BI TP CHNG 3

CU 1: A. Bn cht ca cc con ng chuyn ha? Bn cht ca cc con ng chuyn ha S oxi ha sinh hc l khi nim chung dng ch mt lot cc phn ng oxi ha sinh nng lng xy ra trong cc t bo sng.

O2

C6H12O6
Dng electron 3O2 Dng cacbon

6 H2O

6CO2

S mt hidro ca c cht c th theo 4 con ng khc nhau. mi con ng u c chc nng mt hidro, sinh nng lng v sn sinh cc sn phm trao i cht phn t nh cung cp lm nguyn liu cho cc phn ng sinh tng hp. Hidro tch ra c vn chuyn v cui cng c tip nhn bi oxi to ra nc. 1. Con ng ng phn (glycosis): cn gi l con ng EMP Glucose 2piruvat + 2ATP + 2NADH2 Trong iu kin c hay vng mt O2, glucose u c chuyn thnh piruvat qua 10 phn ng . Trong 2 phn ng 7 v 10 to ra ATP.

ng phn cung cp cho t bo 6 trong 12 tin cht dng tng hp cc n v kin trc : glucose 6 photphat, fructose 6 P, 3 P glixeraldehit, PEP, piruvat, riboz 5 P, eritroz 4 P, axetyl coA, oxalaxetat (AOA) v xucxinyl coA. 3 P glixerat, ketoglutarat,

2. Con ng pento photphat: Con ng ny gip cho nhiu vi khun chuyn ha glucose thnh piruvat khng qua con ng ng phn EMP, cung cp cho t bo 2 tin cht khc l riboz 5 P (dng tng hp axit nucleic) v eritroz 4 P (cng vi PEP dng tng hp cc axit amin thm). Ngnoaif ra cn cung cp NADPH cn cho cc phn ng tng hp kh Glucose piruvat + 3CO2 + 6NADPH + NADH2 + ATP

3. Con ng 2 keto 3 deoxi 6 P gluconat Glucose 2 Piruvat + ATP + NADH2 + NADPH2 Con ng ny ch gp mt s vi khun

4. Qu trnh oxi ha piruvat Piruvat chim vai tr trung tm trong trao i cht trung gin v l tin cht ca nhiu sn phm. Nhiu vi sinh vt oxi ha piruvat thnh acelyt coA Piruvat + coA + NAD+ Acetyl coA + NADH2 + CO2 Piruvat + coA + 2Fd Acetyl coA + 2FdH + CO2 Piruvat + coA Acetyl coA + Focmat

5. Chu trnh acid tricaboxilic: cn gi l chu trnh Krebs: Chu trnh dng oxi ha axetat thnh CO2 v gii phng H2. Cung cp cho t bo 3 tin cht: oxalaxetat (dng tng hp aspacat), ketoglutarat (dng tng hp glutamat) v xucxinyl coA (dng tng hp nhn hem cn cho cu trc catalaza, xitocrom, clorophin, vitamin B12)

6. Chui h hp v qu trnh photphoryl ha: H+ v e tch ra t c cht tham gia vo chui h hp, cc e c chuyn n O2. Nng lng thot ra c chuyn thnh ATP, phn nh gii phng dng nhit. cc thnh phn ca chui nm trong lp lipit kp gm nhiu ezym vn chuyn e v hidro, cc coezym v nhm them, cc dehidrogenaza v h thng vn chuyn. cc thnh phn quan trng nht tham gia vo oxi ha hidro: flavoprotein, protein Fe S, quinon, xitocrom.

