GVHD : TS.

Nguyn Vn Ban
SVTH : Nguyn Th o Phan nh ng

Nh vy h tr sinh sn l mt quy trnh cng ngh, nhm to ra c th mi vi nhiu k thut h tr ph hp cho tng giai on trong tin trnh sinh sn.

K thut h tr sinh sn v c bn c xp thnh cc nhm:

K thut thu nhn giao t. K thut h tr th tinh.

K thut nui phi.

K thut cy truyn phi.

GII THIU:

ng vt c v,sinh sn t nhin l mt qu trnh sinh l phc tp,tri qua 3 giai on c bn :hnh thnh giao t,th tinh v mang thai.
S phi hp cht ch v ng b 3 giai on trn s hnh thnh mt c th mi. cho ra i nhng c th con bnh thng phi cn s tr gip ca cc k thut h tr sinh sn nhm gip cho c th sinh con bnh thng gi l k thut h tr sinh sn.

III.K THUT H TR TH TINH.

Dn tinh nhn to.
Th tinh in vitro GIFT

K THUT H TR TH TINH

Vi th tinh

1.Dn tinh nhn to( artificial isemination _AI): Dn tinh nhn to con gi l gieo tinh l k thut a tinh trng vo c quan con ci.

Dn tinh nhn to ra i nhm tng nhanh tc ci to di truyn ca loi.

1933, k thut thu nhn tinh v dn tinh nga, bo,cu, heoa ph bin. Ngy nay k thut AI a c thng mi ha.

1790, k thut AI ng dng thnh cng ngi v cho n nay AI c s dng ph bin trong h tr sinh sn. C th iu tri cc bnh v sinh nam hay gim hoc mt kh nng th tinh n. Ngoi ra AI con c s dng lm tng hiu qu th tinh v hn ch cc bnh ly qua ng sinh dc.

1.1.Phn loi AI:

Ty vo vi tri a tinh trng vo c quan sinh dc con ci AI c phn thnh 4 hnh thc k thut:
ITI: bm tinh trng vo ng dn trng

AI

IFI:bm tinh trng vo voi trng.

ICI: bm tinh trng vo c t cung.

IUI: bm tinh trng vo c t cung.

Trong cc k thut dn tinh nhn to thi IUI c s dng nhiu nht v c chun ha. tin hnh IUI th tinh trng thu nhn phi c kim tra s lng v cht lng.

ng thi con ci s c theo di thi k ng dc sn sng nhn tinh.

Nhm ch ng cc con ci nhn tinh phi c gy rng nhiu trng bng hormone.

1.2.Thun li v kh khn khi thc hin k thut AI Thun li : Ci to c di truyn ca loi khi s dng tinh trng ging tt. Pht huy kh nng s dung tinh trng.

Sau khi con c cht,tinh trng c th c thu nhn v s dng.

Gim c bnh ly lan qua ng giao phi. Tin li v hiu qu kinh t cao.

Kh khn: Phi pht hin chnh xc thi k ng dc ca con ci. Phi tp hun cho ngi thao tc. Cn mt s k thut ph tr khc nh ng lnh tinh,cc k thut kim tra,nh gi tinh trng,nh gi con vt nhn,theo di sau dn tinh

Lu : K thut IUI thc hin trn ngi d c nguy c a thai. Do gy siu bi non nn chn hn mt trng nn ngi m c th sinh i ,sinh ba Nguy c nhim trng khi thc hin IUI cao nu bnh vin khng c trang b hin i.

2.Th tinh IN VITRO (IVF) : 2.1.Gii thiu: Th tinh l qu trnh kt hp t bo tinh trng vi t bo trng to ra mt t bo mi gi l " hp t ", hp t s pht trin thnh c th mi. Qu trnh kt hp ny thng xy ra trong c th m v ti 1/3 pha trn ca ng dn trng. IVF l qu trnh kt hp gia tinh trng vi trng to ra hp t, c thc hin bn ngoi c th m, ti phng th nghim (trong hp lng, hp petri). Tuy xy ra ngoi c th, nhng cc iu kin cho qu trnh IVF nh mi trng, nhit , m, nht .v.v... cng cc ch tiu sinh hc khc phi ging nh trong c th m.

 ngha ca IVF: Khai thc c tim nng sinh sn nhng gia sc ci cao sn, c bit vi nhng con cao sn nhng v l do no b loi thi. Cung cp vt liu v lm c s cho nhng nghin cu, lai ghp phi, chuyn cy gen, ct phi nhn phi .v.v . . . Gip cho vic nh gi con vt sm hn (rt ngn c khong cch th h).

