi khun Vi sinh vt Vi sinh vt kim nh X khun

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


DANH MC CC BNG

B Tn bng n g 1 Khng sinh c pht hin qua cc nm . 1 2 Cc chng VSV kim nh . 1 3 S phn b ca x khun t cc mu t khc nhau . 1 3 S lng v s phn b ca x khun theo nhm mu . 2 3 HTKS ca x khun theo nhm mu . 3 3 Kh nng c ch cc nhm VSV kim nh . 4 3 Ph khng sinh ca cc chng XK phn lp . 5 3 HTKS ca 5 chng XK la chn trn mi trng thch . 6 3 HTKS ca dch ln men 5 chng XK la chn . 7 3 HT khng nm gy bnh trn ch ca 3 chng XK la chn . 8 3 Hot tnh enzyme ca 5 chng x khun la chn . 9

Trang

19

26

27

29

30

32

33

34

36

37

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


3 Hot tnh enzyme ca dch ln men 5 chng XK la chn . 1 0 3 Kh nng bn nhit ca dch enzyme chng HT12.7 . 1 1 38

39

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


DANH MC CC HNH V, TH Hnh 1.1 1.2 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 Khun lc x khun Hnh dng cung sinh bo t v b mt bo t ca chng Streptomy ces cinereoruber subp T l cc chng x khun phn theo nhm mu Mt s chng x khun thun khit T l cc chng XK c HTKS phn theo nhm mu T l XK c HT vi cc nhm VSV kim nh Kh nng i khng ca cc chng XK vi cc VSV kim nh HTKS ca 5 chng XK la chn Hot tnh khng sinh ca cc chng x khun la chn HT khng nm gy bnh ch ca 3 chng x khun HT enzyme ca 5 chng x khun la chn Tn hnh Trang 5 6 28 28 30 31 32 33 35 36 38 40 40 41 41

3.10 Kh nng chu nhit ca Cellulase 3.11 Kh nng chu nhit ca Amylase 3.12 Kh nng chu nhit ca Protease 3.13 Vng phn gii c cht ca enzyme sau khi x l vi nhit trong thi gian 20 pht

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


TM TT KT QU NGHIN CU 1. Tn ti Tuyn chn v nghin cu hot tnh sinh hc ca mt s chng x khun phn lp ni Pho - i T - Thi Nguyn.
2.

i tng 70 chng x khun c phn lp t cc loi t khc nhau thuc khu

vc ni Pho - i T - Thi Nguyn c dng tuyn chn v nghin cu hot tnh sinh hc.
3.

Mc tiu

Tuyn chn v nghin cu mt s chng x khun c hot tnh khng sinh c nhiu trin vng ng dng trong thc t.

Tuyn chn v nghin cu mt s chng x khun c hot tnh enzyme ngoi bo.

4. Kt qu chnh

Kho st s phn b ca x khun trong cc mu t thu ti khu vc ni Pho, x H Thng, huyn i T, tnh Thi Nguyn l khu vc v ang chu nh hng ca hot ng khai thc khong sn nhiu nm.

Phn lp v thun khit c 70 chng x khun t cc mu t khc nhau: t trng ch, t trng keo, t trng mu, t trng la, t vn, t i trc. Kim tra hot tnh khng sinh ca cc chng x khun vi cc vi sinh vt kim nh bao gm: vi khun Gram dng, vi khun Gram m, nm mc, c bit c s dng cc chng nm gy bnh trn cy ch l loi cy trng ch o tnh Thi Nguyn.

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Tuyn chn c 3 chng x khun c hot tnh khng sinh cao c hot ph rng, c kh nng khng c cc vi sinh vt kim nh thuc cc nhm: vi khun Gram dng, vi khun Gram m, nm mc v nm gy bnh trn ch. Cc chng x khun ny c k hiu: HT17.8, HT19.1 v HT 12.2. y l cc chng c nhiu kh nng ng dng trong thc tin.

Kim tra hot tnh enzyme: amylase, protease v cellulase ca cc chng x khun v tuyn chn c 2 chng c hot tnh enzyme cao c k hiu l: HT12.7 v HT10.6. ng thi nghin cu c kh nng chu nhit ca cc enzyme.

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


M U
1. t vn T xa xa, cc bnh nhim khun l mt trong nhng ni kinh hong i vi con ngi. Chnh iu thi thc cc nh khoa hc trn th gii phi tm ra c mt cht c kh nng phng chng v iu tr cc bnh nhim khun. Nm 1928, A. Fleming pht hin ra penicillin - CKS c ngun gc t nm Penicillium nhng phi hn 10 nm sau, nm 1941, penicillin mi chnh thc c s dng trong y hc v cu sng c bnh nhn nhim trng mu u tin, cng t k nguyn CKS bt u. y l mt trong nhng thnh tu v i nht ca nhn loi trong th k XX. Tuy nhin, do vic s dng cc CKS khng hp l lm cho hin tng khng khng sinh xut hin, pht trin v ngy cng lan rng. Vic s dng mt s cht c hiu cha tr mt s loi bnh khng cn mang li hiu qu nh mong mun. S lng cc vi khun khng vi khng sinh ngy cng gia tng. Chnh v vy, vic tm kim ra nhng CKS mi lun thu ht s quan tm ca nhiu nh khoa hc. Cho n nay, con ngi pht hin khong 17.000 CKS c ngun gc VSV, hn 3.000 CKS bn tng hp v mi nm vn c khong vi trm CKS mi c pht hin. Trong s cc VSV sinh CKS th x khun ng vai tr quan trng hng u, chim 80% cc cht khng sinh c m t, trong ch yu thuc chi Streptomyces [11], [19]. Hin nay, c hai xu hng nghin cu iu chnh sinh tng hp cht khng sinh ca x khun l tuyn chn to ra cc chng x khun cng nghip c kh nng siu tng hp cht khng sinh v ti u ha cc thnh phn mi trng, thit b v iu kin ln men. Tuy cc loi cht khng sinh rt ph bin trn th trng nhng cng ngh sn xut cht khng sinh li ch yu tp trung vo mt s nc, mt s tp on dc phm ca M, Anh, c, H Lan v c bo h cht ch di dng cc sng ch c quyn, lu gi trong tng c s sn xut cng nghip v c xem nh nhng b mt thng mi [24].
1

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Thi Nguyn l mt tnh rt giu tim nng v nng, lm nghip nn c khu h VSV kh phong ph, trong s c khng t loi x khun sinh cht khng sinh. Mt khc, Thi Nguyn li nm trong vng sinh khong, c nhiu loi hnh khong sn phn b tp trung. in hnh l khu vc ni Pho thuc x H Thng - huyn i T, l ni v ang din ra cc hot ng khai thc khong sn mnh m.Trong ch yu l khai thc qung vonfram. Cc hot ng khai thc khong sn c nhng tc ng ng k n mi trng t, nc v qua , rt c th s nh hng n s phn b ca h VSV. Trn thc t c nhng nghin cu v nh hng ca hot ng khai khong ti s pht trin v a dng ca cc h ng, thc vt nhng li cha c nghin cu v nh hng ca hot ng ny ti s phn b v cc hot tnh sinh hc n h VSV t. Xut pht t nhu cu thc t , chng ti tin hnh thc hin ti: Tuyn chn v nghin cu hot tnh sinh hc ca mt s chng x khun phn lp ni Pho - i T - Thi Nguyn. 2. Mc tiu nghin cu - Kho st s phn b ca x khun trong cc mu t thu ti khu vc ni Pho, x H Thng, huyn i T, tnh Thi Nguyn l khu vc v ang chu nh hng ca cc hot ng khai thc khong sn nhiu nm. - Nghin cu hot tnh sinh hc ca x khun t c th tuyn chn ra mt s chng c nhiu trin vng ng dng trong thc t, c bit l trong cng tc bo v thc vt v mi trng. 3. Ni dung nghin cu - Phn lp v thun khit x khun t cc mu t. - Kim tra hot tnh khng sinh ca cc chng phn lp c vi cc VSV kim nh tuyn chn ra cc chng c hot tnh khng sinh cao. - Kim tra kh nng sinh enzyme ngoi bo chn ra cc chng c hot tnh enzyme cao. - Xc nh kh nng chu nhit ca dch enzyme.
2

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Chng 1

TNG QUAN TI LIU


1.1. Gii thiu v x khun 1.1.1. V tr phn loi v s phn b ca x khun trong t nhin Theo h thng phn loi hin nay, XK thuc ngnh Tenericutes (gm vi khun Gram dng v x khun), thuc gii vi khun tht (Eubacteria) v siu gii nhn s (Prokaryota) [34]. X khun thuc lp Actinobacteria, phn lp Actinobacteridae, b Actinomycetales, bao gm 10 phn b, 35 h, 110 chi v 1000 loi, trong c 478 loi thuc chi Streptomyces v hn 500 loi thuc cc chi cn li c xp vo nhm XK him [12], [42]. Streptomyces c bit nhiu trong t ni chng phn hy hoi sinh rt nhiu cc hp cht hu c bng cc enzyme ngoi bo. Mt phn rt ln cc cht khng sinh c s dng hiu qu trong iu tr c ngun gc t cc loi Streptomyces, trong c bit n nht l streptomycin, erythromycin, tetracyclin [40]. X khun l mt nhm vi sinh vt rt a dng trong a s sinh trng hiu kh v to khun ty phn nhnh tng t nh nm. Tn x khun actinomycete bt ngun t ting Hy Lp actys (tia) v mykes (nm) v ban u x khun c coi l vi nm v chng sinh trng ging vi nm. Mng li phn nhnh ca th si thng pht trin c b mt c cht rn (to thnh h si kh sinh) ln bn trong (to thnh h si c cht) [27]. y l mt trong nhng c im phn loi x khun. X khun l VK G(+) c t l G+C cao (>55%) trong DNA. a s x khun sng t do, hoi sinh v phn b rng ri trong t, nc v xc thc vt. X khun ng vai tr quan trng v mt sinh thi trong vng tun hon t nhin. Chng phn hy v s dng cc cht hu c kh phn hy nh humic acid trong t [42]. Nhiu chng x khun c kh nng ha tan lignhin bng cch sinh cc enzyme thy phn cellulose, hemicellulose v cc peoxidase ngoi bo [33]. Cc chng x khun xut hin trong mi trng
3

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


giu cht hu c nh cc compost, c hai pha n ha (mesophilic) v chu nhit (thermophilic) [39], v cng rnh nc thi ni m cc x khun cha mycolic acid kt hp vi vic to thnh cc bt kh v vng bt n nh, c trng [37]. Nhn chung, nhit n ha 25 - 30C v pH trung tnh l iu kin ti u cho x khun pht trin. Mc du vy, nhiu loi c phn lp cc mi trng khc nghit v d nh Arthrobacter ardleyensis a lnh c phn lp t trm tch h Nam cc c th sng nhit 0C [28] v Nocardiopis alkaliphila c phn lp t t sa mc Ai Cp c th sng pH 9,5 - 10 [30]. 1.1.2. c im hnh thi ca x khun * Khun lc c im ni bt ca x khun l c h si pht trin, phn nhnh mnh v khng c vch ngn (ch tr cung sinh bo t khi hnh thnh bo t). H si x khun mnh hn nm mc vi ng knh thay i trong khong 0,2 - 1 m n 2 - 3 m, chiu di c th t ti mt vi cm [11], [13]. Kch thc v khi lng h si thng khng n nh v ph thuc vo iu kin sinh l v nui cy. y l mt trong nhng c im phn bit khun lc ca x khun v khun lc ca nm mc v h si ca nm mc c ng knh rt ln thay i t 5 - 50 m, d quan st bng mt thng. Khun lc ca x khun thng chc, x x, c dng da, dng vi, dng nhung t hay dng mng do. Khun lc x khun c mu sc rt a dng: , da cam, vng, nu, xm, trng ty thuc vo loi v iu kin ngoi cnh. Kch thc v hnh dng ca khun lc c th thay i ty loi v ty vo iu kin nui cy nh thnh phn mi trng, nhit , m ng knh ca mi khun lc ch chng 0,5 - 2 mm nhng cng c khun lc t ti ng knh 1cm hoc ln hn.
4

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Khun lc c 3 lp, lp v ngoi c dng si bn cht, lp trong tng i xp, lp gia c cu trc t ong.