B. Cc cht trao i ca vi sinh vt 1. Cc cht trao i s cp Trong pha tng tc, vi sinh vt sn sinh hng lot cc cht cn thit cho sinh trng ca chng nh cc nucleotit, axit amin, protein, cacbohydrat, lipit, hoc cc sn phm ph cu qu trnh trao i cht nhng nng lng nh etanol, axetol, butanol,y c m t nh l pha thich nghi (tropophase ) v sn phm thng c gi l cc cht trao i s cp. 2. Cc cht trao i th cp Cc vi sinh vt sn sinh hng lot cc sn phm khc cht trao i s cp. Trong pha ny, khng c vai tr r rang trong qu trnh trao i cht cu c th vi sinh vt c sn sinh ra, pha ny cn c gi l pha t pht (idiophase) v sn phm to ra c gi l cht trao i th cp. Nhiu cht trao i th cp c sinh ra t cc cht trung gian v sn phm cui cng ca qu trnh trao i cht s cp.

CU 2: Phn ng oxy ha kh sinh hc trong cng nghip? Phn ng c bn nht trao i cht v nng lng ca vi sinh vt t dng v d dng l phn ng oxy ha kh sinh hc trong cng nghip. Nhng phn ng phn hy (bin i d ha) ny c km theo gii phng nng lng c tin hnh trong t bo sng vi s tham gia ca nhng h enzyme c bit chnh l qu trnh oxy ha kh sinh hc. Cc qu trnh oxy ha kh sinh hc l qu trnh d ha khng nhng l ngun cung cp nng lng cn thit thc hin cc phn ng tng hp khc nhau m cn l ngun to ra hng lot cc sn phm trung gian dng lm nguyn liu cho phn ng tng hp v ng vai tr ht sc quan trng trong vic lin hp cc qu trnh trao i cht. Qu trnh oxy ha cc hp cht hu c c th sinh vt do h enzyme oxy ha kh xc tc. Cc enzyme ny ch yu do h vi sinh vt hoc do bn thn c th ng vt, thc vt to ra trong qu trnh sng ca chng. Cc enzyme ny c tn chung l Oxydoreductase gm mt s nhm enzyme ch yu nh: dehydrogenase (nhm ngoi la NAD, NADP, FAD,), oxydase ( polyphenoloxydase, catalase, lipo oxydase,...) v cc cht chuyn trung gian khc. Cc cht dinh dng c bn dng lm nguyn liu cho qu trnh oxy ha trong c th sinh vt l: gluxit, protit, lipit Trc khi c s dng lm nguyn liu h hp (oxy ha) chng chu nhng bin i chuyn ha khc nhau thc cht l s phn hy chng thnh cc cu t hp phn n gin ( monose, axit amin, axit bo), qu trnh ny cng c thc hin nh xuacs tc ca enzyme ch yu l enzyme thy phn. Cc cu t n gin ny thm vo t bo, v qu trnh oxy ha s xy ra theo c ch kh phc tp. Tuy nhin mt iu c bit l khi vo t bo, qu trnh oxy ha cc cu t n gin ca cht dinh dng ch khc nhau giai on u v ng hng chuyn ha, nhng u cng to thnh mt sn phm trung gian l Acetyl- Coenzyme A.

C th, vo t bo gluco qua qu trnh ng phn to thnh 2 phn t axit pyruvic, y l giai on u chun b cho h hp hiu kh. Cn cc axit amin b oxy ha ch yu cng to thnh axit pyruvic, t axit glutamit to axit - xetoglutaric, t axit aspactic thnh oxaloacetic. Axit pyruvic khi thm vo ti th, b oxy ha tip tc to nn acetyl- coenzyme, axit bo trong t bo cng b oxy ha thnh cc gc axit acetic (ng hn l axit coenzyme A). Nh vy, v thc cht s oxy ha sinh hc c bn km theo sn sinh nng lng quy t li s oxy ha pyruvic v gc axit acetic. Qu trnh oxy ha tip tc c tin hnh trong mt chu trnh kn gi l chu trnh Kreb hay chu trnh tricarboxylic, sn phm cui ca chu trnh ny l CO2, H2O. Chu trnh ny cn to hng lot cc sn phm trung gian quan trng nh a.citric, a.sucxinic, cetoglutaric Tm li lipit v gluxit i vo c th b i chy hon ton to CO2, H2O, cn protit, sau khi thy phn to axit amin, amin s tip tc b oxy ha to CO2, H2O v ammoniac, cht ny tc dng vi CO2 chuyn thnh cacbamil v sau tao ure. Tuy nhin trong c th sinh vt cng tn ti mt s dng oxy ha khc ca gluco khng qua con ng ng phn v chu trnh Kreb, nh con ng oxy ha trc tip gluco Chu trnh petozaphotphat. Nh vy trong c th c nhiu kiu phn gii khc nhau, cc kiu ny b sung cho nhau, c th xy ra song song cng nhau hoc mt vi kiu chim u th nhng iu kin nht nh.

