L IM

Listeria monocytogenes nh ng nm g n y n i ln nh m t tc nhn gy b nh t th c ph m quan tr ng. y l m t lo i tr c khu n Gram dng ng n, nh , khng sinh bo t , th ng c ki u chuy n ng xoay trn quanh tr c thn thnh t ng t r t c trng trong tiu b n gi t treo. Chng c th pht tri n trn mi tr ng nui c y n gi n vng pH gi a 5 v 9. Trn mi tr ng th ch r n,

khu n l c c a chng trng nh nh ng gi t sng trong su t, hi nhu m mu lam nh t khi nhn qua anh sang ph n chi u d i gc 450. V m t sinh ha Listeria monocytogenes d b nh m v i nh ng vi sinh v t nh Lactobacillus, Brochothrix, Erysipelothrix v Kurthia. M t s th nghi m sinh ha c p d ng phn bi t Listeria monocytogenes v i cc loi Listeria khc nh Listeria innocua, Listeria welshimeri v Listerisamurrayi. Xc nh ki u huy t thanh cng l m t cch nh danh quan tr ng i v i vi sinh v t ny. Listeria thu c lo i a l nh, c th pht tir n nhi t th p n 2,50C v cao n 440C. Cc chuyn gia FDA khuy n co c n lu vi c lm v sinh ng d n l nh trn tr n v l ni c i u ki n thu n l i cho Listeria pht tri n v tch t . Li u l ng gy b nh c a Listeria monocytogenes hi n v n cha c bi t. B nh b t u t ng tiu ha v i nh ng tri u ch ng nh tiu ch y, s t nh . Tr ng h p n ng, ch ng gy b nh c th sinh s n trong cc i th c bo v gy nhi m trng mu. Vi khu n tc ng ln h th n kinh trung ng, tim, m t v c th xm nh p vo bo thai trong b nh m gy s y thai, non ho c nhi m trng thai nhi. Listeria monocytogenes c phn l p t nhi u lo i th c ph m khc nhau nh th t, c, rau, s a v c b m t n c. C n lu ki m tra s hi n di n c a vi sinh v t m i cng o n trong qu trnh ch bi n th c ph m, t mi tr ng, nguyn

li u, i u ki n s n xu t, v n chuy n n s n ph m cu i cng. N u chn th c ph m l m t bi n php h u hi u gi m nguy c nhi m b nh.

CHNG I: M 1.1. t v n .

- t n c ta c nhi u i u ki n thu n l i pht tri n ngnh nui tr ng th y h i s n. B bi n Vi t Nam kh di v r ng, l i n m trong vng giao nhau gi a cc dng n c v c kh h u nhi t i nn tr l ng h i s n r t d i do v c gi tr kinh t cao. V v y, ngnh nh b t nui tr ng th y h is n n c ta khng ng ng pht tri n, khng nh ng p ng mhu c u

trong n c m cn xu t kh u ra th tr ng n c ngoi nh: Trung Qu c, i Loan, Hn Qu c, Nh t, M , Anh. Ch t l ng v sinh th c ph m hi n nay ang l m i quan tm hng u khi xu t kh u th c ph m sang cc qu c gia khc, c bi t l i v i m t hng th y h i s n ng l nh. - Tuy nhin, vi c xu t kh u th y h i s n c a n c ta ang g p kh nhi u kh khn v m t trong nh ng v n l vi c nhi m cc tc nhn gy b nh, gy c nh: d l ng khng sinh, vi sinh v t gy b nh. v Listeria monocytogenes l m t trong nh ng tc nhn gy b nh v gy ng c trong s n ph m th y h i s n ng l nh. - Trong v n ng c th c ph m, vi khu n Listeria monocytogenes gy ra b nh Losteriosis. Ca u tin c a b nh Listeriosis c ni n cch y 70 nm, nhng ph i i n nh ng nm 1980, vi khu n Listeria monocytogenes m i c chnh th c xc nh n l tc nhn gy ng c t th c ph m. Listeria monocytogenes hnh thnh nn cc tri u ch ng nh; s t, kh ch u, au lng. N u c t m nh, chng s gy ra ng c th c ph m c p tnh trong kho ng 12 gi , v i cc tri u ch ng nh: nn m a, tiu ch y, au qu n b ng, nh c u

- V i ngha khoa h c v th c ti n nh v y, chng ti quy t nh th c hi n ti: quy trnh pht hi n Listeria trong th y s n ng l nh. 1.2. M c tiu nghin c u. - Tm hi u tc nhn gy b nh Listeria monocytogenes trong th y s n v tm hi u cc phng php xc nh Listeria monocytogenes trong cc s n ph m th y s n ng l nh.

CHNG 2: T NG QUAN 2.1. Gi i thi u v th y h i s n v tnh hnh nhi m khu n c a th y h i s n Vi t Nam v trn th gi i. 2.1.1. Gi i thi u chung v th y h i s n. - H i s n l b t k ng v t ho c th c v t bi n c ph c v nh th c ph m v l th c n c a con ng i. H i s n bao g m ng v t bi n nh; c v cc ng v t c v khc ( bao g m c ng v t thn m m v ng v t gip xc.). - Vi c thu ho ch th y h i s n t nhin c g i l nh b t c. Ngnh nh b t c v nui tr ng th y h i s n c bi t n nh l: nui bi n, nui tr ng th y s n, ho c trong tr ng h p c a c th nui c. H i s n th ng c phn bi t v i th t. M c d, n v n c m t s tnh ch t c a ng v t v n c lo i tr trong m t s ch n chay. H i s n l m t ngu n quan tr ng trong vi c b sung ngu n protein trong nhi u kh u ph n n trn th gi i, c bi t cc vng ven bi n. - Hi n c hn 32000 loi c c s d ng lm ngu n th c ph m cho con ng i. V d nh: c i, c chp, c da trn, c chim l n, c trch, c thu, c m, c cm v m t s loi khc. - Th y h i s n ng l nh l th y h i s n s ch c s ch , ch bi n theo quy trnh nghim ng t v v sinh an ton th c ph m. Quy trnh s ch , ch bi n v a ra s n ph m theo phng php IQF a ra s n ph m ng l nh v i ch t l ng t t nh t. Ngay t khu nguyn li u c tuy n ch n k l ng v i ch t l ng m b o v sau s c s n xu t trn dy truy n v trng tuy t i m b o v sinh an ton th c ph m, t s a ra cc s n ph m an ton. Tr c khi cc s n ph m n tay ng i tiu

dng, chng c ki m tra b i cc c quan y t v c c p gi y php v sinh an ton th c ph m. Chnh v v y, th c ph m ng l nh l s n ph m c ch t l ng v sinh an ton th c ph m r t cao. 2.1.2. Tnh hnh nhi m khu n c a th y h i s n Vi t Nam. - Trong 3 ma h lin ti p, Vi n dinh d ng qu c gia th c hi n ti nghin c u: Th c tr ng nhi m vi sinh v t vo th c ph m th y h i s n ng l nh v ch bi n trn a bn H N i. K t qu ki m tra vi sinh v t t i phng th nghi m 300 m u th c ph m th y h i s n ng l nh v ch bi n s n ( c l y ng u nhin) t m t s ch v siu th trong 6 qu n thnh H N i cho th y 82 m u khng t tiu chu n v sinh an ton th c ph m. Trong c 36 m u c ng l nh, 29 m u tm, cua s ch , 8 m u tp v 6 m u nem ch gi - t bi t c t i g n 30% m u khng t nhi m m t s lo i vi sinh v t v t qu gi i h n cho php. Trong d c 49 m u khng t tiu chu n v Coliforms ( chi m 16.3%), 34 m u khng t v E.coli (11%), 28 m u khng t v C.perfrigens (9.3%) v 7 m u khng t v Vibrio

parahaemolyticus(2.3%). Trong 28 m u nhi m C.perfrigens ch y u l: m u m m tm, m m tp c th gy ng c b t c lc no. Nguy h i hn c l trong h i s n ng l nh c vi khu n Vibrio parahaemolyticus c xc nh n l nguyn nhn gy ra nhi u v ng c th c n do c bi n v h i s n. B nh h u h t xy ra vo ma h i v i nh ng ng i n g i c v nh ng th c ph m cha chn, c th gy ng c, gy au b ng, nn, s t, c bi t l gy ra tiu ch y. 2.1.3. Tnh hnh nhi m khu n c a th y h i s n trn th gi i.

- Ng c tiu ch y c pht hi n vo nm 1976 t con trai nhi m c t i Nh t B n. - Ng c Venerupin u tin bng pht do n ho v nghu ch c trong vng bi n n c Nh t vo m t th i i m t bi t no trong nm, ch t c t o ra b nhi u sinh v t sinh s n mau l , r t nhi u trong cu i ma ng, i khi xu t hi n ngoi khi n c B o Nha. Cn b nh c th lm h gan, ch t kho ng 1/3 n n nhn. - Cu i nm 1987, ng d c m t tr nh c khi n pht tri n nhi u t i pha ng Canada th ph m l ch t acid domoic, m t ch t c t o diatom Nitzschia punens trong n c

neurotoxinmanh pht sinh t n t vong.

l nh.N n nhn s b m t tr nh trong m t th i gian ng n, m t s ca d n - n ph i t o gy ra ng c nguy hi m, vo nm 1991 t i o Guam c 13 tr ng h p ng c do n ph i t o Polycavemosa tsudai, c 3 trong s b ch t. - Nm 2004 c 53 c nh bo v v t qu gi i h n sulphit trong tm. Trong m t hng tm chn chi m 31 c nh bo, y cng l m t hng c quy nh sulphit nghim ng t nh t (khng qu 50 miligram/kg tm). Quy nh ny cng c ngha l: m c d, n u m t nh ch bi n th c ph m tun th nghim cc tiu chu n i v i tm nguyn li u, nhng sau khi n u chn tm th cng ty ny v n c th vi ph m gi i h n tiu chu n (do gi i h n quy nh i v i tm chn th p hn r t nhi u). - Nm ngoi, c 41 tr ng h p b Rasff c nh bo ly nhi m lo i vi khu n Listeria monocytogenes. Trong , c h i xng khi c a an M ch b c nh bo 19 l n v c h i c a c b 10 l n.