Hnh 1.1. Khun lc x khun [43] Khun ty trong mi lp c chc nng sinh hc khc nhau. Cc sn phm trong qu trnh trao i cht nh: CKS, c t, enzyme, vitamin, axit hu c c th c tch ly trong sinh khi ca t bo x khun hay c tit ra mi trng. * Khun ty Trn mi trng c cht c, h si ca x khun pht trin thnh 2 loi: mt loi cm su vo trong mi trng gi l h si c cht (khun ty c cht - substrate mycelium) vi chc nng ch yu l dinh dng. Mt loi pht trin trn b mt thch gi l h si kh sinh (khun ty kh sinh - aerial mycelium) vi chc nng ch yu l sinh sn. Nhiu loi ch c h si c cht nhng cng c loi (nh chi Sporichthya) li ch c h si kh sinh. Khi HSKS va lm nhim v sinh sn va lm nhim v dinh dng [8]. 1.1.3. S hnh thnh bo t ca x khun Bo t x khun c hnh thnh trn cc nhnh phn ha ca khun ty kh sinh - gi l cung sinh bo t. y l c quan sinh sn c trng cho x khun. Trn mi cung sinh bo t mang 30 - 100 bo t, i khi c th mang ti 200 bo t. Hnh thi, cung sinh bo t v bo t l cc c im quan trng nht trong phn loi x khun.

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Cung sinh bo t ca x khun c dng thng hoc ln sng (RF), dng xon l xo (S), chui bo t khng pht trin hoc xon n gin c hnh mc cu (RA). Bo t hnh thnh ng thi trn tt c chiu di ca cung sinh bo t theo 2 cch: kt on hay ct khc v thng c hnh tr, ovan, cu, que vi mp nhn hoc x x, c gai hoc gai pht trin di thnh dng lng [10]. Bo t x khun c bao bc bi mng mucopolysaccharide giu protein vi dy khong 300 - 400A chia lm 3 lp. Cc lp ny trnh cho bo t khi nhng tc ng bt li ca iu kin ngoi cnh nh nhit , pH Hnh dng, kch thc chui bo t v cu trc mng bo t l nhng tnh trng tng i n nh v l c im quan trng dng trong phn loi x khun. Tuy nhin nhng tnh trng ny c th c nhng thay 1.1.4. Cu to ca x khun X khun c cu trc t bo tng t VK G(+), ton b c th ch l mt t bo bao gm cc thnh phn chnh: thnh t bo, mng sinh cht, nguyn sinh cht, cht nhn v cc th n nhp. Thnh t bo x khun c kt cu dng li, dy 10 20 nm c cu to tng t thnh t bo ca VK G(+), thnh phn ch yu l peptidoglucan to nn mt lp vch t bo tng i vng chc. Phn tch di knh hin vi in t thnh t bo XK gm ba lp: lp ngoi cng dy 60A, lp trong v lp gia dy 50A. Cn c vo thnh phn ha hc, thnh t bo x khun c chia thnh 4 nhm chnh [5], [9]:
6

i nht nh khi nui cy trn mi trng c ngun nit khc nhau [14].

Hnh 1.2. Hnh dng cung sinh bo t v b mt bo t ca chng Streptomyces cinereoruber subp [6]

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Nhm I: Thnh phn chnh ca thnh t bo l axit L - 2,6 diaminopimelic (L - ADP) v glyxin. Chi Streptomyces thuc nhm ny. Nhm II: Thnh phn chnh ca thnh t bo l axit meso - 2,6 diaminopimelic (meso - ADP) v glyxin. Thuc nhm ny gm cc chi: Micromonospora, Actinoplanes, Ampullarriella Nhm III: Thnh phn chnh ca thnh t bo l axit meso - 2,6 -diaminopimelic. Thuc nhm ny c cc chi: Dermatophilus, Geodermatophilus, Frankia Nhm IV: Thnh phn chnh ca thnh t bo l axit meso - 2,6 -diaminopimelic, arabinose v galactose. Thuc nhm ny gm cc chi: Mycobacterium, Nocardia, Pseudonocardia Thnh t bo c kt cu dng li, c tc dng duy tr hnh dng ca khun ty v bo v t bo. Ngoi ra thnh t bo XK c th cho php nhiu cht nh: Cht khng sinh, axit amin v nhiu hp cht khc c kch thc tng i ln i qua mt cch d dng. Cc cht dinh dng t mi trng cng thm thu mt cch chn lc qua thnh t bo. Mng sinh cht l lp t bo nm ngay st di thnh t bo, dy khong 7,5 - 10 nm, chc nng ch yu l iu ha s hp thu cc cht dinh dng vo t bo, tham gia vo qu trnh hnh thnh bo t. T bo cht ca XK gm mt s thnh phn ch yu nh: th nhn, khng bo v th n nhp. Nhn ca t bo XK khng c cu trc in hnh, ch l nhim sc th khng c mng bao bc. Khi cn non, ton b t bo ch c mt nhim sc th sau hnh thnh nhiu ht ri rc trong ton b h khun ty. 1.2. i cng v cht khng sinh 1.2.1. Cht khng sinh (Antibiotic) Theo khi nim c, CKS l sn phm c ngun gc t vi sinh vt m ngay nng thp (g/ml) cng c th c ch hoc tiu dit cc vi sinh vt khc mt cch chn lc (vi khun, nm men, nm mc). Thut ng antibiotic c bt ngun t ch Hi Lp: anti l khng li, bios l s
7

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


sng. Thut ng ny c Waksman s dng vo nhng nm 1940 phn bit penicillin vi sulfonamit c pht hin t nhng nm 1930. Thut ng ny c thay i sau khi penicillin v cc cht khng khun khc c ci tin v tng hp mi trong phng th nghim. Ngy nay, thut ng ny c s dng ph bin ch cc hp cht khng khun t nhin, tng hp hoc bn tng hp c hiu qu dit khun nng thp. Nhiu cht khng sinh c s dng nh mt cht ha tr liu c kh nng khng virus, t bo ung th Tt c cc CKS u c tnh c chn lc, mi CKS thng ch tc dng vi mt nhm vi sinh vt nht nh [10]. 1.2.2. Lc s nghin cu cht khng sinh Khng sinh l thuc c con ngi dng ch yu chng cc bnh truyn nhim. Cc bnh truyn nhim chim phn ln trong cc bnh ca con ngi v ng vt. Cho n na sau th k 19 ngi ta pht hin rng vi sinh vt chnh l th phm gy ra hng lot cc bnh truyn nhim. Do liu php ha hc nhm vo cc VSV gy bnh c pht trin thnh liu php iu tr chnh. Nm 1928, Fleming pht hin ra penicillin v khng sinh c dng trong iu tr vo nhng nm 1940. Ngay sau penicillin tr thnh mt khng sinh ni ting v cu sng nhiu chin binh trong chin tranh th gii II [36]. T nhng nm 1940 n cui nhng nm 1960, nhiu khng sinh mi c xc nh hu ht t x khun, v tr thnh thi k vng son ca ha liu php khng sinh (bng 1.1).

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Bng 1.1. Khng sinh c pht hin qua cc nm [6] Nm 1929 1943 1947 1950 1956 1963 1971 CKS c pht hin Penicillin Streptomycin, Bacitracin Cloramphenicol Oxytetracyclin Vancomycin Gentamycin Torbamycin Nc Anh M M M M M M Nm 1939 1945 1949 1952 1957 1966 1972 CKS c pht Nc hin Gramicidin Cephalosporin Neomycin Erythromycin Kanamycin Docycyclin Cephamycin M Italia M M Nht M M

Nm 1944, streptomycin c pht hin t x khun t Streptomyces griseus. Sau n chloramphenicol, tetracyclin, cc khng sinh thuc nhm macrolide v glycopeptide [11]. Vo nm 1962, cc khng sinh tng hp nh nalidixic acid, thuc chng VSV c bn cht quinolone cng c to ra. Vic ci tin trong tng lp khng sinh tip tc thu c ph khng VSV rng hn, hot tnh khng VSV cao hn, v d nh cc khng sinh lactam. Vic pht hin, pht trin v s dng cc khng sinh trong iu tr th k 20 lm gim ng k t l cht do nhim khun. Tuy nhin t nm 1980 s khng sinh mi c a vo iu tr gim hn do chi ph pht trin v th nghim thuc mi ngy cng ln. Bn cnh , mt hin trng ng bo ng l ngy cng tng cc VSV gy bnh khng vi cc khng sinh hin c. Do vy, cc nghin cu cn phi tp trung vo lm th no vt qua tnh khng thuc khng sinh cng nh pht hin cc khng sinh mi c c ch hot ng khc nhau [29].