Cu 3: Phn ng oxy ha kh sinh hc trong cng nghip sinh vt d dng v t dng? *V d: A. Sinh vt d dng: - Nm men S. cerevisiae

EMP

C6H12O6

A.pyruvic

NAD

NADH + H+ CO2

C2H5OH

CH3CHO

B. Sinh vt t dng - Vi khun Nitrat

O2 NH3
+

NO2-

NO3-

ATP

H+

CO2 + H2O

[CH2O]n

CHNG 3: K THUT TO CHNG VI SINH VT TI T HP

3.1 MT S KHI NIM CHUNG V VI SINH VT TI T HP Chng vi sinh vt ti t hp l nhng chng vi sinh vt c bin i theo mc ch ca con ngi. Bng k thut sinh hc phn t, c th ci gn thm mt hoc mt s gen t cc loi sinh vt khc, to nn cc chng vsv ti t hp loi b mt s gen c, gen c hi, c to dng thun c n nh cao v lu di ng dng trong nhiu lnh vc: Cng nghip: sn xut enzym, sn xut cn v nhin liu sinh hc Y hc bo v sc khe con ngi: nhiu chng vi khun v nm ti t hp c s dng sn xut cc protein dc liu s dng trong iu tr bnh cho con ngi. Mt s chng s dng trong sn xut vacxin, hoc lm vect liu php gen trong iu tr bnh cho con ngi Nghin cu c bn: s dng trong tch dng gen, biu hin gen, lp ngn hng gen K thut chuyn gen to cc ging vt nui cy trng mi: chng vi khun Agrobacterium tumefaciens dng chuyn cc gen khc nhau vo nhiu loi cy trng nh thuc l, c chua, ng c hiu qu cao X l mi trng: to ch phm x l ph thi rn, nc thi, nc ao nui thy sn c hiu qu cao, gp phn lm gim thiu nhim mi trng, tng gi tr gia tng ca sn xut nng nghip. 3.2 K THUT TO CHNG VI SINH VT TI T HP Vn to chng vsv ti t hp v nh hng ng dng cc chng vsv ti t hp trong thc tin l khu then cht, gi v tr quan trng trong quyt nh thnh qu ca cng ngh vi sinh. K thut to chng vsv ti t hp gm cc bc sau: Xc nh v tch chit gen ch

 La chn loi vect tch dng To vect ti t hp Bin np vect ti t hp vo t bo vsv to chng ti t hp Chn lc v to dng vsv ti t hp Thu nhn sn phm ti t hp 3.2.1 Xc nh v tch chit gen ch Mi chng vsv ti t hp c ci gn thm mt hoc mt s gen ch khc nhau, ty theo mc ch ca con ngi. Xc nh chnh xc ngun vt liu mang gen ch (thng l cc gen m ha cc protein cn thit cho con ngi) to chng vsv ti t hp. c th tch chit chnh xc cc gen ch, cn phi s dng mt s k thut phn t c trng ring khc nhau. i vi cc gen ch tch chit t vi khun, c th s dng k thut nhn gen PCR vi cc cp mi c hiu nhn gen ch cn thit Cc gen tch chit t cc t bo sinh vt bc cao, cn s dng k thut phin m ngc to cc on cADN t cc AND thng tin hoc phn lp gen ch bng k thut RT PCR. 3.2.2 La chn loi vect tch dng Cn c vo c im c trng, ngun gc, kch thc ca gen ch v loi t bo ch la chn loi vect tch dng cho ph hp. Mt s loi vect tch dng thng s dng v kch thc gen ch c th ci gn: Loi vect tch dng Kch thc on gen ch c th ci gn Plasmid Phage 1 5 kb 15 25 kb