- Cng theo h th ng c nh bo c a Rasff, nm ngoi c 39 c nh bo v s xu t hi n c a Histamin trong th y s n. Trong , c ng chi m 31 c nh bo v h u h t l m t hng p l nh, sau khi nh p kh u c ng ti chn khng H Lan. N c b c nh bo nhi u nh t l Innxia. - Cc thanh tra c a Italia cng pht hi n v c nh bo 41 l n v vi c ly nhi m k sinh trng (Anisakis), ch y u trong c thu ti xu t x t Nauy, an M ch, v c vy chn t Anh. - C nh bo v d l ng Cactimi trong th y h i s n chi m 43 l n, t hn m t n a so v i s l ng c nh bo h i nm 2003 (103) l n, v ch y u lin quan n cc s n ph m c ki m v nhuy n th chn u. S l n c nh bo v ly nhi m th y ngn trong c ki m nm 2004 l 30 l n, tng nh so v i nm 2004. 2.2. Gi i thi u v vi khu n Listeria monocytogenes. 2.2.1. L ch s pht hi n.

Hnh 2.1: Vi khu n Listeria monocytogenes.

- Chi Listeria c t theo tn nh ngo i khoa ng i Anh, Joseph Lister. Nm 1918, m t lo i vi khu n tng t nh Erysipelothrix rhusiopathiae c phn l p t d ch no t y c a m t qun nhn ng i Php. Ch ng vi khu n ny c lu gi t i vi n Pasteur Paris, nhng ph i nhi u nm sau , vi khu n ny m i c m nh danh l Listeria monocytogenes. - Nm 1924, Murray v c ng s , trong qu trnh nghin c u m t d ch b nh trn cc ng v t th nghi m, phn l p c m t ch ng vi khu n t cc h ch Lympho c a cc ng v t b b nh. Sau , l y vi khu n ny tim cho cc con kh e m nh th th y chng, c hi n t ng tng b ch c u n

nhn, tng t nh b nh c a qun nhn ng i Php ni trn. V v y, ng t tn cho n l: Bacillus monocytogenes. Ba nm sau, t i Nam Phi, Piie khi ang nghin c u s mang Yersinia peptis trn chu t phn l p c m t vi khu n t gan chu t v ng t tn n l Listeria hepatolytica. Tr c khu n ny khng th phn bi t v i Bacillus monocytogenes v ch ng vi khu n lu gi vi n Pasteur Paris. Chnh v v y, pirie xu t m t

tn m i ch chung cho cc ch ng ny l Listeria monocytogenes. - Nm 1929, Nyfeldt phn l p c Listeria monocytogenes t mu c a m t b nh nhn b s t km theo vim h ch v ng tin r ng l tc nhn gy b nh tng b ch c u n nhn nhi m trng. T t nhin, nhi u tc gi khc khng ng v i l p lu n c a Nifeldt. Nhi u nm sau , nh ng cng b kinh i n v b nh nhi m Listeria (Listeriosis) trn ng i, k c tr s

sinh v ng i l n, cho th y nh ng b ng ch ng gi ng nh trong y vn nhng c nhng tranh lu n r ng, kh nng truy n b nh t ng v t sang ng i l c c k hi m.

- Nm 1950, nh ng nghin c u u tin, th c s mang tnh h th ng v nhi m Listeria trn ng i th c hi n. Tuy nhin, ph i m t thm ba th p k n a, sau hng lo t cc bo co d ch c cng b m i th y, nghin c u v Listeria monocytogenes t ch tng i b t c tr nn sng s a hn. T t i nay, ch ny thu ht c s quan tm nghin c u c a nhi u chuyn ngnh, khng ch b i v t m quan tr ng c a Listeria monocytogenes v i s c kh e c ng ng, m cn l v, vi khu n ny tr thnh m t m u hnh nghin c u th c nghi m cho hi n t ng k sinh n i bo khng b t bu c. 2.2.2 Phn lo i.

Hnh 2.2. Vi khu n Listeria monocytogenes - Loi khu n gi ng Listeria l nh ng vi khu n hnh que Gram dng, ng n, chng k kh, dng tnh v i catalase, m tnh v i oxidase, di ng 250C v khng di ng 370C. 20-

- Phn lo i h c c a Listeria.spp trong gi i vi sinh v t nh sau: Thu c gi i: Bacteria. Ngnh : Fitmicutes. L p: Bacilli.

10

B : Bacillales. H : Listeriaceae. Gi ng: Listeria. - Hi n t i c 7 loi Listeria c cng nh n: Listeria monocytogenes. Listeria ivanovii. Listeria innocua. Listeria wells. Listeria seeligeri. Listeria grayi (loi ny hi n bao g m c loi c p d i Listeria murayi.). - Trong , cc loi ny ch c 2 loi gy b nh qua th c nghi m v t nhin, Listeria monocytogenes v Listeria ivanovii. Tr c kia, chng gy b nh cho ng i v ng v t, sau ny chng gy b nh ch y u cho ng v t. C 2 loi ny v loi Listeria seeligeri u s n sinh ra _ haemolysis trn Sheep Blood Agar v y chnh l s i dy n i k t v i m m b nh. Tuy nhin, Listeria seeligeri khng gy b nh v th khng th xem xt m t cch ring bi t c i m ny nh l m t gi nh v kh nng gy b nh c a cc loi Listeria. 2.2.3. c i m chung c a chi Listeria. - M i lin quan gi a cc loi trong chi Listeria l ch c tranh lu n nhi u nh t. Ban u, chi ny c cho l m t thnh vin c a h Corynebacteriaceae, b i v cc c i m hnh thi h c v sau nghin c u phn lo i ha h c l i cho th y cc loi Listeria tng i khc bi t so v i Corynebacteriaceae. Cho n nm 1984, trnh t t ng ph n v i 16S rRNA kh ng nh chnh xc v tr trn cy di truy n c a chi Listeria

11

trong

nhm Clostridium-

Bacillus-Lactobacillus,

v i

Brochothrix

thermosphacta l g n nh t. - Chi Listeria ban u c m t l n type v i duy nh t m t thnh vin l Listeria monocytogenes. Nh ng nm sau ny, thm 7 loi khc c xc nh: Listeria invanovii (tr c y g i l Listeria monocytogenes serovar5), Listeria innocua, Listeria welshimeri, Listeria seeligeri, Listeria muarrayi, Listeria grayi v Listeria denitrificans. Listeria denitrificans c phn lo i l Jonesia denitrifocans. Listeria murrays v Listeria grayi t ng c cho l c khc bi t so v i cc loi Listeria khc m b o cho s thnh l p m t chi m i, Murraya, nhng ngy nay c x p thnh m t loi duy nh t Listeria grayi. G n y, Listeria ivanovii c chia thnh hai loi ph l: subsp.ivanovii, v subsp.londonniensis. Trong s cc loi khng thu c monocytogenes ch duy nh t Listeria ivanovii c xc nh l tc nhn gy b nh trn ng i. 2.2.4. c i m hnh thi v khng nguyn. - Cc loi Listeria l tr c khu n Gram dng c kch th c ng n (0.40.50.5-2.0 m). Chng m c trn cc mi tr ng nui c y khng acid, khng sinh nha bo. 200C, chng ch di ng b ng lng m c xung 370C. Chng l vi quanh than, nhng s di ng khng quan st c t 0-450C ( t i u l 30-360C), m c d t c m c pH 9.6, nhng t i u ki n t i u

khu n k kh khng b t bu c v c th m c trn kho ng nhi t dao ng nhi t th p l ch m. Chng cng m c trn m t kho ng pH dao ng r ng, m t s ch ng c th m c ki m. mi tr ng trung tnh ho c hi

12

- Khng nguyn chnh c a cc loi Listeria l khng nguyn thn (O) v khng nguyn lng (H).Quy trnh nh type huy t thanh hi n nay d a trn cc khng nguyn ny, phn lo i c 6 nhm huy t thanh (1/2, 3, 4, 5, 6 v 7) v phn lo i su hn thnh cc serovar cho t t c cc loi tr Listeria grayu v Listeria invanoii. Trong khi Listeria invanoii v Listeria welshimeri c th c phn bi t v i Listeria monocytogenes kh ng nh type huy t thanh th cc loi khc c th c chung m t ho c nhi u khng nguyn trng v i Listeria monocytogenes. V d , m t s ch ng Listeria seeligeri c th khng phn bi t c v m t khng nguyn so v i ch ng thu c Listeria monocytogenes nh, huy t thanh . Cng c n lu r ng, m c d c 13 serovar c a Listeria monocytogenes m i c xc nh hi n nay, trong khi hn 90% cc ch ng phn l p trn lm sang ch thu c v 3 serovar: 1/2a; 1/2b va 4b, i u ny lm h n ch gi tr c a k thu t ny trong cc nghin c u d ch t h c. Cc c tnh quan tr ng c li t k B ng 2.1 Dng phn bi t cc loi Listeria. L.monocytogenes Lo i test Subsp.murrayi -