To nhiu phi, gi r t gim gi thnh cng ngh phi, thnh lp ngn hng phi, trng v lm c s cho vic bo tn, lu gi phc hi li cc ging gia sc v cc ngvt qu him nhng t c gi tr v kinh t.

Khc phc tnh trng v sinh cc con ci tt, c bung trng hot ng bnh thng nhng b tc ng dn trng hoc do iu kin no m trng v tinh trng khng gp nhau c trong c th.

C s khoa hc caIVF C s khoa hc ca IVF c xc lp khi mt ng vt th tinh trong ng nghim u tin ra i(1959).
Hng lot cc quy trnh hot ha tinh trng trong ng nghim kt hp vi IVF thnh cng trn chut ng(1963) chut nht trng (1968),ngi (1969). Sau IVF c hon chnh hn bng cc quy trnh thu nhn v nui chn trng trong ng nghim.

1982, Brackett v cs s dcungj trng chn invivo vo k thut IVF,khi hp t pht trin n giai on thch hp c cy truyn thnh cng.

Phi ca nhiu loi c sn xut bng IVF nh b,d,heo,tru. c nhiu phi c thng mi ha.

2.2. Vt liu cho th tinh in vitro a.Giao t Trng : thng c th 3 dng

Trng non

Trng thnh

Hu trng thnh Tinh trng : ty tng i tng m ta chun b tinh trng theo cc phng php sau: Phng php swim up chun.

To vn cc kt hp swim up.
Li tm vi gradient nng khng lin tc.

Lng hay t trn paraffin lng. Li tm tc cao v ra. Phng php di chuyn v lng. Tuy trong qu trnh th tinh ch c mt tinh trng xm nhp vo trng nhng cn phi c hng chc tinh trng xung quanh. Nng tinh trng c th c quyt nh do s lng tinh trng v dung tch ca vi git mi trng th tinh. Trng thng c th tinh vi nng 100000ttbt/ml

Nng tinh trng cao qu hay thp qu u cho kt qu khng tt. Mc d cn c nhiu tranh ci v nhiu kin cho rng vic s dng nng tinh trng cao cho kt qu kh quan v cc phi c c hi bm vo t cung tt hn.

b.Mi trng th tinh in vitro Trong cc mi trng cho th tinh in vitro ,cc cht cn thit cho s hot ng ca tinh trng thuc 3 nhm: Mui C cht nng lng. Ngun protein.

Ion Ca++ cn thit cho phn ng cc u,ng thi thc y cho cc c ch sinh hc khc tin trin. Glucose v lactat l ngun nng lng cho tinh trng.

Protein c bit l albumin thc y kh nng vn chuyn v tng cng hot ha. pH mi trng : 7,4 v gn ging vi pH mu thch hp cho s th tinh v qu trnh pht trin ca phi.

H m bicarbonat kt hp vi co2 (5%) trong bung kh s gip n nh pH cho t bo. Khi th tinh in vitro hoc nui phi,cn thit phi ph ln trn b mt ca mi trng nui mt lp du khong lm gim qu trnh to ht ngng t trong mi trng,cng nh lm thay i nng cc cht. Lp du khong cn c tc dng nh l hang ro ngn cn cc ht bi,vsv xm nhp. Mt bt li ca s dng du khong l ngn cn s khuch tn ca CO2 xm nhp vo mi trng.

c.Thi gian th tinh :

cc ng vt nu nh th tinh mun,trng thng c cc u to v phi pht trin khng bnh thng. Trng ngi c th th tinh trong vi gi nhng nu cho tinh trng vo th tinh qu mun,kh nng phi bt thng s tng ln.

