Mikro-biotechnologia czyli co mikrobiolog wie o biotechnologii oczyszczania ciekw /Dr Aleksanda Ziembioska/

Streszczenie Rosnce w zastraszajcym tempie zanieczyszczenie rodowiska, zwizane z szeroko pojt dziaalnoci czowieka nie omija rwnie wd stojcych i pyncych kuli ziemskiej. Produkujemy ogromne iloci odpadw, ktre musz byd odpowiednio utylizowane, eby nie zagraay rodowisku. Dlatego te konieczne jest wypracowanie efektywnych i tanich sposobw oczyszczania ciekw, do ktrych nale procesy biologiczne, oparte na dziaalnoci mikroorganizmw. 1. Wstp, czyli w czym rzecz Czowiek produkuje ogromne iloci odpadw, ktre musz byd odpowiednio utylizowane, eby nie zagraay rodowisku. Za procesy oczyszczania ciekw odpowiedzialne s mikroorganizmy, ktre tworz w oczyszczalniach tzw. osad czynny, czyli kaczkowat zawiesin o wysokiej aktywnoci biologicznej. Kiedy technologw interesowao tylko czy osad czynny, czyli mieszanina mikroorganizmw oczyszczajca cieki, funkcjonuje prawidowo i efektywnie. Rozwj nauki spowodowa i jednoczenie umoliwi nam nie tylko odpowiedzi na pytania: czy w ogle i jak sprawnie, ale rwnie dlaczego i kto lub co dziaa w oczyszczalni, z ktrej wydostaje si, czysta ju, woda. Szczeglne zasugi w analizach mikrobiologicznych odniosy metody oparte na biologii molekularnej, takie jak odmiany PCR i elektroforezy oraz hybrydyzacja kwasw nukleinowych. Pozwalaj one na okrelenie skadu zbiorowiska bakteryjnego oraz powizanie rnic w skadzie jakociowym i ilociowym bakterii ze zmiennymi parametrami technologicznymi, takimi jak temperatura, pH, wiek osadu, rodzaj poywki zasilajcej ukad technologiczny, a take typ reaktora biologicznego, dopyw zwizkw toksycznych, czy skala prowadzonego procesu (1,2). 2. Czym jest osad czynny? Jeli do obiegw wodnych doprowadzone zostaj cieki, ulegaj one naturalnym procesom oczyszczania, w skad ktrych wchodz: rozcieoczanie, adsorpcja, sedymentacja oraz waciwe oczyszczanie, czyli szereg reakcji biochemicznych i mineralizacja. Jest to naturalny sposb wczania w aocuchy pokarmowe martwej materii organicznej, przeksztacanej przez bakterie i grzyby mikroskopowe (3). Do oczyszczania ciekw wykorzystuje si midzy nimi metody chemiczne, stosunkowo drogie, a jednoczenie niebezpieczne, gdy generuj potencjalne zagroenie dla pozostaych elementw rodowiska poprzez wprowadzanie chemikaliw do ciekw i wody. Dlatego te technologia zwraca si ku bardziej naturalnym, a tym samym mniej szkodliwym, procesom biologicznego oczyszczania wd (4). Biologiczne oczyszczanie ciekw naladuje proces samooczyszczania, zachodzi jednak znacznie szybciej i w sztucznym ukadzie, jakim jest bioreaktor. Do takich procesw stosuje si najczciej osad czynny. Najprociej rzecz ujmujc, osad czynny jest kaczkowat zawiesin mikroorganizmw, takich jak bakterie, grzyby, Protozoa i Metazoa, ktre funkcjonuj w sztucznym ekosystemie, jakim jest reaktor biologiczny. Metoda osadu czynnego moe byd stosowania zarwno w skali laboratoryjnej, jak i technicznej, w oczyszczalni ciekw. Z ekologicznego punktu widzenia osad czynny jest sztuczn biocenoz (5) (Rys. 1.). Ukady laboratoryjne i technologiczne, oczyszczajce rne rodzaje ciekw, s pocztkowo zaszczepiane osadem z pracujcych ju ukadw technologicznych, aby przyspieszyd jego efektywn prac. Oczywicie reaktor oczyszczajcy cieki, pozostawiony sam sobie, z czasem wytworzyby naturalny osad czynny, powstay z mikroorganizmw docierajcych do ukadu ze rodowiska: z powietrza, z dopywajcymi ciekami, wypukiwanych z gleby itp. Z punktu widzenia technologa wane jest jednak nie tylko uycie gotowego osadu zaszczepiajcego, ktry moe

Projekt Sia wiedzy wspfinansowany przez Uni Europejsk w ramach Europejskiego Funduszu Spoecznego
CZOWIEK NAJLEPSZA INWESTYCJA

natychmiast zaczd pracowad, ale rwnie przyspieszenie procesw adaptacji osadu do nowych warunkw. Przykadowo, w sytuacji zmiany skali procesu (z laboratoryjnej do technicznej w oczyszczalni ciekw lub odwrotnie) zmienia si ilod dostpnych nisz ekologicznych dla funkcjonujcych w osadzie bakterii. Jeli drastycznie zmniejszymy lub zwikszymy skal procesu oczyszczania, bakterie potrzebuj okrelonego czasu na adaptacj i namnoenie si w nowym rodowisku. Osad czynny z instalacji oczyszczalni ciekw, uyty np. do zaszczepienia bioreaktorw laboratoryjnych w fazie adaptacji zmieni swj skad, liczebnod poszczeglnych mikroorganizmw zmieni proporcje, a w zalenoci od oczekiwanego efektu, czyli procesu, ktry bdzie dominowa w reaktorze, nastpi rwnie zmiana jakociowa grup bakterii w osadzie czynnym, co bdzie w gwnej mierze zalene od typu ciekw dopywajcych do reaktora i ustalonych parametrw procesu.