L.welshimeri -

Tan mu beta () CAMP test v i S.aureus R.equi Kh Nitrate

13

Subsp.grayi

L.seeligeri

L.innocua

L.ivanovii

Acid t D-Manitol L-Rhamnose D-Xylose -Methyl-Dglucoside -Methyl-Dmannoside

+ -

+ -

+ V

+ +

+ +

+ + -

+ -

V V

V V

V V

V i (+) 90% cc ch ng dng tnh. (-) 10% cc ch ng dng tnh. (V) 11-89% cc ch ng dng tnh. (W) cc ch ng dng tnh y u. 2.2.5. C u trc. 2.2.5.1. C u trc di truy n. - Genome c a Listeria monocytogenes v Listeria innocua c gi i trnh t c di l 2.94 Mbp v i 2583 khung c m v mol % G+C l 39. Listeria innocua c genome di 3.01 Mbp v i 2973 khung c m v thnh ph n mol 5% G+C l 37. M t i u ng ch l nhi u protein c m ha b i vi khu n ny mang tng ng r t cao so v i Bacillus subtilis. Listeria monocytogenes c m c a d ng th ng nhi u qu n

th , do v y,chng c t i 331 gen m ha cho cc protein v n chuy n khc

14

nhau (11,6% trong s t t c cc gen d ki n) v 209 cc v tr i u ha qu trnh d ch m c tm th y trn lo i vi khu n ny. - Kho ng 0-79% cc ch ng Listeria monocytogenes c ch a plasmid ny d ng n, s khng v i cadmium l hi n t ng ph thu c plasmid v cc plasmid c hi u cho hi n t ng khng v i m t ho c nhi u lo i khng sinh c ghi nh n. Plasmid th ng th y trong cc ch ng Listeria monocytogenes thu c nhm huy t thanh 1. 2.2.5.2. C u trc t bo. - Nhn: l vng nhn nguyn th y, cha c mng nhn nn khng c hnh d ng c nh v v y cn g i l vng nhn. - Ribosome: n m t do trong t bo ch t v chi m t i 70% tr ng l ng c a t bo ch t. Ribosome g m hai ti u ph n ( 50S v 30S), hai ti u ph n ny k t h p v i nhau t o thnh ribosome 70S. - Lng ( khu n mao ): l nh ng s i lng r t m nh, chng c tc d ng gip vi khu n bm vo gi th . Mng t bo: Mng c u t o b i 2 l p phospholipid (PL) chi m 30 40% kh i l ng c a mng, cc protein chi m 60 -70% kh i l ng cc mng. u phosphate c a PL tch i n phn c c, a n c. u hydrocacbon khng tch i n, khng phn c c, v c tnh k n c.

15

Hnh 2.3. Mng t bo c a vi khu n Listeria monocytogenes. - Ch c nng ch y u c a mng. - Kh ng ch s qua l i c a cc ch t dinh d ng, cc s n ph m trao i ch t. - Duy tr p su t th m th u bnh th ng c a t bo. - L ni sinh t ng h p c a thnh ph n t bo v cc polymer c a bao nh y. - L ni sinh t ng h p c a nhi u enzyme, cc protein c a chu i h h p. - Cung c p nng l ng cho s ho t ng c a tin mao. - Tin mao: chng quy t nh kh nng v phu7o7nmg php di ng c a vi khu n, tin mao l nhng s i lng di, d i knh hi n vi quang h c ch c

16

th quan st c u trc khi nhu m theo phng php ring. D i knh hi n vi i n t c th th y r c u trc c a t ng s i tin mao. - Thnh t bo: - Peptidoglycan chi m 30 95%, l lo i x p, kh b n v ng, c u t o b i ba thnh ph n: - N-Acetylglucolsamin (NAG) - Acid N0- acetylmuramic (NAM) - Tetrapepid ch a c D- v L- axit amin. - Thnh t bo r t dy, h p thu v gi l i mu tm khi nhu m v i thu c nhu m tm tinh th . - Thnh t bo lm nh ng nhi m v sau : - Tham gia qu trnh trao i ch t. - L ni ch a ng nhi u ch t c ch a ho t tnh sinh h c. - Bao nh y : - Bo v vi khu n trong i u ki n kh h n. - B o v vi khu n trnh kh i b th c bo. - Cung c p ch t dinh d ng cho vi khu n khi thi u th c n. - Gip vi khu n bm vo gi th .

Hnh 2.4. Lng roi c a vi khu n Listeria monocytogenes.

17

2.2.6. Y u t c l c. 2.2.6.1. T h p gen c a Listeria monocytogenes. _ Gen prfA (prfA): ho t ho qu trnh ly lan cho t bo ch c a vi khu n. _ Gen plcA (PI-PLC) (phosphatidy linocitol-specific phospholipase C) l protein c m ho b i gen plcA,33kDa), c tc d ng dung gi i mng khng bo c a th th c bo. _ Gen plcB(PC-PLC) (phosphatidulcholine-spefic phospholipase C, l protein c m ho b i gen pclB, 29kDa):, c tc d ng dung gi i mng khng bo c a th th c bo. _ Gen hly (LLO l protein c m ho b i gen hly, 58.5kDa), c tc d ng gi i phng vi khu n ra kh i lkhng bo c a t bo ch . _ Gen mpl (Mpl metallprotease c m ho b i gen mpl,60kDa) l gen ch a 510 amino axit, c vai tr tham gia vo qu trnh ho t ng c a gen plcB. _ Gen actA ( AtcA l protein c m ho b i gen ACTa,97kDa) c ch c nng gip vi khu n ly lan t t bo ny sang t bo khc. _ Gen inlA (InlA l protein c m ho b i gen inlA, 80kDa). Protein InlA nh h ng m nh t i internalin khc, xo b inlA th s d n t i bi u hi n inlB cao hn, c ch c nng n i b ho t bo ch . _ Gen inlB (InlB l protein c m ho b i gen inlB, 67kDa), c ch c nng n i b ho t bo ch . _ Trong gen prfA c vai tr nh y u t i u ho chnh nh m n nh ho t ng c a cc gen plcA, plcB, hly, mpl, actA, inlA, inlB. Ngoi ra, cn c gen hly m ho protein t o ra s n ph m Listeriolysin O (LLO) l tc nhn gy b nh Listeriosis ng i v ng v t, plcA m ho t o PI-PLC v gen

18

plcB m ho t o PC-PLC, gen inlA ,m ho cho internalin A, gen inlB m ho cho internalin B, gen inlC m ho cho internalin C. t t c cc gen ny u ph thu pc vo gen prfA. 2.2.6.2. c t listeriolysin A (LLO). _ Listeriosin A (LLO) l m t c t protin c ti t b i L.monocytogenes that kh i khng bo v th c bo ch c tr ng l ng 58.6 kDa, hnh thnh 1 chu i polypeptide g m 529 amino acid. Trnh t u N c c i m l ph n u c tnh i n c, mang i n tch dng v theo sau b i 20 u k n c. trnh t ny m ho tr c ti p cho protein v c phn c t sau v tr lysine 25. k t qu l LLO c b t u t amino axit th 26 v c tr ng l ng phn t l 55.8kDa, di 504 axit amin. _ LLO thu c nhm c t g n ln cholesterol c ho t ho b i nhm thiol c t o ra h u h t cc vi khu n Gram (+).

_ Ho t tnh dung huy t c a LLO c lin quan n pH c a mi tr ng. N ho t ng cao nh t pH 5.5 v g n nh b b t ho t pH 7.0. S pht

hi n ny c th gi i thch vai tr c a LLO trong qu trnh xm nhi m c a Listeria monocytogenes. Sau qu trnh th c bo, mi tr ng acid c a khng bo ch a t bo vi khu n s ho t ho LLO. Chnh c t ny xc ti n qu trnh ly gi i khng bo v vi khu n xm nh p vo t bo ch t, trong khi pH cao hn s lm gi m ho t tnh c a LLO. 2.2.6.3. Vai tr c a y u t c l c. _ Listeria monocytogenes t n t i trong mi tr ng a d ng nh: mi tr ng s ng bao g m t, n c, th c ph m, ng v t. Gen prfA quy nh s bi u hi n c a cc gen c tnh c . Bn ngoi t bo ch , gen prfA t n t i

19

tr ng thi ho t ng th p. Khi

bn trong t bo ch , gen prfAkch ho t

(prfA*) v bi u hi n cc gen c n thi t cho cu c xm nh p vo t bo ch . _ Listeria monocytogenes xm nh p vo t bo c a c th v t ch thng qua c ch th c bo. N u Listeria monocytogenes v n cn s ng sau giai o n u xm nhi m ny, n c c th v t ch ti p nh n nh protein b m t g i l internalin A (inlA) v internalin B (inlB). InlA tng tc v i eCarherin t o i u ki n cho Listeria monocytogenes i vo t bo bi u m, InlB nh n di n Clq-R ( ho c Met) cho php Listeria monocytogenes xm nh p vo trong nhi u lo i t bo c a v t ch . Sauk hi xm nhi m c vo t bo v t ch , Listeria monocytogenes phn gi i khng bo t o ra cc l trn mng t bo v ho t gi i c tnh lu hunh PI-PLC k t h p v i PCPLC, gip LLO phn gi ikhng bo.

20

Hnh 2.5. C ch xm nh p vo t bo c a vi khu n Listeria monocytogenes.