Phagemid Cosmid BAC (thit k t mt phn AND E.coli v cc plasmid) TAC (thit k t mt phn on vir gen ca Ti - plasmid) BiBAC (thit k t mt phn AND b gen agrobacterium) PAC (b gen ca phage P1 + plasmid) YAC (thit k t mt phn AND b gen ca nm men) Viral vect: Adenoviral vect, Retroviral vect, AAV

20 10 kb 30 50 kb 100 300 kb 100 300 kb 100 500 kb 100 300 kb 2.000 kb

Trong sn xut cc cht hot tnh sinh hc phc v con ngi nh cc chng vsv ti t hp, ngi ta thng la chn vect tch dng l cc plasmid hoc th thc khun (phage)

. S vector tch dng l Ti plasmi

3.2.3 To vect ti t hp Cc bc thc hin: Chun b nguyn liu: gen ch tinh sch c nhn gen bng PCR. S dng cc loi enzym gii hn ph hp ct m vng cc vect tch dng ph hp . Thc hin phn ng ni gen ch vi vect tch dng: chun b thnh phn phn ng ph hp vi mi loi vect tch dng. Hn hp cc thnh phn phn ng c qua m oqr nhit 16oC . sau , tin hnh in d vi thang AND chun kim tra kt qu to vect ti t hp. vect ti t hp to c cn gi trong t lnh su -800C n -850C tip tc cc nghin cu tip theo

. Cc bc to vector ti t hp

Phng php to DNA ti t hp: phng php dng u lch

Chn v x l DNA plasmid Plasmid c tch t t bo E. Coli hoc t bo nm men theo phng php chit tch DNA plasmid. Sau , dng enzyme RE II (nh EcoRI) ct to ra plasmid h c hai u lch nhau. Chn v x l on ci DNA on ci c thu nhn v la chn, tinh ch theo mc ch ca tng nghin cu. Ct DNA bng enzyme RE loi II cng loi vi enzyme ct plasmid (EcoRI) to ra cc vt ct ging nhau. To plasmid ti t hp Ghp on ci vo plasmid bng cch cc DNA on ci vi plasmid vi s c mt ca enzyme DNA ligase, ta thu c DNA ti t hp. Phn ng ni xy ra theo s c biu din trn hnh trn. 3.2.4 Bin np vecto ti t hp vo t bo vi sinh vt to chng ti t hp A. K thut bin np bng sc nhit vi khun E.coli a. Chun b t bo kh bin T bo E.coli (LE 392, MC 1061, BL 21) c nui cy trn mi trng thch LB (5% cao nmmen, 10% trypton, 10% NaCl). Ly 1 khun lc E. coli vo 5ml mi trng LB lng, nui 37 0 C, lc vi tc 200 vng/ pht trong 12- 16 gi. Ly 1ml dch VK + 99ml mi trng LB nui lc 2-3 gi, khi OD600 t 0,4 -0,6 ly dch nui cy ln trong 1,0 - 1,5 gi, sau li tm lnh thu cn t bo tc 4500 - 5000 vng trong 8-10 pht. Ho cn t botrong 100ml CaCl2 100mM lnh, trn khay 15 pht ri li tm lnh thu cn t bo. Cn t bo ho trong 40 ml CaCl2 100mM lnh, 1 gi trn , sau li tm thu cn t bo vi tc trong 4000 vng trong 10 pht, thm 500 l CaCl2 100mM lnh, c cha 15% glycerol vo cn t bo thu c cc t bo kh bin. Ly vo mi ng eppendorf 50 l t bo kh bin, gi trong t lnh su nhit -750C n 800C thc hin bin np.

