You are on page 1of 73

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

PHN II: TH NGHIM VI SINH VT HC

32

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

BI 1 : THC HNH LM MI TRNG DINH DNG


I. Khi nim:

- Cc cht dinh dng l nhng hp cht tham gia vo qu trnh trao i cht ni bo. - Mi trng dinh dng l hn hp gm cc cht dinh dng v cc cht c nhim v duy tr th oxi ho kh, p sut thm thu ca t bo v s n nh pH ca mi trng. - Yu cu ca mi trng dinh dng: C cc cht dinh dng cn thit; C pH thch hp; C nht nht nh; Khng cha cc yu t c hi ; Hon ton v trng. - Phn loi mi trng dinh dng: Ngi ta da trn cc c s khc nhau phn loi mi trng II. Phng php lm mi trng Lm mi trng thc hin vic phn lp, nhn ging, gi ging vi sinh vt, ng thi nui cy v nghin cu cc c im sinh hc ca chng. 2.1. Nguyn tc ca vic ch to mi trng - Da trn c s nhu cu v cc cht dinh dng v kh nng ng ho cc cht dinh dng ca tng loi sinh vt. - m bo s cn bng v p sut thm thu gia mi trng v t bo vi sinh vt nn cn iu chnh t l v nng cc cht trong thnh phn mi trng. - m bo cc iu kin ho l cn thit cho cc hot ng trao i cht ca vi sinh vt. 2.2. Cc bc ch to mi trng dinh dng: 1. Pha ch: + Cn, ong tht chnh xc tng thnh phn mi trng v pha ch theo ng trnh t hng dn trong ti liu. + Mi trng lng: Cn, ong cc ct ri cho ho tan vo nc. + Mi trng c: Cn agar ri ngm vo nc Cn ho cht ri ho tan trong nc.
33

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

Vt agar ra, vt kh, b vo xoong mi trng un. 2. Lm trong mi trng: Vic lm trong mi trng s gip ta d dng quan st s pht trin ca vi sinh vt. C th lm bng mt trong cc cch sau: + Cch 1: Lc bng bng, vi tha hay giy lc + Cch 2: Lc bng lng trng trng g. C 1 lt mi trng dng lng trng ca 1 qu trng. Ly lng trng trng + lng nc bng lng lng trng nh tan cho si bt. hn hp trng v nc trn vo mi trng. Trn u, un si 10 - 15 pht. lng ri mi lc. 3. iu chnh pH ca mi trng: + Mun iu chnh pH ca mi trng ngi ta dng HCl 10 % hay NaCl 10 %. Ngoi ra c th dng mt s ho cht khc nh: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3 ... + Mun kim tra pH ca mi trng ta nn dng my o pH (pH metre). Phng php ny nhanh nhy v cho chnh xc cao. Trong phng th nghim c th dng ch th mu xanh bromotomol hay giy qu o pH. Phng php ny tin li, nhanh nhng khng cho chnh xc cao. 4. Phn phi mi trng vo dng c: Ngi ta thng phn phi mi trng vo ng nghim, a ptri, bnh tam gic. Trnh t phn phi gm cc bc sau: + Mi trng cn c un cho ho cht lng ri qua phu thu tinh vo cc dng c. + Tay tri gi dng c cha mi trng. + Tay phi kp nt bng v ko ra. + Nhanh tay rt mi trng vo dng c v y nt bng li. * Ch : i vi ng nghim: Nu dng mi trng lm thch nghing th lng mi trng cn c phn phi chim 1/4 th tch ca ng nghim.
34

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

Nu lm thch ng th lng mi trng cn c phn phi t 1/2 - 1/3 th tch ng nghim. i vi bnh cu hay bnh tam gic, lng mi trng c phn phi chim 1/2 - 1/3 th tch ca bnh. Cc thao tc phn phi phi nhanh, gn, kho lo mi trng khng dnh ln ming dng c hoc nt bng v vic phn phi cn thc hin xong trc khi mi trng b ng c. - Kh trng mi trng: Tu theo tnh cht v iu kin c th ca tng loi mi trng m c ch v phng php kh trng khc nhau. 6. Lm thch nghing, thch ng, thch vo a ptri: + Lm thch nghing: Cn tin hnh ngay sau khi kh trng mi trng va kt thc v mi trng cha ng c. + Lm thch ng: t cc ng nghim c mi trng lm thch ng vo gi , yn cho n khi mi trng ngui v ng c. + thch vo a ptri: Ton b quy trnh thch vo a ptri u thc hin trong t cy v trng * Ch : Thao tc thch phi ht sc khn trng v kho lo hn ch s nhim khun. Mt thch phi phng, nhn, c dy khong 2mm. Thng thng c 1/4 lt mi trng c th phn phi c 22 - 25 a ptri. Sau khi mi trng vo a ptri, 1 - 2 ngy sau khi kim tra li xem mi trng c b nhim khun khng ri mi s dng cy hai phn lp. Nh vit vo nhn: Tn mi trng .................................................... Kh trng ngy ......... thng ........... nm ............ vo ni ct gi mi trng tin cho vic theo di, s dng v bo qun.

35

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

Agar thch Mi trng lng Mi trng thch nghing Thch ng a thch

Hnh 1.1. Mt s dng mi trng trong ng nghim v hp ptri 7. Bo qun v kim tra mi trng: + Mi trng cha dng cn c bo qun ch mt, hn ch tc dng ca nh sng, nhit t 0 - 5 0C v khng mi trng b kh. + Trc khi s dng, kim tra v khun ca mi trng, ngi ta thng t chng vo t m 37 0C, trong 48 - 72h. Sau ly ra quan st, loi b cc ng c vi sinh vt pht trin v ch s dng nhng ng nghim, nhng a ptri c mi trng t yu cu.

36

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

BI 2 : CC PHNG PHP PHN LP VI SINH VT


I. Khi nim :

Phn lp vi sinh vt l qu trnh tch ring cc loi vi sinh vt t qun th ban u v a v dng thun khit. y l mt khu c ngha rt quan trng trong vic nghin cu v ng dng vi sinh vt. Vi sinh vt dng thun khit l ging vi sinh vt c to ra t 1 t bo ban u. - Trong thin nhin hoc trong cc vt phm nghin cu, vi sinh vt thng tn ti dng hn hp gm nhiu loi khc nhau. Mun nghin cu v hnh thi, sinh l, l ho hoc s dng vo thc tin mt loi no th cn phi a chng v dng thun khit. - Nguyn tc: Tch ri cc t bo vi sinh vt; Nui cy cc t bo trn trong mi trng dinh dng c trng cho khun lc ring r, cch bit nhau. II. Phng php phn lp vi sinh vt thun khit:

Qu trnh phn lp vi sinh vt dng thun khit: Vi hu ht cc loi mu nghin cu, qu trnh phn lp vi sinh vt dng thun khit gm cc bc c bn sau: - To ra cc khun lc ring r t qun th vi sinh vt ban u. - Phn lp vi sinh vt thun khit. - Kim tra tinh khit ca cc khun lc. 2.1. To ra cc khun lc ring r t qun th vi sinh vt trn cc mi trng phn lp a. Yu cu: - Nu mu ban u dng rn phi a v dng lng bng cch: + Nghin mu. + Ho tan mu trong nc ct v trng. Sau thc hin nh mu l dng lng. + Tip tc pha long nng cn thit. + Cy mu trn mi trng c trng ca n. - c c chng thun, cn tin hnh lp li nhiu ln cc k thut pha long nu trn cho n khi tt c cc khun lc xut hin trn mi trng u ng nht. Mc thun khit ca chng c th c kim tra nh sau:
37

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

- Vic to hp ria t mt khun lc n ca chng thun ch to ra mt loi khun lc duy nht trn b mt mi trng c hnh thi ging vi khun lc ca chng ban u. - Mi khun lc n ch cha mt loi t bo c hnh thi ging nhau trong quan st di knh hin vi. Trong thao tc to khun lc n cn lu hn ch thp nht nguy c b nhim bng cch thc hin nghim tc cc yu cu ca thao tc v trng. b. Phng php to khun lc n: - C nhiu k thut ria khc nhau thc hin hp ria v to khun lc n. Mt s k thut ria thng dng: k thut ria ch T , k thut ria bn gc , k thut ria tia ,k thut ria lin tc - Thao tc k thut to khun lc n c thc hin nh sau: 1. K thut hp ria: - Dng que cy vng thao tc v trng thu ging. - Ria cc ng trn a ptri cha mi trng thch hp (ria ch T v ria bn gc). Sau mi ng ria, t kh trng u que cy v lm ngui trc khi thc hin ng ria tip theo. - Bao gi a ptri, nhit v thi gian thch hp trong t m. 2. K thut hp tri: - Dng pipetman v u tp v trng, thao tc v trng chuyn 0,1 ml dch cha ging vi sinh vt ln b mt mi trng trong a ptri. - Nhng u thanh gt (que tri) thu tinh vo cn 700, h qua ngn la kh trng. u thanh gt ngui trong khng gian v trng ca ngn la. - M a ptri, t nh nhng thanh gt ln b mt thch ca a petri. Dng u thanh gt xoay, tri u dch ging ln b mt thch. Trong khi tri, thc hin xoay a mt vi ln, mi ln khong 1/2 chu vi a to iu kin cho thanh gt tri dch ging u khp b mt mi trng. - Rt thanh gt khi a, y a, gi v nhit v thi gian thch hp trong t m. 3. K thut hp : - Dng pipetman v u tp v trng, thao tc v trng chuyn 1 m dch cha ging vi sinh vt ln b mt mi trng trong a ptri.

38

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

- khong 15 - 20 ml mi trng un chy v ngu n 45 - 550C vo a petri cy mu. - Xoay nh ia petri cng chiu v ngc chiu kim ng h vi ln dung dch ging c trn u trong mi trng cy. - y np a ptri, ng t nhin. 2.2. Phn lp cc vi sinh vt trn mi trng c a ptri a. Phn lp vi sinh vt hiu kh: + Ht 0,1 ml dch mu pha long cho vo a ptri c mi trng thch

hp. + Dng que gt thy tinh phn phi dch mu tri u khp mt thch. + Tip tc s dng que gt ny gt mu cho u khp mt thch a ptri th 2 ri a th 3. + t cc a ptri 1, 2, 3 trn vo t m nhit thch hp sau mt thi gian nht nh tu ging vi sinh vt ta s nhn c cc khun lc ring r t cc a th 2 v 3. b. Phn lp vi sinh vt k kh: + Dng mi trng c trong ng nghim em chng cch thu loi b khng kh trong mi trng. + ngui mi trng cn 45 - 50 0C. + Ht 0,1 ml dch nghin cu cho vo ng mi trng, y nt li, lc trn quanh trc ng nghim. + Rt nhanh mi trng ng nghim vo np di ca a ptri v y tht nhanh np trn li, sao cho gia mt np v mi trng khng cn khng kh. + Dng parafin hn kn phn tip xc gia 2 np ca a petri v nhit thch hp. + Sau khi vi sinh vt pht trin, chn cc khun lc ring r trong khi mi trng, dng que cy ct c khi mi trng ri cy vo mi trng lng thch hp. 2.3. Kim tra tinh khit ca ging mi phn lp C nhiu cch kim tra: 1. Kim tra vt cy: Quan st s sinh trng ca vi sinh vt qua vt cy trn mi trng c. + Nu vt cy c b mt v mu sc ng u, thun nht chng t ging mi phn lp tinh khit th gi li.
39

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

+ Nu vt cy khng thun nht th loi b. 2. Kim tra li thun chng ca cc loi khun lc: + Chn cc khun lc ring r trn mi trng thch nghing. + Tch cc khun lc ny ra v ho tan, pha long nng cn thit trong nc ct v trng. + Nh 1 git dch trn vo a ptri c mi trng. + Dng 1 que gt phn phi git dch u khp mt thch a ptri th nht, ri a th 2, th 3. + t cc a ptri trn vo t m vi nhit v thi gian thch hp tu loi vi sinh vt. + Sau ly ra quan st cc khun lc ring r. S thun khit ca khun lc l biu hin s thun khit ca ging. III. 3.1. Thc hnh phn lp vi sinh vt t cc loi canh trng khc nhau Phn lp vi khun Bacillus subtilis: - C kh ct nh, cho vo 1 bnh tam gic. - B sung thm: + Mt cht phn + Nc sch ngp c. - un si 15 pht dit cc t bo sinh dng v cc t bo khng sinh bo

t. - y nt bng, t m nhit 25 - 26 0C trong 48 - 72 h. - Kt qu: + Xut hin lp vng xm c nhiu vi khun Bacillus sublitis v c kh bao gi cng c bo t ca vi khun ny. + Soi knh hin vi : T bo Bac. sublitis c hnh que, di, bo t hnh van nm xa tm hay gn tm khun lc. T bo c kch thc (3 - 5 x 0,6) m. 3.2. Phn lp nm mc Aspergillus oryzae, Aspergillus niger v Mucor: - C th phn lp cc loi nm mc ny trn cm ngui, xi lm mc tng, bnh m kh t ngy. - Thng qua mu sc ca mc nhn din. + Mc c mu trng: C th l Mucor hay Rhizopus. + Mc c mu en l Aspergillus niger. + Mc c mu xanh lc l Penicillium italicum. Loi mc ny thng c trn v cam, chanh lu ngy

40

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

- Dng que cy u hnh thc th ly mt t si nm cy vo mi trng thch nghing thch hp (Czapek). 3.3. Phn lp nm men: - C th phn lp nm men d dng t cc mi trng nh: + B mt tri cy v dch p mt s tri cy nh to, l, nho, du, m, da, ... + Trong ru np, trong cc bnh men ru, trong bia, trong nc ma, trong ht kphia. - Nm men ny khi quan st trn knh hin vi thng c dng hnh cu hay hnh trng. T bo c kch thc ln, c kh nng ny chi. Khun lc cho mu trng sa - Chn cc khun lc nm men ring r v cy vo mi trng thch hp ng khoai ty - ng cm hay mi trng Sabouraud).