Rys. 1. Schematyczne przedstawienie bioreaktora jako sztucznego ekosystemu (13) Mieszanina ta ma jeszcze inne, wane z punktu widzenia produkcji pewnych zwizkw, waciwoci. W ostatnich latach sporo mwio si o polihydroksykwasach, wykorzystywanych do produkcji biodegradowalnego i biokompatybilnego plastiku, stosowanego na dod szerok skal w przemyle, medycynie i farmacji (6). Zwizki te s syntetyzowane przez du grup mikroorganizmw, stanowic ich wewntrzkomrkowe rdo wgla i energii na okresy godowe (7). Pierwszym zwizkiem tego typu, odkrytym u bakterii, by polihydroksymalan (PHB, ang. polihydroxybutyrate), zidentyfikowany u Bacillus megaterium (8). Do niedawna zwizki te byy produkowane na skal przemysow z uyciem czystych szczepw bakteryjnych, a komercjalizacja takiej produkcji bya niezwykle kosztowna. Ostatnimi czasy okazao si jednak, e osad czynny, jako mieszana kultura bakteryjna, wietnie nadaje si do produkcji polihydroksykwasw, co obnia koszty produkcji bioplastiku (9). Aktualnie badania nad pozyskiwaniem polihydroksykwasw i optymalizacj tego procesu prowadzi w Polsce kilka orodkw naukowych, m. in. Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu, Uniwersytet Warmiosko-Mazurski w Olsztynie, Politechnika Warszawska i Politechnika dzka. Osad czynny, ktrego nadmiar jest usuwany z oczyszczalni ciekw, moe byd stosowany po odpowiedniej przerbce do nawoenia gleb rolniczych lub do rekultywacji terenw przyrodniczych. Trzeba jednak pamitad, e w osadzie tym wystpuje znaczna liczba bakterii chorobotwrczych, takich jak Salmonella sp., Shigella sp., Escherichia coli, Vibrio cholerae, Mycobacterium tuberculosis

Projekt Sia wiedzy wspfinansowany przez Uni Europejsk w ramach Europejskiego Funduszu Spoecznego
CZOWIEK NAJLEPSZA INWESTYCJA

oraz wirusw i jaj pasoytw, ktre wywouj grone choroby. Dlatego te zastosowanie osadw jako nawozu musi byd poprzedzone jego odpowiedni obrbk, dezynfekcj i eliminacj zwizkw toksycznych, ktre mogyby wpynd negatywnie na jakod upraw (10). 3. Usuwanie zwizkw organicznych cieki dopywajce do biologicznej oczyszczalni ciekw s tak naprawd poywk bakterii, funkcjonujcych w ukadzie technologicznym. Cukry w ciekach s uznawane za najatwiej rozkadalne zwizki organiczne i s eliminowane biologicznie ju w drodze do oczyszczalni. Do dobrze rozkadalnych substancji w oczyszczalniach komunalnych zalicza si rwnie biaka. Do oczyszczalni dopywaj wic gwnie aminokwasy i kwasy tuszczone, powstajce z rozkadu biaek i tuszczw. Zwizki te s wprowadzane do oczyszczalni, gdzie wczaj si w procesy biochemiczne, prowadzone przez wystpujce tam bakterie. Procesy biologicznego rozkadu zwizkw organicznych i nieorganicznych to tak naprawd ogromna i zoona maszyneria biochemiczna, poniewa zwizki organiczne, rozoone czciowo lub cakowicie przez jedn grup bakterii, stanowi poywienie dla zupenie innych mikroorganizmw. Zwizki wgla zostaj rozoone w koocowym etapie do dwutlenku wgla i wody, a uwalniane zwizki azotu i fosforu wkraczaj w etapy przemian, obejmujcych nitryfikacj, denitryfikacj i defosfatacj. 4. 4.1. Procesy przemian azotu w oczyszczalni ciekw Nitryfikacja Aminokwasy w ciekach ulegaj procesowi amonifikacji, czyli zostaj przeksztacone w amoniak. Zwizek ten moe byd nastpnie wczany w biomas bakteryjn lub ulegad dalszym przeksztaceniom w procesie nitryfikacji. Usuwanie amoniaku jest konieczne ze wzgldu na jego toksyczny wpyw na ycie w ekosystemach wodnych, udzia w procesach eutrofizacji oraz zwikszenie zapotrzebowania na tlen w zbiornikach wodnych (11). Proces ten zachodzi w warunkach tlenowych i jest dwustopniowy. Azot amonowy w pierwszej fazie nitryfikacji zostaje utleniony do azotanw (III), a ten nastpnie w drugiej fazie procesu zostaje przeksztacony do azotanw (V). Te dwa etapy nitryfikacji s prowadzone przez dwie odrbne grupy bakterii, w ktrych zwizki azotowe s dla nich rdem energii w formie ATP i NADH, wykorzystywanym pniej do wzrostu i prowadzenia procesw yciowych. Nitryfikatory pierwszej fazy procesu, czyli bakterie utleniajce amoniak zwane s rwnie nitritatorami (ang. ammonia-oxidizing bacteria AOB), a nitryfikatory drugiej fazy, przeksztacajce azotany (III) do azotanw (V) to tzw. nitratatory (ang. nitrite oxidizing bacteria NOB). Znana jest te grupa bakterii heterotroficznych chemoorganotrofw, prowadzcych proces nitryfikacji heterotroficznej, jednak jego funkcja u heterotrofw jest niejasna (12, 4, 13). Badania nad nitryfikatorami s prowadzone od lat. Jednak tak samo jak w przypadku bakterii Anammox, o ktrych wspomn poniej, nitryfikatory bardzo trudno badad w postaci czystych szczepw. Od wielu lat szereg orodkw naukowych bada te mikroorganizmy na przerne sposoby. W jakim celu? Znajomod skadu bakteryjnego nitryfikatorw w osadzie czynnym jest koniecznym czynnikiem dla stworzenia optymalnej mieszaniny zaszczepiajcej, w rnych typach bioreaktorw, oczyszczajcych rozmaite rodzaje ciekw. Od dawna byo wiadomym, e nitryfikacja I fazy jest prowadzona przez bakterie Nitrosomonas sp., a fazy II przez Nitrobacter sp. Badania molekularne oczywicie potwierdziy, e bakterie te zazwyczaj dominuj w osadach prowadzcych nitryfikacj, jednak wci odkrywa si przeogromn biornorodnod bakterii nitryfikacyjnych, a co za tym idzie, modyfikuje si pogldy na procesy przez nie prowadzone i moliwoci ich uycia technologicznego. Badania nad nitry katorami prowadzi si m. in. w orodkach w Holandii (Del Uni ersity of Technology, Nederlands Ins tuut oor Ecologie), Niemczech (M nchen, Technische Universitat), Austrii (University of Vienna) i Belgii (Ghent University of Technology). W Polsce nitryfikatory bada si metodami molekularnymi m. in. w Gliwicach (Politechnika lska) I Olsztynie (Uniwersytet