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


1.2.3. S hnh thnh cht khng sinh x khun Mt trong nhng c im quan trng ca x khun l kh nng hnh thnh cht khng sinh. a s cc CKS ang dng trong y hc hin nay c ngun gc t XK, trong khong 5.500 CKS bit n hin nay, c ti hn 4000 cht t XK [2]. a s cc cht khng sinh c ngun gc t x khun u c ph khng sinh rng, km hm hoc c ch s sinh trng v pht trin ca nhiu loi VSV khc nhau. Ngy nay, ngi ta bit CKS l sn phm trao i th cp ca vi sinh vt. Du vy vn cn nhiu gi thuyt khc nhau v vai tr ca CKS i vi XK. Mt s tc gi cho rng s hnh thnh cht khng sinh l c ch gip x khun tn ti trong mi trng t nhin, s hnh thnh CKS l do s cnh tranh mi trng dinh dng. Li c gi thuyt cho rng CKS ch l sn phm thi ra ca qu trnh trao i cht ca t bo [17], [23]. C 3 con ng sinh tng hp cht khng sinh x khun: CKS c tng hp t 1 cht trao i bc I, thng qua mt chui cc phn ng enzyme. CKS c hnh thnh t 2 hoc 3 cht trao i bc I khc nhau. CKS c hnh thnh bng cch polime ha cc cht trao i bc I, sau tip tc bin i qua cc phn ng enzyme khc. Nhiu chng x khun c kh nng tng hp ng thi hai hay nhiu CKS c cu trc ha hc v tc dng sinh hc tng t nhau [6], [7]. 1.2.4. Cc cht khng sinh c ngun gc t x khun a s cc CKS c dng trong y hc c ngun gc t x khun, trong s c nhiu cht hin vn ang c s dng tng i ph bin trong thc tin. Streptomycin: c Waksman pht hin ra t nm 1943, c ngun gc t x khun Streptomyces griseus, c kh nng chng cc VK G(+) kh mnh. Streptomycin c s dng rt hiu qu iu tr cc bnh dch hch, ho g v c bit quan trng hn c l dng cha cc bnh lao [10].
10

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Neomycin: L cht khng sinh c hot ph rng, c tch ra t x khun Streptomyces fradiae vo nm 1949, c tc dng chng c VK G(+) v G(-) . c bit l chng c nhiu loi vi khun khng li vi penicillin v streptomycin [10]. Gentamycin: C ngun gc t x khun Micromonospora purpurea, c ph khng sinh rng, c tc dng chng c VK G(+) nh t cu, ph cu khng li penicillin v VK G(-) nh mng no cu, lu cu. Trong y hc, ch yu dng iu tr cc bnh do nhim Pseudomonas [10]. Tetracyclin: L khng sinh c tch chit t dch nui cy mt s chng x khun thuc chi Streptomyces, cc CKS ny c ph khng sinh rng, chng c c VK G(+) v G(-), ricketsia v mt vi loi virus ln. Ngoi s dng trong y hc, tetracyclin cn c s dng trong chn nui - th y [2], [10]. Cloramphenicol: c ngun gc t x khun Streptomyces venezuelae, c pht hin vo nm 1947, c hot tnh chng c nhiu VK G(+) v G(-). Ngoi s dng trong y hc, CKS ny cn c dng trong chn nui - th y v thy sn [32]. Erythromycin: C ngun gc t XK Streptomyces erythreus, l CKS c ph rng i vi VK G(+), c s dng nhiu nht trong iu tr bnh vim phi do Mycoplasma v vim hng do lin cu khun [10], [23]. Novobicin: C ngun gc t XK Streptomyces spheroides v Streptomyces niverus, c hot tnh mnh vi cc VK G(+). c bit c kh nng chng cc t cu khng vi penicillin v mt s CKS khc [21]. Amphoterycin B: C ngun gc t XK Streptomyces nodosus, c dng iu chnh cc bnh ngoi da do nm Candida abbicans gy ra [23]. Dactinomycin: C ngun gc t XK Streptomyces antibiticus, c hot tnh km hm pht trin cc khi u c tnh. c dng iu tr mt s bnh ung th [23]. Daunorubixin: C ngun gc t XK Streptomyces coeruleorubidus, c dng iu tr bnh bch cu cp tnh, bnh Hodgkin [23]. 1.3. ng dng ca cht khng sinh
11

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


1.3.1. ng dng trong y hc K t khi CKS c s dng v cu sng c bnh nhn b nhim trng mu nm 1941 [22], n nay hng lot CKS c pht hin v ng dng trong y hc ng gp mt phn khng nh trong cng tc phng v iu tr bnh tt, nht l cc bnh nhim khun ca con ngi. Nh c cc loi thuc khng sinh m con ngi khng ch v loi b c nhiu bnh nguy him nh dch t, thng hn v.v Hin nay cc loi bnh ph bin do nm gy ra nh nm da, nm tc, mng chn, mng tay u s dng khng sinh iu tr bng cch bi trc tip ln da b nhim bnh hoc bng cch ung. C nhiu loi thuc c s dng iu tr bnh ny nh: nystatin, natamicin, hamicin, rimocyclin Phn ln cc CKS c s dng trong y hc c ngun gc t XK, trong c ti 1/3 cc cht khng sinh l do x khun him sinh ra. Trong y hc, khng sinh c th c dng kt hp cng lc nhiu loi khng sinh nhm mang li hiu qu cng hp - tng liu gp hai ca mi loi khng sinh (khi kt hp hai KS hm khun) hoc hiu qu cng lc - tng hiu lc ca CKS (khi kt hp hai KS dit khun) [22]. Cn bnh ung th l mt trong s nhng bnh rt nguy him i vi con ngi. Trc y thng s dng bin php x tr v phu thut iu tr th ngy nay y hc bit s dng thuc KS trong trng hp bnh chuyn sang giai on di cn. Hin nay y hc s dng thuc khng sinh trong iu tr ung th nh daunorubicin c dng trong iu tr bnh bch cu cp tnh, i vi vic phng loi bnh ny ngi ta dng penicillin G hay erythromycin. Cc thuc khng sinh nh mitomycin (do S. cacspitosus sinh ra) c dng trong iu tr ung th v, d dy, phi, i trng [22]. Tuy nhin, cho n nay cha c CKS no c th iu tr cc bnh do virus gy ra mt cch c hiu qu do virus khng chu tc ng ca CKS. 1.3.2. ng dng trong bo v thc vt v chn nui th y
12

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Cht khng sinh khng ch c s dng trong y hc cha bnh cho con ngi m cn c ng dng rng ri trong mt s lnh vc khc nh: bo v thc vt, chn nui, bo qun thc phm Trong chn nui, khng sinh c dng phng cha bnh v kch thch tng trng cho gia sc, gia cm. Khng sinh b sung vo thc n chn nui c tc dng c ch v loi b s hot ng ca vi khun, c bit l vi khun gy bnh ng tiu ha v h hp trn ng vt non, lm cho chng khe mnh, tng trng tt. Rt nhiu KS c dng vi mc ch ny nh tetracyclin, bacitraxin, monelzin Vit Nam, nm 1982 sn xut ch phm biovit 5 v terravit trn quy m 12 tn/nm. Kt qu th nghim trn gia sc, gia cm tng trng 15 - 25%, gim tiu tn thc n 8,2%, tng sn lng trng g 5 7% [1]. Hin nay, bin php thng c s dng trong cng tc bo v thc vt chng li su bnh l s dng cc thuc ha hc. Nhng thuc ha hc c nhiu nhc im nh hin tng khng thuc ca su bnh, mt khc li gy nhim mi trng v nhiu cht c tn d trong sn phm c th gy c cho con ngi v.v khc phc nhng nhc im trn th vic s dng cc CKS trong bo v thc vt va c tc dng nhanh, d phn hy, c tnh c hiu cao, ch tiu dit mt hoc mt s su bnh nht nh m khng nh hng n cc loi c ch khc v c bit cht khng sinh cn c kh nng c ch cc vi sinh vt khng thuc ha hc. Cc khng sinh c dng tiu dit cc nm v vi khun gy bnh cho cy trng nh cc bnh kh vn, vng la la, bnh thi c r cc cy c c Ngoi ra CKS cn c s dng lm cht kch thch tng trng nhng nng nht nh nh kch thch s ny mm ca ht. Cc CKS c dng trong cng tc bo v thc vt thng dng bt hoc dung dch c b sung cc cht n tng bn ca CKS. Cc CKS c th c trn ln vo t, phun trc tip ln thc vt hoc dng trong qu trnh x l ht ging tiu dit cc mm bnh bn trong v bn ngoi ht.
13

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Ngy nay, vic s dng cc CKS trong cng tc bo v thc vt c ph bin rng ri trn th gii nht l cc nc Nga, Nht, Trung Quc, n Nm 1950, Trung Quc tuyn chn c chng Streptomyces sp. 5406 c kh nng c ch Rhizoctonia solani v Verticillium albo atrum gy thi r bng non [19]. Nm 2002, n phn lp c chng Streptomyces sp. 201 c kh nng sinh CKS mi l z methylheptyl iso nicotinate, CKS ny c kh nng khng c nhiu loi nm gy bnh nh Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium semitectum, Fusarium moniliforme[17]. Hin nay, nc ta cng bt u s dng cc CKS c ngun gc t Trung Quc, Nht Bn thay th dn cho vic s dng cc cht ha hc c hi trong cng tc bo v thc vt. Nm 2002, Trung tm cng ngh sinh hc HQGHN phn lp c t t chng XK Streptomyces sp . LD30 c kh nng sinh CKS ph rng, khng vi khun v nm, nhng mnh nht l chng chng Pseudomonas solanacearum gy bnh ho l cy trng [4]. Ngoi cng tc bo v thc vt v chn nui th y th CKS cn c s dng trong cng ngh thc phm. Dng khng sinh bo qun thc phm va r va n gin, va khng cn trang thit b c bit nhng vn m bo cht lng thc phm. Mt s CKS c s dng trong bo qun thc phm nh: clotetraciclin, nisin, subtilin, actidion, biomicin Tuy nhin, vic s dng CKS trong bo qun thc phm cng cn c mt s tn ti: cht khng sinh kh phn hy v khi tn d trong thc phm c th gy ra nhiu mi nguy him cho ngi, lm xut hin nhiu chng vi sinh vt c kh nng khng thuc, lm mt tc dng ca cht khng sinh trong iu tr. V vy, khc phc tn ti trn vic s dng cht khng sinh trong bo qun thc phm cn phi tun theo ng nguyn tc. 1.4. Kh nng tng hp enzyme ca vi sinh vt 1.4.1. u th ca vi sinh vt sinh tng hp enzyme
14