b. K thut bin np Ly 50 l t bo kh bin ang gi trong ng eppendorf nhit -750C n -800C trn khong15 pht, sau thm 0,5 ng vecto ti t hp (ADN ) t nh ng 3-4 ln v trn khong 15-20 pht. Ly mu t vo b n nhit c nhit 420C trong 2 pht, t nhanh trn 2 pht. Sau thm khong1000 l mi trng LB lnh, nui trong 370C my lc trong 30-60 pht. Ly 100 l dch t bo sc nhit, tri ln hp Petri c mi trng LB 2% agarose c b sung ampicilin vi nng 50 g/ml, IPTG v X-gal. hp petri 370C trong 1216 gi, kim tra cc khun lc pht trin trn hp petri. Thu nhn khun trng, cy vo trong mi trng lng kim tra kt qu. Bin np E.coli bng k thut sc nhit c hiu qu khong 1/10000. Sng lc cc t bo mang vect ti t hp, chuyn sang ng thch nghing gi chng ging. B. K thut bin np bng in xung nm men a. Chun b t bo Cy 1 khun lc nm men vo 5 ml mi trng YPD ( 1% cao nmmen, 2% pepton, 2% glucose), nui 280C vi tc lc 250 vng/ pht trong 1 ngy m. Ly 30 l dung dch nui cy vo 100 ml YPD, lc 16-18 gi, o OD600 xc nh mt t bo (OD =1,3 - 1,5). mu trn 5-10 pht, li tm vi tc 4500 - 5000 vng trong 5 pht, ly cn t bo ho trong 100ml nc kh ion lnh, li tm thu cn t bo. Ho t bo trong 20 ml sorbitol 1M, li tm 4500 vng trong 5 pht thu cn t bo. Ho cn t bo vi 0,2ml sorbitol, chia u mi ng eppendorf 50 l dch t bo kh bin gi trong t lnh su nhit -750C n -800C. b. K thut xung in Ly 50 l dch t bo kh bin trong ng eppendorf gi trong t lnh su thm vo 10- 15 g ADN plasmid ti t hp, trn u v chuyn vo cuvet xung in 0,2 cm. Thc

hin xung in 0,25 F, 200 , 1,5 kV trong 4-5 phn nghn giy. B sung 1 ml sorbitol 1M lnh, o u chuyn sang ng mi, cy ln mi trng thch a kim tra kt qu bin np. Hiu qu bin np bng xung in tng i cao (khong1%). 3.2.5 Chn lc dng v to dng vsv ti t hp Dng t bo ti t hp l dng cc t bo mang vect ti t hp,c nui mi trng thch hp to thnh cc khun lc. Chn lc t bo ti t hp theo nhiu phng php khc nhau : Sng lc dng t bo ti t hp bng ch th khng sinh, sng lc dng t bo ti t hp bng ch th khng sinh, Sng lc dng t bo ti t hp bng phng php lai phn t .

K thut nui cy, sng lc

a. Sng lc dng t bo ti t hp bng ch th khng sinh y l phng php n gin v d s dng. Do hiu qu bin np thng rt thp, v vy sau khi bin np cn phi chn lc ng cc t bo mang vect ti t hp. Da vo gen khng cht khng sinh trong vect ti t hp, chun b mi trng dinh dng c b sung cht khng sinh tng ng nui cy cc t bo sau bin np. Trong mi trng c cht khng sinh, cc t bo cha vect ti t hp c gen khngcht khng sinh tn ti v pht trin c, nhng t bo khng c vect ti t hp khng pht trin c. Phng php dng ch th khng sinh thng c hiu qu khng cao, do 1 s t bo khng mang vect ti t hp nhng do xut hin cc t bin khng cht khng sinh, nn vn c th pht trin c. m bo hiu qu sng lc chun xc, thng kt hp s dng ch th hai loi khng sinh, hoc ng thi s dng gen ch th khng sinh cng vi gen ch th mu, ch th enzym... Vd: Vector tch dng mang gen khng ampicilin am R (pBR322) th b sung 1 lng ampicilin thch hp vo mi trng nui cy vi khun sau bin np chn cc dng ti t hp.