2.3.Cc h thng th tinh in vitro :

Th tinh trong ng nghim 5ml Bao gm Th tinh trong a mt ging hay bn ging. Th tinh trong ng mao qun hay cng r. Th tinh trong vi git.

Th tinh trong ng nghim 5ml:

Thch hp nht l ng li tm nha 5ml, np m c vn lng. Kim sot tt pH v p sut thm thu. T l th tinh IVF ti u vi mt OCC/ng nghim trong 0,5ml mi trng v 50000 tinh trng di ng. Kh khn duy nht ca KT ny l mun kim tra s th tinh cn chuyn sang mt a khc.

Th tinh trong a mt hay bn ging: Th tch huyn ph tinh trng c o trc vi nng 100000tt di ng tin/ging.
Cc trng c th tinh s c qua m trong s hin din ca tinh trng chun b. S gn ca tinh trng vo mang zona xy ra t mt n 3h th tinh v do trng c th c ra loi b cc tinh trng tha sau 3h .

Hn ch :
Nng tinh trng s dng cho mt trng t nht l 50 000 tt/trng Th tch mi trng trong 1 ging l <= 5ml V vy nn s kh thc hin vi cc trng hp mu c s lng tinh trng t.

Th tinh trong ng mao qun v cng r:

Tit kim c trng cng nh tinh trng, c bit TH v sinh do yu t tinh trng do tinh trng c trong th tch nh. T l th tinh tt nht t c trong ng mao qun v cc cng r vi th tch 510microlit l 2000-4000 tt di ng. Ni dung ca phng php ny l huyn ph OCC/tt c ht vo cng r bng syringe c gn 1 adaptor( th thch ng).

Huyn ph trng/tt trong cng r c bo v bng cc khong mi trng, ngn cch xen k vi cc bng khng kh. Cc ng mao qun v cng r c nm ngang trong iu kin 5% co2 v 37oC Sau khi th tinh dung pipet y ht dung dch cha trong mao qun v cng r vo a mt ging hay bn ging kim tra.

Th tinh vi git: Phng php IVF ph bin nht l a cc OCCvo mt vi git c chun b sn t 20-50microlit huyn ph tinh trng di lp du.

Thun li: kim sot tt pH v p sut thm thu ca mi trng,hu ch cho TH mu tinh trng t. Kh khn :yu cu ngi thao tc phi c kinh nghim.

Cc vi git c chun b trong a petri nh hay a 1 ging hay 4 ging v trng. Du khong hay paraffin lng u phi c kim tra k v tnh gy c v gy sc. Du khong phi c cn bng ha l trong 24h v 37 C v 5% CO2 trc khi s dng. Cc tinh trng c chun b bng swim up hay li tm trn Percoll, sau li tm tip tc iu chnh v nng 5000 tinh trng di ng trong 50microlit

Khi chun b xong, mi OCC tip nhn 1 git tinh trng cng vi mi trng ti thiu gim s pha long. Cc a sau c t vo t m 5% CO2 v 37oC. Ty theo thi quen tin hnh cng nh iu kin phng th nghim thao tc cho tinh trng vo trong mi trng c trng chun b sn trong git th tinh hay ngc li. Chuyn tinh trng vo trng thng c tin hnh trn ng vt, vic chuyn trng vo tinh trng thng c tin hnh trn ngi.

2.4. nh gi kt qu th tinh: S th tinh thng c nh gi bi s hin din ca hai tin nhn v hai th cc trong trng

Nhm d dng quan st cc trng c th tinh nn c phu tch sau 17-20h nh gi.
Tin trnh th tinh xy ra bnh thng nu c s xut hin ca 2 tin nhn v 2 th cc. Nhng trng c th tinh tt chng cn biu hin hnh dng c th vi mng zona pellucida y n v nguyn sinh cht khe mnh, sch.

Nhng c im khc c quan st thm: nguyn sinh cht ca cc t bo lun c t ht, trong khi t bo cht ca trng cha th tinh thng hon ton sch v khng c c im trn.
Nguyn sinh cht cng c th biu hin t mu nu n mu en. Hnh dng ca trng cng c th khc, t hnh cu n nhng kiu hnh khng c trng.