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Enzyme l nhng protein c sn xut t nhin t thc vt, ng vt, vi sinh vt, c vai tr quyt nh qu trnh trao i cht ca t bo. Chng l nhng cht xc tc thc y tc cc phn ng ha hc m khng lm thay i tnh cht ca chng. Vic sn xut v s dng enzyme c t lu nhiu nc trn th gii. Tuy nhin, ch sau khi con ngi chng minh c kh nng xc tc ca enzyme ngoi t bo th vic nghin cu, sn xut v ng dng enzyme mi thc s pht trin mnh m. Ngy nay, nhiu loi enzyme c sn xut ra vi sn lng ln v c s dng rng ri trong nhiu ngnh kinh t khc nhau nh: cng nghip thc phm, dc phm, dt, ha cht Trc y con ngi tin hnh sn xut ch phm enzyme t ng, thc vt vi khi lng ln (vn tn/nm) nhng khng kinh t v cha p ng c nhu cu tiu dng, do lng enzyme trong c th ng, thc vt rt hn ch. VSV tri li c th tng hp c mt lng ln cc enzyme khc nhau. Do vy VSV l i tng chnh c s dng sn xut enzyme trong vng 30 nm tr li y [25]. H enzyme VSV v cng phong ph: VSV c th ng ha c hu ht cc cht c trong thin nhin, t cc hp cht n gin nh: N2, S, Fe, CO2, CH4 n cc hp cht hu c phc tp nh: tinh bt, protein, cc pectin, cellulose chng t rng trong t bo VSV phi c cha nhng h enzyme tng ng [3]. iu cho php con ngi m ra kh nng tm kim v chn la nhng phc h enzyme cn thit phc v cho cc nhu cu cng ngh khc nhau, c bit l cc nhm enzyme khng th khai thc c t ngun ng vt v thc vt. Enzyme VSV c hot tnh cao hn enzyme t cc sinh vt khc do VSV c tc chuyn ha thc n rt ln. VSV sinh trng v pht trin rt nhanh chng, hm lng enzyme trong t bo tng i ln nn trn quy m sn xut cng nghip, ch sau khong thi gian ngn c th ln men sn xut c lng ln ch phm enzyme. Vic ln men sn xut enzyme c th trin khai trn quy m sn xut cng nghip nn khng b hn ch ln v din tch v s bin i v thi tit, kh hu Phn ln cc thc n nui VSV u l cc ngun nguyn liu n
15

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


gin, r tin v d kim. Trong thc tin sn xut enzyme hin nay thng dng cc nguyn liu cht lng thp, cc ph phm hay ph thi ca mt s ngnh sn xut khc v mt s mui v c. Do vic sn xut enzyme nh VSV c kh nng trin khai vi nhiu u th cho php to hiu qu kinh t cao. VSV rt nhy cm vi tc ng ca mi trng v c kh nng iu chnh qu trnh trao i cht (m thc cht l iu chnh s sinh tng hp hay iu chnh hot lc ca enzyme) thch nghi nhanh chng vi iu kin mi trng. V vy, thng qua vic thay i thnh phn mi trng dinh dng hay iu chnh cc iu kin trong qu trnh ln men, ngi ta cn c kh nng iu chnh ph cc enzyme s c tng hp, lm tng cng nng lc sinh tng hp enzyme hay lm thay i hot tnh ca chng. Ngoi ra, so vi ngun enzyme ng vt v thc vt, i vi nhm enzyme ngoi bo VSV ngi ta khng cn phi ph v t bo nn c th s dng c tc nhn qua nhiu chu k sn xut, ng thi, vic tinh ch thu enzyme ngoi bo VSV thng d dng v chi ph thp hn.

16

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


1.4.2. Tuyn chn cc chng sinh enzyme cao t t nhin VSV sng khp ni trn Tri t, chng c kh nng bin d nhanh duy tr s sng v tn ti trong cc iu kin sng thay i. VSV c h enzyme a dng v phong ph. Tuy nhin khng phi tt c cc VSV u c kh nng sinh enzyme nh nhau, ngay c nhng chng cng mt ging cng khng cng hot tnh sinh tng hp enzyme. V vy, khi tuyn chn VSV tm kim, la chn v phn lp chng c hot lc cao trong vic to thnh enzyme mong mun l cn thit. V d, mun la chn cc chng VSV sinh enzyme chu nhit nn la chn t sui nc nng hay b rc thi; tuyn chn cc VSV sinh enzyme chu kim, chu axit phi t ni c kim cao hay axit cao; la chn chng sinh amylase th la chn ni c nhiu tinh bt; la chn chng sinh enzyme chu mn th nn la chn chng t ngun nc bin; la chn chng sinh cellulase thng tm thy cc mu t c nhiu xc thc vt b phn hy. Nh vy, trong t nhin, nhiu loi VSV c kh nng s dng trong sn xut i hi cc bc nghin cu cng phu, mt nhiu cng sc. Tuy hin nay c nhiu chng VSV a vo sn xut nhng cn nhiu lnh vc i hi tip tc nghin cu tuyn chn cc chng mi nhm phc v cao nht cho con ngi. 1.4.3. Mt s enzyme ph bin c ngun gc t vi sinh vt Tuy bit hn 1000 loi enzyme khc nhau nhng cng ch cc enzyme thy phn mi c s dng rng ri trong hn 30 ngnh kinh t khc nhau, l cc enzyme amylase, cellulase v protease. Lng cc enzyme sn xut hng nm: protease t vi khun l 500 tn/nm, protease t nm mc l 10 tn/nm, pectinase l 10 tn/nm [26]. Cc enzyme ny c ng dng nhiu trong nng nghip, c bit l trong chn nui, vi mc ch l lm tng gi tr dinh dng, tng h s tiu ha thc n, gim chi ph thc n Cc enzyme c dng ngy cng nhiu cc nc trn th gii. * Enzyme amylase: Amylase l cc enzyme ng ha, c kh nng phn hy amylose v amylopectin v cc polysaccharit tng t gii phng glucose. Cc enzyme ny c ngha quan trng trong vic phn hy ph thi cha cc ngun tinh bt t cc lng ngh lm bn, bnh a, bnh cun, ch bin
17

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


nng sn ng, khoai, sn... T cc ph thi lng thc ny, nh cc amylase c th dng sn xut alcohol. Cng nh cc enzyme ng ho -amylase v glucoamylase, t cc ph thi lng thc cha tinh bt ca cc dy chuyn quy trnh ch bin thc n c th sn xut mng bao gi c tnh cht phn hu quang hc v sinh hc [31]. * Enzyme cellulase: Trong thp k qua, enzyme thu phn cellulose ngy cng c quan tm. S quan tm ny l do cc enzyme ny c kh nng thy phn cht thi cha cellulose, chuyn ho cc hp cht kiu lignocellulose v cellulose trong rc thi to nn ngun nng lng thng qua cc sn phm ng, ethanol, kh sinh hc hay cc cc sn phm giu nng lng khc. Th d: t cc cht thi nh my giy nh cc sn phm t bt giy v giy c th thu ngun nng lng ethanol [32]. * Enzyme protease: Protease thuc nhm enzyme thy phn protein c s dng rng ri trong cng nghip thc phm, chng hn trong ch bin c v tht. Protease c th thy phn cc protein c trong cht thi, sn xut cc dung dch c hoc cc cht rn kh c gi tr dinh dng cho c hoc vt nui. Protease thy phn cc protein khng tan thng qua nhiu bc, ban u chng c hp th ln cc cht rn, ct cc chui polypeptit to thnh cc lin kt lng trn b mt. Sau , qu trnh ho tan nhng phn rn xy ra vi tc chm hn ph thuc vo s khuch tn enzyme ln b mt c cht v to ra nhng phn nh. Chnh v tnh cht trn m protease c s dng, mt mt tn dng cc ph thi t ngun protein nhng ph thi ny khng cn l cc tc nhn gy nhim mi trng, mt mt x l cc ph thi protein tn ng trong cc dng chy thnh dng dung dch ra tri khng cn mi hi thi [35].

18

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Chng 2 I TNG, VT LIU V PHNG PHP NGHIN CU
2.1. Vt liu nghin cu 21 mu t c ly t cc a im khc nhau thuc khu vc ni Pho - i T - Thi Nguyn. y l khu vc v ang c cc hot ng khai thc khong sn nhiu nm. 2.2. i tng nghin cu 2.2.1. X khun Gm 70 chng x khun phn lp t cc mu t ti khu vc ni Pho i T - Thi Nguyn c s dng nghin cu cc hot tnh sinh hc. 2.2.2. Vi sinh vt kim nh Gm 11 chng VSV kim nh thuc: vi khun Gram (+), vi khun Gram (-), nm mc v 4 chng nm phn lp trc tip t cc mu ch b bnh trng ti Thi Nguyn (bng 2.1). Bng 2.1. Cc chng VSV kim nh
Vi sinh vt kim nh VK G (+) VK G (-) Staphylococcus aureus ATCC 25923 Bacillus subtilis VTCC-B-888 Escherichia coli VTCC-B-883 Pseudomonas aeruginosa VTCC-B-481 Fusarium oxysporum VTCC-F-1301 Nm mc Fusarium solani VTCC-F-1302 Aspergillus niger VTCC-F-001 1 Nm gy bnh trn ch N2 PL3 TB4 C quan cung cp Vin Kim Nghim B Y t Vin Bo tng ging chun VSV Vit Nam Vin Bo tng ging chun VSV Vit Nam Vin Bo tng ging chun VSV Vit Nam Vin Bo tng ging chun VSV Vit Nam Vin Bo tng ging chun VSV Vit Nam Vin Bo tngging chun VSV Vit Nam Khoa KHSS Trng H Khoa hc H Thi Nguyn Khoa KHSS Trng H Khoa hc H Thi Nguyn Khoa KHSS Trng H Khoa hc H Thi Nguyn Khoa KHSS Trng H Khoa hc H Thi Nguyn

2.3. Ha cht, dng c v thit b


19

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


2.3.1. Ha cht - Cc loi ng chun: glucose, saccharose, lactose, fructose, mantose ca hng Merck (c), Trung Quc sn xut. - Cc loi mui: K2HPO4, KH2PO4, KI, MgSO4.7H2O, KNO3, CaCO3, NaCl, FeSO4.7H2O nhp t Anh, Trung Quc. - Cc loi cao: cao tht, cao nm men, cao malt, peptone ca hng Merck (c). - Cc loi ha cht khc: Thch, tinh bt tan, casein, CMC (Carboxyl Methyl Cellulose) ca Nht, Trung Quc, Vit Nam sn xut. 2.3.2. Dng c v thit b - KHVQH Olympus (Nht) - KHVT Joel (Nht) - My lc (Hn Quc) - Box cy v trng Nuaire (M) - My ly tm Hettich (c) - T lnh 2.3.3. Mi trng nghin cu * Mi trng Gause I (g/l): Mi trng phn lp v gi ging x khun Tinh bt tan: 20; K2HPO4: 0,5; MgSO4.7H2O: 0,5; NaCl: 0,5; KNO3: 0,5; FeSO4: 0,01; Thch: 20; Nc my va 1 lt, pH: 7,0 - 7,4. * Mi trng MPA (g/l): Mi trng nui cy vi khun Cao tht: 5; pepton: 10; NaCl: 5; thch: 18; Nc my va 1 lt; pH: 7,0 - 7,2. - T m, t sy Memmert (c) - Cn phn tch, cn k thut - Ni kh trng (i Loan) - My o pH 151 Martini (Nht) - My ct nc Hamilton - L vi sng Sharp

