XC NH HOT CA PROTEINASE THEO PHNG PHP ANSON CI TIN

1.Nguyn tc
Phng php ny da vo s thy phn protein (cazein hoc

hemoglobin) bi enzyme. Sau bt hot enzym v kt ta protein cha b thy phn bng acid tricloroacetic. nh lng sn phm c to thnh trong phn ng bng phn ng mu vi thuc th Folin, kt qu phn tch da vo th chun tyrosin.
n v hot proteinase l lng enzym trong mt pht 30oC

chuyn ha c mt lng cazein tng ng vi 1mol tyrosin bng. 2.Tin hnh 2.1. Thc hin phn ng thy phn Chun b 2 ng nghim sch, ng th nghim v ng kim tra.
Trc khi tin hnh phn ng thy phn, dung dch c cht v dung dch

enzym u phi a n 30oC i vi ng th nghim:

1. Cho vo mi ng nghim 2ml dung dch c cht (300C) 2. Tip tc cho thm 1 ml dung dch enzyme (300C) vo ng nghim c c

cht v gi 300C 10 pht phn ng thy phn xy ra. 3. Kt thc phn ng bng cch cho 5ml dung dch tricloacetic 5% vo ( bt hot enzym v kt ta c cht khng c thy phn), lc u, 4. yn nhit phng trong 10 pht. 5. Lc tch kt ta va thu dung dch trong sut. Dung dch thu c dng lm phn ng mu vi thuc th Folin. ng kim tra (mu trng)
1. Cho 1 ml dung dch enzyme (300C) vo ng nghim.

2. Cho 5ml dung dch tricloacetic 5% vo, lc u ( bt hot enzyme)

3. Tip tc cho ng nghim 2ml dung dch c cht (300C) v gi nhit

300C (trong ni cch thy) 10 pht. 4. yn nhit phng 10 pht. 5. Lc thu dch trong lm phn ng mu vi thuc th Folin 2.2. Phn ng to mu

1. Cho 1ml dch lc trong vo ng nghim.

2. Tip tc cho 4ml Na2CO3 6%, lc u.

3. Cho thm 1ml thuc th Folin 0,2N lc u. 4. Gi 30 pht trong nhit phng. 5. So mu trn my quang ph bc sng 750nm. 3. Tnh kt qu: Ly s liu c trn my ca mu th nghim v mu kim tra Da vo phng trnh ng chun tyrosin tnh lng mol tyrosin tng ng. Tnh s n v hot ng proteolitic ca 1ml dung dch enzyme theo cng thc
HP/ml = mol tyrosin* 8 t

8: Th tch ton b hn hp phn ng t: Thi gian enzym tc dng vi c cht Ha cht - Dung dch casein 2% Ha tan 2g cazein 100ml dung dch m Sorensen pH 7,6. un trn bp in cho n khi ha tan hon ton. Dung dch m Sorensen c pH 7,6 c pha nh sau (pha 1000 ml):

Cho 818ml dung dch Na2HPO4 1/15M (cn 23,9 g Na2HPO4.12H2O ha tan trong nc ct v dn nc n vch ca bnh nh mc 1000ml) v 182ml dung dch KH2PO4 1/15(cn 9,07g KH2PO4 ha tan trong nc ct v dn nc n vch ca bnh nh mc 1000ml) vo trong l ng ha cht c th tch 1000ml. Sau iu chnh c pH 7,6 bng my o pH. Chun b bnh cu y trn 2 lt v ng sinh hn c bu. Cho vo bnh 100g Natri Wolframat (Na2WO4.2H2O), 25g natri molypdat (Na2MO4.2H2O), 50ml dung dch acid phosphoric (H3PO4) 85% v 100ml HCl m c v 700ml nc ct. Lp ng sinh hn v m nc lm ngui ng sinh hn, un si 10 gi. Sau khi un si xong, tip tc cho vo bnh cu 150g Li2SO4, 50ml nc ct, un cho n tan.

- Dung dch Folin- Ciocalteau (1N):

ngui nhit phng.

 Cho thm vi git Brm (Thao tc trong t ht trnh hi brm bay vo ngi) Tip tc un si loi b brm tha (dung dch thu c c my vng) Lm ngui v thm nc ct c 1000ml dung dch. Bo qun kn trong l ti mu.

Trong thi gian bo qun, nu dung dch ng sang mu xanh th cho vo dung dch vi git brm v un li c dung dch mu vng.

- Dung dch Na2CO3 6% - Dung dch acid tricloacetic 5% Dng ng chun tyrosin Pha dung dch gc tyrosin c nng 10-3M (1mol/ml): cn 18,12 mg tyrosin tinh khit, ha tan trong dung dch HCl 0,2N ri cho vo bnh nh mc n 100ml v cho HCl 0,2N cho n vch bnh nh mc T dung dch gc pha thnh dy nng dung dch nh sau: Dung dch gc 0,1 (ml) HCl 0,2N(ml) 4,9 Nng tyrosin 0,02 (mol/ml) 0,2 4,8 0,04 0,4 4,6 0,08 0,6 4,4 0,12 0,8 4,2 0,16 1,0 4 0,20 1,5 3,5 0,30

Ly mi dung dch trn 1ml cho vo 7 ng nghim v cho thm vo mi ng nghim 5ml dung dch Na2CO3 6% v 1ml dung dch Folin 0,2N (Pha long dung dch 1N chun b trn 5 ln), lc u, sau yn nhit phng 10 pht. Mu i chng: thay 1ml dung dch tyrosin bng 1 ml nc ct. o trn my so mu bc sng 750nm. Dng ng chun tyrosin vi trc honh l nng tyrosin v trc tung l mt quang (OD: Optical Density)