41

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

BI 3 : CC PHNG PHP NUI CY V BO QUN VI SINH VT


I. 1.1 Cc phng php gieo cy: Cy truyn t ng nghim ny sang ng nghim khc: - Dn nhn ghi

Tn ging vi sinh vt Ngy cy vo thnh ng nghim, di nt bng mt cht. - Tay tri cm 2 ng nghim: 1 ng ging 1 ng mi trng - Tay phi cm que cy v kh trng trn ngn n cn cho n khi nng dy cy - Dng ngn t v ngn p t kp nt bng vo lng bn tay xoay nh, ko nt ng ging ra - H nng kh trng khng kh ming 2 ng nghim - i khi que cy va ngui, kho lo a que cy tip xc vi khun lc trong ng ging. - Rt que cy ra, khng que cy chm vo thnh ng nghim v a ng vo mi trng thc hin cc thao tc cy truyn. - Kh trng li phn khng kh ni ming 2 ng nghim ri y nt bng - Kh trng li que cy sau khi s dng xong - Ch : Nu ng ging l canh trng lng c vi sinh vt th dng pipet ht canh trng thay que cy. Thao tc kh trng ng ht bt u thc hin u nh ng ht sau khi tho giy bao gi. S dng xong cm ng ht vo dung dch crmic kh trng. 1.2. Phng php cy trn thch nghing: Phng php ny dng cy truyn cc vi sinh vt hiu kh. - S dng que cy u trn tin hnh cc thao tc theo ng trnh t ni - Thc hin vic cy ging vo ng thch nghing bng cc thao tc tip theo: + Ho ging u que cy vo git nc y ng nghim. + Nh nhng lt que cy trn mt thch theo cc kiu (hnh 3.1)
42

trn

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

Hnh ch chi Hnh vng xon Hnh vch ngang song song

Hnh 3.1 : Mt s kiu cy trn ng thch nghing 1.3 Phng php cy trn thch ng: Phng php ny dng cy cc vi sinh vt k kh. - S dng que cy hnh kim - Sau khi ly ging vi sinh vt, dng que cy ny m su vo phn khi thch hnh tr.

Hnh 3.2 : Cch s dng Pipetmain (a) Cy bng que cy u nh (b) Cch cy vi sinh vt k kh bng que cy hnh kim (c) - m st y ng nghim v m thnh 3 ng: 1 ng chnh gia, 2 ng st thnh ng tu yu cu. - ng cy phi thng, nh nhng khng gy nt, v mi trng (hnh 3.2).
43

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

1.4.

Phng php cy trn a ptri:

C th cy trn a ptri theo 1 trong 2 cch sau: * Dng que cy u trn v thc hin theo trnh t sau: - a ptri ln bn. - Dng que cy ly canh trng vi sinh vt theo th t v yu cu phng php chung. - Tay tri h m np a ptri va cho que cy vo. - Nh nhng v nhanh chng lt que cy ln mt thch theo mt trong cc kiu sau: + Theo hnh ch chi trn ton b mt thch (hnh 3.3a) + Theo nhng ng song song (hnh 3.3b) + Theo 4 hnh ch chi 4 gc (hnh 3.3c)

Hnh 3.3 : Cc kiu cy trn thch a

44

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

Hnh 3.4 : Cch dn vi sinh vt trn b mt mi trng. A Que gt Drigalxki; B Dn bng que gt; C: S sinh trng ca VSV sau khi dn u bng que gt; D : S sinh trng ca VSV sau khi dn bng que cy * Dng pipet: Thng p dng nh lng vi sinh vt v cy mt lng kh nhiu ging. C 2 cch: - Cch 1: + Trn dch cy vo thch bng cch ht 0,1 ml dch nghin cu cho vo ng nghim c mi trng thch nhit 500C. + y nt bng li, lc nh cho vi sinh vt phn phi u trong mi trng. + thch ny vo a ptri kh trng. + Xoay trn a ptri cho thch dn u y hp. + yn cho thch ng c li v t vo t m nhit thch hp. - Cch 2: + Ht 0,1 ml dch cy, nh vo a ptri c mi trng c. + Dng que gt phn phi git dch u khp mt thch a. + Ct vo t m vi nhit v thi gian thch hp tu loi vi sinh vt.

45

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

III.

Cc phng php nui vi sinh vt :

m bo s pht trin ca vi sinh vt, sau khi cy xong phi quan tm n cc iu kin nui dng chng. Cc iu kin bao gm: - Nhit : Tu loi vi sinh vt khc nhau, chn nhit ti thch cho s pht trin ca chng v duy tr s n nh nhit . - m: duy tr m trong qu trnh nui cn: - m bo lng nc khi lm mi trng. - Trong iu kin cn thit c th phun nc v khun vo phng nui hoc nc bc hi trong t m. - xi (O2): - i vi vi sinh vt hiu kh: + Cung cp thng xuyn v y O2. + Lp mi trng nui cy c dy va phi. + Cc bnh cha mi trng c lc thng xuyn trong qu trnh nui cung cp thm oxi cho vi sinh vt. + Nu nui cy trong mi trng c khi lng ln phi tin hnh sc kh thng xuyn hay nh k. - i vi vi sinh vt k kh: Hn ch s tip xc vi oxi bng cch; ln b mt mi trng parafin, du vazlin; Cy trch su vo mi trng c. Nui cy trong bnh ht chn khng. Nui trong ng nghim c bit sau khi rt ht khng kh v hn kn li .un si mi trng mt thi gian loi ht O2. ngui 450C. Dng ng ht cy vi sinh vt vo y ng nghim. Lm ngui tht nhanh ri vazlin ln b mt hn ch s tip xc vi O2. - Kt qu ca vic nui cy: Sau khi nui thi gian v nhit thch hp cho mi loi vi sinh vt ta thy: - Trong mi trng lng: Vi khun pht trin s lm c mi trng. - Trong mi trng c thch nghing: + Nm men, vi khun pht trin s to nn vt ni trn mt thch trong hay trng c. + Nm mc s to nn nhng si mnh t vt cy.

46

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

- Trong mi trng thch ng: Cc vi khun k kh pht trin y ca ct mi trng.

Hnh 3.5 : Cc dng c nui ym kh a. Bnh ht m chn khng b. v c. Cc kiu ng nghim hn kn IV. 4.1. BO QUN CC CHNG VI SINH VT THUN KHIT Cc phng php bo qun ging vi sinh vt 1. Phng php cy truyn nh k ln mi trng mi: - Phng php ny p dng bo qun tt c cc loi vi sinh vt. - u im: Phng php ny n gin, d lm, thi gian bo qun khng lu. - Nhc im: Tn mi trng, cng sc v thi gian. Phm cht ban u ca ging c th b thay i do nhiu nguyn nhn kh xc nh c th trong qu trnh cy truyn. 2. Phng php gi ging trn mi trng thch c lp du khong: - Yu cu ca phng php ny l s dng du khong nh parafin lng hay vazlin phi trung tnh, c nht cao, khng cha cc sn phm c vi vi sinh vt v v trng. - Cch bo qun: + Kh trng du khong bng cch hp 1210C trong 2h. Sau sy kh t sy (1700C) trong 1 - 2h; ngui + i vi vi sinh vt k kh :

47

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

+ Hn ch s tip xc vi xi bng cch : * ln b mt mi trng parafin, du vazlin * Cy trch su vo mi trng c. * Nui cy trong bnh ht chn khng (hnh 3.5) * Nui trong ng nghim c bit sau khi ht ln khng v hn kn li (hnh 3.5). * un si mi trng mt thi gian loi ht O2. ngui 45oC. Dng ng ht cy vi sinh vt vo y ng nghim. Lm ngui tht nhanh ri vazlin ln b mt hn ch s tip xc vi O2. + ln b mt mi trng c vi sinh vt pht trin tt mt lng du cch mp trn ng nghim 1 cm. + Dng parafin c hn kn ming ng, bnh nui VSV. - u im: Phng php ny n gin nhng hiu qu cao nh kh nng lm chm qu trnh bin dng v h hp nn vi sinh vt pht trin chm li. Mi trng khng b mt nc v kh. 3. Phng php gi ging trn t, ct, ht * Trn t, ct: Dng bo qun cc chng to bo t tim sinh (hoc bo t v tnh) vi thi gian bo qun t mt n nhiu nm. - Cch bo qun: + t, ct em ry ly ht u v ngm trong HCl hay H2SO4 m c 8 - 12h loi b cc axit hu c trong ct. + Ra k v gi iu kin v trng. + Sy kh v gi iu kin v trng + y ct vo ng nghim c vi sinh vt pht trin trn mi trng thch v lc tht u. + Rt ton b ct ln vi sinh vt vo 1 ng nghim khc. + Hn kn ming ng nghim ny s bo qun c rt lu. * Trn ht: Dng bo qun cc chng c dng hnh si sinh bo t hoc khng. Thi gian bo qun c th ti 1 nm. - Cch bo qun: + Ht ng cc (la, bobo) c ra sch. + Nu cho ht va nt, ro nc. + Cho vo cc ng nghim cc ht ng cc ni trn. + Ph trn mt cc ht ny mt lp bng thm nc nu ht ng cc.
48

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

+ Cy ging vi sinh vt trn lp bng cho mc tht dy. + Gi nhit 15 - 200C. 4. Phng php ng kh: Phng php ny lm cho t bo mt nc trng thi t do. ng thi lm gim, thm ch lm ngng hn qu trnh phn chia ca vi sinh vt. Nh chng c kh nng chu c nhiu tc ng ca ngoi cnh. - Phng php ny dng nhiu trong sn xut, thi gian bo qun ln ti vi chc nm. * Ch : vic bo qun vi sinh vt c kt qu cn phi m bo chn ging thun khit, cha b bin i cc c tnh do t bin ngu nhin ng thi cn phi chn giai on ti u trong chu trnh sng bo qun.

49

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

BI 4 : CC PHNG PHP NHUM MU V QUAN ST HNH THI VI SINH VT


I. Phng php lm tiu bn tm thi : 1.1. Cch lm tiu bn git p - Dng que cy hoc ng ht ly ging vi sinh vt lm vt bi. - t l knh ln git canh trng tht nh nhng trnh khng to thnh bt kh. Mun vy mt mp l knh tip xc vi phin knh ri t t h l knh xung. - a tiu bn ln quan st trn knh hin vi. 1.2. Cch lm tiu bn git treo Loi tiu bn ny dng theo di s sinh sn, s hnh thnh bo t, kh nng di ng v phn ng ca t bo vi sinh vt vi cc loi kch thch - Dng phin knh c bit c phn lm hnh trn gia. - Bi vazlin quanh phn lm ca phin knh. - Cho 1 git canh trng ln gia l knh. - Thn trng xoay ngc l knh cho git canh trng xung pha di ri t ln phn lm ca phin knh. 1.3. Cch lm tiu bn tm thi c nhum mu a. Nguyn tc : Phng php ny s dng thuc nhum khng hoc t c vi vi sinh vt v c pha long nng m bo cho t bo vi sinh vt vn sng v hot ng sau khi nhum mu. b. Cch nhum : + Nh 1 git thuc nhum xanh mtylen 0,001% ln phin knh. + Nh 1 git canh trng vi sinh vt vi thuc nhum. + y l knh ln git dch. + Quan st tiu bn vt knh (x 10) ri (x 40)

50

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

II. 2.1.

Phng php lm tiu bn c nh : Cc bc tin hnh lm tiu bn c nh 1. Lm vt bi : 2. C nh vt bi : Cc cch c nh : + C nh bng nhit : + C nh bng ho cht : Cch ny tuy phc tp nhng khng gy bin dng t bo, khng gy bin i cu trc t bo v khng lm t cc tin mao. Ngi ta thng dng cc ho cht l ru v axtn c nh vt bi. Cch c nh : C th thc hin mt trong nhng cch sau : o Nhng vt bi vo ru. Vi ru 950 ngm vt bi t 5 - 15 pht. Vi ru mtylc ngm khong 2 - 5 pht. o Ngm vt bi vo dung dch axtn trong 5 pht. o Nh vi git ru 90 - 950 ln vt bi. t chy v dp tt ngay. Lm nh vy vi ln ri kh.

2.3.

Nhum mu tiu bn c nh a. Nguyn tc :

- S dng thuc nhum c kh nng thm thu qua mng t bo v kt hp vi thnh phn khc nhau ca t bo thnh nhng hp cht mu c trng bn vng. - Tu theo mc ch nghin cu v kh nng bt mu khc nhau ca cc thnh phn t bo m chn loi thuc nhum v cch nhum cho ph hp. - C 2 cch nhum chnh : + Nhum n : Ch dng 1 loi thuc nhum trn 1 tiu bn. + Nhum kp : Dng ng thi 2 hay nhiu loi thuc nhum trn 1 tiu bn. b. Cch nhum : - t tiu bn ln cu thu tinh (t nm ngang ming mt khay nhn, hoc thu tinh). - Nh vo vt bi vi git Fuchsin Ziehl, yn t 1 - 2 pht.
51

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

- Ra vt bi bng cch nghing phin knh, dng bnh xt cho dng nc chy nh qua vt bi n khi nc chy ra khng cn mu na - Dng giy thm kh tiu bn hoc h nh tiu bn trn n cn - Quan st tiu bn vt knh (x 40) ri chuyn sang vt knh (x 100) dng du soi. III. 3.1. Quan st c im sinh hc ca cc nhm vi sinh vt : Quan st c im sinh hc ca vi khun (Bacteria).

Ngi ta thng lm tiu bn git p v git treo quan st hnh thi vi khun sau khi nui cy chng nhit 370C sau 24 - 48h 3.2. Quan st c im sinh hc ca x khun (Actinomycetes) Cc c im sinh hc c trng cn quan st - Hnh dng bo t - c im cung sinh bo t. - Phng thc hnh thnh chui bo t Cch quan st - Lm tiu bn git p vi Streptomyces griseus cy trn thch nghing. 3.3. Quan st c im sinh hc ca nm mc (Molds) - c im ca si nm: Mu sc, c vch ngn hay khng c vch ngn. - c im ca c quan sinh sn: hnh dng, cch sp xp cc b phn ca c quan sinh sn. - Hnh dng, cu to, cch sp xp ca bo t. Cch quan st: - Lm tiu bn nm mc khng nhum mu - V hnh v nhn xt v hnh dng chung ca si nm; v tr, hnh dng, cch sp xp ca bo t, th bnh, cung th bnh, cung bo t nh ca 2 ging nm mc trn. - Thao tc s dng knh hin vi soi ni - Lm tiu bn nm mc nhum mu: 3.4. Quan st c im sinh hc ca nm men (Yeasts) - Hnh thi, kch thc t bo nm men. - S ny chi ca nm men
52

Cc c im sinh hc c trng cn quan st:

Nhng c im sinh hc c trng cn quan st.