Cc chi tit v hnh dng v s th tinh nn c ghi nhn tip tc vo ngy th hai cho mi hp t quan tm.

Mc d s hin din ca 2 tin nhn khng nh cho s th tinh thnh cng, nhng s vng mt ca chng khng c ngha l tht bi. C th thay vo l s hot ho trinh sn, hay s chm tr do mt vi s c nh lin quan n qu trnh th tinh.

Cc bt thng khc cng c quan st:

Trng cha trng thnh vi ti mm hay khng c ti mm hoc th cc c thy xen ln gia cc trng sau khi thu nhn v th tinh.

Cc trng xut hin vi 3 tin nhn thng pht trin bt thng v nhng sai lch nghim trng trong nhim sc th bi v hnh thnh ti 3 thoi v sc. Cc trng vi mt tin nhn v hai th cc c hot ha v thng cha u tinh trng ang xon cht hay tho xon mt phn. Trng mt tin nhn v mt th cc: nu khng thy hnh thnh th cc th 2,trng ny thng khng c kh nng pht trin nn loi b chung.

S ti th tinh: Cc trng khng xut hin (hoc khng quan st c) tin nhn c th c ti th tinh.

S th tinh c xc nhn vo ngy th 2, nhng iu ny c th l kt qu ca qu trnh th tinh ln u tin. Cng khng loi tr kh nng ny sinh s chm tr th tinh do cc khim khuyt chc nng tinh trng hoc s trng thnh tr ca trng.
Nhng phi ny ni chung cn chn on trc khi cho lm t.

3.GIFT (GAMTE INTRAFALLOPIAN TRANSFER 3.1.Gii thiu : Nm 1984, Ricardo Asch gii thiu k thut liu php giao t mang li li ch to ln M.
K thut ny nh mt mn qu cho nhng cp v chng v sinh. K thut ny lin quan n vic tim mt hay nhiu trng trn vi tinh trng c hot ha v lc sch vo trong vi dn trng.

3.2.Tin hnh :
tin hnh GIFT cng phi tin hnh thu nhn tinh trng v trng.

Tinh trng c lc sch, hot ha.

Trng c thu nhn t vic gy siu bi non.

K thut ny c tin hnh vi s h tr ni soi bng. Hn hp trng v tinh trng c tim trc tip vo ng dn trng bng cch quan st trc tip qua ni soi.

GIFT c tin hnh qua 3 bc:

Kch thch rng trng nhiu. Trng v tinh trng sau khi thu nhn c nh gi cht lng v xp loi,tinh sch v hot ha,s dng cc t bo tt. Chuyn giao t: trng v tinh trung sn sang s c trn li chuyn vo ng dn trng.

3.3.Nhng thun li v bt li : GIFT thun li hn IUI l tinh trng v trng gp nhau trong ng dn trng, ni xy ra s th tinh t nhin. Tuy nhin GIFT cng c mt vi bt li : do cn phi tin hnh ni soi cng nh s h tr ca cc k thut khc nn tn km. Mt khc khng th trc tip theo di qu trnh th tinh nn khng bit c nu s th thai khng xy ra th nguyn nhn do yu t no. T l thnh cng 25%-30% cao hn khng ng k so vi IVF.

4. VI TH TINH ( MICROINSEMINATION) 4.1. Gii thiu lch s pht trin

- Nm 1992, phng php tim thng tinh trng tt vo

trong bo tng ca trng(ICSI) c gii thiu sau thnh cng ca Palermo v cs (B).
-ICSI thnh cng th, b, ch, heongi (1992). - Nm 1991 Ng v cs (Singapore) thnh cng trong phng php tim tinh trng vo khoang ca non bo (SUZI).