- Cc dng c thy tinh ca Trung Quc, c, Vit Nam

* Mi trng khoai ty (g/l): Mi trng phn lp v gi ging nm mc chun


20

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Khoai ty: 200; ng: 20; Thch: 20; pH = 7 - 7,4 * Mi trng Crapek - Thom (g/l): ): Mi trng phn lp v gi ging nm ch NaNO3: 2; K2HPO4: 1; MgSO4: 0,5; KCL: 0,5; FeSO4: 0,01; Saccharose: 30; Thch: 20; Nc my va 1 lt; pH = 7 - 7,4 * Mi trng xc nh hot tnh enzyme ngoi bo Mi trng tinh bt tan (g/l): Tinh bt tan: 2; Thch: 18; Nc ct va 1 lt. Mi trng CMC (Carboxyl Methyl Cellulose) (g/l): CMC: 2; Thch: 18; Nc ct va 1 lt. Mi trng casein (g/l): Casein: 2; Thch: 18; Nc ct va 1 lt. 2.4. Phng php nghin cu 2.4.1. Phng php ly mu t Dng dao ly khong 10 - 15 g t cch b mt t 5 - 20 cm cc v tr khc nhau (4 - 5 v tr) trong 1 vng 50 m2. Trn u cc mu t v ng vo ti nilng kh trng. Ngoi ti ghi r loi t, ngy v ni ly mu [12]. t ly v c phn lp ngay hoc c th bo qun trong t lnh nhit 40C trong thi gian 24 gi. 2.4.2. Phng php phn lp x khun 2.4.2.1. Phn lp x khun theo Vinogradski Cn 1 g t cho vo bnh nn 50 ml cha 9 ml nc ct v trng, lc trn my lc 30 pht. Dng pipet v trng ht 0,5 ml dch t sang ng nghim c cha 4,5 ml nc v trng v tip tc pha long n 10 -2, 10-3 10-6. T mi nng pha long, nh 0,1 ml dch sang a Petri cha mi trng Gause 1. Dng que gt v trng chang u, sau nui nhit phng t 4 - 7 ngy. Trn mi mu t, khun lc ca x khun c cy ria 3 pha sang a Petri cha mi trng Gause 1 lm sch. Sau nui nhit phng 4 - 7 ngy, t cc khun lc c lm sch cy truyn sang ng
21

Nc my va 1 lt;

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


nghim cha mi trng thch nghing Gause 1, tip tc nui iu kin trn trong 10 - 14 ngy [13]. Theo ISP (Chng trnh x khun quc t), mu sc khun ty kh sinh ca cc chng x khun c chia thnh 8 nhm mu: nhm mu trng (White), nhm mu xm (Grey), nhm mu (Red), nhm mu vng (Yellow), nhm mu xanh lc (Green), nhm xanh mu da tri (Blue), nhm mu tm (Violet), v nhm mu khng xc nh (X) [17, 18, 35]. 2.4.2.2. Phng php m s lng khun lc mc trn a thch Sau khi nui cy nhit v thi gian thch hp, m s lng khun lc mc trong mi a Petri, t tnh s lng t bo trong 1 g t. * Cch m: m s khun lc bng cch p sp a Petri, trn mt y pha ngoi ca a, dng bt vit knh nh du cc khun lc c m. Nu s lng khun lc nhiu, dng bt chia mt y thnh cc phn v m s khun lc trong tng phn sau cng li. Khng m cc a khun lc mc qu dy khng th m c hoc cc a b nhim nh hng n s pht trin ca x khun. * Cch tnh kt qu: Theo l thuyt: 1 khun lc c hnh thnh t 1 t bo. Tuy nhin trn thc t kh c th xc nh c chnh xc l mt khun lc c th c hnh thnh t 1 hay nhiu t bo. V vy tnh tng s t bo c trong 1 n v th tch, ngi ta thng dng thut ng n v hnh thnh khun lc trong 1 n v th tch (CFU - Colony Forming Unit). Nh vy t s khun lc mc trn a thch c th suy ra s lng t bo (CFU) c trong 1 g t theo cng thc sau: CFU/g = A x 1/K x 1/V Trong : A: S lng khun lc trung bnh mc trn cc a thch c cng pha long. V: Th tch dch t pha long c cy gt trn a thch.
22

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


K: pha long ca dch t c cy trn thch. S CFU/1 a Petri c coi l tt tnh tng s CFU/1 g t nu khi cy 0,1 ml dch t pha long trn mi trng m c t 30 - 300 khun lc/1 a. 2.4.3. Phng php thun khit v bo qun ging Do mt ca khun lc gim dn theo pha long ca dch huyn ph nn cc a thch c pha long thp, cc khun lc thng mc tch ri nhau v c kh nng c hnh thnh t mt t bo ring r. Dng que cy v trng ly mt t t bo t cc khun lc ring r trn a cy vo cc ng thch nghing c cha mi trng Gause 1, vo t m 28 - 300C trong thi gian t 4 - 7 ngy, sau kim tra tht k thun chng ca cc chng ging, loi b cc ng b nhim. Gi cc ng ging ny trong t lnh nhit 2 - 40C. bo qun ging cho cc nghin cu tip theo, chng ti tin hnh cy chuyn ging nh k 3 thng mt ln trn mi trng thch nghing Gause 1, trc khi s dng cn cy chuyn ging sang ng thch mi [9]. 2.4.4. Phng php xc nh hot tnh khng sinh * Phng php thi thch y l phng php s tuyn x khun c hot tnh khng sinh. X khun c nui cy trn mi trng Gause 1, Gause 2, hoc ISP4 trong a Petri sau 5 - 7 ngy. Nui cy VSVK trn cc mi trng thch hp trong cc a Petri (vi khun nui trn mi trng MPA, nm mc nui trn mi trng khoai ty). Dng khoan nt chai khoan cc thi thch c x khun c nui cy t 5 - 7 ngy, sinh trng tt, khng b nhim. t cc thi thch ln b mt mi trng thch a cy VSV kim nh. Sau t cc a vo t lnh 40C trong vng 4 - 5 gi cht khng sinh khuch tn ri nui 28 - 300C. c kt qu sau 24 gi i vi vi khun kim nh, 48 - 72 gi i vi nm kim nh. Hot tnh khng sinh ca mi chng x khun c xc nh theo kch thc vng v khun: D - d (mm), trong D l ng knh vng v khun, d l ng knh ca thi thch.
23

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


* Phng php c l y l phng php xc nh hot tnh khng sinh ca dch ln men. X khun c nui lc trong mi trng Gause 1 dch th trn my lc trn vi tc 220 vng/pht trong 5 - 7 ngy, thu dch khng sinh th bng cch ly tm dch ln men 5000 vng/pht trong 10 pht. Dng khoan nt chai khoan l trn b mt thch cy VSV kim nh trong cc a Petri. Nh vo mi l khoan 0,1 ml dch khng sinh cn th. Cc bc tip theo tin hnh nh phng php thi thch [7, 9, 14]. 2.4.5. Phng php ln men x khun T ng thch nghing, ging c hot ha c cy sang cc bnh nn c dung tch 250 ml cha 25 ml mi trng Gause 1 v nui lc 220 vng/pht nhit 28 - 30 0C trong thi gian 5 - 7 ngy. Sau thu dch ln men, li tm vi tc 5000 vng/pht trong 10 pht thu ring sinh khi v phn dch. Ty theo mc ch nghin cu m s dng phn dch hay phn sinh khi xc nh hot tnh khng sinh ca dch ln men hay ca sinh khi t bo [9]. 2.4.6. Xc nh hot tnh enzyme ca x khun bng phng php khuch tn trn a thch Nui cy XK trn mi trng Gause 1 dch th trn my lc 220 vng/pht sau 5 - 7 ngy thu dch enzyme t mi trng nui cy bng cch ly tm 5000 vng/pht trong 10 pht. Xc nh hot tnh enzyme bng phng php c l: dng khoan nt chai khoan cc l trn mi trng c cht. Nh vo cc l khoan dch nui cy x khun. Sau t cc a vo t lnh 40C trong vng 4 - 5 gi cht khng sinh khuch tn ri nhit phng trong thi gian 12 24 gi. Hin vng phn gii bng cc thuc th tng ng: i vi tinh bt hin bng thuc th lugol, i vi CMC hin bng cng g v i vi casein hin bng axit tricloaxetic (hay comasie blue). Hot tnh enzyme c xc nh bng gi tr D - d (mm), trong D l ng knh vng thu phn c cht, d l ng knh l thch.
24

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


2.4.7. Phng php xc nh kh nng chu nhit ca enzyme Dch nui cy sau khi lc c un cch thy cc mc nhit : 400C, 500C, 600C, 700C, 800C trong cc khong thi gian 20, 40 v 60 pht, sau ngui v xc nh hot tnh enzyme bng phng php khuch tn trn a thch. 2.4.8. Phng php x l s liu Kt qu nghin cu c x l theo phng php thng k sinh hc trn phn mm excel. y l phn mm lp trnh sn, cc hm s dng c da trn nhng cng thc c bn ca ton thng k trong c cng thc: - Gi tr trung bnh ( X ): - lch chun ( ): - Sai s m:
m =

X =

1 n Xi n i =1
n i

(X
i =1

X )2

n 1

Chng 3 KT QU V THO LUN


3.1. Kt qu phn lp x khun 3.1.1. Phn b ca x khun trong t T 21 mu t thu t cc loi t khc nhau thuc khu vc ni Pho - i T - Thi Nguyn, chng ti phn lp v thun khit c 70 chng x XK. S lng v s phn b ca x khun trong t c trnh by trn bng 3.1. Bng 3.1. S phn b ca x khun t cc mu t khc nhau Loi t ly mu t trng ch t trng keo t trng mu t trng la t vn S lng mu 4 3 3 3 3 pH ca t 4,1 6,2 7,6 6,7 7,5
25

S lng S chng phn XK/g (CFU/g) lp c 6 1,5 x 10 5 6 2,3 x 10 4 6 5,5 x 10 8 6 2,0 x 10 1 6 8,7 x 10 40