21

_ Sau khi phn gi i khng bo, Listeria monocytogenes c phng thch vo cytosol, t i y chng pht tri n v nhn ln, trong giai o n ny i h i ph i c protein b m t khc nh ActA n di chuy n t t bo ny sang t bo khc, v t ng h p actin. ui actin cho php vi khu n xm nh p vo t bo ch khc, n ph thu c vo ho t ng c a PC-PLC v Mpl. 2.2.7. B nh v tri u ch ng c a b nh do vi khu n Listeria monocytogenes gy ra. 2.2.7.1. B nh do vi khu n Listeria monocytogenes gy ra. - Nhi m Listeria ph n mang thai:

H i ch ng ny xu t hi n trong kho ng m t ph n ba cc tr ng h p nhi m Listeria m c d t l ny c th cao hn nhi u trong cc t d ch. H u h t cc tr ng h p nhi m khu n u xy ra vo 3 thng cu i c a thai k. a s ph n mang thai b nhi m Listeria monocytogenes c d u hi u: s t , m t m i v au lng, c khi th y b tiu ch y, au b ng, bu n nn ho c nn trong su t th i k nhi m khu n. Vi khu n c th ly truy n qua rau thai d n n nhi m khu n t cung, vim mng m v mng i, sinh non, ho c b nh kh i pht giai o n s m nh ng tr m i sinh. Ph n nhi m b nh d b sy thai t nhin. Tr s sinh tu n l u tin kh i pht b nh v i nh ng d u hi u nhi m khu n, kh th , nh ng t n thng ch ng u h t nhi m khu n c trng b i nh ng p-xe r i rc da, h i gan, lch,

tuy n th ng th n, ph i v nh ng c quan khc. N u nhi m khu n bo thai giai o n s m th ng i km v i nh ng bi n ch ng s n khoa nh : sinh non v vim mng m v mng i. Nhi m Listeria tr s sinh:

22

G n gi ng nh cc tr ng h p nhi m khu n lin c u nhm B nhi m Listeria

tr s sinh,

tr s sinh c th c chia thnh hai nhm kh i pht

s m v mu n. Kh i pht s m l bi u hi n nhi m khu n trong vng 5 ngy, nh t l kho ng 48 gi sau sinh. B nh kh i pht mu n th pht b nh sau 5 ngy t khi sinh, trung bnh l 14 ngy. T l t vong cao t i 60% cho nhm kh i pht s m v 25% cho nhm kh i pht mu n. a s cc tr ng h p b nh kh i pht s m b truy n nhi m Listeria trong t cung qua ngu n vi khu n trong mu m . tr s sinh v i c tnh l c u

monocytogenes t

Nhi m khu n t m o l c c k hi m g p. Bi u hi n kinh i n c a b nh kh i pht s m l b nh u h t nhi m khu n h t r i rc m t s c quan n i t ng. M c d bi u hi n i n hnh hn c a

d ng b nh ny l nhi m khu n huy t km theo vim ph i v vim mng no. C th c ban s n v ban d ng g nh. Trn th c t th ng kh phn bi t gi a b nh Listeriosis kh i pht s m v cc th khc c a nhi m khu n tr s sinh trn cc b nh c nh lm sng n c. Tri ng c v i th kh i pht s m c a b nh ny, tr s sinh c kh i pht mu n th ng bi u hi n kh e m nh lc tr m i sinh. Ng i ta cho r ng tr s sinh b vi khu n ngay t lc m i sinh, nhng do cc y u t cha bi t no , vi c kh i pht b nh b ch m l i. Cng gi ng nh v y, nhng cc tr ng h p nhi m khu n do nhi m trng b nh vi n xy ra sau khi tr c sinh ra d c ghi nh n trong nhi u bo co v cc nhm nhi m Listeria kh i pht mu n. B nh kh i pht mu n hay c vim mng no ho c vim no mng no ( 90% cc tr ng h p). Kh i pht mun th ng m th m hn so v i th b nh kh i pht s m v i nh ng tri u ch ng th ng g p nh tr b km ho c b b, kh ch u v s t.

23

- Nhi m Listeria Nhi m Listeria

ng i tr ng thnh. ng i tr ng thnh th ng g p trn cc b nh c nh suy

gi m mi n d ch, c bi t khi h mi n d ch c a t bo b suy gi m nh trong u h lympho, cc h th ng i u tr ch ng th i ghp trong cc ca ghp c quan n i t ng ho c ghp t y xng t thn ho c cng loi, khi b nh xy ra i n hnh d i d ng m t bi n ch ng mu n. Ngay trong th i k u c a i d ch AIDS, Listeria monocytogenes khng c coi l tc nhn gy b nh quan tr ng v i b nh nhn nhi m HIV, v c m t s ki n gi i thch kh thuy t ph c cho hi n t ng ny nh ho t tnh khng Listeria c a cotrimoxazole c dng trong i u tr d phng nhi m Pneumocystis jiroveci tr c . Nh ng nghin c u g n y l i cho th y, nhi m Listeria xy ra b nh nhn dng tnh v i HIV cao hn 150-300 l n so v i nhm i ch ng. Nh ng b nh m n tnh khc nh nghi n r u v ti u ng cng l i u ki n thu n l i cho vi c ly nhi m Listeria monocytogenes. Nhi m Listeria ti n tri n ng i tr ng thnh c th c x p thnh ba nhm ty theo cc bi u hi n lm sng: b nh lin quan n h th ng th n kinh trung ng (CNS) chi m kho ng 75% cc tr ng h p, nhi m khu n huy t nguyn pht v nhm cc lo i khc bao g m ph r ng cc lo i nhi m trng t i ch . - Nhi m khu n h th n kinh: Vim mng no c ho c khng c d u hi u th n kinh c c b l bi u hi n hay g p nh t c a nhi m Listeria h th n kinh trung ng. Gi ng nh cc tr ng h p vim mng no m khc, vim mng no do Listeria th ng kh i pht c p tnh v i s t cao, c ng gy v s nh sng, nhng c thm

24

cc r i lo n v n ng nh run r y ho c m t kh nng i u ha. Co gi t cng th ng hay xu t hi n hn so v i cc th khc c a vim mng no. Bi u hi n c a vim mng no hay g p nh t c a nhi m Listeria h th n kinh trung ng l vim mng no, th ng hay nh h ng nh t n vng no sau. Th ny c ti n tri n theo ki u hai th i n hnh: ti n tri u ch ng khng c hi u nh au u, bu n nn, nn v s t, ti p l li t dy th n kinh khng i x ng ti n tri n, cc d u hi u ti u no ho c li t nh n a ng i v suy gi m th c. Tin l ng b nh x u, t l di ch ng th n kinh cao cc tr ng h p s ng st. Ngu n g c nhi m khu n th n kinh l t

nhi m khu n huy t, khng c b ng ch ng cho th y l ly b nh t nh ng v tr nhi m b nh khc. - Nhi m khu n huy t: Nhi m khu n huy t nguyn pht l bi u hi n hay g p th hai trong nhi m Listeria ti n tri n ng i l n tu i khng mang thai, kho ng 25-50% cc tr ng h p. Khng c c i m lm sng phn bi t cho th hi n nhi m Listeria ny. B nh nhn c th b t t huy t p n ng v i b nh c nh lm sang tng t nh trong shock ni c t vi khu n Gram m, l tr ng h p c th km theo h i ch ng suy gi m h h p ng i l n. - Vim mng trong tim xy ra trn cc van tim c t n thng t tr c, hay gy tnh tr ng ngh n m ch h th ng. - Vim d dy ru t c p tnh gy tiu ch y d ch. - Nhi m khu n ng v t: b nh t 2-6 tu n. ng v t b Trong s cc ng v t, b nh do Listeria monocytogenes tc ng chuyn bi t trn gia sc, c u v d v i th i gian nh ng ng i b suy gi m mi n

25

nhi m Listeria monocytogenes ch y u l qua th c n b nhi m Listeria monocytogenes, qua ng h h pho c do ti p xc tr c ti p. S pht b nh xy ra km theo s suy gi m mi n d ch i v i tc nhn gy b nh do cc y u t gy stress (mang thai, s ng c, s v n chuy n, i u ki n mi tr ng km). ng v t b nhi m b nh do Listeria monocytogenes th ng s t, bi ng n, suy nh c v b m t phng h ng. 2.2.7.2. Cc tri u ch ng c a b nh do vi khu n Listeria monocytogenes gy ra. - Cc tri u ch ng c a Listeriosis th ng b t u xu t hi n vi ngy sau khi n u ng ph i cc lo i th c ph m b nhi m khu n. Tuy nhin, c m t s tr ng h p th i gian ko di n 2 thng m i xu t hi n cc d u hi u u tin c a b nh. Cc d u hi u v tri u ch ng c a b nh th ng g p l: tiu ch y, s t 380C ( 100,40F) ho c cao hn, au cc c, c cc cn n l nh ho c rung mnh bu n nn. - N u xu t hi n tnh tr ng nhi m Listeria vo h th n kinh, m t s cc d u hi u b nh v tri u ch ng cng g n tng t v i nhi m Listeria khu tr. Bao g m: s t, au cc c v cc cn rung mnh, n l nh nhng chng th ng di n bi n n ng hn cc tri u ch ng v b nh l th ng c th c v tinh th n, c cn co gi t, nh t u, m t thng b ng, au ng cc chi. 2.2.8. C ch gy b nh. tnh tr ng lan t a. C nh ng thay i v tm th n. C xo tr n v m t nh n c (c c th b c ng, kh chuy n ng), c cn ng kinh, m t ki m sot v n

