Cong Nghe Enzyme

CNG NGHE ENZIM GVC: Ths.
Trn Xun Ngach

Trang: 1
Mc lc
Chuong 1: NGUYN LIEU THU ENZIM V PHN BO....................................................................3
1.1. Ngun dng vt: ........................................................................................................................................3
1.2. Ngun gc thuc vt:..................................................................................................................................4
1.3. Ngun vi sinh vt:......................................................................................................................................4
Chuong 2: SAN XUAT CC CHE PHAM ENZIM TU VI SINH VAT............................................5
2.1. Diu ho qu trnh sinh tng hop enzim trong mi truong nui cy vi sinh vt..............................5
2.2. Tuyn chon v cai tao ging vi sinh vt cho enzim c hoat luc cao:...............................................11
2.3. Phuong php bao quan ging vi sinh vt :..........................................................................................12
2.4. Mi truong nui cy vi sinh vt sinh tng hop enzim: ......................................................................13
2.5. Cc phuong php nui cy vi sinh vt:................................................................................................17
2.6. Tch v lm sach ch phm enzym :....................................................................................................22
Chuong 3: KY THUAT SAN XUAT CHE PHAM TU HAT COC NAY MAM (MALT).........24
3.1. Nguyn liu dai mach:............................................................................................................................24
3.2. Lm sach v phn loai hat:.....................................................................................................................25
3.3. Rua, st trng v ngm hat:....................................................................................................................26
3.4. Ny mm:.................................................................................................................................................28
3.5. Sy malt:....................................................................................................................................................34
3.6. Tch mm, r, bao quan malt:...............................................................................................................37
3.7. K thut san xut mt s loai malt dc bit:.........................................................................................38
Chuong 4: SAN XUAT ENZIM TU THUC VAT..................................................................................40
4.1. San xut ureaza tu du rua:.....................................................................................................................40
4.2. Thu nhn bromelain tu dua:..................................................................................................................40
Chuong 5: ENZIM CO DINH.......................................................................................................................44
5.1. Gioi thiu chung:......................................................................................................................................44
5.2. Mt s phuong php chu yu ch tao enzim c dinh :......................................................................44
5.3. Mt s lin kt trong vic c dinh enzim. ............................................................................................45
5.4. Anh huong cua su c dinh dn hoattnh cua enzim...........................................................................46
5.5. Cc reactor chua enzim c dinh:...........................................................................................................48
5.6. . Su dung enzim c dinh trong y hoc v trong cng nghip:.............................................................50
Chuong 6: GII THIEU MOT SO LOAI ENZIM CHU YEU V KHA NNG UNG
DUNG 55
6.1. Amylaza....................................................................................................................................................55
6.2. Proteaza.....................................................................................................................................................58
6.3. Pectinaza....................................................................................................................................................60
6.4. Xenluloza:.................................................................................................................................................64
CNG NGHE ENZIM GVC: Ths. Trn Xun Ngach
Trang: 2
6.5. Saccaraza v glucooxydaza. ..................................................................................................................66
Chuong 7: PHUONG PHP XC DINH HOAT DO MOT S LOAI ENZIM............................68
7.1. Don vi do hoat d:...................................................................................................................................68
7.2. Cc phuong php xc dinh hoat d enzim:.........................................................................................69
7.3. Chun bi dich chit enzim d xc dinh hoatd....................................................................................71
Trang: 3
Chuong 1: NGUYN LIJU THU ENZIM V PHN B
1.1. Ngun dng vt:
1.1.1. Tuy tang: (Pan creas)
Dy l ngun enzim som nht, lu di nht, c chua nhiu loai enzim nht nhu:
tripxin, kimotripxin, cacboxy pectidaza A v B, ribonucleaza, amilaza, lipaza.
+ Tripxin y hoc phai l loai tinh ch.
+ Ung dung du tin cua ch phm tripxin l lm mn da d lt da, khu cc vt nut
trn da.
+ San xut san phm thuy phn protein y hoc (dich truyn y t) v mi truong nui cy
vsv.
+ Ch phm dich tuy y hoc d chua bnh v tuy (ri loan chuc nng, bi ct bo tuy).
+ San xut ch phm enzim ty rua (vt bn, mu kh tan) o nhit d vua phai, khng
thch hop voi nhit d cao v pH thay di.
1.1.2. Mng nhy da dy lon:
L ngun enzim pepxin A, B, C, D, gastrisin. Cc enzim ny duoc tit ra ngoi t bo
cng voi dich vi ( khi tiu ho thuc n). Di voi cc typ pepxin c pH
opt
=1.32.2.
1.1.3. Da dy b:
Trong ngn thu tu cua da dy b c tn tai enzim thuc nhm Proteaza tn l renin.
Enzim ny d tu lu duoc su dung ph bin trong cng ngh phomat. Renin lm bin di
cazein thnh paracazein c kha nng kt tua trong mi truong sua c du nng d Ca
2+
.
Dy l qu trnh dng tu sua rt din hnh, duoc nghin cuu v ung dung dy du nht.