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

- Hnh dng, s lng bo t trong 1 ti bo t. Cch quan st: - Lm tiu bn nhum n nm men cy trong mi trng dch th vi xanh mtylen Loeffler. - Quan st s ny chi ca nm men. IV. PHNG PHP NHUM KP - QUAN ST CU TO T BO VI SINH VT 4.1 Cc phng php nhum kp - Quan st cu to t bo sinh vt: - Nhum kp l phng php nhum trong ngi ta s dng 2 hay nhiu loi thuc nhum trn 1 tiu bn. - Nguyn tc ca vic nhum kp + Cc cu trc khc nhau, thm ch cc phn khc nhau ca mt cu trc thng c tnh cht l hc, ho hc cng nh kh nng bt mu khc nhau. + Vic s dng ng thi cc loi thuc nhum trn cng mt tiu bn cho php ta c th quan st v phn bit cc cu trc d dng hn. 1.Phng php nhum Gram : a. Nguyn tc : - Da trn kh nng bt mu ca t bo cht v mng t bo vi thuc nhum tm kt tinh v it m hnh thnh nn hai loi phc cht khc nhau. + Loi phc cht th nht vn gi nguyn mu ca thuc nhum nn khng b ra tri khi x l bng cn. Vi sinh vt c phc cht ny thuc loi gram dng. + Loi phc cht th hai khng cn gi c mu ca thuc nhum nn mt mu khi x l bng cn v bt mu ca thuc nhum b sung. Vi sinh vt c phc cht ny thuc loi gram m. b. Cch tin hnh : - Lm tiu bn : + Dng que cy ly nc v trng lm 3 vt bi trn phin knh (hai u v gia phin knh). + Dng que cy ly mt cht khun lc ca chng lm vt bi theo th t sau: Bn tri phin knh l Bacillus subtilis Bn phi phin knh l Escherichia coli
53

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

gia phin knh l Bac.subtilis trn ln vi E. coli + kh vt bi trong khng kh hoc c nh nh trn ngn n cn. - Nhum tiu bn + t 3 ming giy lc ln 3 vt bi. + Nhum tiu bn bng thuc nhum tm kt tinh qua giy lc trong 1 pht (hnh 50) + Nhum lugol trong 1 pht. + Ra nc. + Ty bng cn trong 30 giy, nghing tiu bn nh t t tng git cn cho n khi tan ht mu. + Ra nc. + Nhum b sung Fuchsin hay Safranin t 10 - 30 giy + Lm kh v soi tiu bn vi vt knh du. - Kt qu: + Vt bi ca Bac. sublitis mu tm - gram dng. + Vt bi ca Bac. sublitis + E.Coli c mu hng ln mu tm. + Vt bi ca E.Coli mu hng - gram m. 4.2. Phng php nhum bo t ca t bo vi khun - S hnh thnh bo t l mt hnh thc i mi t bo khi gp nhng iu kin khng thun li trong chu trnh sng - Nguyn tc nhum : Da trn cu trc c bit ca mng bo t : dy, chc, kh bt mu, cha nhiu lipit. Trc ht x l t bo cht bo t d bt mu bng nhit v axit. Nhum mu c t bo cht ca bo t v t bo bng thuc nhum c hot tnh mnh. Ty mu t bo cht t bo i v nhum n bng thuc nhum khc b sung. Nh t bo cht ca bo t v t bo cht t bo bt mu phn bit. Phng php gietska : - Lm vt bi vi Bac. subtilis nui cy 2 tun tui trn ng thch nghing v vt bi kh t nhin. - Nh vi git HCl 0,5% ln vt bi, h nng trn ngn n cn cho bc hi, gi 2 pht ri ra nc. - t ln vt bi ming giy lc ri nh Fuchsin Ziehl, h nng cho n khi bc hi. Nu thuc nhum cn phi b sung ngay v gi trong 5 pht.

54

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

- B giy ra v ra li vt bi bng nc. - Ty mu bng cch nhng phin knh vo dung dch H2SO4 1% trong 2 pht. - Ra vt bi bng nc. - Nhum vt bi bng xanh mtylen Loeffler trong 5 - 15 pht. - Ra nc, kh t nhin vt bi. - Quan st tiu bn trn knh hin vi vi vt knh u. - Kt qu : Bo t mu , t bo cht mu xanh. 4.3. Phng php nhum nhn (cht nhn) ca vi sinh vt cc vi sinh vt bc thp, nhn cha c cu to in hnh (cht nhn cha c bao bc bi mng nhn). cc vi sinh vt bc cao, nhn c cu to in hnh (c mng nhn bao xung quanh cht nhn). Thnh phn ho hc ca c nhn v cht nhn u l ADN, ch mt s rt t loi vi sinh vt l ARN. - Nguyn tc : Do tnh cht bt mu ca ADN trong nhn v ARN trong t bo cht tng t nhau. Dng HCl lm tan ARN trong t bo cht ri mi tin hnh nhum mu ADN trong nhn. - Cch tin hnh : + Lm tiu bn t ng thch nghing cy vi khun sau 24h hoc cy nm men sau 48h. + kh t nhin ri c nh tiu bnbng hi dung dch axit osmic 2% trong 2 - 3 pht (c th thay axit ny bng axit axtic). + t tiu bn vo cc thy tinh c HCl 1N, un cc axit ny 600C v gi trong 3 - 5 pht. + Ra ngay tiu bn bng nc ct. + Nh ln tiu bn dung dch Formalin 1%, gi trong 1 - 2 pht. + Ra li tiu bn bng nc ct. + Nhum vt bi bng dung dch 0,5 - 1% Fuchsin v gi trong 1 - 2 pht. + Ra tht sch lp thuc nhum trn tiu bn bng nc ct.
55

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

+ kh, quan st tiu bn vi vt knh du trn knh hin vi. * Kt qu : - Nhn mu nu thm, t bo cht mu hng.

56

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

BI 5 : CC PHNG PHP XC NH S LNG T BO VI SINH VT


Trong bt k mt loi mu vt no, mun bit s lng chung ca cc nhm vi sinh vt cng nh s lng ring ca mi nhm thnh phn, u cn phi m s lng t bo ca chng. xc nh s lng vi sinh vt trong t, nc, khng kh v dch nui cy ngi ta c th s dng nhiu phng php khc nhau. Trong c 2 phng php di y c dng nhiu hn c : - Phng php xc nh trc tip s lng t bo bng phin knh c khung m Goriaep (phng m hng cu). - Phng php xc nh gin tip s lng t bo bng cch m s lng khun lc mc trn mi trng thch. Ni chung c 2 phng php trn u phi tin hnh theo 2 bc sau y : Chun b mu : xc nh gin tip hoc trc tip t bo vi sinh vt 1.1. Ly mu : Tu theo loi vt phm cn xc nh m ta ly mu nghin cu vi s lng v khi lng khc nhau cho ph hp. Yu cu ca vic ly mu. - Ly mu c tnh cht i din. - Lng mu ly va phi, phn tch cc c tnh l, ho, sinh hc. - Dng c ly mu, cha mu phi v trng. - Ly mu xong phi phn tch ngay v khng c qu 24h. - Mu ly phi c nhn ghi k hiu v ghi vo s nhng c im ca mu v ni thu mu. 1.2. Pha long mu : Chun b mt s bnh tam gic cha 90ml nc ct v trng, mt s ng nghim cha 9ml nc ct v trng v mt s ng ht (1ml) v trng. a. Mu trng thi lng : - Pha long mu theo dy thp phn I.

57

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

Hnh 5.1 : Phng php pha long mu theo dy thp phn b. Nu mu nghin cu trng thi c (nh t, lng thc, thc phm) - Chun b 2 bnh hnh nn c dung tch 250 ml + Bnh 1 cha 90ml nc ct v trng + Bnh 2 v trng v khng cha g - Kh trng ci chy s bng cch cho mt t cn vo v t ln. Sau ngui. - Cn 1 g t (hoc mu) cho vo ci s v nghin nt mu. - Dng ton b nc bnh 1 chuyn ton b mu sang bnh 2. - Lc 5 pht, lng 30 giy ri tip tc pha long mu nh mu trng th lng. - Tu theo s c on s lng vi sinh vt trong mu m pha long nhiu hay t

58

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

Hnh 5.2

II.

Phng php nh lng vi sinh vt :

S hin din ca vi sinh vt c th c nh lng bng nhiu phng php khc nhau nh m s lng t bo trc tip trn knh hin vi, nh lng gin tip thng qua mc cn nh sng ( c) , m s khun lc mc trn mt mi trng xc nh, nh lng mt cch thng k bng phng php pha long ti hn ( phng php MPN) ... 2.1 Phng php nh lng trc tip : Mt vi sinh vt n bo c kch thc ln nh nm men, to ... c th c xc nh bng cch m trc tip bng bung m trn knh hin vi .Quy trnh m trc tip cho php xc nh nhanh chng mt vi sinh vt trong mu nhng phng php ny c mt s nhc im l khng phn bit gia t bo sng v t bo cht, d nhm ln t bo vi sinh vt vi cc ht vt th khc trong mu, kh t c chnh xc cao, khng thch hp cho huyn ph vi sinh vt c mt thp. 1. m trc tip bng bung m hng cu : Bung m hng cu thng l mt phin knh dy 2 - 3 mm c mt vng a m nm gia phin knh v c bao quanh bi mt rnh. a m thp hn b mt ca phin knh khong 1/10 mm, c hnh trn v th khi c ph ln bng mto l knh th su ca a m s ng u nhau. Vng a m c din tch 1mm2 v c chia thnh 25 vung ln c din tch mi l 1/25 mm2 v 400 vung nh hn, mi c din tch 1/400 mm2.
59

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

Khi thc hin quan st v m vi sinh vt, cho thm vi git formalin vo trong mu, trn u. Pha long mu cn m sao cho trong mi nh ca bung m c khong 5 - 10 t bo vi sinh vt. t c pha long nh vy cn phi c lng c s lng vi sinh vt trong mu, ng thi phi th vi ln trong qu trnh pha long. Mu phi c pha long bng dung dch pha long cha 0,1% pepton v 0,1% laurylsulphate v 0,01% methyl blue. Tt c cc dung dch pha long u cn phi c lc trc khi s dng. t mt git mu c pha long vo vng m trn bung m khu vc bung m. Chnh th trng sao cho mt th trng cha trn mt ln (4 x 4 = 16 nh). m s t bo hin din trong 1 ln. Sau , chnh th trng tm 1 ln khc. m s t bo ca t nht 5 ln. Ly tr s trung bnh. Cch tnh mt t bo nh sau : th tch ca mt ln l 1/25mm2 x 1/10m = 1/250mm3 hay 1/250 x 103cm3 = 4 x 10-6 ml. Nh vy, mt t bo ca huyn ph mu l : N/ml = 0,25a x 106 t bo/ml (trong a l s t bo bnh qun trong mt ln 2.2. Phng php cy gt : a. Phng php cy gt (hp tri) - Tin hnh pha long mu theo phng php nu trn. - Ghi vo y a Petri c mi trng thch cc thng tin : . Nng pha long. . Ngy cy. Dng pipet v khun ly 0,1 md dch huyn ph cho vo mi a thch (tng ng vi 2 git dch). S t bo cy trn b mt thch phi c dn u v khong nn vt qu vi trm.

Lu : c th dng th tch mu cy t 0,05 - 0,5 ml. Tuy nhin, th tch mu cy cng nh th sai s c th xy ra cng ln. Khi tt c cc th tch 0,1 ml t bo cc pha long khc nhau u c chuyn ln b mt thch ca a Petri, s dng que cy gt bng thu tinh dn u cc t bo trn b mt thch. Lu rng que cy gt thu tinh phi c v khun trc khi c a vo a Petri tip theo, bng cch nhng vo trong cn, vy nh loi i lng cn d bm bng que cy, t chy phn cn cn li trn que cy trn ngn la n cn. Lm ngui que cy bng cch nh n vo b mt thch, ri dn u lng cht lng cha t bo trn . Nu th tch cht lng em cy qu nhiu, cc t bo s tri dt trong cht lng, v sau khi t bo phn
60

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

chia, hai khun lc xut pht t mt t bo c th hnh thnh. Cc a thch c chun b mt ngy trc khi cy thng hp thu nhanh lng cht lng em cy. Lp cht lng trn thch cng mng, s hp thu xy ra cng nhanh. Di y l phn thc nghim nh lng s t bo vi sinh vt c trong mu bng phng php m s khun lc trn thch a. Cch tin hnh : - Cho mt t ging vi sinh vt vo ng nghim cha 1 t nc ct v khun nh que cy vng to huyn ph t bo. Cn b hng dn c th chun b trc cc dch huyn ph t bo c nng nm trong khong xc nh. - Pha long dch huyn ph t bo cc nng thch hp nh : 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 , 10-5 ... tin hnh cy mu cc pha long khc nhau vo cac a Petri (lp ba, tc l cy mu mi pha long vo 3 a Petri) theo hai phng php trn. Lu rng phng php cy gt, ch cy 0,1 ml dch mu ln mi trng thch rn sn, cn i vi phng php a th cy 1 ml dch mu vo a trc khi thm mi trng thch lng ngui vo. - t cc a thch va cy vo t m ci nhit 30oC v trong 48 gi. - Kt thc thi gian , ly cc a thch ra, tin hnh m khun lc v tnh s lng t bo trong 1ml mu theo cng thc nu trn. Mt t bo vi sinh vt trong mu ban u tnh t s liu ca pha long D1 c tnh theo cng thc l : Mi (CFU/ml) = Ai x Di/V Trong : Ai l s khun lc trung bnh/ a Di l pha long V l dung tch huyn ph t bo cho vo mi a (ml) Mt t bo trung bnh MI trong mu ban u l trung bnh cng ca Mi cc nng pha long khc nhau.

