Quy trnh chuyn gen khng su bnh trn cy ci ngt

Phm Th Sng

LI M U Ci ngt l mt loi rau c s dng rt nhiu trong i sng bi v thnh phn dinh dng trong ci ngt kh cao, c bit l thnh phn dip hong t v vitamin K. Ngoi ra, ci xanh cn c rt nhiu vitamin A, B, C, D, cht caroten, anbumin, a-xit nicotic... Nhng nm gn y, an ton thc phm ang l vn c x hi quan tm. Phn ln v ng c u do an ton thc phm khng c m bo. Nhng mun c c thc phm an ton th t khu sn xut nguyn liu, thu hoch cho n bo qun, ch bin v lu thng phn phi phi tun theo cc quy trnh k thut, cng ngh nht nh. Trong thc t sn xut hin nay, nhiu nng dn lm dng phn ha hc v cc loi nng dc nn tn nhiu chi ph sn xut v gy nh hng khng nh n mi trng, s a dng sinh hc v cn bng sinh thi b ph v. V th, xy dng mt nn nng nghip bn vng l mt vic c ngha chin lc trong cng cuc pht trin chung ca t nc, c bit vi v tr quan trng ca khu vc nng thn trong s nghip pht trin kinh t x hi ca nc ta hin nay. Khi khoa hc v k thut pht trin pht trin th mt phng php mang li nhiu hiu qu l s dng cng ngh gen. Cng ngh gen co php a gen c li vo thc vt nhm to ra nhng loi cy trng mang li nhng tnh trng m ta mong mun m y l cy ci ngt c mang gen khng su bnh nhm hn ch vic s dng thuc tr su nhm m bo ngun thc phm an ton v gim nhim mi trng. Phng php s dng vi khun Agrobacterium tumefaciens theo hng dng vi khun chuyn np to ra cy ci ngt chuyn gen p ng nhu cu hin nay.

-1-

Quy trnh chuyn gen khng su bnh trn cy ci ngt

Phm Th Sng

I. KHI QUT V CY CI NGT I.1. C IM V THNH PHN DINH DNG Ci ngt thuc h Brassicaceae rt giu cht dinh dng. Trong 100 g ci c cha: 1,1 g protein; 0,2 lipit; 2,1 g cacbohidrat; 61 mg canxi; 37 mg photpho; 0,5 mg st; 0,01 mg caroten; 0,02 thiamin (B1); 0,04 mg ribopalavin (B2); 0,3 mg niaxin (B3); 20 mg axit ascorbic (C). Ci ngt c nhn bit do mu l xanh nht v c hoa nh mu vng v v c coi l mt trong nhng loi rau ngon nht trong h ci pak choy. Chiu cao ca cy t 20 30 cm. L hnh van mang mu xanh nht hoc xanh thm. Cy bt u c hoa khi c t 7 n 8 l. R chm su khong 12 cm v c bn knh 12 cm. ng knh chum l khong t 15 n 45 cm. c trng quanh nm, v chnh l ng xun, thi gian sinh trng 35 - 45 ngy. I.2. CNG DNG CY CI NGT Theo ng y, ci ngt tnh n, c cng dng thng li trng v, lm tc ngc, tiu thc h kh... c th dng cha cc chng ho, to bn, n nhiu gip cho vic phng nga bnh tr v ung th rut kt v cng gip chng suy nhc thn kinh, gim au nhc phng chng cc bnh ung th, tim mch v nhiu loi bnh khc. Ci c nhiu cng dng rt tt nh c tc dng ngn nga ung th gan v kt hp iu tr bnh ung th v x cng gan. I.3. TNH HNH RAU CI NGT HIN NAY Ci ngt l rau ngn ngy c th trng quanh nm, khng cn vn nhiu m tiu th d dng. Tuy nhin, ci ngt, ci xanh li d gy ng c nht cho ngi tiu dng bi nhiu su bnh hi kh tr, thi gian sinh trng ngn m phn ln cc thuc ha hc li c thi gian cch ly di trong khi thuc vi sinh v iu ha sinh trng km tc dng vi mt s su. Hn na, nng dn ha phn m ti nhiu ln cy sinh trng nhanh.