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


t i trc Tng 5 21 4,2 4,5 x 106 12 70 Kt qu trn bng 3.1 cho thy s phn b ca x khun trong cc mu t l kh phong ph v ph thuc nhiu vo c im, tnh cht ca tng loi t. X khun thng phn b nhiu cc loi t ti xp, thong kh, giu cht hu c, c pH v m thch hp. S lng x khun gp nhiu nht loi t vn (8,7 x 106) v t trng mu (5,5 x 106). y l nhng loi t thng xuyn c cuc xi, b sung ngun dinh dng, c m v pH thch hp. Tt c cc c tnh ny l iu kin rt thun li cho s phn b ca x khun. V vy, s chng x khun phn lp c t loi t ny cng nhiu nht. Ngc li, nhng loi t ngho dinh dng, c m khng thch hp v c bit l c pH qu cao hay qu thp, x khun phn b rt t. Theo cc kt qu nghin cu, t chu nh hng ca cc hot ng khai thc thic khu vc ni Pho u thuc loi t chua [15], v vy, y l loi t khng thch hp cho x khun pht trin. Tuy nhin, nhng loi t c hot ng sn xut ca con ngi, pH c th c ci thin. 3.1.2. Phn b ca x khun theo nhm mu T 70 chng x khun phn lp c, chng ti nhn thy mu sc h khun ty rt a dng. Theo Shirling v Gottlieb [38], c 6 nhm mu xut hin vi s lng v t l khc nhau, c th hin trn bng 3.2, cc hnh 3.1 v 3.2. Bng 3.2. S lng v s phn b ca x khun theo nhm mu STT 1 2 3 4 5 6 Nhm mu Xm (Grey) Trng (White) Xanh (Blue) Nu (Brown) Hng (Pink) Vng (Yellow) Tng S lng chng phn lp c 29 23 10 5 2 1 70 T l (%) 41,4 32,9 14,3 7,1 2,9 1,4 100

Kt qu trn bng 3.2 cho thy nh thng l, x khun thuc 2 nhm mu xm v trng vn chim u th. T l x khun thuc nhm xm chim
26

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


41,4%, tip l nhm trng chim 32,9%, cc nhm mu cn li chim t l rt thp. Kt qu ca chng ti ph hp vi cc kt qu nghin cu trc, khi phn lp x khun cng nhn thy nhm mu xm l chim u th [9,21]. Tuy nhin, cng theo kt qu ca mt s tc gi khc [6,26] li nhn thy x khun thuc nhm mu trng chim u th hn, sau mi n nhm mu xm v cc nhm mu khc. Nh vy, theo nhiu kt qu nghin cu, khng th tm ra mt quy lut chung cho s phn b ca x khun theo nhm mu. Nhng cc kt qu nghin cu phn lp x khun nhiu a im khc nhau trong nc u nhn thy l x khun thuc 2 nhm mu xm v trng lun c tn xut xut hin cao hn so vi cc nhm mu khc. S khc bit v mu sc ca h khun ty c th do nhiu nguyn nhn nh: iu kin t nhin: kh hu, nhit , m, tnh cht ca t, cht dinh dng, pH, Chnh v vy, trc y, mu sc h khun ty x khun c coi l nhng ch tiu c bn phn loi x khun, nhng do x khun c tnh bin d cao nn cc c im hnh thi, tnh cht nui cy thng khng n nh, rt d b thay i, trong c c im v mu sc h khun ty. V vy, cc c im v hnh thi v tnh cht nui cy thng c gi tr thp v mt phn loi.

27

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Hnh 3.1. T l cc chng x khun phn theo nhm mu

Hnh 3.2. Mt s chng x khun thun khit 3.2. Hot tnh khng sinh ca x khun phn lp 3.2.1. Hot tnh khng sinh ca x khun phn b theo nhm mu nghin cu v tuyn chn ra cc chng x khun c hot tnh khng sinh cao, trc ht, chng ti kim tra s b hot tnh ca 70 chng x khun phn lp c bng phng php thi thch. Kt qu c 43 chng trong tng s 70 chng c hot tnh khng sinh, chim t l 61,4%. ng thi s lng v t l cc chng c hot tnh cng c s sai khc gia cc nhm mu (bng 3.3 v hnh 3.3) Bng 3.3. HTKS ca x khun theo nhm mu STT 1 2 3 4 5 6 Nhm mu Xm (Grey) Trng (White) Xanh (Blue) Nu (Brown) Hng (Pink) Vng (Yellow) Tng cng S chng X khun c HTKS phn lp S T l c lng (%) 29 16 37,2 23 18 41,9 10 2 4,7 5 5 11,6 2 1 2,3 1 1 2,3 70 43 100 T l chng c HTKS so vi tng s (%) 22,9 25,7 2,9 7,1 1,4 1,4 61,4

So snh vi kt qu cng b trc [16, 18], kt qu ca chng ti cho thy t l x khun c hot tnh khng sinh l tng i cao. iu ny chng t, s lng x khun c kh nng sinh cht khng sinh t Thi
28

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Nguyn l rt ln. c bit, t khu vc ni Pho, t l x khun sinh khng sinh c phn cn cao hn so vi t mt s khu vc khc ca Thi Nguyn [6, 18]. Kt qu ny cho thy, s hnh thnh cht khng sinh ca x khun ph thuc nhiu vo cc yu t ca mi trng, khng phi ch ph thuc vo ngun dinh dng. y cng l c im chung cho qu trnh sinh tng hp cc sn phm bc 2, trong c cht khng sinh. T l cc chng x khun c hot tnh khng sinh cng khc nhau gia cc nhm mu. Trong s cc chng c hot tnh, hai nhm mu xm v trng, x khun phn b nhiu nht ng thi cng c t l chng c hot tnh khng sinh cao nht. Tuy nhin, nhm mu trng mc d c s lng chng t hn so vi nhm mu xm, nhng t l chng c hot tnh khng sinh li cao hn (chim 41,9%), tip theo mi l nhm mu xm (chim 37,2%). Cc nhm mu cn li c t l rt thp.

Hnh 3.3. T l cc chng XK c HTKS phn theo nhm mu Tuy nhin, nu xt ring tng nhm mu, cc nhm mu nu, vng v hng, mc d x khun phn b rt t nhng t l chng c hot tnh li rt cao. ng ch l nhm mu nu, ch c 5 chng nhng tt c cc chng u c hot tnh. y l kt qu rt ng phi quan tm. 3.2.2. Ph khng sinh ca cc chng x khun phn lp

29

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


kim tra hot ph ca cc chng x khun, chng ti s dng cc nhm VSV kim nh l vi khun gram dng, vi khun gram m v nm mc. Kt qu th hin trn cc bng 3.4 v hnh 3.4. Bng 3.4. Kh nng c ch cc nhm VSV kim nh
XK c HT vi VK G(+) XK c HT vi VK G(-) XK c HT vi nm mc XK c HT vi 2 XK c HT vi nhm VK G(+) c 3 nhm v VK G (-) VSV kim nh

S T l S T l S T l lng % lng % lng % 72,0 27,9 62,7 31 9 12 0 27 9

S lng 9

T l S T l % lng % 20,9 3 3 6,97

Trong tng s 70 chng c hot tnh, nh thng l, s chng c hot tnh vi nhm VK G (+) l cao nht, c 31 chng (chim 72,09%), tip theo l hot tnh vi nm mc, c 27 chng (chim 62,79%) v thp nht l hot tnh vi nhm VK G (-), ch c 12 chng (chim 27,9%). ng ch , trong s c 9 chng (chim 20,93%) c hot tnh vi c 2 nhm VK G(+) v G(-) v c bit l c 3 chng (chim 6,97%) c hot tnh vi c 3 nhm VSV kim nh.

Hnh 3.4. T l XK c HT vi cc nhm VSV kim nh Kt qu ny mt ln na cho thy, khng ch x khun c hot tnh khng sinh chim t l cao m x khun c hot tnh khng nm cng kh cao so vi nhiu nghin cu trc y [16, 21].

30

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Trong s cc chng c hot tnh khng sinh, kh nng c ch cc VSV kim nh cng c s khc nhau. Kt qu th hin trn bng 3.5 nhn thy, vi 7 chng VSV kim nh, s chng x khun c kh nng c ch Staphylococcus aureus chim t l cao nht (c 26 chng - chim 60,46%), tip theo l Bacillus subtilis (c 24 chng chim 55,81%) v thp nht l Pseudomonas aeruginosa (ch c 2 chng chim 4,65%). c bit, trong s cc chng x khun c hot tnh khng nm, s chng c hot tnh vi 2 chng Fusarium oxysporum v Aspergillus niger u chim t l kh cao.

31

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Bng 3.5. Ph khng sinh ca cc chng XK phn lp Vi sinh vt kim nh VK G(+) VK G(-) Nm mc Staphylococcus aureus ATCC 25923 Bacillus subtilis VTCC-B-888 Escherichia coli VTCC-B-883 Pseudomonas aeruginosa VTCC-B-481 Fusarium oxysporum VTCC-F-1301 Fusarium solani VTCC-F-1302 Aspergillus niger VTCC-F-001 Chng XK c HTKS S lng T l (%) 26 60,46 24 12 2 15 12 16 55,81 27,90 4,65 34,88 27,90 37,20

Hnh 3.5. Kh nng i khng ca cc chng XK vi cc VSV kim nh


S.a: Staphylococcus aureus ATCC 25923; B.s: Bacillus subtilis VTCC-B-888;

E.co: Escherichia coli VTCC-B-883; P.a: Pseudomonas aeruginosa VTCC-B481; F.o: Fusarium oxysporum VTCC-F-1301; F.s: Fusarium solani VTCC-F1302; A.ni: Aspergillus niger VTCC-F-001.