- Nm 1992, Cohen v cs (M) cng b thnh cng trong phng php to l thng trn b mt mng zona (PZD).
43

4.2. Mt s thit b v dng c c th

- K thut vi thao tc in vitro trc tip cc t bo sinh dc

nn c h tr cc thit b c th nh : Knh hin vi soi ngc vi thao tc v km theo mt lot cc dng c vi tim. -H thng quan st ngc ( Contrast optical systems ) - knh soi ni (Stereomicroscope) - B phn vi thao tc ( Micromanipulator) - B phn vi tim ( Microinjector)

44

Vi dng c : -Holding pipette ( dng c nh trng ) c ng knh ngoi 0,080-0,150 mm v ng knh trong 0,015-0,025 mm. + Mt quy tc cho KN v KT cho pipette l 90% v 20% so vi ng knh ca t bo trng.
+ Thng b un cong vi gc 200 300 phn cui. - Injection pipette ( chc v tim tinh trng ) c ng knh ngoi 0,0058-0,0078 mm v ng knh trong 0,0048-0,0056 mm. - Cc pipette thng c cc ng mao qun thy tinh thng mi c k ban u 1mm O.D v 0,75 mm I.D.

- Dng c dng ct mng zona Pellucida trong k thut

AH v ZD l cc loi dao ct
45

Holding pipette

Injection pipette
46

47

Dng c ct mng zone pellucida

48

B hiu chnh

B n Cn gn vi ng chuyn

tinh trng
Cn gn vi ng c nh tbo V tr t cc a mu

49

4.3. Cc k thut vi th tinh c bn

A, khoan mng zona( zone drilling- ZD)

-Ln u tin c bo co bi Gordon v Talansky (1986) - To ra mt l m mng trong sut ting trng d dng chui vo bn trong trng. - C th khoan mt l nh trn mng bng tirode acid vi mt micropipette nhn.

- Ngoi ra mng zona

c th ph bng trypsin hoc pronase ( Gordon v cs, 1988)
50

51

B, Tch b mt phn mng trong sut (PZD)

Malter V Cohen (1990) to ra phng php tch phn trong sut gi l PZD

-Dng ng ht u nhn c s dng m vo mng trong sut ti v tr

1h v bn kia,u xuyn ra ngoi qua ti v tr 11h. Dng ng ht khc gi ly i phn mng trong sut nm pha trn ca ng ht u nhn. 52

Nhc im ca PZD l to tng i ln vng mng trong sut khin phi pht trin km.

C, tim tinh trng vo di mng trong sut (SUZI) -Dng mt ng ht nh

a thng tinh trng xuyn qua mng trong sut vo khong khng quanh non tng.

- D gy nguy c a th
tinh tng cao.

53

D, Bm tinh trng vo bo tng trng (ICSI)

-1976, Uehara v Yanagimachi tim tinh trng ngi vo thng trong bo tng non ca chut ti. - 1988, Lanzendorf v cs nhn thy rng tinh trng ngi thiu u cc c kh nng chng li s ng c ca bo tng non.

54

-Mt s cun sch Brussels nu ln vic s dng phng php

tim tinh trng vo trong bo tng trn lm sng bng ng ht c ng knh < 6m vi u nhn ngn. -tinh trng nm trong git PVP lm gim kh nng chuyn ng tinh trng nhng chng vn khe mnh, kh nng th tinh cao. -tinh trng c hnh thi bnh thng c ht vo kim,u tin ko phn ui sau ht phn u.

55

Chun b giao t:
- Kch thch bung trng tng s nang non pht trin Mt Gamete-20 Tch lp Git Trng (enzym hyluronidase tbao mi 80IU/ml cumulus trng Tinh Git PVP Tinh trng a cy(30mm) dch 10%

-sau c vo knh hin vi o ngc c gi m 37 C, tim tinh trng bng h thng vi thao tc, phn i 200 ln

Chun b ha cht
-Dung dch nht 10% PVP gim s di ng ca tinh trng. - du khong c cn bng ha l trong t m 5% co2 v 370 . - Hyaluronidase tch bt cc tbao cunmulus
56

Chun b a tim

Cc thao tc ICSI c tin hnh trn loi a Shallow Falcon hay cc np a petri 60mm.