Projekt Sia wiedzy wspfinansowany przez Uni Europejsk w ramach Europejskiego Funduszu Spoecznego
CZOWIEK NAJLEPSZA INWESTYCJA

Warmiosko-Mazurski). Takie analizy uatwiaj stworzenie szczepionki osadu czynnego, skadajcej si z wyselekcjonowanych bakterii, prowadzcych efektywne procesy oczyszczania, ktr mona stosowad zarwno na skal laboratoryjn. jak i techniczn. 4.2. Denitryfikacja Denitryfikacja to proces, ktry faktycznie zimniejsza ilod azotu w ciekach. Polega on na przeprowadzeniu produktu nitryfikacji azotanu (V) w wolny azot atmosferyczny. Bakterie denitryfikujce wystpuj w przernych rodowiskach, s to gwnie bakterie fakultatywne, wykorzystujce w procesach oddychania tlen jako ostateczny akceptor elektronw, lecz w warunkach jego braku zdolne do wykorzystania w tym celu innych zwizkw. Wynika to z faktu, e denitryfikacja jest procesem zachodzcym w rodowisku pozbawionym rozpuszczonego tlenu, nie jest ona jednak procesem zachodzcym beztlenowo, a anoksycznie. Oznacza to, e stenie tlenu nie przekracza wartoci 0,5 mg/dm3, a do prawidowego przebiegu procesu denitryfikacji jest potrzebny rwnie jon NO3- i zwizki organiczne jako rda wgla i energii. W procesie tym mog uczestniczyd takie bakterie jak: Alcaligenes faecalis, Pseudomonas aeruginosa, czy nawet Nitrosomonas europea, zdolny do denitryfikacji autotroficznej (14). Szybkod tego procesu jest zalena od jakoci dostarczonego rda wgla. Najefektywniejsze pod tym wzgldem s atwo przyswajalne zwizki, jak np. metanol. Denitryfikacja zachodzca w oczyszczalni, gdzie rdem wgla s doprowadzanie do niej cieki jest stosunkowo mniej efektywna. Na korzyd procesu denitryfikacji przemawia fakt, e eksploatacja oczyszczalni w takich warunkach jest taosza. Ze wzgldu na koniecznod zdobywania znacznych nakadw finansowych na prowadzenie klasycznych procesw nitryfikacji-denitryfikacji badacze poszukuj innych, korzystniejszych metod usuwania azotu ze ciekw. Moe nim byd proces Anammox. 4.3. Proces beztlenowego utleniania amoniaku Anammox W konwencjonalnych ukadach oczyszczania ciekw stosowane s dwa, opisane powyej, procesy usuwania azotu: nitryfikacja i denitryfikacja. Maj one jednak spore wady. Nitryfikacja jest procesem drogim, poniewa zachodzi w warunkach tlenowych, co wymaga staego napowietrzania, pochaniajcego nawet do 90% cakowitego zuycia energii w oczyszczalni. Natomiast denitryfikacja wymaga znacznych zasobw wgla organicznego (15). Dodatkowym problemem jest koniecznod uzyskania wysokiego stopnia oczyszczenia ciekw, co narzucaj cise normy unijne. Stosunkowo niedawno odkrytym i bardzo obiecujcym pod wzgldem efektywnoci usuwania zwizkw azotu i obniania kosztw tego procesu jest Anammox Anaerobic Ammonium Oxidation (16). Proces ten odgrywa rwnie wan rol w obiegu biogeochemicznym azotu w przyrodzie, gwnie w rodowiskach beztlenowych i mezofilnych (17). Usuwanie azotu w oczyszczalni w tym procesie moe byd znacznie taosze, poniewa koszt napowietrzania ograniczony zostaje do prawie 50%, a emisja CO2 o okoo 90% (18). Zastosowanie praktyczne tego procesu nie jest jednak takie proste, poniewa bakterie te rosn bardzo wolno, co utrudnia i opnia rozruch oczyszczalni i optymalizacj oczyszczania ciekw (19). Proces Anammox przewidywano na podstawie obliczeo termodynamicznych ju w latach siedemdziesitych ubiegego wieku (20), chod wydawao si, e o cyklu obiegu azotu wiadomo ju wszystko. Odkryto go jednak dopiero w 1995 roku w reaktorze, w ktrym zachodzia denitryfikacja (21). Bakterie prowadzce proces Anammox nale do jednego rzdu: Planctomycetales. Bada si je jedynie metodami biologii molekularnej, poniewa nie jest moliwe wyizolowanie ich w postaci czystych szczepw, co wynika m. in. z dugiego czasu hodowli. Pomimo informacji o procesie Anammox w latach dziewiddziesitych (22, 23), pierwsz bakteri Anammox Candidatus Bodadia anammoxidans zidentyfikowano w wzbogacanej kulturze bakteryjnej osadu czynnego bioreaktora w Holandii (18, 24). Aktualnie znanych jest pid rodzajw tych bakterii: Candidatus: Bocadia, Kuenenia, Scalindua, Anammoxoglobus i Jettenia (2, 25). Bakterie Anammox znacznie rni si od innych