-2-

Quy trnh chuyn gen khng su bnh trn cy ci ngt

Phm Th Sng

chnh l nguyn nhn khin d lng thuc tr su v d lng nitrat thng cao 2 chng loi rau ny v dn n tnh trng ng c cho ngi tiu dng. Ngy nay, rau ci ngt ngy cng c trng ph bin v cho thu nhp kh cao. Do vy nng dn sn xut rau dng mt cch nng cao nng xut cy trng ny. V ng dng cng ngh gen l bin php thng minh v bn vng. nhm gip cay trng chng li su bnh m cn m bo c an ton thc phm II. QUY TRNH CHUYN GEN VO VI KHUN II.1 VT LIU DNG CHUYN GEN II.1.1. Chng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 Agrobacterium tumefaciens l vi khun gy bnh gh khi u trn cy, pht sinh ung th, to ra kt qu trc tip hnh thnh khi u tng hp ra mt loi dinh dng c bit gip cho vi khun pht trin. Gen Agrobacterium l nhm genus c tnh cht sinh sn trong t, gram m, cng h vi Rhizobium. C bn species c ghi nhn. Agrobacterium tumefaciens to ra khi u trong t bo tumor cha c phn ha v cha c t chc. mt vi dng ca Agrobacterium tumefaciens khng to khi u nhng kch thch s tng trng ca teratomas (th d thng, khc thng). tuy nhin thc vt thuc n t dip t ra khng i vi Agrobacterium, ch tr mt vi loi ca Asparagus. Kh nng chuyn DNA ca Agrobacterium tumefaciens c s dng trong cng nghip gen hin i.

Vi khun Agrobacterium tumefaciens. a: Di knh hin vi in t. -3-

Quy trnh chuyn gen khng su bnh trn cy ci ngt

Phm Th Sng

I.I.3. Plasmid pCAMBIA 3301, Plasmid pUbi.cryIA(b) v Plasmid pUbi.cryIA(c) Plasmid pCAMBIA 3301 c di l 12Kb cha gen gusA v gen bar. Plasmid pUbi.cryIA(b) v Plasmid pUbi.cryIA(c) c cha gen cryA c di 4 kb hai u c v tr ct ca enzyme hin III

Plasmid pCAMBIA II.2. QUY TRNH CHUYN PLASMID VO VI KHUN II.2.1 To plasmid S dng enzyme hind III . Enzyme hind III l mt loi endonuclease Cu trc ca HindIII l kh phc tp, v bao gm homodimer mt. Ging nh endonucleases loi khc hn ch II, c cho l cha mt li ph bin cu trc bao gm bn -t v mt -xon . Tiu n v cha 300 axit amin v khi lng phn t d on l 34.950 Da. Mc d tm quan trng ca enzyme ny trong sinh hc phn t v cng ngh DNA. Tuy nhin, ngi ta

-4-

Quy trnh chuyn gen khng su bnh trn cy ci ngt

Phm Th Sng

tin rng HindIII s dng mt c ch chung ca cng nhn v xc tc ca DNA c tm thy trong cc loi enzyme nh EcoRI , Bam HI , v mc BGL II . Khng ging nh hu ht cc endonucleases loi ti liu hn ch, HindIII l duy nht ch n hot ng km khi khng c xc tc khi Mg 2 +. V tr ct ca hind III:

Hinh III ct ti u hind III ca chui plasmid pCAMBIA 3301 v ct plasmid pUbi.cryIA(b) v plasmid pUbi.cryIA(c) sau plasmid pCAMBIA 3301 b ct hai u m ra v c x l bi Alikaline phosphate chng khng ni li vi nhau. Cn plasmid pUbi.cryIA do c hai v tr ct to nn hai on 6Kb tng ng vi thn v 4Kb tng ng vi on gen cryIA Sau tin hnh ni 2 on DNA plasmid pCAMBIA 3301 12kb v on gen cryIA 4kb vi nhau bi enzyme ligase nhit 4oC trong 16 gi th to ra plasmid mi l plasmid pITB-CRY (Institute of Tropical Biology) di 16kb. Nhn dng vector nh vi khun E.coli nhm thu c lng ln bn sao plasmid pITB-CRY. T bo vi khun E.coli khng c kh nng bin np. T bo vi khun E.coli c th c x l tr nn c kh nng tip nhn plasmid pITB-CRY. Hai plasmid mi vo vi khun bin np E.coli, nhn bn E. coli v tch chit AND trn. II.2.2 a plasmid vo vi khun Agrobacterium tumefaciens Phng php s dng l phng php bin np. Bin np l hin tng tip nhn DNA trn c tch t qu trnh nhn dng trong vi khn E.coli t vo t bo vi sinh vt vi much ch khuch i s lng ln bn sao DNA Plasmid nh b my di truyn ca vi sinh vt sau gip ua gen mc tiu vo vt ch th hin chc nng ca gen. qu trnh c tin hnh nh sau:

-5-

Quy trnh chuyn gen khng su bnh trn cy ci ngt

Phm Th Sng

Sau khi to c vector ti t hp mang gen ngoi lai, vic tip theo l bin np n vo t bo vt ch. Trong trng hp ny t bo vt ch thng c s dng l vi khun Agrobacterium tumefaciens khuch i mt lng ln DNA plasmid ti t hp dng cho nghin cu ny. thng thng nc ngoi ngi ta thng s dng phng php s dng sng bn gen nhng Vit Nam iu kin cha c do ta c th s dung phng php sc nhit a plasmid ti t hp vo vi khun Agrobacterium tumefaciens. Phng php sc nhit l phng php l hc da vo nguyn l gin n ca mng t bo a plasmid mi to thnh vo t bo vi khun. Dng que cy v trng gt ly mt khun lc Agrobacterium tumefaciens cho vo eppendorf c ch dung dich bin np (dung dch bin np c to thnh bng cch ha tan plasmid mi vo 100ul nc ct) v trn lm cho vi khun trn u trong dung dch. Sau t vo ngn khong 10 pht sau ly ra cho vo nc m khong 40 oC trong khong 50 giy sau mang vo lnh tip tc nhm gy sc nhit lm cho mng t bo vi khun gin ra plasmid cha enzyme cn thit xm nhp vo v to ra vi khun mang gen ti t hp cn thit. Sau cy chng ny ln dung dch thch hp lc u. Quy trnh c th c m t bng s hnh:

-6-

Quy trnh chuyn gen khng su bnh trn cy ci ngt

Phm Th Sng

-7-

Quy trnh chuyn gen khng su bnh trn cy ci ngt

Phm Th Sng

III. QUY TRNH CHUYN GEN VO CY Qu trnh chuyn gen vo cy l mt qu trnh phc tp v kh thc hin t c hiu qu cao phi lm trong iu kin v trng v s dng cy trong phng th nghim. Cy trong ng nghim hoc cy con ny mm t ht c s dng lm vt liu chuyn gen v s dng Agrobacterium tumefaciens cha plasmid mang gen bar, gen gus v CryIA to ra trn III.1. CCH CHUYN GEN VO CY CI NGT Chun b cy ci ngt thuc loi Brassica integrifolia L. t ht ny mm khong 5-6 ngy c l mm cung di 1-2 mm. hoc cy trong nui cy m.
Rau ci ngt 5 ngy tui

S dng vi khun Agrobacterium tumefaciens c bin np gen CryIA lc qua m gy nhim mu, sau cc l mm c nui cy trn mi trng ti sinh to chi Mi trng ti sinh to chi l mi trng MS bao gm: - 2mg/l NAA