26

Hnh 2.6. C ch gy b nh c a vi khu n Listeria monocytogenes. - T lu, cc nh khoa h c pht hi n ra r ng vi khu n Listeria ly lan t t bo ny sang t bo khc trong c th con ng i. - Sau khi xm nh p vo c th qua ng tiu ha, Listeria monocytogenes ti p t c di chuy n qua d dy r i i vo cc m ru t non c a v t ch , bao g m cc t bo bi u m v cc i th c bo c a m ng Peyer. Trong su t qu trnh di chuy n chng s khng gy ra nh ng thng t n m h c

27

n u li u l ng khng l n. Trong d ch lympho ho c mu th Listeria monocytogenes di chuy n r t nhanh n h ch b ch huy t, l lch v gan r i nhanh chng i su vo khng bo, h u h t vi khu n xm nh p v ph h y khng bo nh k t h p v i pH th p, cc enzyme th y phn v oxy ha trong khng bo. - T khng bo chng s dy chuy n vo t bo ch t v nhn ln trong vng 30 pht sau khi xm nhi m, t 40-60 pht trong t bo gan v i th c

bo. Qu trnh xm nhi m vo c quan hon thnh sau 5-7 ngy. Tuy nhin, n u khng t c p ng c mi n d ch t bo b ch huy t CD8+ v gamma, interferon gin ti p ho t ha i th c bo. N u t bo c a v t ch khng t o ra p ng mi n d ch th Listeria monocytogenes s di chuy n n cc v tr khc trong c th nh no v nhau thai. Gy ra hi n t ng s y thai ph n , cc d t t b m sinh tr em, vim mng no,

gy t vong cho thai nhi. - Vi khu n l n ln trong m t t bo v di chuy n nhanh chngt o thnh m t c u trc theo hnh ngn tay nh ra t t bo v y sang t bo li n k . Khi , vi khu n s ti p t c gy b nh cho t bo li n k . - Gio s Ireton v nhm c a ng pht hi n ra m t qu trnh th hai h tr vi c ly lan c a vi khu n sang nh ng t bo kh e m nh m tr c y cha c bi t n. Qa trnh ny d n d n lm suy y u kh nng t v kh i vi c nhi m b nh c a t bo th hai. Vi khu n Listeria di chuy n qua t bo ch t c a t bo trong c th ng i s d ng m t ph n khung c a t bog i l s i actin. Vi khu n Listeria c mu xanh v s i actin c mu . S i actin hnh thnh m t c u trc d ng ui pha sau vi khu n. Nh ng s i

28

actin ny, c tc d ng y vi khu n Listeria qua t bo ch t c a t bo trong c th ng i. - Mng t bo hay l p ngoi cng c a t bo kh e m nh thng th ng cng ra. Tnh tr ng cng k v ng l c tc d ng ngn ch n vi khu n Listeria khng ly lan sang nh ng t bo cha nhi m b nh li n k . - Tuy nhin phng th nghi m c a gio s Ireton pht hi n ra r ng m t lo i protein trong vi khu n Listeria g i l InIC xu t hi n lm gi m i cng c a mng t bo nh ng t bo nhi m b nh, i u ny s lm cho vi c di chuy n c a vi khu n xuyn th ng mng t bo v sau ly lan sang cc t bo kh e m nh li n k d dng hn. Phng th nghi m c a gio s Ireton cng a ra b n bo co cho th y cch m InIC lm gi m cng l ngn ch n ch c nng protein Tuba trong c th ng i. Thng th ng, ch c nng c a Tuba trong t bo ng i khng nhi m b nh l t o ra cng c a mng t bo. Protein InIC trong vi khu n Listeria kh ng ch s ho t ng c a Tuba, lm gi m cng v gip vi khu n ly lan sang cc t bo li n k . Vi khu n mang m m b nh c th ly lan b ng cch ki m sot cng c a mng t bo trong t bo ng i. 2.2.9. Tnh hnh nhi m listeria monocytogenes Vi t Nam v trn th gi i. - n nh ng nm 1980, th c ph m c coi l tc nhn chnh gy truy n nhi m Listeriosis. - Vo nh ng nm 1981, t i Canada , m t tr n i d ch t th c ph m lm nh h ng n 41 b nh nhn l do n ph i c i b p ly nhi m t cc phn t c u b nhi m b nh. - Vo nm 1983, Boston c 49 ng i b nhi m b nh Listeriosis do tiu th ph i s a khng c tuy t trng k l ng.

29

- Nm 1985, cc tr n d ch b nh l n xy ra

B c M t i California b t

ngu n t phomat m m c 142 ng i b nhi m, nh ng phomat khc gy ra 122 tr ngh p b nhi m Listeriosis Switzerland. Trong khi Anh, c

300 tr ng h p b nhi m trng Listeriosis. - Nh ng nm 1990, Php d ch b n xy ra do n ph i l i l n, th t l n,

phomat m m b nhi m khu n. - Trong th i gian v a qua, tr c tnh hnh s l ng cc m u c tra ng l nh b pht hi n nhi m Listeria monocytogenes ngy cng gia tng, th c hi n ch o c a lnh o b , c c qu n l ch t l ng nng lm th y h i s n (NAFIQAD) c quy t nh thnh l p nhm cng tc ch tr th c hi n ti khoa h c c p c s Xc nh nguyn nhn ly nhi m v xu t gi i php ki m xot m i nguy hi m Listeria monocytogenes trong s n ph m c tra ng l nh. Ngy 6/11/2009, c c t ch c h i ngh nghi m thu nh gi k t qu th c hi n ti. - Theo s li u cc k t qu phn tch c a ti cho th y 162/485 m u (bao g m 29/120 m u nguyn li u c l y t i cc nh my ch bi n, 79/186 m u v sinh cng nghi p sau khi v sinh, 8/28 m u tay cng nhn, 24/36 m u bn thnh ph m) b pht hi n nhi m Listeria monocytogenes. - Vo ngy 19/3/2007, c quan qu n l th c ph m Anh qu c c l nh thu h i cc lo i bnh m k p th t, do cng ty th c ph m Anchor cung c p cho h th ng b nh vi n v tr ng h c t i Lun n, do s n ph m ny b nhi m vi khu n Listeria monocytogenes. - y khng ph i l l n u, m t nhi u nm qua vi khu n ny gy ra cc v ng c th c ph m l n t i m t s qu c gia trn th gi i (M , c, Canada, Php, B ..). Chng ta c th i m qua vi v ng c i n hnh

30

nh sau: Vo thng 12 nm 1999, t i Php c v ng c do n ph i hamburger c nhi m vi khu n Listeria gy cho 27 ng i m c b nh. Trong , c 7 ng i ch t. Theo th ng k c a M , hng nm s b nh ly nhi m Listeria kho ng 2500 ng i, v i g n 500 ng i ch t. Th ng k t i Anh t nm 2001-2005 c 1933 ng i m c b nh do vi khu n Listeria gy ra - Trong nh ng nm qua, nh ng con c hun khi, v b c lin quan n d h Listeriosis do vi khu n Listeria gy ra t i Th y i n v Finland. - C quan h u quan cc n c trn t ng c nh bo v lo i vi khu n ny. ng th i cng ra cc bi n php ki m tra nghim ng t ngu n nguyn li u th c ph m. Nguy c c a lo i vi khu n ny khng ch gy ra ng c th c ph m m quan tr ng hn l chng gy ra cc b nh l nguy hi m nh x y thai, vim mng no, nhi m trng huy t. Th ng giai o n b nh t vi ngy n 2 thng. Chnh v v y, ng i ta th ng khng nh n bi t c ngay s ly nhi m c a lo i vi khu n ny. D u hi u kh i pht c a b nh l c s t, kh ch u, au lng. N u c t m nh chng s gy ra ng c th c ph m c p tnh trong kho ng 12 gi , v i cc tri u ch ng nn m a, tiu ch y, au qu n b ng, nh c u. 2.2.10. Nguyn t c i u tr . - M c d trn invitro cho th y cn nh y c m v i nhi u thu c (tr Cephalosporin v Fosfomycin), k t qu i u tr b ng li u phpkhng sinh trong b nh nhi m Listeria ti n tri n th ng khng t t, m t ph n do s ch m ch trong vi c b t u i u tr b ng khng sinh thch h p khi cha a ra c ch n on s m trong qu trnh b nh v m t ph n do nhi u b nh nhn c tnh tr ng suy gi m mi n d ch. Hn n a, Listeria monocytogenes l m t lo i vi khu n k sinh n i t bo khng b t bu c, v