Projekt Sia wiedzy wspfinansowany przez Uni Europejsk w ramach Europejskiego Funduszu Spoecznego
CZOWIEK NAJLEPSZA INWESTYCJA

bakterii budow ich komrki. Jedn z gwnych rnic jest wystpowanie u bakterii Anammox wewntrzkomrkowych przedziaw, poczonych z bon komrkow, gdzie odrbny jej fragment, zwany anamoxosomem, zawiera znaczne iloci enzymu - oksydoreduktazy hydroksylaminy (HAO). Enzym ten bierze udzia w utlenianiu hydrazyny do azotu czsteczkowego (18). Badania nad ekologi i fizjologi tego procesu s prowadzone na szerok skal w rnych orodkach naukowych w Europie, m. in. w Delft University of Technology w Holandii, Max Planck Institut for Marine Microbiology w Niemczech. Proces Anammox jest prowadzony w zakresie temperatur od 10 do 43C, z optimum w okolicy 37C. Bakterie Anammox, funkcjonujce w warunkach naturalnych, mog prowadzid ten proces nawet w temperaturze 15C (18, 26). Ze wzgldu na wysokie koszty podgrzewania takich ukadw do temperatury optymalnej dla wzrostu i funkcjonowania tych bakterii w ukadach technologicznych, wane byo wykazanie, e proces mona prowadzid w temperaturze duo niszej ni optymalna, nawet w okolicach 20C. Wyniki takich badao wyszy rwnie spod rki polskich badaczy (27, 28, 29, 30). W procesach na skal techniczn proces Anammox jest uruchamiany w systemach z biofilmem, osadem granulowanym lub sekwencyjnych reaktorach porcjowych (SBR, ang. Sequencing Batch Reactor) (18). Takie oczyszczalnie ju funkcjonuj w penej skali, jeden z nich, w postaci reaktora SBR, dziaa w w Strass, w Austrii (31), drugi - reaktor UASB (ang. Upflow Anaerobic Sludge Blanket) funkcjonuje w Rotterdamie, w Holandii (32). Jednak nadal czas wpracowania biomasy w tych ukadach wynosi ponad 3 lata (18). W Polsce nadal trudno jest znaled informacje dotyczce funkcjonowania procesu Anammox, zarwno w skali laboratoryjnej, jak i technicznej. Prace badawcze, z perspektyw przeoenia badao na skal techniczn, prowadzi si w tym zakresie w Katedrze Biotechnologii rodowiskowej, Wydziau Inynierii rodowiska i Energetyki Politechniki lskiej. Obejmuj one analizy fizyko-chemiczne i molekularne biornorodnoci bakterii Anammox w zou biologicznym i bioreaktorach membranowych (MBR, ang. Membrane Bioreactor). Naley rwnie wspomnied, e rne typy bioreaktorw maj rn efektywnod oczyszczania ciekw. W ostatnich latach prowadzi si intensywne badania nad bioreaktorami membranowymi. MBR ma kilka cech, ktre daj mu przewag nad innymi bioreaktorami, nie tylko w skali laboratoryjnej. Reaktory membranowe mog byd niewielkich rozmiarw, co jest wane ze wzgldu na koniecznod dostosowania wielkoci bioreaktora do skali prowadzonego procesu oczyszczania ciekw. cieki s filtrowane na membranie, ktra spenia rol osadnika wtrnego, a odpyw ciekw oczyszczonych jest praktycznie pozbawiony zawiesiny mikroorganizmw i ma wysok jakod oczyszczenia (33). W ukadach MBR testuje si aktualnie moliwod efektywnego usuwania takich zwizkw zagraajcych rodowisku jak: farmaceutyki, rodki kontrastujce oraz zwizki ropopochodne. Analizy te prowadzi si zarwno w Kraju (m. in. Politechnika lska, Politechnika Warszawska), jak za granic (m. in. Hiszpania University of Santiago de Compostela, Szwajcarii Ewag Aquatic Research) (34, 35, 36). 5. Procesy przemian fosforu w oczyszczalni ciekw Usuwanie zwizkw fosforu ze ciekw jest rwnie wane jak usuwanie azotu, poniewa fosfor jest rwnie pierwiastkiem biogennym, ktrego nadmiar w wodzie powoduje eutrofizacj. W ciekach fosfor wystpuje najczciej w postaci jonw fosforanowych (V) lub jako fosfor organiczny. Eliminacja tego pierwiastka ze ciekw opiera si w gwnej mierze na kumulacji go przez bakterie zdolne do prowadzenia takiego procesu i usuwania osadu, zawierajcego te bakterie, jako nadmiernego do czci osadowej oczyszczalni. Bakterie takie maj moliwod kumulacji zwizkw fosforu w postaci ziaren polifosforanw w cytoplazmie komrek, przechowujc w ten sposb zapasy na czas ewentualnego godu. Pod wzgldem kumulacji zwizkw zapasowych bakterie te funkcjonuj tak samo jak bakterie kumulujce polihydroksykwasy. W latach siedemdziesitych ubiegego wieku stwierdzono, e udzia fosforu w osadzie czynnym, wynoszcy w konwencjonalnych oczyszczalniach

Projekt Sia wiedzy wspfinansowany przez Uni Europejsk w ramach Europejskiego Funduszu Spoecznego
CZOWIEK NAJLEPSZA INWESTYCJA