a petri

Git cha tinh trng Git PVP

57

-Trn a to cc git mi trng nh(dnh cho trng) c ph

trc lp du khong cn bng l ha. -Mt git ln cha tinh trng v mt git PVP bt ng tinh trng trc khi ht. Quy trnh vi tim c bn

58

-Tinh trng di ng trong mi trng c thu nhn vo trong

pipette, ui vo trc v ht y ra vo vi ln cho n khi tinh trng bt ng. -Trng c gi trong holding pipette sao cho v tr vng nh ln v tr 12 hay 6 gi. -Ti v tr 3 gi mng zona b m thng bi mi nhn cha tinh trng, khi pipette xuyn qua 1/3-1/2 ng knh ca trng th y nhanh kim v pha trc cng thi im v trng c ko v pha pipette gi. -sau tinh trng c bm vo trng cng vi mt lng nh mi trng sau 1-2s th mi trng c thu nhn li vo trong pipette nu c th. -Trng sau khi cy tinh trng vo c nui cy vo trong t co2 vic kim tra thc hin sau 16-18h v ln 2 vo ngy hm sau.
59

Cc phng php vi th tinh

60

K thut ICSI c h tr bi in p(piezo-icsi)

61

-1995 do Kimura th nghim thnh cng trng chut - Nguyn l ca phng php ny l dng dng c vi thao tc c in p cao to l xuyn qua mng zona v non tng nhm a tinh trng vo tbo trng.

Quy trnh thc hin -Chun b pipette gi v pipette tim + Pipette gi c ng knh 10m +Pipette tim u nhn nhng vo dd hydrofluoric acid-ra nc ct- nhng vo ethanol 100% - kh. -Du khong v thy ngn phi c ht vo trong pipette - u pipette tim c ng knh 4-5m. - Bm tinh trng vo trong trng +a plastic 100*15 mm c s dng lm bung thao tc

62

Git 2:(2, 2)

Git 1: (2, 2)

Git 3:(6, 2)

-Git 1: Dng ra pipette(PVP-sanline) -Git 2: Dng cha huyn ph tinh trng trong PVP-saline. -Git 3: Dng cha mi trng ca trng. Tt c cc git u ph bi du khong. -S hin din ca thy ngn lm gia tng kh nng xuyn mng zona v mng non ca pipette. -Khi ht tinh trng vo trong pipette lc phn thn v u tinh trng tip cn vi ming ca pipette s c 2-3 xung in t ngt lm bt ng63 tinh trng.

-Trng c nh v phn nhn xiay pha 6h v phn pipette tip xc vi trng v tr 3h, cng lc mt vi xung in pizeo c to ra gip vic xuyn mng d dng hn. -u pipette nh nhng xuyn qua bo tng, tinh trng c nhanh chng y ra ngoi. v tr ny u pipette lm cng non mng, thng m khng h b v.

- Sau khi a tinh trng vo tronh non tng, pipette tim c

ko ngc ra tht nhanh, pipette gi cng nh trng. Chuyn trng vi tim vo mi trng nui phi v t vo t m 37 0C, 5% CO264 v kim tra s pht trin ca phi.

PIEZO-ICSI CHUT

65

ROSI (Round spermaitd injection ) -L k thut ICSI nhng s dng cc tinh trng hnh trn khng ui (1n) - Nhm kim tra kh nng pht trin ca tinh nguyn bo v tinh t t bin khng th th tinh. - Tinh trng c a vo t bo trng giai on telophase II. - em li hy vng cho nam gii khng th sn xut tinh trng trng thnh tuy nhin hn ch lm cho vic bt thng v gen tr s sinh l cao,

66

67

nh gi s th tinh v phn ct -16-18 gi sau th tinh tin hnh nh gi s s lng v hnh dng ca tin nhn qua knh hin vi o ngc. - tip tc kim tra phi v lc 24, 48 gi sau th tinh. - Cc phi thch hp cho vo ng lnh ngy th nht v th hai. - Kt qu th tinh khng hiu qu l do: + Cht lng tinh dich + Tinh trng + Cht lng trng - Rosi cho kt qu th tinh khong 1-27%

68