31

nhi u thu c khng sinh c kh nng thm nh p bn trong t bo km. Th m ch n u c th thm nh p c, cc thu c ny c th khng n nh ho c gi m ho t tnh trong i u ki n mi tr ng ny. - Kh nng thm nh p n i bo km v nhi u ki n cho r ng cc -lactam ch c kh nng km khu n i v i Listeria monocytogenes, nhng cc aminopenicillins, amoxicillin v ampicillin c cho l cc thu c thch h p trong cc tr ng h p Listeria xm nhi m lm gy b nh Listeriosis. M c d ph i dng li u cao hn so v i bnh th ng (8-12g/ngy, chia 2

l n). Nhi u tc gi khuy n co nn s d ng thm m t aminoglycoside, nh gentamicin 5-7mg/kg/ngy. Cc m hnh ng v t th c nghi m s d ng ampicillin g n liposomal ho c phn t nano cng cho k t qu kh quan m c d hi n t ng ny v n c nh gi l i trn lm sng. - Th i gian t i u c a li u php khng sinh cho b nh Listeriosis v n cha c xc nh, i u ny ph thu c vo nhi u bi u hi n lm sng khc nhau v cc i u ki n thu n l i gy b nh, nhng ni chung c khuy n co t i thi u l 2 tu n trong nhi m khu n nguyn pht v nhi m Listeria ph n mang thai t nh t 3 tu n v i vim mng no v b nh

tr s sinh. Li u trnh ng n hn c th lm b nh ti pht. Vim mng trong tim c th c n c i u tr t i 6 tu n. - V i nh ng b nh nhn khng dung n p v i ampicillin +/- aminoglycoside, cotrimoxazole c coi l li u php thay th ch p nh n c. - Vi c l a ch n khng sinh cho b nh nhn trong tr ng h p khng dung n p v i c ampicillin v cotrimoxazole l m t v n kh khn. i u tr b ng Vancomycin cng cho k t qu km, v m c d cc thu c khc nh carbapenem, fluoroquinolone th h m i hn, linezelid v

32

quinupristin/dalfopristin c ho t tnh t t trn invitro ch ng l i Listeria monocytogenes, nhng kinh nghi m v i nh ng thu c ny trn lm sng v n cn r t h n ch . - Khng khng sinh m c ph i cc ch ng phn l p trn lm sng tng i cc ch ng mang gen tetM c

hi m g p, m c d khng tetracycline

ghi nh n v i kh nng khng thu c qua plasmid. V i nhi u lo i khng sinh khc c ch khng qua trung gian plasmid cng c ghi nh n. 2.2.11. Cch phng ng a. - Gi th c n ngoi gi i h n c a vng nhi t nguy hi m t 40C n 600C. - Th c n no c n gi l nh th ph i gi nh ng th c n nng th ph i gi nhi t 40C ho c th p hn, cn nhi t trn 600C tr ln.

- N u chn ton b th c n ti c ngu n g c t ng v t. - Gi v sinh t i a lc n u n ng hay chu n b b a n. Chi r a d ng c , dao, th t b ng dung d ch Javel pha long trong n c. - C n th n v i cc lo i c v bi n hun khi. - R a tay b ng savon. - Th ng xuyn chi r a, t y trng t l nh. - Khng nn dung th c ph m c mi l . - Khng dung th c ph m qu th i h n s d ng. - Khng th c ph m ti s ng chung v i th c n n u chin. - Th c n n u chn dung ngay khng lu ngy trong t l nh. - R a k th c n tr c khi s d ng. - Gi th c n c n u chn tch bi t kh i rau, th c ph m cha ch bi n.

33

CHNG 3: PHNG PHP XC NH VI KHU N L.MNOCYTOGENES. 3.1. Phng php xc nh truy n th ng. 3.1.1. Nguyn l v phng php. S d ng phng php c y m Listeria monocytogenes trn mi tr ng nui c y chuyn bi t sau khi khu n l c nghi ng nghi m sinh ha. 3.1.2. Ph m vi pht hi n vi khu n. Pht hi n s hi n di n c a vi khu n Listeria monocytogenes trong th y s n. 3.1.3. D ng c s d ng. M u th c ph m c n ki m tra. Bnh tam gic 500ml, ng ln men (Durham). T m 30-500C. Que c y vng. Que c y th ng. Knh hi n vi. a petri. Pipettes 25,10 v 1ml. ng nghi m c n p y. m nhi t 300C trong 48h. ch n cc kh ng nh Listeria monocytogenes b ng cc th

3.1.4.Mi tr ng nui c y. - Canh tng sinh s c p Listeria Enrichment Broth I(LB I). - Canh tng sinh th c p Listeria Enrichment Broth II (LB II)

34

- Mi tr ng Enrichment Broth (EB) c i ti n t mi tr ng LB, c s d ng trong mi tr ng tng sinh t ng giai an. - Mi tr ng Oxford Agar, ni tr ng Palcam Agar. - Th ch mu. - Mi tr ng th ch m m BHI. Rhamnose Phenol Red Broth (RPR), Xylose Phenol Red Broth (XPR).

- Thu c th catalase, oxidase. 3.1.5.Quy trnh phn tch vi khu n Listeria Monocytogenes. 3.1.5.1. Quy trnh ki m nghi m vi khu n Listeria monocytogenes.

35

 ng nh t 25g m u trong 225ml LB I,

300C, 24h.

C y 0.1ml canh khu n sang 10ml mi tr ng LB II

300C,24h

Ria ln a Oxford Agar ho c a Palcam Agar,

300C, 48h

Ch n cc khu n l c c trng c a Listeria

Ria ln a th ch TSA,

qua m

CAMP v i S.aureus v R.equi

Th ch mu, 370C,2 4-48h

Th ch m m, 250C, 25-48h

Soi canh khu n BHI 250C

Th nghi m Catalas e.

Th nghi m Oxydase

Canh RPR, 370C, 48 gi

Canh XPR, 370C, 48 gi

S.aureus (+), r.equi (-)

Tan mu y u

Di ng hnh d trong th ch m m

Chuy n ng xoay trn

Dng tnh

m tnh

Dng tnh

m tnh

K t lu n: Listeria monocytogenes (+)/(-) trong 25 m u th nghi m

S 3.1. Quy trnh ki m nghi m vi khu n Listeria monocytogenes.

36

3.1.5.2. Thuy t minh quy trnh. a/ Tng sinh. ng nh t 25g m u trong 225ml mi tr ng tng sinh LB I trong 30 giy. ti p t c 300C trong 24h. Chuy n 0.1 ml LB I sang ng 10 ml LB II, 300C trong 24 gi . 450C n u m u th

Quy trnh tng sinh m t giai o n c th c hi n nh sau : Cn 25g m u, thm vo 225ml canh EB ( c lm m l cc s n ph m s a v hnh ng nh t m u trong 30 giy. 300C i v i cc s n ph m khc ) v ti n 300C trong 48 gi . 450C n u m u th l

Quy trnh tng sinh m t giai o n c th c hi n nh sau: Cn 25g m u, thm vo 225ml canh EB ( c lm m 300C trong 48h. b/ Phn l p. Phn l p Listeria monocytogenes trn mi tr ng OXFORD. Dng tm bng v trng th m d ch m u t ria sang a cn l i. ng tng sinh, tr i sang a mi tr ng Oxford Agar. T nh ng v t c y ny dng que c y vng 370C trong 24-48h. Trn mi tr ng ny khu n l c Listeria monocytogenes c mu xm hay mu nu c bao quanh b i vng en, khu n l c lm, nh , ng knh kho ng 1mm. Phn l p Listeria monocytogenes trn mi tr ng PALCAM. Dng pipet ht 0.1 ml m u cho vo mi tr ng th ch Palcam, sau ti n hnh c y trang ( trang n khi th y mi tr ng lan u m t th ch l c). Sau , em 370C trong vng 48 gi . Sau 48 gi l y ra quan st, ta th y khu n l c Listeria monocytogenes c mu xm n cc s n ph m khc ) v ti n hnh ng nh t m u trong 30 giy,

37

xanh l cy, c tm mu en. Mi tr ng xung quanh chuy n sang mu xanh en. c/ Kh ng nh Listeria monocytogenes b ng cc th nghi m sinh ha. Th kh nng tan huy t. Ch n khu n l c i n hnh trn mi tr ng th ch Oxford, dng que c y vng,c y truy n sang mi tr ng th ch mu, 370C, 24-48 gi . Trn mi tr ng th ch mu, khu n l c Listeria monocytogenes c bao quanh b i vng tn huy t h p do hi n t ng dung huy t d ng vng tan huy t trong v r. Tr c khi ti n hnh th nghi m kh ng nh, c y chuy n khu n l c nghi ng l vi khu n Listeria monocytogenes sang mi tr ng l ng khng ch n l c, - Th nghi m Catalase. Nguyn t c: Cc vi sinh v t k kh v hi u kh ty nghi ch a chu i i n t c cytochrome u c enzyme catalase (tr cc 250C, trong 20 gi .

Streptococcus.spp). Enzyme catalase c vai tr b o v t bo kh i cc t n thng b i cc d n xu t c tnh cao c a oxy phn t trong t bo vi sinh v t. Cc vi sinh v t c kh nng bi n d ng nng l ng theo phng th c v i oxy l ch t nh n i n t cu i cng trong chu i truy n i n t t o H2O2. Catalase th y phn hydrogen peroxide (H2O2) thnh H20 v O2, ngn c n s tch t c a phn t c c tnh cao ny trong t bo. S th y phn hydrogen peroxide s gii phng O2 c ghi nh n qua s s i b t kh. Ch ng lm i ch ng c a th epidermidis, Enterococcus faecalis. nghi m ny l Staphylococcus

38

Hnh 3.1. th nghi m Catalase. Phng php ti n hnh: Ha ch t dng ti n hnh th nghi m l: Hydrogen Peroxide 30%, dung d ch m Photphate pH 7.0. Th trn lame. Dng que c y th ng c y l y m t t sinh kh i t khu n l c thu n t trm lame, nh 1 gi t H2O2 30% ln sinh kh i vi sinh v t trm lame, nh 1 gi t H2O2 0.5% r i y l i b ng lamelle. N u dng tnh s xu t hi n b t kh b gi l i gi a lame v lamelle. Th nghi m trn a Petri. Nh tr c ti p 1ml H202 30% ln sinh kh i ch ng thu n trn b m t th ch. N u dng tnh s xu t hi n s i b t quanh sinh kh i. Th nghi m Oxidase. Nguyn t c: Xc nh s hi n di n c a h enzyme oxidase vi sinh v t. Enzyme quan tr ng nh t l cytochrome oxidase trong chu i truy n i n t c a h h p hi u kh v i O2 l ch t nh n i n t cu i cng , ch hi n di n