1-2% suchej masy mona zwikszyd, poprzez manipulacj parametrami technologicznymi w taki sposb, aby w osadzie wzrosa ilod bakterii zdolnych do kumulacji fosforu. czc taki zabieg z analizami mikrobiologicznymi okazao si, e w osadzie czynnym wzrs udzia pewnych okrelonych rodzajw bakterii, zdolnych do kumulacji fosforu w swoich komrkach. Byy to gwnie bakterie z rodzaju Acinetobacter i Pseudomonas (14). Od tamtego czasu prowadzi si szeroko zakrojone badania nad grup bakterii zwanych PAO (ang. polyphosphate-accumulating organisms), identyfikujc je metodami molekularnymi i badajc ich preferencje dotyczce parametrw technologicznych, sprzyjajcych rozwojowi. Jednoczenie trwaj intensywne badania nad znalezieniem moliwoci zwikszania ich iloci w osadzie czynnym. Aktualnie wiadomo, e jedn z waniejszych grup PAO s bakterie z rodzaju Propionibacterium i Rhodocyclus (37). 6. O metodach biologii molekularnej sw kilka Osad czynny, zarwno tworzcy si w warunkach naturalnych, jak i w sztucznych, jakimi s bioreaktory, jest skomplikowan mieszanin mikroorganizmw. Jeszcze na pocztku ubiegego wieku analizy mikrobiologiczne tej biocenozy byy znacznie ograniczone. Problem polega na tym, e tradycyjne podejcie mikrobiologiczne opierao si na czystych, izolowanych metod pytkow lub probwkow, kultury bakteryjne, a bakterii osadu czynnego nie dao si rozdzielad na podoach mikrobiologicznych, w warunkach laboratoryjnych. Chod wydawao si, e naukowcom udao si odtworzyd naturalne siedlisko tych mikroorganizmw, bakterie osadu czynnego w okoo 95% pozostaway dla nich tajemnic. Prawdopodobnie nie chodzi tu jedynie o warunki fizykochemiczne, ale rwnie o pewne specyficzne interakcje midzygatunkowe, tworzce rodowisko ycia tych bakterii. Wszystko zmienio si w chwili, gdy odkryto, e za wszystkie cechy organizmw odpowiedzialne jest DNA, a t czsteczk mona z powodzeniem izolowad i badad na przerne sposoby. Dlatego te metody oparte na badaniu DNA, RNA i biaek, czyli metody biologii molekularnej, wkroczyy szybko do laboratoriw badajcych nie tylko osad czynny, ale rwnie inne zbiorowiska mikroorganizmw, wystpujce w rodowisku, takie jak gleba czy woda. Badania z uyciem tych metod pokazay jak niewiele tak naprawd wiemy o biornorodnoci bakteryjnej w rodowisku i pozwoliy wskazad mikroorganizmy, ktre s odpowiedzialne za wane procesy biochemiczne w mieszaninach rodowiskowych. Zapewne rodzi si pytanie: po co technologom w oczyszczalni ciekw metody biologii molekularnej? Ot informacje o tym, co tak naprawd miesza si w bioreaktorach moe uatwid dopasowanie parametrw fizyko-chemicznych procesu oczyszczania ciekw do skadu osadu czynnego. Badajc takie zbiorowiska w laboratorium jestemy w stanie przeledzid jakie zwizki chemiczne czy parametry fizyczne s zwizane z pojawianiem si, bd znikaniem okrelonych gatunkw czy rodzajw. Stosujc t wiedz w skali technicznej procesu oczyszczania, moemy zarwno kontrolowad nadmierny rozwj pewnych niepodanych w ukadzie mikroorganizmw, jak i wspomagad rozwj tych, ktre zwikszaj efektywnod prowadzonych procesw. Przykadem moe byd stosowane na szerok skal w zachodniej Europie, a u nas nadal raczkujcy, monitoring bakterii nitkowatych, odpowiedzialnych m. in. za proces puchnicia osadu czynnego. Taka sytuacja jest wysoce niepodana w oczyszczalniach, ze wzgldu na to, e puchncy osad czynny zamiast osiadad na dnie osadnikw wtrnych i wracad do obiegu wewntrznego oczyszczani, wypywa na powierzchni osadnika, unoszc do odpywu ciekw oczyszczonych czd zwizkw, ktre powinny zostad zatrzymane w obrbie oczyszczalni. Dlatego te puchnicie osadu zmniejsza efektywnod procesw technologicznych. Bakterie nitkowate s rwnie odpowiedzialne za proces pienienia si osadu, powodujcy podobne problemy eksploatacyjne. Od lat siedemdziesitych ubiegego wieku prowadzi si intensywne badania nad ekologi i fizjologi tych bakterii, aby poznad wroga i znaled jego sabe strony (38). Ale dopiero rozkwit metod biologii molekularnej pozwoli poznad te mikroorganizmy dostatecznie dobrze, aby znaled stosowane w praktyce metody zapobiegania ich

Projekt Sia wiedzy wspfinansowany przez Uni Europejsk w ramach Europejskiego Funduszu Spoecznego
CZOWIEK NAJLEPSZA INWESTYCJA