-8-

Quy trnh chuyn gen khng su bnh trn cy ci ngt

Phm Th Sng

- 4mg/l BA - 3.3 mg/l AgNO3 Trong hai ngy ( c b sung acetosyringone nng 100M). Sau ra v dit vi khun bng dung dch khng sinh 500mg/l cefotaxime trong thi gian 30 pht Sau chuyn mu sang mi trng ti sinh to chi c cha cht chn lc PPT v 500mg/l cefotaxime. Tip tc cy chuyn 2 tun/ ln trn cng mt loi mi trng. Sau 4-5 tun mu c chi ti sinh c chuyn qua mi trng ra r sau c a ra ngoi mi trng. III.2. PHNG PHP KIM TRA CY CHUYN GEN Kim tra bng ch th gusA bng dung dch X-Gluc bng cch ngm cc mnh l chi nh vi dung dch X-Gluc khong 15 gi 37oC, mu chuyn gen s c mu xanh chm trng, mu i chng tc khng mang gen s khng chuyn mu. PCR gen cryIA(c) DNA thc vt c chy PCR vi cp mi chuyn bit, quy trnh tch DNA thc vt c thc hin theo phng php ca Dellaporta (1983). Cc cy chuyn gen c kim tra s biu hin ca gen cryIA ( c ) qua kh nng khng su bng cch th su xanh Heliothis armigera ln cc mu l trong a petri.

-9-

Quy trnh chuyn gen khng su bnh trn cy ci ngt

Phm Th Sng

III.KT LUN Thc phm bin i gen (GMF-genetically modified food) l thc phm m bn thn chng hoc ch bin t cc c th ng, thc vt mang cc gen ti t hp c chuyn vo mt cch nhn to nhm phc v cc li ch kinh t. Nh s dng Plasmid ITB chuyn gen chng ta thu nhn cy ci ngt chuyn gen mang gen cryIA(c) khng su xanh Heliothis armigera. Bng cc k thut sinh hc phn t v sinh hc chng ta c th xc nh c ca gen ny hin din cy ci ngt chuyn gen v gen chuyn c biu hin tnh trng kh r rt. Cy trng chuyn gen l mt thnh tu ca khoa hc v cng ngh, vic ng dng quy trnh ny trn nhiu loi thc vt khng nhng mang li gi tr kinh t m gp phn bo v mi trng v xy dng h sinh thi bn vng. Qua ti ta c th bit c quy trnh chuyn gen khng su bnh vo cy ci ngt v c th ng dng vo thc t mang li hiu qu kinh t m bo nhu cu ca th trng m vn m bo an ton cho ngi s dng. ng dng cng ngh sinh hc phn t ta v s to ra c nhiu thnh phm mi mang ngha quan trng m bo ngun thc phm sch m bo c vn an ninh lng thc ton cu. Vit Nam ang tng bc tip cn vi cng ngh gen nhm to ra nhng cy trng c kh nng chng su bnh, chng hn, chng kim loi nng v vic to ra cy ci ngt chuyn gen mang mt ngha ht sc quan trng v cn thit.

TI LIU THAM KHO Ti liu sch

- 10 -

Quy trnh chuyn gen khng su bnh trn cy ci ngt

Phm Th Sng

Trang Quan Sen. K thut ghp gen, mt cng ngh hng u ca th k 21, K thut ghp gen. Nh xut bn Tng hp TPHCM,2011 Nng Vinh v Ng Xun Bnh. Cng ngh sinh hc i cng. Nh xut bn Nng nghip. 2008 PGS.TS. o Xun Vinh. Bi ging Cng ngh sinh hc phn t v ng dng,2010 Ti liu trn internet http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/kien-thuc-cn-sinh-hoc-cay-trong-chuyengen-va-moi-truong-pocket-no-4-.900332.html http://vietsciences.free.fr/thuctap_khoahoc/thanhtuukhoahoc/thucpha mchuyengen.htm http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1118

- 11 -