3.2.3. Tuyn chn cc chng x khun c HTKS cao Cn c vo kt qu kim tra s b hot tnh khng sinh, chng ti chn ra 5 chng x khun c hot tnh mnh nht tip tc sng lc bc 2. Cc chng ny k hiu l: HT12.2, HT19.2, HT19.1, HT17.8, HT17.18. Trn bng 3.6 v hnh 3.6 l kt qu kim tra s b hot tnh khng sinh ca 5 chng la chn. Bng 3.6. HTKS ca 5 chng XK la chn trn mi trng thch
32

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Vi sinh vt kim nh VK G (+) S. aureus ATCC 25923 B. subtilis VTCC-B-888 E. coli VTCCB-883 P. aeruginosa VTCC-B-481 F. oxysporum VTCC-F-1301 F. solani VTCC-F-1302 A. niger VTCC-F-001 HT17.8 38,1 0,6 35,3 0,1 38,3 0,3 34,2 0,8 15,10,1 32,40,5 + Hot tnh khng sinh (D-d, mm) HT19.1 HT12.2 HT19.2 35,1 0,3 35,2 0,4 38,1 0,4 34,4 0,3 + 20,1 0,1 + 11,8 0,3 10,2 0,7 + 7,1 0,1 HT17.18 19,1 0,2 7,3 0,1 7,6 0,5

VK G (-)

15,9 0,3 10,5 0,3 7,2 0,2 10,2 0,1 + +

10,2 0,3 10,5 0,3 10,20,1 10,7 0,1 + 6,2 0,1 8,9 0,1 +

Nm mc

Ch thch: (+): Hot tnh yu ( 4 mm)

Hnh 3.6. HTKS ca 5 chng XK la chn S.aureus: Staphylococcus aureus ATCC 25923; B.subtilis: Bacillus subtilis VTCC-B-888 Bc tip theo, cc chng x khun ny c nui lc trong mi trng dch th kim tra hot tnh ca dch ln men. Kt qu kim tra c th hin trn bng 3.7. Bng 3.7. HTKS ca dch ln men 5 chng XK la chn

33

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Vi sinh vt kim nh VK G (+) S. aureus ATCC 25923 B. subtilis VTCC-B-888 E.coli VTCCB-883 P. aeruginosa VTCC-B-481 F. oxysporum VTCC-F-1301 F. solani VTCC-F-1302 A. niger VTCC-F-001 Hot tnh khng sinh (D-d, mm) HT17.8 10,2 0,1 10,2 0,2 10,2 0,1 11,2 0,1 15,1 0,1 16,8 0,7 HT19.1 15,2 0,2 17,2 0,3 20,8 0,7 20,5 0,5 23,8 0,7 27,8 0,7 HT12.2 15,4 0,3 11,2 0,1 12,2 0,2 15,3 0,5 17,5 0,5 11,2 0,1 HT19.2 13,2 0,1 10,3 0,3 10,2 0,2 5,0 0,4 15,2 0,2 HT17.18 15,3 0,3 15,3 0,3 6,0 0,7 9,2 0,1 -

VK G (-)

Nm mc

Ch thch: (-) : Khng c hot tnh Kt qu trn cho thy, c 5 chng x khun la chn u vn gi c hot tnh khng sinh tng i n nh khi chuyn t mi trng thch sang mi trng dch th. C 3 chng l HT17.8, HT19.1, v HT12.2 c hot tnh cao vi tt c cc VSV kim nh, c bit l c hot tnh khng nm kh mnh (hnh 3.7). Tuy nhin, tt c cc chng u khng c hot tnh vi nm Aspergillus niger VTCC-F-001.

34

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Hnh 3.7. Hot tnh khng sinh ca cc chng x khun la chn 1: HT17.8 ; 2. HT18.4 ; 3. HT19.1 ;
S.aureus: Staphylococcus aureus ATCC 25923; VTCC-B-888;

4. HT18.5

B.subtilis: Bacillus subtilis


F.oxysporum: Fusarium

E.coli: Escherichia coli VTCC-B-883;

oxysporum VTCC-F-1301; F.solani: Fusarium solani VTCC-F-1302

Vi hng nghin cu tuyn chn ra cc chng c hot tnh khng sinh cao, c hot ph rng v c bit l c hot tnh khng nm gy bnh thc vt, 3 chng x khun HT17.8, HT19.1 v HT12.2 c la chn tip tc nghin cu. Tip theo, tm hiu kh nng ng dng ca 3 chng x khun la chn, chng ti tin hnh kim tra hot tnh khng nm ca 3 chng ny vi 4 chng nm gy bnh trn ch - l cc chng 1, N2, PL3 v TB4. Kt qu cho thy, c 3 chng x khun u c hot tnh vi t nht 1 trong 4 chng nm gy bnh trn ch (bng 3.8). Bng 3.8. HT khng nm gy bnh trn ch ca 3 chng XK la chn K hiu chng nm gy bnh trn ch 1 N2 PL3 TB4 Hot tnh khng sinh (D-d, mm) HT19.1 HT17.8 HT12.2 22,2 0,1 23,1 0,5 16,2 0,1 15,1 0,1 10,2 0,2 + 10,3 0,1 + + +

Ch thch: ( +) : Hot tnh yu ( 4 mm) (-) : Khng c hot tnh


35

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Chng HT17.8 c kh nng c ch c 3 chng: 1, N2 v PL3, chng HT19.1 c ch c 2 chng: 1 v N2, cn chng HT12.2 ch c ch c chng 1. ng ch , chng HT17.8 v HT19.1 c hot tnh kh mnh vi c 2 chng nm 1 v N2 l nhng nm phn lp c t nhng l ch non b cc bnh m xm v m nu (hnh 3.8).

Hnh 3.8. HT khng nm gy bnh ch ca 3 chng x khun Bnh m xm v m nu l nhng bnh gp rt ph bin trn cc vng trng ch nc ta, trong c cc vng ch Thi Nguyn. Khi ch b dch hi ny th khng nhng nh hng n nng sut m cht lng ch cng b nh hng. Chnh v vy, cc kt qu nghin cu ny l nhng kho st bc u lm c s cho hng nghin cu ng dng tip theo, c th m rng hn na kh nng ng dng ca chng HT17.8 v HT19.1 vo thc tin. 3.3. Tuyn chn x khun c hot tnh enzyme 3.3.1. Hot tnh enzyme ca x khun Trong qu trnh sng, x khun cn phi tng hp nn cc enzyme. Cc enzyme c hnh thnh trong t bo v mt s c tit ra mi trng xung quanh. Trong sn xut enzyme t x khun ch yu l thu nhn cc enzyme ngoi bo. Khng phi tt c cc VSV u c kh nng sinh enzyme nh nhau, v vy, khi tuyn chn chng ging phi tin hnh phn lp, kim tra v la chn cc chng c hot tnh enzyme mnh, sinh nhiu enzyme mong mun theo tng mc ch.

36

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Cc chng x khun tip tc c nghin cu v kh nng sinh enzyme ngoi bo. Trong cc th nghim, chng ti s dng 3 loi c cht kim tra kh nng sinh enzyme l: tinh bt, carboxymetylcellulose (CMC) v casein. Kt qu kim tra bc u, chng ti chn ra 5 chng c hot tnh enzyme mnh nht v k hiu l: HT10.6, HT12.7, HT12.5, HT17.15, HT18.8. Kt qu kim tra hot tnh enzyme ca 5 chng la chn c trnh by trn bng 3.9. Bng 3.9. Hot tnh enzyme ca 5 chng x khun la chn K hiu chng HT10.6 HT12.7 HT12.5 HT17.15 HT18.8 Hot tnh enzyme (D - d, mm) Amylase 12,1 0,1 6,9 0,5 + + + Cellulase 11,9 0,1 9,9 0,1 10,9 0,1 10,0 0,6 7,2 0,2 Protease 12,1 0,2 10,1 0,1 11,2 0,1 9,9 0,1 7,1 0,1

Ch thch: ( +) : Hot tnh yu ( 4 mm)

Bc tip theo, 5 chng la chn trn c nui lc trn mi trng dch th kim tra hot tnh enzyme ca dch ln men. Kt qu kim tra c trnh by trong bng 3.10 cho thy, nhn chung, cc chng gi c c 3 hot tnh enzyme ni trn, nhng mc biu hin hot tnh c s khc nhau. Hot tnh protease biu hin mnh nht v yu nht l hot tnh amylase. Bng 3.10. Hot tnh enzyme ca dch ln men 5 chng XK la chn K hiu chng HT10.6 HT12.7 HT12.5 HT17.15 HT18.8 Hot tnh enzyme (D - d, mm) Amylase Cellulase Protease + 12,5 0,1 + + + 10,2 0,1 16,1 0,1 + 8,0 0,1 + 12,2 0,3 16,2 0,3 4,9 0,1 12,2 0,7 +

Ch thch: (+): Hot tnh yu (4 mm)


37

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Chng HT12.7 c hot tnh enzyme mnh nht, c bit l hot tnh cellulase v protease, tip theo l cc chng HT10.6 v HT17.15, 2, 2 chng cn li l HT12.5 v HT18.8, c 3 hot tnh enzyme u biu hin rt yu (hnh 3.9).

Hnh 3.9. HT enzyme ca 5 chng x khun la chn 1: HT17.15 2: HT12.7 3: HT12.5 4: HT10.6 5: HT18.8.

Cn c t kt qu trn, chng ti la chn chng HT12.7 tip tc nghin cu kh nng chu nhit ca enzyme. 3.3.2. Kh nng chu nhit ca enzyme Cc enzyme ngoi bo c ng dng nhiu trong cng tc bo v mi trng x l cc rc thi hu c. Chnh v vy, kh nng chu nhit ca enzyme l mt trong cc c im cn phi c nghin cu. xc nh kh nng chu nhit ca enzyme t chng HT12.7, chng ti tin hnh nui lc chng x khun ny trong mi trng dch th thu dch enzyme th. Tin hnh x l dch enzyme th cc mc nhit : 40 0C; 500C; 600C; 700C v 800C trong thi gian 20, 40, v 60 pht. Hot tnh enzyme c xc nh bng phng php khuch tn trn a thch. Kt qu c trnh by trn bng 3.11. Bng 3.11. Kh nng bn nhit ca dch enzyme chng HT12.7

38

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


Thi gian (pht) Amylase 20 Cellulase Protease Amylase 40 Cellulase Protease Amylase 60 Cellulase Protease Enzyme 400C 17,1 0,2 22,1 0,1 24,8 0,1 16,9 0,2 20,2 0,6 24,1 0,5 15,9 0,3 18,9 0,1 23,9 0,1 500C 16,8 0,2 21,5 0,7 23,8 0,1 16,8 0,1 20,1 0,7 22,9 0,1 15,8 0,2 17,9 0,1 22,9 0,1 600C 11,1 0,1 11,2 0,1 17,8 0,2 5,3 0,5 11,0 0,1 15,8 0,3 3,9 0,1 10,0 0,1 13,1 0,1 700C 9,9 0,1 11,2,,0,2 6,0 0,1 11,4 0,4 6,1 0,1 11,1 0,1 800C 9,8 0,1 9,1 0,1 4,9 0,1 6,7 0,1 6,1 0,1 Hot tnh enzyme (D-d, mm)

i chng (dch enzyme cha x l nhit ): Amylase: 17,2 0,1; Cellulase: 22,1 0,3; Protease: 24,8 0,5; ( -) : Khng c hot tnh Kt qu trn cho thy, hot tnh enzyme ca chng HT12.7 tng i bn vng vi nhit , hot tnh c s thay i khi tng dn thi gian x l cng mt mc nhit . Kh nng phn gii 3 ngun c cht c s khc nhau. Hot tnh ca 3 loi enzyme u tng i n nh 2 mc nhit 40 0C v 500C. Hot tnh gim rt nhanh cc mc nhit 600C, 700C v 800C. Cc enzyme cellulase v protease c kh nng chu nhit tt hn, 80 0C hot tnh enzyme vn khng b mt, trong khi , vi enzyme amylase, hu nh khng cn hot tnh 700C v 800C.