61

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

2.3. Phng php nh lng bng cch thng k VSV bng phng php pha long ti hn: Phng php MPN (Most Probable Number) Phng php MPN (phng php c s xc sut cao nht ; s ti kh) cn c gi l phng php pha long ti hn hay phng php chun . y l phng php dng nh gi s lng vi sinh vt theo s lng vi sinh vt c xc sut ln nht hin din trong mt n v th tch mu. y l phng php nh lng da trn kt qu nh tnh ca mt lot th nghim c lp li mt s pha long khc nhau. Thng thng, vic nh lng ny c thc hin lp li 3 ln 3 pha long bc 10 lin tip, tng cng 3 x 3 = 9 ng nghim. Quy trnh thc hin nh lng theo phng php ny l nh sau : Cho vo cc ng nghim c cha mi trng thch hp cho s tng trng ca i tng vi sinh vt cn nh lng mt th tch chnh xc dung dch mu 3 nng pha long bc 10 lin tip (v d 1/10, 1/100, 1/1000). nhit v thi gian thch hp. Da vo kt qu biu kin chng minh s tng trng ca vi sinh vt cn kim nh trong tng ng nghim (thng l cc hin tng nh sinh hi, i mu, c ), ghi nhn s lng cc ng nghim dng tnh tng pha long. S dng cc s liu ny v da vo bng Mac Crady suy ra mt vi sinh vt c trnh by di dng s MPN/100ml hay s MPN/1g mu. chnh xc ca tr s MPN ph thuc vo s lng ng nghim lp li trong mi pha long ; Bng 5.1: Bng tra mpn dng cho lot 3 ng nghim 3 nng pha long lin tip S lng ng S lng ng S S dng tnh dng tnh MPN/100 MPN/1 S mo mu s dng S mo mu s dng ml 00 ml 10 1 0,1 10 1 0,1 0 0 0 2 0 0 9 0 0 1 3 2 0 1 14 0 0 2 6 2 0 2 20 0 0 3 9 2 0 3 26 0 1 0 3 2 1 0 15 0 1 1 6 2 1 1 20 0 1 2 9 2 1 2 27
62

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3

3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

12 6 9 12 16 9 13 16 19 4 7 11 15 7 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3

3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 -

63

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

Bng 5.2 : Bng tra mpn dng cho lot 5 ng nghim 3 nng pha long lin tip S lng ng S lng ng S S dng tnh dng tnh MPN/100 MPN/1 S mo mu s dng S mo mu s dng ml 00 ml 10 1 0,1 10 1 0,1 0 0 0 0 4 0 2 20 0 0 1 2 4 0 3 25 0 0 2 4 4 1 0 17 0 1 0 2 4 1 1 20 0 1 1 4 4 1 2 25 0 1 2 6 4 2 0 20 0 2 0 4 4 2 1 25 0 2 1 6 4 2 2 30 0 3 0 6 4 3 0 25 1 0 0 2 4 3 1 35 1 0 1 4 4 3 2 40 1 0 2 6 4 4 0 35 1 0 3 8 4 4 1 40 1 1 0 4 4 4 2 45 1 1 1 6 4 5 0 40 1 1 2 8 4 5 1 50 1 2 0 6 4 5 2 55 1 2 1 8 4 0 3 25 1 2 2 10 5 0 4 30 1 3 0 8 5 0 0 45 1 3 1 10 5 0 3 60 1 4 0 11 5 0 4 75 2 0 0 5 5 1 0 35 2 0 1 7 5 1 1 45 2 0 2 9 5 1 2 65 2 0 3 12 5 1 3 85 2 1 0 7 5 1 4 115 2 1 1 9 5 2 0 50 2 1 2 12 5 2 1 70
64

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4

2 2 2 3 3 4 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 3 3 4 4 5 0 0

0 1 2 0 1 0 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1

9 12 14 12 14 15 8 11 13 11 14 17 20 14 17 20 17 20 20 25 25 13 17

5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 -

2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 -

2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 -

95 120 150 175 80 110 140 175 200 250 130 170 225 275 350 425 250 350 550 900 1600 1800 -

65

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

BI 6 : XC NH KH NNG PHN GII CC CHT HU C KHNG CHA NIT CA VSV


I. XC NH KH NNG LN MEN (RU ETYLIC) CA NM MEN 1.1. Tin hnh qu trnh ln men ru - Lm mi trng ln men t nc p tri cy : nho, du, da, m v.v... hoc t nc mch nha. - iu chnh pH = 4 - 6 - Thanh trng dch p tri cy theo phng php Tyndal hoc kh trng bng ni hp p sut 0,75 atm trong 20 pht. - mi trng ngui ti 30oC th cy men ging vo vi t l 2 - 5% th tch dch ln men. y nt bnh ln men. - t bnh c dch ln men vo t m 28 - 30oC, sau 1-2 ngy ly ra. 1.2. Xc nh cc c trng ca qu trnh. a. Xc nh cc i tng vi sinh vt tham gia: - Lm tiu bn git p, git treo hay nhum n thy c hnh dng t bo nm men - Yu cu : quan st tiu bn vt knh (x40) trn knh hin vi. Ch nhn bit cc du hiu c trng v hnh thi ca mi loi. b. Xc nh cht lng men ging trc khi cho ln men: - Xc nh t l t bo ny chi trong dch men ging bng phng php m s lng t bo ny chi trn khung m Goriaep. - Xc nh t l t bo sng v cht bng tiu bn nhum sng nm men ( phn bit 2 loi t bo ny). - Xc nh s lng t bo/1ml dch men ging bng phng php m s lng t bo trn khung m Goriaep. c. Xc nh tc qu trnh ln men thng qua lng CO2 to thnh : * Nguyn tc : - Da vo phng trnh tng qut ca qu trnh ln men : C6H12O6 2C2H5OH + CO2 + 27kcal - Lng ng phn gii trong qu trnh ln men cng nhiu th lng CO2 to ra cng ln. - Tc qu trnh ln men chnh l lng CO2 bay ra t 1 th tch mi trng nht nh trong 1 khong thi gian xc nh.
66

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

* Cch tin hnh : - xc nh lng CO2 to ra trong qu trnh ln men, ngi ta s dng mt dng c ch to theo nguyn tc ca bnh ln men Smith - Dng c ny gm cc b phn sau : + Mt bnh cu cha 50mlo dch ln men v 10ml dch men ging. + Ming hnh cu c y bng 1 nt cao su. + Bnh cu c ni vi 1 l thu tinh ming rng qua 1 ng thu tinh un cong. Mt u ng thu tinh nm phn trn dch ln men trong bnh cu. u kia ca ng nhng vo 1 ng nghim cha y nc p ngc trong l thu tinh (hnh 6.1).

Hnh 6.1 : Dng c thu CO2 trong th nghim ln men

- t dng c ln men ny vo t m c nhit 32 - 35oC. - Sau mt thi gian, quan st thy bt kh CO2 thot ra theo ng thu tinh v y mc nc trong ng nghim xung. - Lng nc b y xung cng nhiu chng t lng CO2 to ra cng ln. - C th xc nh c th tch lng CO2 ny bng cch thay ng nghim thng bng ng nghim c vch chia t 1 - 25ml. - Cn c vo th tch mc nc h xung ta bit c th tch CO2 c to thnh trong qu trnh ln men ti cc thi im cn xc nh. (Sau khi ln men 24h, 48h...). Phng php ny dng nh lng CO2 trong qu trnh ln men. d. nh tnh CO2 c to ra: * Nguyn tc : - Da trn phn ng khi cho CO2 i qua dung dch Ba(OH)2 hoc nc vi trong s lm cho dung dch ny b c. * Cch tin hnh : - Cho vo ng nghim : + 5ml dch ln men. + 1ml dung dch Ba(OH)2 10%
67

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

- Dng kp g kp ng nghim v un nh trn ngn n cn. - lng ta s thy c kt ta trng do BaCO3 c to thnh theo phn ng: CO2 + Ba(OH)2 BaCO3 + H2O e. Cc phn ng nh tnh ru tylic: * Nguyn tc chung : Da vo cc phn ng c trng ca ru tylic vi cc cht xc nh s c mt ca ru trong qu trnh ln men. * Cch tin hnh : - Phn ng to thnh indoform: + Cho vo ng nghim cc cht sau : . 5ml dch ln men. . 5ml NaOH . 0,1 g it tinh th dng bt. + un nng ng nghim hay ngm ng nghim vo ni cch thu 60oC cho n khi it tan ht v mt mu. + ngui s xut hin tinh th indoform mu vng (CHI3). S to thnh CHI3 do s c mt ca ru tylic trong dch ln men - Phn ng vi K2Cr2O7 : + Cho vo ng nghim 1 (th nghim) : . 2ml dch ln men. . Thm 1-2 ml H2SO4 m c . Nh tng git K2Cr2O7 1% cho n khi xut hin mu xanh lc. + Cho vo ng nghim 2 (i chng): . 2ml dch cha ln men . 1-2ml H2SO4 m c . Nh tng git K2Cr2O71% Quan st s chuyn mu ca 2 ng nghim trn vo gii thch kt qu. * Cc bc phn tch : Trong bnh nh mc loi 100ml, ta cho 20ml dch nui cy c tch b cc t bo bng cch lng, lc hoc ly tm. B sung nc
68

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

ct cho ti 100ml, khuy trn v ly ra 10ml cho vo bnh cu y trn loi c dung tch 50 - 75ml. Trong bnh nhn loi c 3 ch phnh hnh cu, ta rt 25ml dung dch bicromat v 10ml H2SO4 c. y bnh cu bng nt cao su c gngvi mt ng dn m u cui tht li ca n phi chm ti y ca bnh nhn (hnh 6.2). Sau trong 10 - 15 pht ct 2/3 dung tch bnh. Dung dch bicromat trong thi gian s chuyn t mu da cam sang mu nu bn. Sau khi ct, trnh cho cc cht dch t bnh nhn khng tro tr li, ta tho bnh nhn ra ri mi b n i. em cht dch trong bnh nhn chuyn vo mt bnh nh mc II. XC NH KH NNG LN MEN LACTIC CA VI KHUN LACTIC 2.1. Tin hnh qu trnh ln men lactic * Cch 1: - Nguyn liu: Da ci Nc mui 3 - 3,5% ng - Cch lm: + Da ci b ho, ra sch, ct khc, ro. + Pha 500ml dung dch NaCl 3 - 3,5% v b sung thm vo 2 tha c ph ng. + Xp da vo l thu tinh v m cht. + nc mui t t cho ngp da. + Ln men nhit 28 - 300C trong 2 - 3 ngy. + Vi khun lactic sng trn b mt rau qu l tc nhn ca qu trnh ny. * Cch 2: + Cho vo bnh tam gic - 150 ml sa ti kh trng. - 3 tha c ph sa chua khuy cho tht nhuyn + Lc bnh men ging tan u + t m 30 - 350C trong 3 - 4h ta c sa (chua) ng t.
69

0,5 kg 500 ml 2 tha c ph

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

2.2.

Xc nh cc c trng ca qu trnh a. Xc nh cc i tng vi sinh vt tham gia:

- Lm tiu bn git p t nc da ci chua quan st c hnh dng, s sp xp t bo ca cc vi khun ln men lactic. - Lm tiu bn git treo quan st s chuyn ng ca nhng vi khun lactic t dch trong ca sa chua. - Yu cu nhn bit c 2 dng cu khun v trc khun ca cc vi khun ln men lactic. b. Xc nh s c mt ca axit lactic trong qu trnh ln men bng cc phn ng nh tnh * Nguyn tc chung: - Da trn cc phn ng mu c trng ca axit lactic vi mt s hp chy khc nhau xc nh s c mt ca chng trong qu trnh ln men lactic. * Cch tin hnh: - Phn ng chuyn axit lactic thnh axtaldhyt: + Cho vo ng nghim: 5 ml dch ln men. 1 ml H2SO4 10%. un si Thm tng git KMnO4 2% + Trc khi un 1 ming giy lc tm dung dch AgNO3 trong amnic. Nu trong dch nghin cu c axit lactic th axit ny s c chuyn thnh axtaldhyt v lm en ming giy lc. - nh lng axit lactic bng phng php chun : + Cho vo ng nghim: 10 ml nc da. 20 ml nc ct 1 - 2 git phnolphtalin. Lc tht k trn u cc cht. + Chun dung dch bng NaOH 0,1N. + Cch tnh: Khi lng axit lactic (trong 10 ml dch ln men)
70

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

= S ml dung dch NaOH 0,1n (dng chun ) x 0,009g (1 ml dung dch NaOH tng ng 0,009g axit lactic) III. XC NH QU TRNH LN MEN ACETIC CA VI SINH VT: 3.1. Tin hnh th nghim ln men acetic - Cho vo dng c thu tinh c ming rng, th tch 100ml. + 30 - 40 ml bia. + 0,5ml ru tylic (cht giu nng lng). + 3 - 5ml axit axtic 1N axit ho mi trng. - dng c ny ngoi khng kh vi gi ri y bng vi mn mng, cho vo t m 25 - 300C. - Sau 2 - 3 ngy trn ming dng c s thy xut hin 1 lp vng vi khun axtic trn b mt mi trng. 3.2. Xc nh cc c trng ca qu trnh ln men axtic a. Xc nh thnh phn loi vi sinh vt tham gia - Lm tiu bn quan st vi khun acetic t lp mng trng ca dm. - Tin hnh nhum n tiu bn bng xanh mtylen hoc Fuchsin, Lugol. - Quan st tiu bn bng vt knh du (x 100). b. Cc phn ng nh tnh axit axtic: * Nguyn tc: Da vo nhng phn ng c trng ca axit axtic vi cc cht khc nhau xc nh s c mt ca axit ny trong qu trnh ln men. * Cch tin hnh: - Phn ng to thnh tyl axtat: + Cho vo ng nghim cc cht sau: 5 ml dch ln men. 0,5 ml ru tylic 96%. 3 ml H2SO4 m c. + un nng ng nghim trn n cn v thy mi thm bay ra do tyl axtat to thnh. iu ny chng t trong thnh phn dch ln men c axit axtic. - Phn ng to thnh st axtat: + Cho vo ng nghim cc cht sau:
71

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

3 ml dch ln men 1 ml NaOH 20% Vi git dung dch FeCl3 5% + Lc u ng nghim v un nng trn ngn n cn. Nu dung dch c axit axtic th s c mu thm do st axtat c to thnh. c. Phn ng nh lng axit axtic + Cho vo bnh tam gic c th tch 100 ml 10 ml dch ln men 1 - 2 git dung dch phnolphtalin 0,1% + Chun bng dung dch NaOH 0,1N + Tnh s gam axit axtic trong 10 ml dch ln men (Bit rng 1ml NaOH 0,1N tng ng vi 0,006g axit axtic). IV. XC NH QU TRNH PHN GII XENLULOZA CA VI SINH VT 4.1. (g): KNO3 KH2PO4 MgSO4 NaCl 2,5g 1,0g 0,5g 0,5g Tin hnh qu trnh phn gii hiu kh xenlulza - Cho vo ng nghim 4 - 5 ml mi trng Vinogratxki c thnh phn sau

0,01g FeSO4 Mn2(SO4)3 0,01g Nc ct 200 ml - Nhng vo dung dch trong ng nghim mt di giy lc (20 x 1,5 cm) - Dng kp st kp mt u di giy vo ming ng nghim. - Cho vo ng nghim mt cc t nh (ngun vi sinh vt) ri t ng nghim vo t m, gi 300C trong 7 - 15 ngy. - Cc vi sinh vt phn gii xenlulza pht trin, tit ra men xenlulaza lm cho giy b phn hu, ho nhy c mu vng, hng, lc, cht nhy c mu sc chnh l khun lc ca vi khun. - Xc nh cc i tng vi sinh vt tham gia qu trnh phn gii xenlulza hiu kh
72

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

quan st hnh thi cc vi sinh vt hiu kh tham gia vo qu trnh phn gii ny ta lm tiu bn t cc cht nhy trn b mt giy lc - Nhum n vt bi bng Fuchsin. - Quan st tiu bn di knh hin vi vi vt knh du (x 100). Tin hnh qu trnh phn gii k kh xenlulza - Cho vo ng nghim 10ml mi trng c thnh phn nh sau (%): 0,2% KNH4PO4 0,1% KH2PO4 0,03% CaCl2 Peptn 0,1% 0,05% MgSO4 0,5% CaCO3 - Cho mt di giy lc (10 cm x 1,5 cm) ngp trong ng nghim c mi trng. - un si nh ng nghim v b vo mt cc t nh cy ngun vi sinh vt c bo t. - t m 300C v 600C trong 1 - 2 tun. - Vi khun phn gii Xenluloza k kh pht trin 600C s lm cho mi trng c ln, phin giy lc c mu vng, nhy v nt vn dn ra. - Xc nh thnh phn loi vi sinh vt phn gii Xenluloza k kh - Lm tiu bn t ch nhy ca giy v nhum n bng Fuchsin. - Quan st tiu bn di knh hin vi vi vt knh du (x 100). 4.2.