39

cc lai hi u kh hay k kh ty nghi. H at tnh cytochrome oxidase c pht hi n nh thu c th p- phenylenediamine. Trong i u ki n c s hi n di n c a cytochrome C kh trong t bo, thu c th ny b oxy ha thnh m t h p ch t indophenol c mu xanh dng. Ch ng dng lm i ch ng l (+) Pseudomonas aerugnosa, (-) Acinetobacter lwoffi. Phung php ti n hnh. Cch 1: c y sinh kh i ch ng thu n ln ng th ch nghing Nutrien Agar, nhi t thch h p trong 24-48 gi . Nhng m t mnh gi y l c vo dung d ch 1% teramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride ho c oxalate. Dng que c y vng thu l y sinh kh i, dn u ln v tr c thu c th trn gi y l c. N u khng xu t hi n mu xanh th ph n ng m tnh. Cch 2: C y sinh kh i ch ng thu n ln ng th ch nghing Nutrien Agar, nhi t thch h p trong 24-48 gi . Nh ln sinh kh i vo

gi t m i l ai thu c th m i pha l 1% p-aminodimethyaniline oxalate v 1% -napthol trong ethanol. N u khng xu t hi n mu xanh th ph n ng m tnh. Th nghi m tnh di ng. Nguyn t c. Vi sinh v t h at ng di chuy n c l nh tim mao. Kh nng di ng c th dng phn bi t cc vi sinh v t, kh nng ny c quan st nh s tng tr ng v di ng c a vi sinh v t vo bn trong th ch m m. Ch ng dng lm i ch ng l: Serratia marcescens, Acinetobacter lwoffi.

40

Phung php ti n hnh. S d ng mi tr ng th ch m m ch a 0.5% agar. Mi tr ng c un tan ch y, phn ph i thnh dung tch 5ml vo ng nghi m v trng, h p kh trng ngu i 1200C trong 15 pht. Cc ng mi tr ng ny c lm nhi t thch tr ng thi ng v b o qu n 4-100C. Dng que c y th ng thu

l y sinh kh i t khu n l c c a ch ng thu n sau khi

h p. Ch ng c c y b ng cch m su u que c y xuyn vo gi a mi tr ng trong ng nghi m n su kho ng 2cm . Cc ng mi tr ng c 370C trong 24/48 gi . Th c hi n song song v i vi c i u ki n tng t m t ng mi tr ng khng c c y vi sinh v t dng lm ng i ch ng. ng i ch ng khng c vi sinh v t tng tr ng, mi tr ng trong. N u s d ng mi tr ng th ch m m m trong ng nghi m c Listeria monocytogenes th Listeria monocytogenes s m c lan kh i ng c y theo hnh d v lm v n c mi tr ng xung quanh. Kh nng bi n d ng ng. Nguyn t c. Xc nh kh nng s d ng m t ngu n carbon nh t nh c a vi sinh v t tng tr ng. Phng php ti n hnh. cc ng canh trng th kh nng ln men ng 370C trong 7 ngy. K t qu (+) (mu vng) th ng quan st c trong vng 24-48 gi . Listeria monocytogenes ln men rhamnose nhng khng c kh nng ln men xylose. Th nghi m CAMP.

41

Nguyn t c. Ph n ng CAMP l ph ng ph i h p gi a nhn t protein ti t b i cc loi Streptococcus nhm B v i nhn t -hemolysin ti t ra b i ch ng Streptococcus aureus gy ra hi n t ng lm tan h ng c u c a c u ho c b trn mi tr ng th ch mu. Nhn t CAMP c vai tr tng c ng ho t tnh photpholipase C xc tc thu phn thnh ph n ch y u c a mng h ng c u c u ho c b l -hemolysin. Photpholipase C thu phn lecithin mng ngoi t o thnh cc diglyceride, photphatidyl

choline v ceramide. Ceramide v diglyceride k t t v i nhau thanh nh ng gi t c. Nhn t CAMP tc d ng ln cc kh i t ny t o ra kho ng tr ng trn mng ngoi gip cho photpholipase C c i u ki n ti p xc v thu phn sphigomelin mng trong lm h ng c u d v .

Trong th nghi m CAMP ng i ta ti n hnh c y ch ng ki m nghi m cng v i m t ch ng Staphylococcus t o nhi u -lysin ln mi tr ng th ch mu c b sung mu c u hay b. N u ch ng ki m nghi m CAMP th s xu t hi n ng tan huy t vng ln c n chung c a ng c y ch ng ki m nghi m v Saccharomyces aureus. Phng php ti n hnh. Trn a th ch dung th CAMP, c y Saccharomyces aureus thnh m t ng c y m ng, tng t c y Rhodocus equi t o thnh 2 ng c y song song cch nhau 4cm. C y ch ng nghi ng Listeria monocytogenes gi a, g n nhng khng ch m vo 2 ng c y song song c a Staphylococcus aureus v Rhodococus equi. C th c y m t ho c nhi u dng vi khu n nghi ng Listeria monocytogenes lm ch ng ki m nghi m ki m tra trn cng

42

m t a. C y ch ng i ch ng Listeria monocytogenes v ch ng Listeria innocua thnh hnh vung gc nhng khng ch m vo nhau. a 370C trong 20-36 gi . Ph n ng dng tnh khi xu t hi n vng

c ng h ng tan huy t ngay t i ranh gi i c a ch ng ki m nghi m v i Staphylococcus aureus ho c gi a ch ng th nghi m v i Rhodococus equi. Ph n ng CAMP dng tnh v i Rhodococus equi s t o vng tan huy t r ng (5-10mm) v c hnh d ng u mi tn. Ph n ng dng tnh v i Staphylococcus aureus th ng t o vng tan huy t h p ( kho ng 2 mm) c d ng hnh trn. Listeria monocytogenes cho ph n ng CAMP dng v i S.aureus v m v i Rhodococus equi. Ng c l i, Listeria innocua c ph n ng CAMP m v i c hai loi Staphylococcus aureus v Rhodococus equi. 3.2. Phng php hi n i. 3.2.1. Phng php ELISA. 3.2.1.1. Nguyn t c. - Nguyn t c c a phng php mi n d ch l ph n ng gi a m t t

bo(khng nguyn) v im t khng th c hi u. Tn hi u c a m t ph n ng mi n d h c th nh n bi t thng qua s ngng t a hay k t dnh c a khng nguyn khng th ho c b ng cch s d ng nh ng khng th c nh d u b ng cch nhu m hynh quang, ng v phng x , hay enzyme. - Phng php ELISA l phng php h p th mi n d ch lin k t enyme. Nguyn t c k thu t Elisa l s d ng khng th n dng hay cn g i l khng th s c p ph bn ngai nh ng gi ng nh nh m m c ch thu gi c php thu gi b ng cch s d ng khng th th 2 c g n enzyme pht tn hi u. Khi cho vo h n h p ph n ng m t c ch t c hi u c a enzyme,

43

ph n ng xy ra v lm i mu cc s n ph m lm i mu ph n ng.V v y chng ta c th pht hi n c s hi n di n c a khng nguyn. 3.2.1.2. Quy trnh th c hi n phn tch.

( tng sinh l n 1

Chu n b m u 30- 350C/24h, tng sinh l n 2

300C/22-24h.

Cho m u vo gi ng 30 pht,

35-370C

Thm ph c h p khng th v enzyme

Thm c ch t, d kh ang 10 pht

20-250C

c k t qu

S 3.2. Quy trnh pht hi n Listeria monocytogenes. Thuy t minh quy trnh. Chu n b m u. Tng sinh l n u : Thm 25g m u vo 225ml dung d ch 3M Listeria Broth (LB), tr n u, 36=5-370C/24h.

44

Tng sinh l n 2: Chuy n 0.1ml dung d ch tng sinh l n 1 vo 9.9ml canh FRASER 300C/22-24h.

Cch ti n hnh phn tch b ng ph n ng ELISA. Chu n b : X l nhi t. Chuy n 1ml m u t canh Fraser vo 50l dung d ch ph tr m u vo ng c dn nhn, ngm 15 pht trong n c si, ngu i. M h pp Listeria VIA v t chn . nhi t phng. M bao v tho gi ng ra r i

Cch ti n hnh: B c 1: C y m u v m u i ch ng, ghi l i v tr c y m u v dung pipep ht 200lm u v d ch i ch ng vo gi ng r i r a v b n c m i gi ng 3 l n. B c 2: Thm 200l ch t k t h p vo m i gi ng, y gi ng, pht. R a: h t dung d ch trong gi ng r i r a v b n c m i gi ng 4 ln. B c 3: Thm 200l c ch t vo m i gi ng, B c 4: c k t qu . c b ng m t th ng nh b ng so mu ho c s d ng my c. N u m u c mu xanh l cy n xanh dng m th m u dng tnh. 3.2.2. Phng php lai phn t . 20-250C/15 pht. Them 20l gi ng r a 35-370C/30

dung d ch k t thc gip n nh mu vo m i gi ng ( n u c n).