39

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Hnh 3.10. Kh nng chu nhit ca Cellulase

Hnh 3.11. Kh nng chu nhit ca Amylase

40

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Hnh 3.12. Kh nng chu nhit ca Protease

Hnh 3.13. Vng phn gii c cht ca enzyme sau khi x l vi nhit trong thi gian 20 pht

41

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


KT LUN V KIN NGH KT LUN
1. S phn b ca x khun trong cc loi t l khc nhau. S lng x khun phn b trong cc loi t dao ng t 1,5 106 CFU/g t - 8,7 106 CFU/g t. S lng x khun phn b trong t vn l nhiu nht, c ti 8,7 106 CFU/g t. 2. T 21 mu t thu t cc loi t khc nhau ti khu vc ni Pho i T - Thi Nguyn, chng ti phn lp v thun khit c 70 chng x khun. T l cc chng thuc nhm xm chim 41,4%, tip l nhm trng chim 32,9%, cc nhm xanh chim 14,3%, nhm nu chim 7,1%, nhm hng chim 2,9%, v nhm vng chim 1,4%. 3. Trong tng s 70 chng x khun phn lp c c 43 chng c HTKS, chim 61,4%. Trong tng s cc chng c HTKS c: t l khng vi VK G (+) l 72,09%, khng VK G (-) l 27,9%, khng nm mc l 62,79%, khng c 2 nhm VK G (+) v VK G (-) l 20,93% v khng c 3 nhm VSV kim nh l 6,97%. 4. Tuyn chn c 3 chng x khun c HTKS cao, c hot ph rng tip tc nghin cu. Cc chng x khun ny c k hiu: HT17.8, HT19.1 v HT 12.2. 5. Kim tra hot tnh enzyme: amylase, Cellulase v protease ca cc chng x khun v tuyn chn c 2 chng c hot tnh enzyme cao c k hiu l: HT12.7 v HT10.6. ng thi nghin cu c kh nng chu nhit ca cc enzyme chng HT12.7.

KIN NGH
1. Nghin cu cc c im sinh l, sinh ha, phn loi v kh nng tng hp cht khng sinh ca 3 chng x khun la chn: HT17.8, HT19.1, HT12.2. 2. Nghin cu tnh cht l ha ca cht khng sinh t 3chng x khun la chn.

42

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


TI LIU THAM KHO A. TI LIU TING VIT 1. Ng nh Bnh,Vi sinh vt hc cng nghip, Trung tm Khoa hc T nhin v Cng ngh Quc gia, tr. 53-71, 2005. 2. Nguyn Vn Cch, Cng ngh ln men cc cht khng sinh, NXB Khoa hc v k thut, tr.17, 2004. 3. Nguyn Vn Cch, L Vn Nhng, C s cng ngh sinh hc, tp 4 cng ngh vi sinh, NXB Gio dc Vit Nam, 2009. 4. Nguyn Hong Chin, Nghin cu chng x khun streptomyces V6 sinh cht khng sinh chng vi khun gy bnh ho xanh c chua, Lun vn Thc s Sinh hc, H Ni, 2000. 5. Vi Th oan Chnh, Nghin cu kh nng nng cao hot tnh khng sinh ca chng Streptomyces rimosus R77 v Streptomyces hygroscopicus 5820 bng k thut dung hp t b o trn, Lun n TS sinh hc, Vin cng ngh sinh hc, H Ni, 2000. 6. Vi Th oan Chnh, Tuyn chn v nghin cu x khun c kh nng i khng vi mt s chng vi khun gy nhim trng bnh vin, Bo co tng kt ti khoa hc v cng ngh cp B. M s B2009 - TN07 - 02. 7. Nguyn Ln Dng, Thc tp vi sinh vt hc NXB i hc v Trung hc chuyn nghip, H Ni, 1993. 8. Nguyn Ln Dng, Phm Th Trn Chu, Mt s phng php nghin cu vi sinh vt hc - Tp III, NXB khoa hc v k thut, H Ni, 1978.

43

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


9. Nguyn Ln Dng, on Xun Mu, Nguyn Phng Tin, ng c Trch, Phm Vn Ty, Mt s phng php nghin cu vi sinh vt hc, Tp I, NXBKHKT H Ni, 1972. 10. Nguyn Ln Dng, Nguyn nh Quyn, Phm Vn Ty, Vi sinh vt hc - tp II, Nh xut bn i hc v Trung hc chuyn nghip, H Ni, 1977. 11. Nguyn Ln Dng, Nguyn nh Quyn, Phm Vn Ty, Vi sinh vt hc, NXB Gio dc, 2007. 12. Nguyn Ln Dng, Nguyn Kim N Tho, Cc nhm vi khun ch yu, Vietscience, 2006. 13. Nguyn Thnh t, C s sinh hc vi sinh vt, tp 1, NXB i hc s phm, 2007. 14. Nguyn Thnh t, K.A. Vinogradva V.A.Poltorac, Tnh bin d b mt bo t x khun sinh choromomycin , Act.A. buraviensis, microbiologia, TXL III, N5, NXB Academia cccp, 1974. 15. L c, Nguyn Quc Vit, Tc ng ca hot ng khai thc khong sn ti i T, ng H, Thi Nguyn n mi trng khu vc. Hi tho KH Quc gia Nhng vn mi trng v pht trin bn vng vng ng Bc, Tr. 153 159, 2007. 16. Bi Th Vit H, Nghin cu x khun sinh cht khng sinh chng nm gy bnh thc vt Vit Nam, Lun n Tin s Sinh hc, H Ni, 2006. 17. Thu H, Nghin cu x khun sinh cht khng sinh chng nm phn lp t t Qung Nam Nng, lun n tin s sinh hc, H Ni, 2004.
44

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


18. Trnh Ngc Hong, Nghin cu tnh i khng ca x khun vi mt s VSV gy nhim trng bnh vin, Lun vn Thc s Sinh hc, 2009. 19. L Mai Hng, Nghin cu x khun sinh cht khng sinh phn lp H Ni v vng ph cn, Lun vn ph tin s Sinh hc, H Ni, 1993. 20. L Gia Hy, C s cng ngh vi sinh vt v ng dng, NXB Gio dc Vit Nam, 2010. 21. L Gia Hy, Nghin cu x khun thuc chi Streptomyces sinh cht khng sinh chng nm gy bnh o n v thi c r phn lp Vit Nam, Lun n Ph tin s Sinh hc, H Ni, 1994. 22. Nguyn Khang, Khng sinh hc ng dng, NXB Y hc, H Ni, 2005. 23. Phan Quc Kinh, Cng nghip ha cht, Thng tin Kinh t & Cng ngh, s 1, 2004. 24. Phan Quc Kinh, Vi nt v tnh hnh sn xut ha dc trn th gii, Tp ch cng nghip ha cht, s 4, 2002. 25. Nguyn Xun Thnh, Gio trnh vi sinh vt hc cng nghip, NXB Gio dc, 2007. 26. ng Vn Tin, Nguyn nh Tun, Vi Th oan Chnh, Ng nh Bnh, Nghin cu x khun sinh khng sinh khng vi khun Xanthomonasoryzae gy bnh bc l la. Bo co khoa hc Hi ngh CNSH ton quc , 2009.

B. TI LIU TING ANH


45

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


27. Ashutosh K, Pharmaceutical Microbiology, New Age International (P) Ltd, pp. 89 101, 2008. 28. Chen M., Xiao X., Wang P., Zeng X., Wang F, Arthrobacter ardleyensis sp. nov. isolated from Antarctic lake sediment and deep-sea sediment, Arch Microbiol, 183, pp. 301- 305, 2008. 29. Fred C. Tenover, Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria, Amer.J. Med, 119, pp. 310, 2006. 30. Hozzein W.N., Li W.J., Ali M.I.A., Hammouda O., Mousa A.S., Xu L.H., Jiang C.L., Nocardiopsis alkaliphila sp. nov., a novel alkaliphilic actinomycete isolated from desert soil in Egypt, Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 54, pp. 247-252, 2004. 31. J.H. Auh, H.Y. Chae, Y.R.Kim, K.H.Shim, S.H. Yoo, K.H. Park, Modification of Rice Starch by Seclective Degradation of Amylose Using Alkalophilic Bacillus Cyclomaltodextrinase, J. Agric, Food Chem, 2006. 32. MA. Elberson, F. Malekzadeh, M.T. Yazdi, N. Kameranpour, M.R. Noori Daloii, M.H. Matte, M. Shahamat, R.R. Colwell, K.R. Sower, Cellulomonas persica sp. nov. and Cellulomonas iranensis sp. nov., mesophilic cellulose degrading bacteria isolated from forest soils, J. Syst. Evol. Microbiol 50, p.993, 2000. 33. Pasti M. B., Pometto A. P., Nuti M. P., Crawford D. L., Ligninsolubilizing ability of actinomycetes isolated from termite (Termitidae) gutt, Appl Environ Microbiol, pp. 2213-2218, 1990. 34. Ramasamy Nooruddin Rengasamy Vijaykumar, Chinnasamy Muthukumar, and

Thajuddin,

nnamalai

Panneerselvam,

Saravanamuthu, Studies on the diversity of actinomycetes in

the Palk Strait region of Bay of Begal, India, Actinomycetologica, 2007.


46

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


35. R. Gupta, O.K Beg, P. Lorenz, Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59 (1) ,p. 15, 2002. 36. Saga T., Yamaguchi K, History of antimicrobial agents and resistant bacteria, J Japan Med Assoc, 137, pp. 513 517, 2008. 37. Seong C.N., Kim Y.S., Baik K.S., Lee S.D., Hah Y.C., Kim S.B., Goodfellow M, Mycolic acid-containing actinomycetes associated with activated sludge foam, J Microbiol, 37, pp. 66-72, 1999. 38. Shirling E.B., D. Gottlieb, Methods for characterization of streptomyces species. Vol. 16. No. 3. International Journal of Systematic Bacteriology. 39. Steger K, PhD. Thesis: Composition of microbial communities in composts. A tool to assess process development and quality of the final product. Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, 2006. 40. Stuart H, Essential microbiology, John Wiley & Sons Ltd., England, pp. 191 369, 2005. 41. Waksman, S.A, The Actinomycetes. Classification, identification and descriptions of genera and species, vol 2, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA, 1961. 42. Zhang JF, Liu JJ, Lu MQ, Cai Cj, Yang Y, Li H ,Xu C, Chen GH, Rapamycin in hibits cell growth by induction of apoptosis on hepatocellular carcinoma cells in vitro, Transpl Immunol, 2007. MT S TRANG WEB:

47

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


43.http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan.ht m

48

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn


PH LC

c im hnh thi khun lc ca 4 chng nm gy bnh trn l ch phn lp ti Thi Nguyn

Khun lc chng 1

Khun lc chng N2

Khun lc chng PL3

Khun lc chng TB4

49

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn

You might also like