73

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

BI 7 : XC NH KH NNG PHN GII CC CHT HU C CHA NIT CA VI SINH VT


I. Xc nh kh nng phn gii protein ca vi sinh vt. 1.1. Thc hin qu trnh amn ho prtit - Cho vo bnh tam gic c th tch 100 - 150ml + 3 - 5g tht + 20 - 30ml nc ct + Mt cc t nh nghin ra cung cp ngun vi sinh vt. - un nng bnh tam gic nhit 80 - 900C dit cc t bo sinh dng v gi li nhng t bo mang bo t. - bnh vo t m nhit 27 - 280C trong 7 ngy. - Kp mt ming giy qu trn ming ng nghim xc nhn NH3 c gii phng ra trong qu trnh phn gii prtit. 1.2. Xc nh cc c trng ca qu trnh a. Xc nh thnh phn loi vi sinh vt tham gia: - Lm tiu bn t dch phn gii prtit sau 2 - 4 ngy. - Nhum Gram hay nhum n vt bi. - Quan st tiu bn bng vt knh du (x 100) trn knh hin vi. b. Cc phn ng nh tnh mt s sn phm ch yu ca qu trnh phn gii prtit * Nguyn tc: Da trn nhng phn ng mu, phn ng kt ta c trng ca cc sn phm trong qu trnh phn gii prtit vi cc ho cht khc nhau xc nhn s c mt ca chng trong cc qu trnh ny. * Cch tin hnh: - Xc nh s c mt ca prtit trong qu trnh amn ho prtit bng phn ng mu: + Cho vo ng nghim: 5ml dung dch ln men thi. 1ml dung dch NaOH 30% 0,5ml dung dch CuSO4 1% + un nh ng nghim cho ti si
74

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

+ Kt qu: Dung dch c mu xanh tm nu trong c prtit. Dung dch c mu hi nu trong c peptn. - Phn ng nh tnh NH3 C th pht hin NH3 theo cch sau: Cho dch ln men thi vo 1 bnh tam gic. t giy qu tm nc ln ming bnh nhng khng c giy qu chm vo dch ln men. y nt vo ming bnh v dng nilon bao ngoi cho kn phn nt li. * Kt qu: Nu c NH3 bay ra th giy qu s chuyn thnh mu xanh. ngc li nu dung dch ln men khng c NH3 bay ra th giy qu vn gi nguyn mu ca n. - Phn ng nh tnh indol: Indol l sn phm c hnh thnh khi vi sinh vt phn hu cc axit amin c vng benzen (nh triptophan). C th pht hin indol bng cch sau: Cho vo ng nghim: 3 - 4 ml dch ln men sau 24 - 48h. Nh vi git thuc th Ehrlich vo. * Kt qu: Dung dch to thnh c mu ca Rosindol do s c mt ca indol trong dch ln men. + Cch 2: Cho vo ng nghim: 5ml dch ln men 0,5ml H2SO4 10% Lc k ri cho thm: 0,5ml KNO2 0,01% * Kt qu: Mu ca Nitritindol c to thnh do trong dch ln men c mt indol. - Phn ng nh tnh H2S: H2S c hnh thnh khi vi sinh vt phn prtit c cha lu hunh. C th th kh nng to H2S bng 1 trong cc cch sau: + Cch 1:
75

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

Cho vo ng nghim hay bnh tam gic dch ln men. Kp vo ming bnh (hay ming ng nghim) 1 t giy lc tm axtat ch). Kt qu: Giy lc chuyn sang mu en do trong dch ln men c mt H2S. + Cch 2: vo ng nghim mi trung thch ch (mi trng thch c 0,1% axtat ch) v dng ng thch ng. Dng que cy nhn ly sinh khi vi khun amn ho prtit v cy trch su vo mi trng thch t 2 - 3 ng cy. Nui cc vi khun ny nhit thch hp trong 20 - 41h. Sau ly ng nghim ra quan st: Nu cc ng cy c mu en chng t c H2S sinh ra trong mi trng. Nu cc ng cy c mu khng thay i chng t khng c H2S sinh ra trong mi trng.

76

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

BI 8 : PHNG PHP XC NH KH NNG TO SN PHM BC HAI VI SINH VT


I. Xc nh kh nng sinh khng sinh ca vi sinh vt 1.1. Phn lp ging vi sinh vt - Cn 1g t - Nghin t trong ci s - Ho t vi 10ml nc v khun - Cho vo bnh tam gic dung tch 200ml vi 90ml nc v khun - Tin hnh pha long cho ti khi tch c tng t bo ring bit. - Tch t bo trn mi trng thch a bng phng php cy gt - thch a 370C trong 1-2 ngy - Khi khun lc nh hnh thnh, phn lp v nui trn mi trng thch nghing. - Dng cc ging phn lp, nui chng trong mi trng lng my lc, nhit phng. - Xc nh hot tnh cht khng sinh - Xc nh hot tnh cht khng sinh c to ra trong dung dch ln men nh trnh by di y. 1.2. Xc nh hot tnh cht khng sinh a/ Phng php kim tra s b (phng php Kolmen v Boerner) - Trn mi trng thch a , cy vi sinh vt kim tra theo mt ng thng. - trong iu kin nhit bnh thng - Sau cy vi khun c kh nng b c ch bi khng sinh nghin cu - em nhit tng t nh trn - Sau 3-4 ngy, nhn xt v ghi kt qu. Nu vi sinh vt c kh nng c ch th s xut hin vng v khun vng khng c s pht trin ca vi sinh vt. b/ Phng php thi thch - Nui cy vi sinh vt vo thch a - Dng ci t nt cao su, n nh ln thi thch v ly thi thch ra. - Dng kp v khun n thi thch vo a thch nui vi sinh vt kim nh v t thi thch vo ch c. Nui chng trong iu kin phng th nghim, sau ly ra o vng v khun xung quanh l c. c/ Phng php dng ng thp khng g

77

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

- Cy vi sinh vt kim nh vo a petri vi mi trng thch dinh dng theo phng php a - Khi thch ng, dng kp v khun gp 6 ng thp khng g t nh nhng vo 6 v tr u nhau trn mt thch. ng thp khng g c chiu cao0,1mm, ng knh bn ngoi 8mm, ng knh trong 6mm. Nu khng c ng thp khng g c th s dng ng bng s hoc thu tinh. - Dng mt ng nh git c cha cht khng sinh cho vo ng thp. - t cc a thch vo t m trong thi gian 3-4 gi. - Xc nh ln vng v khun. d/ Phng php dng khoanh giy lc - Dng giy lc v ct chng ra thnh nhng hnh trn c ng knh 6mm - Kh trng giy lc (bng nhit kh) - Tm dung dch cha cht khng sinh cn nghin cu - Sy ming giy ny 400C trong 1 gi. - Dng kp v trng t ming giy ny vo a petri nui sn vi sinh vt kim nh sao cho nhng ming giy ny c mt khong cch u nhau. - t a petri c nhng ming giy trn vo t m 370C trong thi gian 1618 gi. - Ly ra o vng v khun.

78

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

BI 9 : PHNG PHP THU NHN V XC NH HOT TNH ENZYM T VI SINH VT


I. THU NHN CH PHM ENZYM VI SINH VT TH T PHNG PHP NUI CY B MT 1.1. Nguyn tc Trong qu trnh pht trin ca vi sinh vt, enzym lun lun c tng hp tham gia vo qu trnh ng ho v qu trnh d ho. Di y l phn thc nghim c tin hnh thu nhn ch phm enzym th. 1.2. Nguyn liu v ho cht 1. Ging vi sinh vt c dng trong th nghim l nm si Aspergillus oryzae. Nm si ny c th sinh tng hp enzym amylase, protease v c cellulase tu theo c cht cm ng m ta a vo. 2. Mi trng bn rn c bn gm: - Cm 70% - Tru 25% - Cc nguyn liu cha c cht cm ng tng hp ra enzym tng ng 5% - m mi trng l 60 - 65% 3. Thit b tit trng 4. Cc dng c thu tinh dng trong nui cy gm a Petri, bnh tam gic 250 ml, bnh tam gic 1000 ml. 5. Khay hoc cc dng c an bng tre. 6. T m 1.3. Cch tin hnh 1. Chun b 50g mi trng c bn trn trong mi bnh tam gic c dung tch 250 ml, hoc 10g mi trng trn vo cc hp Petri. Nu cn c hm lng protease cao, cho thm 5% bt u nnh, nu cn c hm lng pectinase cao cho thm 5% bt c rt, ... lm c cht cm ng. 2. Dng nc my to ra m mi trung t 60 - 65%, em tit trng 1210C trong 30 pht. 3. Chun b 3 - 5 ng nghim nc v khun.
79

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

4. Bng thao tc v trng, thc hin trong t cy v trng, 10ml nc v trng ny vo cc ng nghim ging. 5. Dng a thu tinh v khun khuy nh bo t nm si Aspgilles ho u trong nc. 6. Dng pipet v khun ht ly 2 ml cho vo a Petri c cha mi trng c v khun v ngui, hoc ton b 10 ml nc ho u bo t vo bnh tam gic c mi trng thanh trng v lm ngui. 7. Lc u mi trng trong bnh tam gic trn u vi bo t hoc xoay u mi trng trong a Petri trn u vi bo t. 8. Bao gi a Petri hoc y nt bng bnh tam gic v vo t m c nhit n nh 370C. Nui trong thi gian 36 gi. 9. Nu th nghim c thc hin vi mc ch kim tra kh nng sinh tng hp enzym th sau 36 gi nui cy, ta thu c ch phm enzym th. 10. Nu th nghim c thc hin vi mc ch thu nhn lng ch phm th nhiu hn ta c th nui chng trong nhng bnh tam gic 1000 ml vi lng mi trng l 200 - 250g. Hoc ta s nui chng trong nhng khay bng nhm hoc cc dng c c an bng tre, na. Chiu dy ca mi trng khi nui trn khay khong 3 - 5 cm l tt nht. 11. Khi nm si bt u chm to ra bo t l thi gian enzym c to ra nhiu nht. Ta nn thu nhn ch phm th giai on ny. 12. Ch phm th sau khi thu nhn c em sy nhit di 400C c qut thng gi d bo qun v dng lu di. 1.4. nh gi cht lng ch phm enzym th Ch phm enzym th c xc nh hot tnh chung v hot tnh ring theo nhng phng php tng ng vi tng loi enzym c trnh by cui chng ny. II. THU NHN CH PHM ENZYM VI SINH VT TH T PHNG PHP NUI CY CHM 2.1. Nguyn tc Phng php nui cy chm l phng php vi sinh vt pht trin, sinh sn v trao i cht trong lng mi trng. Mi trng dng trong nui cy chm thng l mi trng lng.

80

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

2.2.

Nguyn liu, dng c v ho cht

- Ging vi sinh vt c s dng l vi khun Bacillus sublitis c kh nng sinh tng hp enzym protease v amylase. - Mi trng nui cy l mi trng Edwards: M40. - Bnh tam gic 250 ml. - Cc ho cht cn thit kim tra hot tnh protease (xem phng php xc nh hot tnh protease cui chng). 2.3.
0

Cch tin hnh

- Chun b 50 ml mi trng trong bnh tam gic 250 ml. em tit trng 121 C trong 30 pht v ngui. - Chun b ng nghim c 10 ml nc ct v khun lm ngui. - Cho 10 ml nc ct v khun v lm ngui ny vo trong ng nghim ging. Dng que thu tinh khuy nh cc t bo v bo t Bacillus sublitis ho ln trong nc. Tt c cc thao tc ny c thc hin trong t cy v trng. - ton b 10 ml dch trong ng nghim ny vo trong bnh tam gic 250 ml c 50 ml mi trng kh trng v ngui. Thao tc ny cng phi c thc hin trong t cy v trng. - t cc bnh tam gic vo my lc c tc 160 - 300 rpm. Nui nhit d phng. - Sau khi nui xong, em ly tm, thu ly dch. Dch thu c gi l ch phm enzym th. 2.4. nh gi cht lng ch phm enzym Ch phm enzym th c xc nh hot tnh enzym chung v hot tnh enzym ring theo nhng phng php xc nh hot tnh emzym c trnh by cui chng ny. III. 3.1. THU NHN CH PHM ENZYME BN TINH KHIT Nguyn tc: Trong nhiu trng hp ng dng, ngi ta dng ch phm enzym th v trong nhiu trng hp ngi ta dng ch phm enzyme bn tinh khit v ch phm enzyme tinh khit.Ch phm bn tinh khit l ch phm trong ngi ta loi ra c nc, cc thnh phm mi trng, snh khi vi sinh vt v cc

81

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

cht ho tan. Trong ch phm ny cn cha 1 lng protein khng hot ng v 1 s thnh phn rt nh khc. thu nhn c ch phm enzyme bn tinh khit (cn gi l ch phm enzyme dng ta), ngi ta thng dng cc tc nhn gy ta protein. Nh vy, thnh phn ta thu c gm c c protein khng hot ng v protein enzyme. Trong protein enzyme cha enzyme ta cn thu nhn v c enzyme khng cn thu nhn. 3.2 Nguyn liu, dng c v ho cht: - Ch phm enzyme th (thu c t nui cy theo phng php b mt v nui cy theo phng php chm). - Cn 96%. - Cc dng c nghin ch phm th, lc. - T lnh. - a, thu tinh, cc thu tinh, phu lc. - L sy. 3.3 Cch tin hnh: 1. kt ta enzyme, ngi ta c th dng cc loi dung mi nh cn, aceton, mui trung tnh (nh ammonium sulpate),....Trong th nghim ny, ta dng cn nh 1 tc nhn to ta v cn d kim v cng cho kt qu rt tt. Cn c gi trong t lnh 40C trc khi lm kt ta enzyme. 2. Ch phm enzyme th t canh trng nui cy theo phng php b mt c nghin mn trong my nghin bi. Nu khng c my nghin bi ngi ta c th gi bng ci, chy s vi s tr gip ca ct thch anh hoc bt thu tinh. Ct thch anh hoc bt thu tinh c ra sch v sy tht kh trc khi s dng, cho vo gi cng vi canh trng nui cy b mt. Ct hay bt thu tinh lm tng kh nng ph v t bo ca vi sinh vt m khng lm thay i bn cht enzyme nn thng s dng trong cc th nghim thu nhn enzyme t canh trng nm si. Sau khi nghin canh trng nui cy b mt, cho vo 1 lng nc gp 4-5 ln khi lng canh trng trn ho tan protein - enzyme t khi canh trng. Tin hnh lc v thu dch lc. Bo qun dch lc trong t lnh 40C. 4. Ly cn t t lnh t t vo dch lc enzyme lm lnh, khuy rt nh cn ho u vi dch enzyme. Sau , hn hp ny vo t lnh. Lng cn dng kt ta enzyme thng gp 2 - 2,5 ln lng dch enzyme. Sau 15 24 gi, hn hp s phn thnh 2 lp. em ly tm hoc lc thu protein enzyme dng ta. Protein - enzyme dng ta ny cn cha nhiu n. Nc
82