mnoeniu si w osadzie czynnym oczyszczalni (39). wietnym przykadem substancji, ktrej niekorzystne dziaanie na bakterie nitkowate z gatunku Microthrix parvicella wykazano w badaniach jest chlorek poliglinu Al3+ o nazwie handlowej PAX-16. Bakterie nitkowate z rodzaju M. parvicella wystpuj we wszystkich strefach oczyszczalni (tlenowej, beztlenowej i niedotlenionej), powodujc intensywne pienienie osadu, dlatego te dla ograniczenia ich rozwoju w oczyszczalniach stosuje si wspomniany zwizek, ktry z powodzeniem eliminuje te mikroorganizmy z osadu (40). W Polsce nadal skad osadu monitoruje si tradycyjnymi metodami mikroskopowymi, w oparciu o indeksy biotyczne, np. indeks Madoniego, stosowany od lat dziewiddziesitych (41). Indeks ten opiera si na zaoeniu, e liczebnod pewnych grup wikszych mikroorganizmw osadu czynnego, takich jak orzski czy wiciowce, jest cile powizane ze zmian parametrw oczyszczania ciekw. Indeks ten ma jedn wad, mianowicie, zanim pewne zmiany technologiczne odbij si na liczebnoci organizmw wyszych, niektre grupy bakterii, odpowiedzialnych za wane procesy w cigu oczyszczania ciekw, zostan zniszczone. Std postulat, aby metody molekularne byy stosowane w celu monitoringu osadu czynnego, poniewa s szybsze i bardziej efektywne od tradycyjnych. Swoisty opr, jaki stawiaj technolodzy w implementacji metod molekularnych w monitoring oczyszczalni wynika z faktu, e nie widz oni koniecznoci czenia zmian biologicznych z fizyko-chemicznymi. Jest to duy bd, poniewa bez znajomoci zalenoci ekologicznych pomidzy organizmami biocenozy osadu czynnego zastosowanie metod biologicznych w oczyszczaniu ciekw nie byoby moliwe. Istnieje kilka podstawowych metod monitoringu biocenoz bakteryjnych. S one proste, a jednoczenie dziki rozwojowi rynku odczynnikw do biologii molekularnej rwnie coraz taosze. Nale do nich hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH, ang. Fluorescent in situ Hybridization) oraz elektroforeza w gradiencie denaturacji (DGGE, ang. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). Wyniki uzyskiwane tymi dwoma metodami pozwalaj uzyskad caociowy obraz biocenozy bakteryjnej, poniewa FISH daje wynik gwnie ilociowy, natomiast DGGE jakociowy. Obydwie metody s oparte na najwaniejszej w biologii molekularnej zasadzie komplementarnoci zasad azotowych. Kwas deoksyrybonukleinowy jest podwjn helis, zbudowan z antyrwnolegych aocuchw, skadajcych si z czterech podstawowych nukleotydw. S to: adenina (A), tymina (T), guanina (G) i cytozyna (C). Zasada komplementarnoci polega na tym, e pary nukleotydw budujcych helis zawsze bd czyd si zgodnie ze schematem: AT i GC, z tym, e w pierwszym przypadku jest to podwjne, a w drugim potrjne, wizanie wodorowe. Drugim wanym pojciem, ktre pojawia si w przypadku metod molekularnych jest temperatura topnienia DNA, czyli temperatura (lub stenie czynnika denaturujcego), konieczne do rozerwania wizao wodorowych pomidzy parami zasad azotowych w kwasie deoksyrybonukleinowym. FISH jest odmian hybrydyzacji. Oznacza to, e materia genetyczny musi byd najpierw poddany denaturacji wysok temperatur i czynnikiem rozrywajcym wizania wodorowe, aby otrzymad pojedyncze nici DNA, a tym samym uzyskad dostp do interesujcych nas sekwencji. Po zakooczeniu dziaania czynnika denaturujcego nastpuje spontaniczna renaturacja nici na zasadzie komplementarnoci. Poszukujc okrelonego genu i jego lokalizacji w materiale badanym konstruuje si tzw. sond oligonukleotydow, czyli fragment kwasu nukleinowego o sekwencji komplementarnej do poszukiwanej sekwencji, charakterystycznej dla okrelonego rodzaju, gatunku lub grupy mikroorganizmw. Oznacza to, e musimy wiedzied jakiej sekwencji szukamy, aby sprawdzid czy znajduje si ona w prbce i w jakiej iloci. Jeli badamy mieszanin osadu czynnego to prbk, zawierajc DNA wszystkich mikroorganizmw osadu, poddajemy hybrydyzacji z odpowiednio dobran sond. Sonda jest znakowana fluorescencyjnie, wic jeli poczy si z DNA bakteryjnym, o sekwencji komplementarnej do niej i utworzy fragment dwuniciowy, to zastosowanie odpowiedniej dugoci fali wietlnej (promieniowanie UV w mikroskopie fluorescencyjnym) wzbudzi sygna fluorescencyjny obserwowany w postad wiecenia w odpowiednim miejscu badanego preparatu

Projekt Sia wiedzy wspfinansowany przez Uni Europejsk w ramach Europejskiego Funduszu Spoecznego
CZOWIEK NAJLEPSZA INWESTYCJA

(Rys. 2). FISH stosuje si z powodzeniem do okrelania lokalizacji i iloci interesujcych nas mikroorganizmw w osadzie czynnym, ktre spodziewamy si znaled w prbce biologicznej.

Rys. 2. Schemat fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (18) Metod pozwalajc uzyskad wyniki komplementarne do FISH jest DGGE. Rozdzia elektroforetyczny w gradiencie denaturanta jest poprzedzony amplifikacj metod PCR (ang. Polymerase Chain Reacton, reakcja aocuchowa polimerazy). C to znaczy? Mieszanina DNA bakteryjnego, ktr izoluje si z osadu czynnego, zawiera przerny materia genetyczny. W zalenoci od tego, czy chcemy badad wszystkie bakterie, czy tylko wybrane grupy mikroorganizmw odpowiedzialnych za interesujce nas procesy (np. nitryfikatorw, denitryfikatorw, bakterii nitkowatych), dobiera si odpowiedni marker molekularny (tu: gen lub jego fragment), ktrego ilod trzeba zwielokrotnid przez waciw analiz. Metoda PCR to nic innego jak sztuczna replikacja, zachodzca w warunkach laboratoryjnych, w tzw. termocyklerze. Sprzt ten umoliwia szybkie zmiany temperatury, niezbdne do denaturacji DNA, przyczenia tzw. starterw, zaznaczajcych na zasadzie komplementarnoci w badanych materiale genetycznym fragment DNA, ktry chcemy zwielokrotnid i samego procesu amplifikacji, czyli powielania DNA. Rekcja PCR zachodzi cyklicznie, a enzymem, wykorzystywanym w procesie, jest polimeraza DNA (std te i nazwa metody). Po zakooczeniu reakcji PCR wielkod produktu jest sprawdzana poprzez rozdzia elektroforetyczny w elu agarozowym. Nonik ten pozwala na okrelenie rnicy w wielkoci produktu, ale nie w jego jakoci, czyli sekwencji nukleotydw. Taka analiz jakociow produktu PCR zapewnia DGGE, czyli inny rodzaj elu poliakrylamidowy, w ktrym utworzony zosta rosncy gradient czynnika denaturujcego mocznika. Produkt PCR przeciskajc si przez pory elu rozdziela si na mniejsze fragmenty, a ze wzgldu na rnic w sekwencji, a nie wielkoci produktw PCR. Taka sytuacja wynika z faktu, e amplifikowalimy gen o okrelonej wielkoci, ale dla rnych bakterii w mieszaninie osadu czynnego, std ta sama wielkod, ale rna sekwencja. Czynnik denaturujcy rozrywa wizania wodorowe w produktach PCR na rnej wysokoci w elu. Uzyskujemy w ten sposb tzw. fingerprint prbki, czyli