45

3.2.2.1.Nguyn t c. - Phng php s d ng m u d pht hi n v sinh v t trong th c ph m c d a trn s pht hi n m t an gene c trng c a vi sinh v t. C s c a v ec m u d l qu trnh lai phn t . - C s c a vi c s d ng m u d l phng php lai phn t . Qa trnh ny bao g m s tch r i hai m ch i c a chu i xo n kp DNA v s ti b t c p cc trnh t nucleotide b sung khi nhi t tr l i bnh th ng. S lai phn t xy ra khi o nm i c trnh t nucleotide b sung v i m t vng trnh t trn DNA m c tiu g p nhau do chuy n ng nhi t v khi nhi t mi tr ng th p hn Tm t nh t vi . Qa trnh lai phn t ch u nh h ng b i r t nhi u y u t : n ng DNA trong mi tr ng, nhi t v th i gianph n ng, kch th c cc trnh t lai v l c ion c a mi tr ng. 3.2.2.2. Cch lm. - H th ng ny s d ng que v i m u d pht hi n Listeria. M u d l nh ng an Oligomer DNA nh d u b ng ha ch t pht quang. Quy trnh c th c chia lm 6 b c: Pht v t bo thu nh n rRNA. M u d DNA c ui oligodeoxyadenylic nucleotide (dA) v m u d pht hi n ch a fluorescenin isothiocynate (F) t vo ph n ng. Que th c bao b c b i polydeoxythydien (dT) g n k t c v i oligo dA c a m u d Que th c t vo ng o ch a m u d pht hi n c nh d u b ng enzyme. u 5 v 3c a phn t c

46

Sau khi r a, l ai b ph n enzyme th a , que th c t vo ng o ch a c ch t t o mu. Sau khi hi n mu, mu c pht hi n 3.2.3.Phng php PCR. 3.2.3.1. Nguyn t c. - Phng php PCR l m t phng php invitro t ng h p DNA d a trn khun l mt trnh t DNA ban u, khuy ch i, nhn s l ng b n sao c a khun ny thnh hng tri u b n sao nh h at ng c a enzymepolymerase v mt c p m i c hi u cho an DNA ny. - Ton b qu trnh c l p i l p l i 25-30 chu k m t b n sao c a m u DNA c th bi n thnh ha2ng t b n sao trong vng 3-4 gi . 3.2.3.2. Cch lm. Cch xc nh Listeria monocytogenes b ng k thu t PCR v i c p m i LM-F v LM-R. - Ch ng vi sinh v t: Listeria monocytogenes. - Chu n b th nghi m. Trnh t gen hlyA c cng b trn ngn hng gen. Ph n m m BLAST dung xc nh trnh t gen ch hlyA c a Listeria monocytogenes. C p m i LM-F v LM-R. Ha ch t s d ng tch chi t DNA t ng s . Phng php ti n hnh th nghi m cho ph n ng PCR. D a trn trnh t gen hlyA c a cc ch ng Listeria monocytogennes c cng b trn ngn hng gen, c p m i LM-F v LM-R c thi t k bao g m 20bp/m i cho s n ph m PCR 468bp. b c sng 450nm.

47

- Xc nh tnh c hi u c a m i. Tnh c hi u c a m i c kh o st b ng cch ki m tra kh nng b t c p c a m i thi t k v i cc khun DNA c a vi khu n Listeria moocytogenes v khng ph i l vi khu n Listeria mococytogenes trong ph n ng PCR. - Ph n ng PCR. DNA khun t Listeria monocytogenes c thu nh n cho ph n ng PCR b ng cch tch lm s ch DNA v i chloroform ho c s l nhi t t bo 1000C trong 10 pht. T i u ha i u ki n PCR v n ng MG2+ (1 .5-4.0 mM), n ng m i (0.1-0.5pmol/m i) v n ng dNTPs (100250Mm/m i lo i). Ph n ng PCR c th c hi n v i th tch h n h p 25ml vi chu trnh nhi t g m 940C/3 pht,( 940C/ 1 pht, 600C/1 pht , 720C/ 1 pht)30 trnh, 720C/ 5 pht v 40C/5 pht. nh gi k t qu trn gel agarose 1% v i 3ml s n ph m. - Xc nh nh y c a phng php. Mi tr ng nui c y qua m c a vi khu n Listeria monocytogenes l tr6n mi tr ng LEB c nh l ng, pha long v i m t thch h p. Ly tm thu sinh kh i 1ml canh tr ng ha tan trong 100ml TE, x l nhi t thu DNA cho ph n ng PCR 3ml d ch t bo qua s l nhi t c s d ng lm khun cho ph n ng PCR. nh gi k t qu nh i n di trn gel agarose 1% v i 3ml s n ph m. - B gen DNA. B gen DNA c a Listeria monocytogenes c tch v lm s ch dung l khun cho ph n ng PCR khuy t i o n gen m c tiu hlyA v i c p m i LM-F v LM-R. K t qu ph n ng PCR v i khun DNA tinh s ch cho th y m t dy DNA c kch th c n m trong kho ng kch th c s n ph m

48

PCR c thi t k s n. V i m c ch thu nh n DNA b n m u cho ph n ng PCR m t cch n gi n hn, huy n ph Listeria monocytogenes c s l nhi t 1000C trong 10 pht ph v t bo, gi i phng DNA,

ly tm 10000 vng / 1 pht 10 pht, thu d ch ly tm ch a DNA lm khun cho ph n ng PCR. - Xc nh i u ki n t i u cho ph n ng PCR. N ng Mg2+: ph n ng PCR c th c hi n c a Mg2+ t 1.5mM-4.0Mm. N ng m i: PCR c th c hi n t i cc n ng m i khc nhau t 0.105 pmol. D ch t bo c xc nh m t vi khu n b ng phng php m khu n l c. Pha long d ch vi khu n v i cc n ng khc nhau, x l nhi t cc d ch huy n ph vi khu n, 3 ml d ch sinh kh i vi khu n sau khi s l nhi t dung lm khun cho ph n ng PCR cho th y ph n ng PCR cho k t qu dng tnh v i m u c m t t bo 6 102/ ph n ng tng ng v i m t t bo 2 104 CFU/ml. - u i m c a phng php PCR. Th i gian cho k t qu nhanh. C th pht hi n nh ng vi sinh v t kh nui c y. Vi c nui tng sinh l n gi n hop7n v i khi khng c n thi t. Ha ch t c n cho ph n ng PCR d tm v d t n tr hn so v i tr ng h p huy t thanh h c. Khng c n d ng c nui c y v mi tr ng phn tch ph c t p, c th th c hi n ngay t i hi n tr ng. t t n km v nhn s , c th c t ng ha lm gi m chi ph phn tch pht hi n cc vi khu n gy b nh trong th c ph m. cc n ng cu i cng

49

- Nh c i m c a phng php PCR. S c ch ho t tnh a Tag DNA polymerase b i thnh ph n c a m u v t do m u th c ph m th ng c nh ng thnh ph n ph c t p. Tuy nhin, vi c chi t tch v tnh ch DNA t th c ph m hay mi tr ng tr c khi th c hi n phng php PCR th ng cho php lo i b nh ng h p ch t c ch . M t vi sinh v t gy b nh hi n di n trong m u th c ph m th ng th p nn trong a s tr ng h p c n c b c nu i c y lm giu c c m t pht hi n b ng PCR. Phng php ny khng phn bi t c t bo s ng v i t bo ch t. Do v y , c th d n n tr ng h p dng tnh gi do DNA t t bo ch t . ng c l i, phng php ny cho php pht hi n bo t , d ng ti m sinh hay t bo ch t c a cc vi sinh gy b nh, gy ng c th c ph m.

50

CHNG 4: K T LU N V KI N NGH 4.1 K t lu n. - Tm l i, vi khu n Listeria monocytogenes l 1 loi vi khu n gy ng c th c ph m nguy hi m cho ng i n ph i nh ng th c ph m b ly nhi m. - c bi t, n gy nguy hi m i v i nh ng ph n mang thai, nh ng ng i l n tu i, nh ng c h th ng mi n d ch suy gi m v tr s sinh khi m c ph i vi khu n Listeria monocytogenes c th nguy hi m n tnh m ng. - Trn th gi i hi n nay, v n v vi khu n ny hi n nay l v n v cng c quan tm. M c d, n khng xy ra nhi u d ch b nh t i Vi t Nam. Nhng tnh hnh ly nhi m Listeria moncytogenes t ng xu t hi n t i Vi t Nam v trn th gi i v i m t m c cng ngy cng tng cao. - Trn th gi i hi n nay, c nhi u cng trnh nghin c u v vi khu n Listeia monocytogenes v hi n nay cc n c Chu u v n v vi khu n Listeria gy nhi m vo th c ph m hi n ang r t c quan tm v ki m sot k b ng cc phng php hi n i. - Nhng t i Vi t Nam v n nguy hi m ny cha c quan tm ng m c v cha phng php phng ch ng 1 cch ng m c. 4.2. Ki n ngh . - T nh ng nguy hi m trn nn c cch phng ch ng s ly nhi m c a vi khu n Listeia monocytogenes. - Nn ki m tra nghim ng t nh ng th c ph m tiu dng v m c vi khu n trong th c ph m, c bi t l i v i vi khu n Listeria monocytogenes.

51

TI LI U THAM KH O [1] Phng php phn tch vi sinh v t trong n c, th c ph m v m ph m. Tr n Linh Th c. [2] Vi khu n y h c PGS- Ts L Vn Phng [3] Gio trnh vi sinh v t h c th c ph m Ki u H u nh. [4] S tay ki m nghi m vi sinh trong th y s n nh xu t b n nng nghi p. [5] Aerobic and Facultative Gram-Positive Bacilli

52