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

tn ti trong s lm gim hot tnh enzyme. Do , cn phi loi nc bng cch sy kh nhit < 400C. Khng nn sy nhit cao hn lm nh vy, enzyme rt d mt hot tnh. 3.4. nh gi cht lng ch phm enzyme: Ch phm enzyme bn tinh khit c xc nh hot tnh chung v hot tnh ring theo phng php xc nh hot tnh enzyme trnh by cui chng ny. IV. CC PHNG PHP KIM TRA HOT TNH ENZYME VI SINH VT. 4.1 PHNG PHP KIM TRA HOT TNH AMYLASE Phng php Wolhgemuth: Phng php ny xc nh lng enzyme t nht c th phn gii hon ton lng tinh bt vi cht ch th mu iodine. Mt n v Wolhgemuth l lng enzyme t nht m sau 30pht 300C, khi c ion clrine, c th phn gii 1mg tinh bt n cc sn phm khng to mu vi iodine. Hot tnh ca enzyme c biu din bng s n v Wolhgemuth trn 1ml dch mi trng hoc 1ml dung dch chit enzyme . a. Thit b, vt liu v ho cht: - Bnh tam gic hay bnh cu. - ng nghim. - My ly tm hay my lc . - Pipet t ng. - Dung dch enzyme : nghin cn thn phn mi trng thch c cha vi sinh vt,cn 20 - 100g cho vo bnh tam gic hay bnh cu, thm 500 - 1000ml dung dch NaCl 1%, lc lin tc t 1-2 gi trn my lc nhit phng. Lc hay ly tm thu c dch chit trong sut. Nu mi trng nui cy l dch th, ch cn ly tm sinh khi ri s dng phn cht lng trong sut thu c phn tch. - Dung dch tinh bt 0,1% (R48). - Dung dch NaCl 0,02% (R49). b. Cch tin hnh: Chun b 10 ng nghim, cho vo mi ng 1ml dung dch NaCl 0,1%. Thm vo ng th nht 1 ml enzyme ri lc u, ly 1ml chuyn sang ng th 2, li lc u v ly 1ml chuyn sang ng th 3 ...C th cho n ng th 10. Sau cng, ly 1ml ng th 10 b i. Cho vo mi ng 2ml dung dch tinh bt
83

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

0,1%, lc u, gi 30C trong 30 pht. Lm lnh, cho vo 1 git dung dch iodine 0,02N. Ghi nhn ng c pha long ca dung dch enzyme trong ng th 4, 2 l s mg tinh bt trong mi ng nghim. PHNG PHP KIM TRA HOT TNH PROTEASE 1. Xc nh hot ca ch phm protease t vi sinh vt (phng php anson ci tin) Hot ring ca ch phm c biu din bng n v hot ng thu phn ca ch phm trn 1mmg protein. a. Thit b, vt lu v ho cht - My o mt quang. - My lc ng nghim (vortex mixer). - ng nghim. - Dung dch Na2CO3 6%. - Dung dch acid trichloracetic 5%. - Dung dch hemoglobin bin tnh 2% (R54)hoc dung dch casein2% (R55). - Thuc th Folin - Ciocalteu (R56). - Dung dch tyrosine chun 1 (mol/ml (R57). b. Cch tin hnh: 1. Chun b cc dung dch tyrosine c nng t 0,01 n 0,05 (mol/ ml bng cch pha long dung dch tyrosine chun b 1 (mol/ml vi dung dch HCL 0,2N. Lp th ng chun biu din s ph thuc ca s hp thu theo lng tyrosine (tnh bng ( mol) nh sau: cho 1ml dung dch tyrosine pha long vo cc ng nghim (s ng nghim bng s dung dch tyrosine pha long ), thm 4ml dung dch Na2CO3 6%, lc u, thm 1ml thuc th Folin pha long 5 ln, lc u , 30 pht nhit phng ri em so mu bc sng 750nm. S dng cuvette dy 1cm. 2. Chun b 2 ng nghim sch: ng th nghim v ng kim tra. - Cho vo ng th nghim 2ml dung dch hemoglobin 2% hay casein 2%, yn t 5 - 10 pht dung dch ny t 300C. Cho vo ng 1ml dung dch enzyme c nhit 300C. Gi ng 300C trong 10 pht. Khi ng 10 pht, cho ngay vo 5ml acid trichloracetic 5%, lc u, giu 30 pht 300C . Lc.Ly 1ml dung dch lc cho vo 1 ng nghim khc, thm 4ml dung dch Na2CO3 6%, lc u, thm 1ml thuc th Foliln pha long 5 ln , lc u, 30 pht nhit phng ri em so mu vi bc sng 750nm. S dng cuvette dy 1cm. 4.2

84

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

- i vi ng kim tra: cho vo nghim 2ml dung dch hemoglobin 2% hay casein 2% (s dng dng loi c cht vi ng th nghim), cho 5ml acid trichloracetic 5% vo ngay, lc u ri mi cho 1ml enzyme vo.Tin hnh cc bc tip theo tng t nh trn. Ly hiu s ca gi tr hp th quang gia mu th nghim v mu kim tra , i chiu vi th chun, tnh ra s (mol tyrosine tng ng. Tnh s n v hot ng thu phn (HP) ca 1ml dung dch enzyme em phn tch xc nh hot ng theo cng thc: HP/ml=(s ( mol tyrosine x 8)/t (n v ) Trong , 8 l th tch ton b hn hp phn ng (2ml dung dch c cht, 1ml dung dch enzyme v 5 mldung dch acid trichloracetic), cn t l thi gian enzyme vi c cht (10 pht). Tnh hot thu phn ca ch phm: HP/glucoamylase ch phm = (HP/ml x 1000)/ a (n v) Trong : a - s mg ch phm em phn tch. 2. Phng php chun formol Phng php ny cn c vo s tng ca 1 trong cc nhm carboxyl hay amyl t do trong dung dch thu phn protein. Protein b thu phn cng nhiu th s nhm carrboxyl hay amyltuwj do trong dung dch cng tng. Trong phng php ny, formol c s dng kho cc nhm amyi, cn cc nhm carboxyl c chun bng dung dch kim c nng xc nh. T tnh ra s mg m amyl tng ng trn c s lng kim s dng. Hot ca enzyme c tnh bng s mg m amyl c to thnh sau 1h iu kin nhit v pH thch hp. a. Vt liu, ho cht: - B iu nhit hay m (400C). - Bnh tam gic dung tch 100ml. - Dung dch m c pH thch hp cho hot ng ca enzyme . - Dung dch gelatin 2% (R60). - Hn hp formol (R61). - Dung dch NaOH 0,1 N. b. Cch tin hnh: - Chun b hai bnh tam gic sch dung tch 100ml. - Cho vo bnh th nht (bnh th nghim) 10 ml dung dch gelatin 2% trong dung dch m c pH thch hp, 5 ml dung dch enzyme , lc u, gi

85

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

400C trong 1h trong b iu nhit, ly bnh ra, thm 10 ml hn hp formol v chun bng dung dch NaOH 0,1 N cho n khi xut hin mu xanh da tri. - Cho vo bnh th hai (bnh kim tra) tng t nh trn nhng cho hn hp formol vo vi gelatin, lc u ri mi cho dung dch enzyme vo. iu kin ny, enzyme b kim hm hon ton. Tin hnh chun song song vi bnh th nghim cho n khi xut hin mu xanh da tri. Hot phn gii protein ca 1ml dung dch enzyme c tnh nh sau: H =[(a -b) x 1,42]/t x v n v Trong : a - s ml dung dch NaOH 0,1 N dng chun bnh th nghim; b - s ml dung dch NaOH 0,1 N dng chun bnh kim tra; t - thi gian tc dng enzyme (h); v - th tch dung dch enzyme s dng (ml) ; 1,42 - s mg m amyl tng ng vi 1ml dung dch NaOH 0,1 N . 4.3 PHNG PHP KIM TRA HOT TNH CELULASE Cellulase l enzyme xc tc cho qu trnh chuyn ho Cellulase thnh cc sn phm ho tan. Hai enzyme chnh ca phc h enzyme phn gii Cellulase l enzyme C1 enzyme Cx. 1. Xc nh hot ca cellulase da vo lng ng kh to thnh Tu theo yu cu ca tng th nghim v mc hot ng ca enzyme m c th s dng cc phng php nh lng ng kh khc nhau. Hot ng ca enzyme c tnh bng n v/ml mi trng hoc g ch phm. Mt n v hot ng l lng enzyme phn gii c cht to thnh 1mg glucose sau 1h tc dng nhit 400C, pH = 5,0. a. Ho cht: - ng nghim. - T m hay b iu nhit, 400C. - Dung dch Na - CM - cellulose (3 ml dung dch cha 50mg Na - CM cellulose ). - Si bng hay cellulose . - Dung dch m acetate 0,5 M, pH =5,0. - Dung dch m acetate 0,2 M, pH =5,6. - Mecthilate.

86

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

- Cc thit b, vt liu v ho cht s dng nh lng ng kh theo phng php Nelson. b. Cch tin hnh: Vi enzyme CX: cho 3 ml dung dch c cha 50 mg Na - CM - cellulose vo ng nghim thm 1ml dung dch acetate 0,5 M, pH =5,0 v 1ml dung dch enzyme , nng nhit ln n 400C v gi trong 1 h. Ly ra 1ml cho vo ng nghim kh, sch, thm ngay cc ho cht nh lng ng kh theo phng php Nelson. Tin hnh mu kim tra theo cch tng t, nhng sau khi trn ln enzyme vi c cht, ly ngay 1ml xc nh ng kh. Hot ng enzyme c tnh bng s lng ng kh (tnh theo glucose)gia bnh th nghim v bnh kim tra. T tnh ra n v hot ng ca 1ml dch mi trng hoc 1 g ch phm. Lu : phng php ny s khng chnh xc nu lng c kh to thnh trong 5 ml hn hp phn ng vt qu 0,7mg. Vi enzyme C1: cho vo ng nghim (ng knh khong 3cm) 150mg si bng loi tp cht (hoc100mg cellulose ), thm 5ml dung dch enzyme , 10ml dung dch m acetate 0,2 M pH = 5,6 5ml nc ct. 50ppm mecthiolate, gi 24h 400C trn my lc, ly tm, tch ly glucose cn li. Ly 1ml dch lc nh lng ng kh theo phng php Nelson. Mu kim tra cng c gi cng iu kin nh trn. 2. Xc nh hot cellulose bng cch o ng knh vng thu ngn Khi enzyme cellulase tc dng ln c cht cellulose trong mi trng thch, c cht b phn gii lm cho c ca mi trng b gim i, mi trng tr nn trong sut. trong sut c to ra ca mi trng t l vi hot ng ca enzyme . a. Thit b, vt liu v ho cht: - T m, a Petri.,Na -CM cellulose,Thc o mm, Thch. - Dung dch m citrate phossphate, pH = 5,0. b. Cch tin hnh:Chun b mi trng c cha 2% thch, 0,5% Na -CM - cellulose trong dung dch m citrate phossphate, pH = 5,0ri phn phi vo a Petri. Sau khi thch ng, khot nhng l nh trn mt thch, cho vo 0,1 0,5 ml dung dch enzyme , gi 400C. Sau 24gi, o ng knh phn mi

87

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

trng trong sut ch enzyme tc dng.Biu din hot ca enzyme bng s mm ng knh vng thu phn. V. THU NHN SINH KHI NM MEN BNH M 5.1. Cch thc hin - Chun b 3 ng nghim nc ng c hm lng ng 4%. Tit trng, ngui. Mi ng cha 10ml mi trng. - Dng que cy v trng ly que cy nm men t ng ging chuyn qua cc ng nghim nc ng trn v nui trn my lc c tc quay 160rpm. - Chun b 3 bnh cu y bng dung tch 150ml cha 100ml dung dch mi trng nc ng cha 4% ng b sung 0,15% urea v 0,25%DAP. - Chuyn ton b s dung dch trong tng ng nghim vo cc bnh cu y bng. t cc bnh ny trn my lc c tc vng quay 300rpm. Nui 300C trong thi gian 16-18 gi. - Sau thi gian ny tin hnh kim tra cht lng nm men bnh m. 5.2. Kim tra cht lng nm men bnh m nh gi cht lng nm men bnh m theo cc ch tiu sau : a/ Tng s t bo/ml b/ T l t bo nm men ny chi c/ T l t bo cht/t bo sng d/ Hot tnh enzyme amylase e/ Hot lc lm n bnh Cc ch tiu t a-d c xc nh theo cc phng php trnh by trong cc chng trc v chng 9. Ring ch tiu xc nh hot lc lm n bnh (hay hot lc ln men) c th thc hin theo phng php sau : - Ly tm dch nui cy nm men bnh m, thu nhn sinh khi dng paste - Chun b mt ly nc ng c hm lng ng 10% - To mt vin sinh khi nm men ny c kch thc ging nh mt ht u nnh. - Th vin sinh khi ny vo ly nc ng, xc nh thi gian ban u, thi gian kt thc c tnh khi vin sinh khi ny ni trn dung dch nc ng. - Hot lc lm n bnh cng mnh khi thi gian lm vin sinh khi ni trn b mt dung dch nc ng cng ngn.