Projekt Sia wiedzy wspfinansowany przez Uni Europejsk w ramach Europejskiego Funduszu Spoecznego
CZOWIEK NAJLEPSZA INWESTYCJA

jej wzr prkowy, ktry moemy porwnad z innymi prbkami rozdzielonych produktw PCR. Jest to jakociowa analiza zbiorowiska bakteryjnego, ktrej wynik, w poczeniu z metod ilociow, jak jest FISH, pozwala zobrazowad skad mikroorganizmw w prbce osadu czynnego i poczyd jego zmiennod z parametrami procesu oczyszczania lub wpywem zwizkw szkodliwych. Schemat DGGE i porwnanie fingerprintw osadu czynnego przedstawiono na rysunku 3. Warto rwnie wspomnied o szybkich metodach identyfikacji bakterii chorobotwrczych, opartych na biologii molekularnej. O ile identyfikacja bakterii grup funkcjonalnych w osadzie, odpowiedzialnych za okrelone procesy biochemiczne, z reguy nie jest moliwa klasycznymi metodami mikrobiologicznymi, o tyle wikszod bakterii chorobotwrczych dod dobrze ju zbadano. Std moliwod badania takich patogenw zarwno metodami klasycznymi, jak i metodami molekularnymi, ktre daj duo szybszy, jednoznaczny i powtarzalny wynik. Zalicza si do nich zarwno metody hybrydyzacyjne (FISH lub klasyczna hybrydyzacja DNA:DNA), jak i te oparte na PCR (np. multiplex PCR, w ktrym stosuje si kilka par starterw specyficznych gatunkowo, identyfikujc jednoczenie kilka rnych patogenw, bez koniecznoci izolowania czystych szczepw). Oczywicie zawsze najpewniejsz metod identyfikacji jest sekwencjonowanie DNA, ktrej wynik mona porwnad z bankiem genw i precyzyjnie zidentyfikowad bakteri.

Rys. 3. Schemat rozdziau elektroforetycznego produktw PCR metod DGGE (a); porwnanie fingerprintw osadu czynnego monitoring zmiennoci bakterii w czasie, w zalenoci od stenia zanieczyszczeo w ciekach (b); do produktw PCR w trakcie amplifikacja dodawany jest tzw. ogon GC, fragment ok. 30-40 nukleotydw GC zapobiegajcy cakowitemu rozpleceniu nici DNA podczas pniejszego rozdziau elektroforetycznego 7. Podsumowanie Osad czynny jest produktem w peni naturalnym. Czowiek jedynie zaadoptowa go do swoich potrzeb i z powodzeniem wykorzystuje do oczyszczania ciekw, manipulujc jego skadem mikrobiologicznym. Mikrobiologa interesuje, co w tym osadzie siedzi i jakie zalenoci biochemiczne i ekologiczne tam zachodz. Technolog zapyta, dlaczego ma byd wicej tego lub innego mikroorganizmu i czy jeli wspomoe si rozwj okrelonej bakterii, dostaniemy bardziej oczyszczone cieki, w dodatku niszym nakadem finansowym. A cae zagadnienie to czysta biotechnologia. Biologia daje podwaliny teoretyczne, technologia korzysta z tej teorii, aplikujc j praktycznie. I to jest caa prawda o tej dziedzinie wiedzy. Wsppraca, ktra daje efekty. Dr Aleksandra Czogalla, Politechnika lska

Projekt Sia wiedzy wspfinansowany przez Uni Europejsk w ramach Europejskiego Funduszu Spoecznego
CZOWIEK NAJLEPSZA INWESTYCJA

Bibliografia 1. Tang C. J. i wsp., Effect on substrate concentration on stability of Anammox biofilm reactors, Journal of Central South University of Technology, 2010, tom 17, zeszyt 1, str. 79-84. 2. Hu B.-I. i wsp., Identification and quantification of Anammox bacteria in eight nitrogen removal reactors, Water Research, 2010, doi: 10.1016/j.watres.2010.07.021. 3. Fijakowska E. i wsp., Osad czynny biologia i analiza mikroskopowa, Oficyna Wydawnicza Impuls, Krakw, 2005. 4. Szewczyk K. W., Biologiczne metody usuwania zwizku azotu ze ciekw, Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej, Warszawa, 2005. 5. Trojan P., Ekologia oglna, PWN, Warszawa, 1975. 6. Liu Z., i wsp., Optimization of polyhydroxybutyrate (PHB) production by excess activated sludge and microbial community analysis, Journal of Hazardous Materials, 2010, doi:10.1016/j.jhazmat.2010.08.003 7. Anderson A.J., Dawes E.A., Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates, Microbiology Reviews, 1990, tom 54, str. 450472. 8. Lemoigne M., Produits de dshydration et depolymerization de lacide hydroxybutyrique, Bulletin de la Socit de chimie biologique, 1926, tom 8, str. 770782. 9. Castilho L.R. i wsp., Production of polyhydroxyalkanoates (PHAs) from waste materials and by-products by submerged and solid-state fermentation, Bioresource Technology, 2009, tom 100, str. 59966009. 10. Szwedziak K., Charakterystyka osadw ciekowych i rolnicze wykorzystanie, Inynieria Rolnicza, 2006, tom 4, str. 297-302. 11. Egli K. i wsp., Community analysis of ammonia and nitrite oxidizers during start-up of nitritation reactors, Applied and Environmental Microbiology, 2003, tom 69, zeszyt 6, str. 3213-3222. 12. Klimiuk E., ebkowska M., Biotechnologia w ochronie rodowiska, PWN, Warszawa, 2004. 13. Ziembioska A., Analiza filogenetyczna bakterii nitryfikacyjnych w rnych typach instalacji oczyszczania ciekw, praca doktorska, Politechnika lska/Uniwersytet dzki,2008. 14. Miksch K., Sikora J. (red.), Biotechnologia ciekw, PWN, Warszawa, 2010. 15. Yang J., I in., High-rate nitrogen remo al by the Anammox process at ambient temperature, Bioresource Technology, 2010, doi:10.1016/j.biortech.2010.08.039. 16. Furukawa K. i wsp., Innovative treatment system for digester liquor using Anammox process. Bioresource Technology, 2009, tom 100, str. 5437 - 5443. 17. Li H., i wsp., Molecular detection of anaerobic ammonium-oxidizing (Anammox) Bacteria in high temperature petroleum reservoirs, Microbial Ecology, 2010, doi: 10.1007/s00248-0109733-3. 18. Ziembioska A., Cema G., Dwa punkty widzenia, czyli Anammox okiem biologa i technologa, Forum Exploatatora, 2010, w druku. 19. Fernndez I. i wsp., Biofilm and granular systems to impro e Anammox biomass retention, Biochemical Engineering Journal, 2008, tom 42, str. 308 313. 20. Broda E., Two kinds of lithotrophs missing in nature, Zeitschrift fr allgemeine Mikrobiologie, 1977, tom 17, zeszyt 6, str. 491 493. 21. Mulder A. i wsp., Anaerobic ammonium oxidation discovered in denitrifying fluidized bed reactor, FEMS Microbiology Ecology, 1995, tom 16, str. 177-184. 22. Strous M. i wsp., The sequencing batch bioreactor as a powerful tool for the study of slow growing anaerobic ammonium-oxidizing microorganisms, Applied Microbiology and Biotechnology, 1998, tom 50, str. 589 596.