Ch c khun lc ca nhng t bo mang gen khng ampicilin pht trin c trn mi trng c b sung ampicilin.

b. Sng lc dng t bo ti t hp bng gen ch th mu S dng gen ch th mu kt hp vi gen ch th khnh sinh l phng php chn lc Dng ti t hp c hiu qu cao. Trong k thut sng lc th ti t hp t bo vi khun, gen LacZ kt hp vi IPTG v X- gal lm gen ch th mu c s dng tng i ph bin, d nhn bit dng ti t hp nh mu sc khun lc. Gen LacZ m ho enzym- galactosidase ca vi khun E.coli c cht cm ng IPTG (isopropyl thiogalactoside- cht ng ngca lactose) - galactosidase c tng hp trong t bo E.coli. Nu mi trng c mt X-gal (5-bromo -4-cloro-3-indolyl - -D- galactopyranoside), enzym- galactosidase c kh nng thu phn X-gal t 1 hp cht khng mu thnh mu xanh. Do mi trng nui cy vi khun sau khi bin np c b sung thm mt t Xgal v cht cm ng IPTG, cc t bo vi khun c gen LacZ nguyn vn (khng to ADN ti t hp) tng hp enzym- galactosidase thu phn X-gal cc t bo ny pht trin thnh khun lc c mu xanh. Nu gen ci ADN c xen vo gia gen LacZ (vect ti t hp) lm cho gen LacZ mt hot tnh, enzym- galactosidase khng c tnghp, t bo vi khun pht trin thnh cc khun lc c mu trng. La chn cc khun lc c mu trng cy chuyn vo mi trng dinh dng c thch thu c dngt bo mang vect ti t hp. c. Sng lc dng t bo ti t hp bng phng php lai phn t y l phng php chn lc dng ti t hp c chnh xc cao, nhng phc tp v tn km, phi c thit b chuyn dngPhng php lai axit nuclic (ADN, ARN)vi mu d nh du phng x hoc hunh quang (mu d l cc on oligo nucltit c nh du phng x, hoc hunh quang). Cc bc thc hin gm: + Sau khi bin np cc t bo vi khun ( hoc nm men) c nui cy t hp petri trn mi trng c 2% agar, mi t bo pht trin thnh mt khun lc. t mt mng lai ln trn hp petri, cc khun lc in du ln mng lai cc v tr tng ng

+ Ly mng lai in du cc khun lc vi khun sau bin np,em lai phn t vi mu d mh du phngx (hoc hunh quang), mu d phi c trnh t tng ngvi on c hiu ca gen ti t hp. + nhit thch hp to phn ng lai. Ra mng lai loi b cc mu d Khng c lai v thc hin k thut phng x t ghi. Kt qu hin hnh phngx cho thy nhng v tr c phn ng lai s c cc chm en trn phim nhy phng x, hoc cc vt mu khi hin hnh hunh quang. La chn cc khun lc cc v tr tng ng trong hp petri c cc dng ti t hp. 3.2.6 Thu nhn sn phm ti t hp Cn c vo mc ch ca con ngi v sn phm to thnh l sn phm ngoi bo hay ni bo, la chn cc k thut ly tm v tch chuieets ph hp thu nhn v tinh sch cc cht hot tnh sinh hc. Cng ngh sn xut mi loi cht hot tnh sinh hc c c im c trng ring, ty thuc loi t bo vsv ti t hp c s dng lm t ba ch sinh tng hp cht hot tnh sinh hc. Sau khi thu nhn v tinh sch cc cht hot tnh sinh hc t cc chng vsv ti t hp , cn kim tra tinh sch, c t, tp cht v kim tra tc dng theo ng cc quy nh hin hnh, trc khi a sn phm ra thng mi ha.