88

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

BI 10 : PHNG PHP XC NH TNG VI KHUN HIU KH V COLIFORM


I. XC NH TNG S VI KHUN HIU KH 1.1. Mi trng v ho cht - Mi trng s dng l Plate Count Agar (PCA) c pH 7,0 0,2. Mi trng c pha ch , phn phi vo trong cc bnh thu tinh hay trong cc ng nghim v hp kh trng 1210C trong 15 pht. Cc bnh hoc ng nghim cha mi trng cha s dng c bo qun trong t lnh 2-80C. Trc khi s dng mi trng phi c un chy v lm ngui 450C trong b iu nhit. Ngoi mi trng trn, cn c th s dng c mi trng khc nh Tryptose Glucose Agar, Nutrient Agar. - Dung dch nc mui pepton SPW (Saline Pepton Water) dng pha long cha 8,5g NaCl v 1g pepton trong 100ml nc. Dung dch ny c cha trong cc bnh cha 0,5-1,0 lt, hp kh trng v c phn phi thnh cc th tch chnh xc 9ml vo trong cc ng nghim v trng. 1.2. Quy trnh phn tch 1.2.1. Chun b mu nc trc khi phn tch Trc khi tin hnh phn tch, thc hin vic ng nht mu nh sau : i vi mu dng rn dng cc dng c nh ko, kp c kh trng cn chnh xc 10g (hay 25g) mu vo trong bao PE. Tt c thao tc tip theo cn phi tin hnh trong iu kin v trng. Thm vo lng mu ny 90ml (hay 225ml) dung dch pha long SPW. Thc hin ng nht mu bng my dp mu (stomacher). Thi gian dp mu ph thuc vo tnh cht c l ca mu, nhng khng qu 2,5 pht. Trong trng hp khng c my dp mu thc hin thao tc ng nht mu nh sau : xt nhuyn mu trong iu kin v trng. Cn chnh xc trong iu kin v trng (225ml) nc SPW c hp kh trng. Lc u trong mt thi gian nht nh (t nht l 2 pht). i vi mu dng lng, ht 10ml (hoc 25ml) cho vo bnh tam gic cha 90ml (hay 225ml) nc SPW c hp kh trng, lc u. Sau khi c lm ng nht bng mt trong cc phng php nh trn, dung dch mu thu c c pha long l 10 ln so vi ban u. Dch mu ng nht c tip tc pha long theo dy thp phn bng cch dng pipet v trng (hoc pipetman vi u tp v trng) chuyn 1ml dch mu vo ng nghim cha 9ml dung dch pha long. Trn mu trong ng nghim cho ng nht bng my rung (vortex) hay dng pipet ht o dch mu
89

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

ln xung 5-10 ln. Dung dch mu ny c pha long l 10-2. Sau s dng cng pipet hoc pipetman c u tip chuyn 1ml dch m ny vo ng nghim th 2 cha dung dch pha long v thao tc tng t c dch mu vi pha long 10-3. Tip tc thc hin tng t c cc pha long thp phn theo cho n pha long cn thit. Lu nu pipet hoc u tip pipetman nguy c b nhim trong qu trnh thao tc (chm tay, chm mt ngoi ng nghim, mt ngoi bnh cha...), cn phi thay pipet hoc u tip v trng khc. 1.2.2. Cy mu Chn 2 hay 3 pha long lin tip d kin cha 25-250 t bo vi sinh vt trong 1ml cy ln a petri. Dng pipet v trng hoc pipetman vi u tp v trng chuyn 1ml dch mu pha long chn vo gia a petri v trng. Tng ng vi mi pha long cy t nht 2-3 a (tc l thc hin 2-3 ln lp li). Sau khi cy vo mi a 10-15 ml mi trng PCA c un chy v n nh 450C. Trn u dch mu vi mi trng bng cch xoay trn a petri xui v ngc chiu kim ng h, mi chiu 3-5 ln ngay sau khi mi trng. t cc a trn mt phng ngang cho thch ng c. Lt ngc v cc a trong t m nhit 30 10oC trong 72 gi. Nhit v thi gian c th thay i theo quy nh ca tiu chun. 1.2.3. Cch tnh kt qu m tt c s cc khun lc xut hin trn cc a sau khi . Chn cc a c s m t 25-250 tnh kt qu. Mt tng vi khun hiu kh trong 1g hay 1ml mu c tnh nh sau : A (CFU/g hay CFU/ml) =
N n1Vf1 + ... + nVf i i

Trong : A : s t bo (n v hnh thnh khun lc) vi khun trong 1g hay 1ml mu N : tng s khun lc m c trn cc a chn Ni : s lng a cy ti pha long th i V : th tch dch mu (ml) cy vo trong mi a Fi : pha long tng ng V d : trong 1 trng hp phn tch 1g mu c th nhn c kt qu nh sau : 10-3 10-4 Nng pha long Kt qu a 1 235 26 a 2 246 21 A=
235 + 246 + 26 = 2,4 x105(CFU/g) 2 x1x0, 001 + 1x1x0, 0001 90

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

Cc kt qu tng s vi khun hiu kh thng c biu din di dng s m ca c s thp phn. Trng hp c khun lc vi sinh vt mc loang, mi vt loang c tnh l mt khun lc. Nu s khun lc chim hn 1/3 a th phi ghi nhn iu ny v nh du kt qu nhn c. Nu pha long cao nht, s khun lc m c trn a > 250, v d nng 10-5 s m c ln hn 250, kt qu c ghi : >2,5 x107 CFU/g. Nu pha long thp nht, s khun lc m c trn 1 a < 25, v d nng 10-1 s m nh hn 25, kt qu c ghi : < 2,5 x 102 CFU/g Quy trnh nh lng tng vi khun hiu kh trong thc phm c tm tt Chun b dch ng nht hoc pha loang mu co pha loang 10-1, 10-2, 10-3...

Chon 2 nng pha loang thch hp, chuyn 1ml mu vao a petri v trung (mi nng cy 2 a)

Rot vao mi a 10-15ml mi trng PCA a c lam ngui n 450C, lc cho mu phn tan u vao mi trng , u 300C trong 72 gi

Chon cac a co s khun lac trong khoang 25-250 khun lac /a m

Tnh kt qua : tng vi sinh vt hiu kh trong mu (CFU/g hoc CFU/ml) COLIFORMS V ESCHERICHIA COLI nh ngha Coliforms, Coliforms chu nhit, Coliforms phn v E.coli - Coliforms l nhng trc khun gram m khng sinh bo t, hiu kh hoc k kh tu , c kh nng ln men lactose sinh acid v sinh hi 37oC trong 2448 gi. Trong thc t phn tch, Coliforms cn c nh ngha l cc vi khun c kh nng ln men sinh hi trong khong 48 gi khi c 37oC trong mi trng canh Lauryl Sulphate v canh Brilliant Green Lactose Bile Salt. Nhm
91

II. 2.1.

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

Coliforms c xem l nhm vi sinh vt ch th : s lng hin din ca chng trong thc phm, nc hay cc loi mu mi trng c dng ch th kh nng hin din ca cc vi sinh vt gy bnh khc. Nhiu nghin cu cho thy rng khi s Coliforms ca thc phm cao th kh nng hin din ca cc vi sinh vt gy bnh khc cng cao. Tuy nhin mi quan h gia vi sinh vt gy bnh v vi sinh vt ch th ny vn cn nhiu tranh ci. Nhm Coliforms gm 4 ging l : Escherichia vi 1 loi duy nht l E. coli, Citrobacter, Klebsiella v Enterobacter. Tnh cht sinh ho c trng ca nhm ny c th hin qua cc th nghim Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) v Citrate (iC) thng c gi tm tt chung l IMViC. - Coliforms chu nhit l nhng Coliforms c kh nng ln men lactose sinh hi trong khong thi gian 24 gi khi c 44oC trong mi trng canh EC. - Coliforms phn (Faeceal Coliforms hay E. coli gi nh) l Coliforms chu nhit c kh nng sinh indole khi c khong 24 gi 44,5oC trong canh Trypton. Coliforms phn l mt thnh phn ca h vi sinh rut ng ngi v cc ng vt mu nng khc v c s dng ch th mc v sinh trong qu trnh ch bin, bo qun, vn chuyn thc phm, nc ung cng nh ch th s nhim trong mu mi trng - E. coli l Coliforms phn cho kt qu th nghim IMViC l ++-- (Indol +, Methyl Red +, Voges-Proskauer -, Citrate -). 2.2. nh lng Coliforms, Coliforms chu nhit, Coliforms phn v E. coli bng phng php MPN. 2.2.1. Nguyn tc : S lng Coliforms, Coliforms chu nhit, Coliforms phn v E. coli trong mu nc, thc phm cha mt thp ca nhm vi khun ny c th c xc nh bng phng php MPN (Most Probale Number). Phng php ny da vo nguyn tc mu c pha long thnh mt dy thp phn (hai nng k tip nhau khc nhau 10 ln); 3 hoc 5 mu c pha long thp phn lin tip c trong ng nghim cha mi trng thch hp c ng by kh Durham. Mi nng pha long c t 3 n 5 ng lp li. Theo di s sinh hi v i mu nh tnh s hin din trong tng ng th nghim ; y l cc ng dng tnh. Ghi nhn s ng nghim cho phn ng dng tnh mi nng pha long v da vo bng MPN suy ra s lng vi sinh vt tng ng hin din trong 1g (hoc 1ml) mu ban u.

92

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

2.2.2. Mi trng v ho cht - Mi trng lng Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate) - Mi trng lng Brilliant Green Lactoase Bila Salt (canh BGBL) - Mi trng lng E. coli (E. coli medium, canh EC) Cc mi trng lng trn c chun b trong cc ng nghim cha ng Durham p ngc. Sau khi kh trng, ch th s dng cc ng nghim khng c bt kh bn trong ng Durham. - Canh Tryptone - Mi trng rn Simmon Citrate Agar (Thch simmon Citrate) - Dung dch nc mui pepton SPW (Saline Pepton Water) - Thuc kh Kovacs - Canh MR-VP - Thuc th Methyl Red - Thuc th a-napthol 2.2.3. Quy trnh phn tch Chun b ng nht mu hoc pha long mu c dch mu c pha long -1 10 . a. nh lng Coliforms Tun t cy 1ml dch mu pha long 10-1 vo 3 ng nghim ging nhau, mi ng cha 10ml canh LSB. Thc hin tng t vi dch mu pha long 10-2 v 10-3. y l trng hp xc nh MPN bng h s 3 nng v 3 ng nghim lp li (h 3 x 3 hay 9 ng nghim). Nu nghi ng s lng Coliforms trong mu qu cao, phi s dng cc mu c pha long cao hn. cc ng nghim 370C trong 48 gi. Ghi nhn : ng c sinh hi. Dng que cy vng (khuyn cy) cy chuyn dch mu cc ng LSB (+) sang cc ng cha canh BGBL v 370C trong 48 gi. Ghi nhn s ng cho kt qu (+) (c sinh hi) ng vi mi pha long. b. nh lng Coliforms chu nhit Dng que cy vng chuyn mt vng dch mu t cc ng canh LSB sang mi trng canh EC, 44,50C 0,20C trong 24 gi. m s lng cc ng cho kt qu (+) (sinh hi) mi pha long. c. nh lng Coliforms phn Dng que cy vng ria dch mu t cc ng (+) trn mi trng canh EC sang mi trng thch a EMB. cc a ny 370C trong 24 gi. Cc khun lc trn, dt hnh a v c nh kim tm l khun lc ca Coliforms phn hay E. coli gi nh. Chn khun lc ng knh ln hn1mm v cy vo canh Trypton,
93

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

44,5 0,2oC trong 24 gi. Nh thuc th Kovacs vo cc ng nghim. ng nghim c s xut hin mu trong mi trng trong vi pht l ng (+). Thc hin tng t cho cc ng (-) trn mi trng EC. Ghi nhn s lng cc ng cho kt qu (+) trn mi trng Trypton tng ng vi mi pha long. d. nh lng E.coli Trc tin thc hin tng t nh trng hp nh lng Coliforms phn nh trn. Dng que cy vng ria dch mu t cc ng (+) trn mi trng canh EC sang mi trng thch a EMB. cc a ny 370C trong 24 gi tm cc khun lc E. coli gi nh (trn, dt hnh a v c nh kim tm). Chn khun lc ng knh ln hn 1mm v c vo cc mi trng MRVP, Simmom Citrate Aga thc hin cc th nghim IMViC. Khun lc E.coli gi nh cho kt qu th nghim IMViC tun t l ++-- chnh l E. coli. ng nghim cho kt qu (+) trong mi trng EC v khun lc E.coli gi nh trn mi trng EMB cho kt qu th nghim IMViC nh trn l ng nghim E.coli (+). Thc hin tng t cho tt c cc ng nghim cho kt qa (+) trong mi trng EC v to c khun lc E.coli gi nh trn mi trng EMB. Ghi nhn s lng cc ng nghim c E.coli (+) mi pha long ca mu. 2.2.4. Cch c kt qu tt c cc trng hp nu trn, t s lng cc ng nghim c E.coli (+) mi pha long ca mu dng bng MPN thch hp (bng 3x3 tc 9 ng nghim) tnh ra mt vi sinh vt trong mu v biu din di dng tr s MPN/g hay MPN/ml mu ban u cha pha long. 2.3. nh lng Coliforms, Coliforms phn bng phng php m khun lc 2.3.1. Nguyn tc Mu c ng nht ho c cy mt lng nht nh ln mi trng thch chn lc thch hp cha lactose. m s khun lc ln men lactose v sinh acid sau khi 37 10C trong 24-48 gi. Ngoi lactose mi trng chn lc cho Coliforms cn cha mui mt c ch vi khun gram dng v cht ch th pH nh neutra red, crystal violet. Trn mi trng ny khun lc Coliforms c mu n mu m, ng knh ln hn 0,5mm, xung quanh khun lc c vng ta ca mui mt. Vic khng nh c thc hin bng cch nui cy trn mi trng canh chn lc nh BGBL. nh lng Coliforms phn, thc hin tng t nhng thay i nhit l 440C. Mt Coliforms hay Coliforms phn c tnh da trn s lng khun lc in hnh m c, t l khng nh v pha long mu trc khi cy vo a.
94

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

pht hin c b phn t bo Coliforms b tn thng hay b gim sc sng do qu trnh ch bin hay bo qun thc phm, b phn ny c th khng tng trng c trong mi trng chn lc, trc tin mu c cy vo trong mi trng khng chn lc nh TSA, trc khi b sung mi trng chn lc. 2.3.2. Mi trng v ho cht - Mi trng Trypton Soya Agar (TSA) c chun b trong cc bnh hay chai thu tinh, hp kh trng v bo qun 4-80C. Trc khi s dng mi trng c un chy v lm ngui 450C trong b iu nhit. - Violet Red Bile Agar (VRB) c chun b trong cc chai thu tinh, c un chy v lm ngui 450C trong b iu nhit trc khi s dng. C th s dng mi trng Desoxycholate Agar thay cho VRB. - Mi trng canh Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) c phn phi 10ml vo mi ng nghim v trng cha mt ng durham p ngc. Hp kh trng. Sau khi hp kim tra cc ng m bo khng c bt kh trong ng durham. - Mi trng canh EC Broth c chun b tng t nh trng hp mi trng BGBL. - Mi trng canh Trypton Broth c phn phi 5ml vo mi ng nghim hp kh trng. - Thuc th Kovacs hay Indol 2.3.3. Quy trnh phn tch Mu c ng nht ho v pha long tng t nh phn nh lng tng s vi khun hiu kh sao cho cha <100 t bo Coliforms trong 1ml dung dch pha long. Chuyn 1ml dch pha long mu chn vo a petri. B sung vo mi a cy mu khong 5ml mi trng TSA c un chy v n nh trong b iu nhit 450C. Lc trn a petri xui v ngc chiu kim ng h, mi chiu 3-5 ln trn u dch mu vi mi trng. nhit phng trong 1-2 gi hi phc cc t bo b tn thng. B sung vo mi a 1015ml mi trng thch VRB nhit 450C ln trn mi trng TSA. Ch cho mi trng trong a ng c, lt ngc a v 37o 10C trong 24 -48 gi. Thc hin trn mu 2 nng pha long lin tip sao cho mi a s xut hin t 10-100 khun lc v lp li t nht 2 a ng vi nng pha long. - Th nghim khng nh Coliforms Trong trng hp mu c cha cc ngun carbon khc khng phi lactose, trnh cc trng hp vi sinh vt s dng cc ngun carbon trong
95