Projekt Sia wiedzy wspfinansowany przez Uni Europejsk w ramach Europejskiego Funduszu Spoecznego
CZOWIEK NAJLEPSZA INWESTYCJA

23. 24. 25.

26. 27.

28. 29. 30. 31. 32.

33. 34. 35.

36.

37.

38. 39. 40.

41.

van de Graaf A. A. i wsp., Anaerobic oxidation of ammonium is a biologically mediated process, Applied and Environmental Microbiology, 1995,tom 61, str. 1246 1251. Strous M. i wsp., Missing lithotroph identified as new planctomycete, Nature, 1999, tom 400, zeszyt 6743, str. 446 - 449. Hirsch M. D., Long Z. T., Song B., Anammox bacteria diversity in various aquatic ecosystems based on the detection of hydrazine oxidase genes, Environmental Microbiology, 2010, doi: 10.1007/s00248-010-9743-1. Strous M., Microbiology of anaerobic ammonium oxidation, praca doktorska, Technical University of Delft, Holandia, 2000. Cema G. i wsp., Biological nitrogen removal from landfill leachate by deammonification assisted by heterotrophic denitrification in rotating biological contactor (RBC), Water Science and Technology, 2007, tom 55, zeszyt 8-9, str. 35-42. Dosta J. i wsp., Short- and long-term effects of temperature on the Anammox process. Journal of Hazardous Materials, 2008, . tom 154, zeszyt 1-3, str. 688-693. Fernandez I. R., Towards the improvement of start-up and operation of Anammox reactors, praca doktorska, The University of Santiago De Compostela, Hiszpania, 2010. Isaka K. i wsp., Nitrification of landfill leachate using immobilized nitrifying bacteria at low temperatures, Biochemical Engineering Journal, 2007, tom 37, str. 49 55. Wett B., Solved upscaling problems for implementing deammonification of rejection water, Water Science and Technology, 2006, tom 53, zeszyt 12, str. 121-128. van der Star W. i wsp., Startup of reactor for anoxic ammonium oxidation: Experiences from the first full-scale anammox reactor in Rotterdam, Water Research, 2007, tom 41, zeszyt 18, str. 4149-4163. Redjeno i J. i wsp., Membrane Bioreactor (MBR) as an Advanced Wastewater Treatment Technology Handbook of Environmental Chemistry, 2008, tom 5, zeszyt S/2, str. 37101. Reif R. i wsp., Fate of pharmaceuticals and cosmetic ingredients during the operation of a MBR treating sewage, Desalination, 2008, tom 221, zeszyt 1-3, str. 511-1 517. Wiszniowski J. i wsp., Membrane biological reactor (MBR) for treatment of wastewater contaminated by petroleum organic compounds. Proceedings of a Polish-Swedish-Ukrainian seminar, E. Plaza, E. Levlin (red.), Stockholm, Sweden, Raport nr 19. http://www.lwr.kth.se/forskningsprojekt/Polishproject/SUP/index.htm, September 23-25, 2009. Ziembioska A. i wsp., DGGE-based monitoring of bacterial diversity in activated sludge dealing with wastewater contaminated by organic petroleum compounds, Archives of Environmental Protection, 2010, tom 4, w druku. Kawaharasaki M. i wsp., Flow cytometric sorting and RFLP analysis of phosphate accumulating bacteria in an enhanced biological phosphorus removal system, Water Science and Technology, 2002, tom 46, zeszyt 12, str. 139144. Eikelboom, D. Geurkink, B., Filamentous microorganism observed in industrial activated sludge plants, Water Science and Technology, 2002, tom 46, zeszyt 12, str. 535542. Nielsen P. H. i wsp., Identity and ecophysiology of fllamentous bacteria in activated sludge, FEMS Microbiology Reviews, 2009, tom 33, str. 969998. Gielert M., Kubicka Formela U., Zastosowanie PAX-16 do zwalczania puchnicia i pienienia w wielofazowych bioreaktorach oczyszczalni ciekw Gdaosk-Wschd, Materiay Midzynarodowego Seminarium Naukowo-Technicznego, 2002. Drzewicki A., Biotyczny Indeks Osadu Czynnego w praktyce monitoringu oczyszczania ciekw, Gaz, woda i technika sanitarna, 2010, tom 7, zeszyt 8, str. 42-44.

Projekt Sia wiedzy wspfinansowany przez Uni Europejsk w ramach Europejskiego Funduszu Spoecznego
CZOWIEK NAJLEPSZA INWESTYCJA