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

mu ln men v to khun lc c hnh dng tng t Coliforms cn thc hin thm bc khng nh nh sau : chn t nht 5 khun lc nghi ng, dng que cy vng cy chuyn sang cc ng nghim cha mi trng BGBL (trng hp khng nh Coliforms tng s) hoc mi trng EC (trng hp khng nh Coliforms phn). cc ng BGBL 37 10C v cc ng EC 440C trong 2448 gi. Kt qu khng nh l (+) khi vi khun tng lm c mi trng v sinh hi trong ng Durham. Tnh t l khng nh l t s gia s khun lc cho kt qu (+) vi s khun lc c dng trong th nghim khng nh Coliforms phn, cc khun lc cho kt qu (+) trn EC cn c thc hin th nghim indol 440C. Th nghim khng nh Coliforms phn ch c xem l (+)trn th nghim Indol. 2.3.4. Cch tnh kt qu D vo s khun lc m c v t l khng nh, tnh mt ca Coliforms v Coliforms phn theo cng thc sau : A (CFU/g hay CFU/ml) =
N xR n1Vf1 + ... + nVf i i

Trong : A : s t bo (n v hnh thnh khun lc) vi khun trong 1g hay 1ml mu N : tng s khun lc m c Ni : s lng a c s khun lc c chn ti mi pha long V : dung dch mu (ml) cy vo trong mi a Fi : pha long c s khun lc c chn ti cc a m R : t l khng nh 2.4. nh lng E.coli bng phng php m khun lc

2.4.1. Nguyn tc Mu c ng nht ho c cy mt lng nht nh ln mi trng thch chn lc thch hp cha lactose, 440C trong 24 gi, m cc khun lc c hnh c trng ca Coliforms. Khng nh cc khun lc m l E.coli bng cc th nghim IMViC.

96

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

2.4.2. Mi trng ho cht - Mi trng canh Trypton Soya Agar (VRB) c chun b tng t phn nh lng Coliforms - Mi trng canh Escherichia coli Broth (EC Broth) c phn phi 10ml trong mi ng nghim cha ng Durham p ngc, hp kh trng ngui v kim tra khng c s hin din ca bt kh trong ng Durham. Cc ng EC ny c bo qun 2-80C cho n khi s dng . - Mi trng canh Lactose Trypton Lauryl Sulphate Broth (LST Broth) c chun b tng t nh mi trng canh EC. - Mi trng canh Trypton Broth c chun b tng t phn nh lng Coliforms. - Mi trng canh MR-VP Broth c phn phi 5ml vo mi ng nghim, hp kh trng, ngui v bo qun 80C cho n khi s dng. - Mi trng thch Simmon Citrate c chun b di dng cc ng thch nghing c mu xanh lc. - Thuc th Kovacs. 2.4.3. Quy trnh phn tch. Mu c ng nht, pha long v nh lng tng t nh phn Coliforms phn vi bc khng nh c tin hnh nh sau: chn 5 khun lc nghi ng, dng que cy vng cy chuyn sang mi trng canh EC, 44 0,5oC trong 24 gi. Chn cc ng cho kt qu (+) (sinh hi) v dng que cy vng cy chuyn sang cc mi trng sau: canh trypton, canh MR-VP, thch simmon Citrate. cc mi trng trn 44 0,5oC trong 24 gi. Thc hin th nghim Indol, Mrthyl Red, Voges Proskauer, Citrate (xem chng IV). Ghi nhn s khun lc cho th nghim khng nh E.coli (+) (IMViC l + + - -). 2.4.4. Cch tnh kt qu. Tnh t l khng nh v tnh mt E.coli (CFU/ml hay CFU/mg) theo cng thc tng t trn.

97

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

Tm tt cc bc ca qui trnh nh lng cc loi Coliforms v E.Coli. Chun b dch ng nht hoc pha loang co pha loang 10-1 , 10-2 , 10-3 ...

Chuyn 1ml dung dch 10-1 , 10-2 , 10-3 vao ng 10ml canh LSB, mi nng 3 ng lp lai, u 370C

Ghinhn cac ng LSB (+) mi nng pha loang

Cy vao ng canh BGBL, u 37 10C , 48 gi

Cy vao ng canh EC, u 44,5 0,20C , 24 gi

S ng (+) mi pha loang

S ng (+) mi pha loang Cy ln thach EMB, u 370C , 24 gi

Chon khun lac in hnh, cy vao canh Trypton, u 44,5 0,20C , 24 gi Th nghim Indol m s ng canh EC (+) va Indol (+), tra bang Coliforms Coliforms chu nhit Coliforms phn

Chon khun lac in hnh, cy vao canh Trypton, MRVP, SC Citrate u 44,5 0,20C , 24 gi Th nghim IMViC m s ng canh EC (+) va IMViC ++--, tra bang E.Coli

98

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

Chun b dch ng nht hoc pha loang co pha loang 10-1 , 10-2 , 10-3 ...

Cy 1ml dung dch mu vao a petri, b sung 5ml mi trng TSA, lc u, yn 1-2 gi
Rot vao mi a 10-15ml mi trng thach VRB, ng, u 370C trong 24 -48 gi.

m cac khun lac mau o n o m, co vong tua mui mt, ng knh

Cy vao ng canh BGBL, u 370C , 24 - 48gi m s ng canh (+) (sinh hi); tnh ty l khng nh Mt Coliforms Th nghim Indol

Cy vao ng canh EC, u 440C , 24 - 48gi Chon ng canh (+) (sinh hi) Cy vao ng canh Trypton, MR-VP, thach SC Citrate, u 440C , 24gi Th nghim IMViC m s ng canh EC(+) va IMViC ++--, tnh ty l khng nh E.coli nhColiforms Mt E.Coli

m s ng canh (+) (sinh hi); tnh ty l khng nh Mt Coliforms phn

Quy trnh nh lng Coliforms, Coliforms chu nhit, Coliforms phn va E. coli bng phng phap m khun lac

99

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

XC NH TNG NM MEN, NM MC nh ngha v nguyn tc Nm men v nm mc l nhm vi sinh vt rt a dng, cho n nay c hn 400.000 loi nm men v nm mc c m t. y l nhm vi sinh vt nhn tht, c vch t bo l lp v chitin, c nhn v cc bo quan khc. Tt c cc loi men v mc u thuc nhm vi sinh vt d dng, chng cn ngun carbon hu c cung cp nng lng t mi trng bn ngoi. V th vi sinh vt ny thng xuyn c phn lp t thc phm hay cc ngun giu dinh dng khc. C th phn bit c nm men v nm mc theo khi nim n gin nh sau: nm mc l vi nm dng si, sinh sn bng bo t hay khun ty; nm men l nhng t bo n tnh pht trin theo kiu ny chi, thnh thong c th tn ti dng khun ty gi trong cc t bo kt nhau thnh chui. n v hnh thnh khun lc ca nm mc v nm men l mm to nn 1 khun lc khi nui cy trong mi trng. Mm c th l 1 bo t , 1 t bo hay 1 on ca khun ty. Qu trnh tng trng ca nm men v nm mc ph thuc vo rt nhiu yu t t mi trng. Hu ht nm mc, nm men u thuc nhm vi sinh vt a mt, nhit thch hp cho s pht trin ca chng trong khong 20 280C, 1 s t trong s ny a lnh hay a nng. Nc hot tnh cng l nhn t nh hng rt quan trng n tng trng. Hu ht cc loi nm men v nm mc pht trin tt trong c cht c nc hot tnh khong 85% hay ln hn, 1 s t loi c th tng trng trong c cht c nc hot tnh thp hn khong 60 70%. Nm mc v nm men tng trng c vng pH t 2 9, trong pH thch hp nht nm trong khong 4 6,5. Hu ht nm mc , nm men u thuc nhm hiu kh bt buc, 1 s c th pht trin trong iu kin vi hiu kh. Mt s c th tip nhn oxy nguyn t t c cht ca chng nhng d dng no , oxy vn l nguyn t cn thit cho qu trnh pht trin ca nm men v nm mc. Trong thc phm, nm men v nm mc hin din c th tng trng lm thay i mu ca thc phm, 1 s c th to c t gy ng c thc phm. Mt nm men v nm mc trong mu c xc nh chung di dng tng nm men nm mc bng k thut pha long, tri v khun lc trn mi trng Dichloran Glycerol Agar (DG18)hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC). Mi trng DG18 c s dng cho cc loi mu thc phm c hm lng nc thp nh cc loi thc phm kh, go, ng cc, tiu, cc loi thc c du, c hm lng ng hay mui cao. Mi trng
100

IV. 4.1.

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

DRBC c s dng cho cc mu c hm lng nc cao nh sa v cc sn phm ca sa, cc loi rau qu v tri cy ti, cc loi hp....i vi mu c mt nm mc thp, v d nh m phm, mi trng c s dng l mi trng Malt Extract Agar (MEA) hay Potato Dextrose Agar (PDA) cha 40ppm Chloramphenicol hay chlotetracyline. 4.2. Mi trng v ho cht - Dung dch pha long (nc pepton 1%) - Mi trng thch Dichloran Rose Bengal Chlorampleicol Agar (DBRC) - Mi trng thch Malt Extract Agar (MEA) - Mi trng thch Potato Dextrose Agar (PDA) - .Mi trng thch Sabouraud Dextrose Agar (SDA) - Mi trng canh Sabouraud Dextrose Agar (SDB) Cc loi mi trng thch c chun b trong a petri, lm kh b mt trong iu kn v trng, trnh nh sng trc khi s dng.Mi trng thch Sabouraud Dextrose Agar cn c chun b di dng cc ng thch nghing. 4.3. Quy trnh phn tch nh tnh i vi mu c nguy c nhim v mt nhim nm mc qu thp, vic phn tch thng c hin 1 cch nh tnh theo quy trnh nh sau: Mu c pha long 10-1 v ng nht trong mi trng SDB. Dch ng nht c 300C, theo di tng ngy n 7 ngy. Nu trong canh trng c s xut hin ca nm mc, tin hnh chuyn ln cc a thch SDA, MEA hay PDA, 300C trong 7 ngy. Cc khun lc nm mc xut hin trn cc a mi trng ny c cy chuyn ln b mt ng thch nghing SDA nh danh khi cn thit. 4.4. Quy trnh phn tch nh lng Cn 10g mu trong ti PE v trng, b sung 90ml dung dch pha long. Trng hp mu dng kh, ngm mu trong dung dch khong 30 pht trc khi ng nht mu. Mu c ng nht bng my dp mu trong 2 pht v c pha long thnh cc dy nng thp phn lin tip thch hp. Ht v trng 0,1ml dch mu ln cc a mi trng DBRC hoc DG18. Nu mt trong nm men v nm mc thp, c th cy 1ml mu. Dng que gt thu tinh tri dch mu u trn b mt a mi trng cho n kh. t nga a trong bao nylon, h ming bao, nhit 250C trong 5-7 ngy. a c t nga to m cho s pht trin ca nm men mc v hn ch lm kh thch. Thc hin 3 a cho mi nng pha long. m v s lng khun lc nm mc v nm men trn tt c cc a cy. Khi cn thit phi quan st bng knh hin vi soi ni hay knh lp phn bit khun lc nm men hay nm mc. Kt
101

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

qu c gghi bng n v CPU/g. Nu c yu cu phn loi hay nh danh cc loi nghi ng sinh c t, cc khun lc nm mc c cy chuyn vo trong cc ng thch nghing SDA gi n cc phng th nghim chuyn nh danh v phn loi nm. Cn lu rng trong thi gian nm mc c th to bo t v pht tn vo trong mi trng nui cy to nn cc khun lc mi. hn ch hin tng ny, trong sut thi gian , khng c chm tay hoc di chuyn cc a cho n khi m kt qu. Mt khc, khi tin hnh m khun lc cn hn ch vic m a hn ch s pht tn ca bo t vo trong khng kh, gy nhim vo trong mu hay mi trng nui cy khc. i vi m phm, vic nh lng c thc hin trn cc a mi trng. Mi trng thch MEA hay thch PDA. Cc a c 300 C trong 7 ngy trc khi tin hnh m ring l s khun lc nm men, nm mc xut hin trn a.
ng nht mu trong SDB thanh pha loang 10-1 u 300C, 1 - 7 ngay

Cy canh trng co mc moc ln a SDA, MEA, hay PDA, u 300C trong 7 ngay

Kt lun: co/ khng co nm mc

Quy trnh nh tnh nm mc

102

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

ng nht va pha loang mu thanh cac pha loang 10-1, 10-2, 10-3 Mu thc phm Trai 0,1ml mu ln a DRBC hoc DG18, u nga a 250C, 5-7 ngay Mu my phm Trai 0,1ml mu ln a MEA hocPDA, u nga a 300C, 7 ngay

m khun lac nm mc, nm men, tnh mt (CPU/g)

Cy ln ng thach nghing SDA, u 300C, 7 ngay

nh danh

Quy trnh nh lng tng nm men nm mc

103

Th nghim vi sinh vt hc

ThS.L Xun Phng

BI 1 : THC HNH LM MI TRNG DINH DNG.........................................33 BI 2 : CC PHNG PHP PHN LP VI SINH VT .............................................. 37 BI 3 : CC PHNG PHP NUI CY V BO QUN VI SINH VT ................. 42 BI 4 : CC PHNG PHP NHUM MU V QUAN ST HNH THI VI SINH VT.......................................................................................................................................... 50 BI 5 : CC PHNG PHP XC NH S LNG ..................................................57 T BO VI SINH VT ......................................................................................................... 57 BI 6 : XC NH KH NNG PHN GII CC CHT HU C KHNG CHA NIT CA VSV ..................................................................................................................... 66 BI 7 : XC NH KH NNG PHN GII CC CHT HU C CHA NIT CA VI SINH VT................................................................................................................ 74 BI 8 : PHNG PHP XC NH KH NNG TO SN PHM BC HAI VI SINH VT ............................................................................................................................... 77 BI 9 : PHNG PHP THU NHN V XC NH HOT TNH ENZYM T VI SINH VT ............................................................................................................................... 79 BI 10 : PHNG PHP XC NH TNG VI KHUN HIU KH V COLIFORM .................................................................................................................................................. 89

104

You might also like