Trong thuc t nu ch phm renin bi nhim pepxin (trong truong hop thu ch phm renin
o b qu th. Khi d, da dy b d pht trin dy du c kha nng tit ra pepxin) th kha
nng dng tu sua km di.
Gn dy c nghin cuu san xut proteaza tu vsv c dc tnh renin nhu o cc loi
Eudothia Parasitica v Mucor Purillus.
1.1.4. Cc loai ni tang khc:
Gan, l lch, thn, phi, co honh tim, da con, huyt. Cc loai ny du c chua enzim,
da s tn tai trong t bo. Chi c mt s loai duoc san xut duoi dang ch phm nhu: gan,
tim lon d tch aspartat-glutamat aminotransferaza, huyt tuong (tu huyt) d tch ra
trombia (Proenzim chng dng mu)
Nhn chung nguyn liu dng vt dng d tch enzim phai tuoi tt (ly ngay sau khi
git m) hoc giu o -20
0
C c th duoc 112 thng vn khng lm giam hoat tnh enzim.
Trang: 4
1.2. Ngun gc thc vt:
1.2.1. Cy du rua (Canavalin ensifirmis):
Dy l cy thuc ho du Canavalia c nhiu o chu Phi, o Vit Nam c ni k trn.
Trong tt ca cc ni du rua du rt giu enzim Ureaza, hm luong c th dn 20% cht
kh.
1.2.2. Ho dua (Bromalaceae):
Bao gm tt ca cc ni dua trng ly qua, ly soi (k ca cc ni dua dai). Trong cc b
phn khc nhau cua cy dua (vo, li, chi, thn, l,) du c chua enzim bromelain.
Trong d nhiu nht l phn li du qua dua. Hoat tnh cua enzim bromelain phu thuc
nhiu vo trang thi v diu kin bao quan nguyn liu. Cc nghin cuu d chi ra rng
cc nguyn liu sy kh o nhit d 400C s giu duoc hoat tnh enzim tt hon so voi
nguyn liu d duoc bao quan lanh o nhit d 4
0
C.
1.2.3. Nhua du du (Carica Papaya. L):
Dy l loai cy n qua ph bin o cc nuoc nhit doi. Tu qua tuoi hoc thn thu duoc
nhua (latex) chnh l ch phm papain th d tu d tinh ch thnh papain thuong phm.
Hin nay nguoi ta d tao ra duoc cc ging du du c san luong mu v hoat tnh papain
cao d khai thc c hiu qua ngun enzim ny (khng dt vn d ly qua).
1.2.4. Mt s loai nguyn liu thuc vt khc:
Khi tin hnh nghin cuu khoa hoc, y sinh hoc, nhiu khi cn xem xt (dinh tnh, dinh
luong, cu trc phn tu, d hoat dng enzim, ) cua mt s loai enzim c trong ban thn
nguyn liu d d dinh luong su dung. Dng ch hon ca l:
Ch phm enzim Polyphenoloxydaza (EPPO): din hnh nht l eppo cua l ch, cua
ni nhu hat ca cao tuoi, nuoc p qua nho. Ch phm loai ny ph bin hon ca l loai bt
axeton.
1.2.5. Hat cc v mt s loai cu chua tinh bt:
Trong hat cc ny mm (malt) v mt s loai cu ny mm (din hnh l khoai lang) c
mt h enzim rt phong ph duoc nguoi ta su dung tu rt lu trong cc linh vuc: mt tinh
bt (mach nha), ruu v bia (thm ch c mt phuong php san xut ruu etylic mang tn l
phuong php maltaza hay phuong php malt)
1.3. Ngun vi sinh vt:
Dy l ngun enzim phong ph nht, c o hu ht cc loi vi sinh vt nhu: nm mc,
vi khun v mt s loi nm men. C th ni vi sinh vt l ngun nguyn liu thch hop
nht d san xut enzim o qui m lon dng trong cng ngh v doi sng. Dng ngun vi
sinh vt c nhung loi ch chnh nhu sau:
+ Chu dng v nguyn liu nui cy vi sinh vt v ging vi sinh vt.
+ Chu ky sinh truong cua vi sinh vt ngn: 16100 gio nn c th thu hoach nhiu ln
quanh nm.
+ C th diu khin sinh tng hop enzim d dng theo huong c loi (dinh huong su
dung v tng hiu sut tng thu hi).
+ Gi thnh tuong di thp v mt truong tuong di re, don gian, d t chuc san xut.
Tuy nhin trong moi truong hop cn luu kha nng sinh dc t (gy dc, gy bnh) d
c bin php phng ngua, xu l thch hop.
Trang: 5
D san xut ch phm enzim, nguoi ta c th phn lp cc ging vi sinh vt c trong tu
nhin hoc cc ging dt bin c lua chon theo huong c loi nht, chi tng hop uu th
mt loai enzim nht dinh cn thit no d.
Chuong 2: SAN XUT CC CHE PHAM ENZIM T VI SINH VAT
2.1. Diu ho qu trnh sinh tng hp enzim trong mi trung nui cy vi
sinh vt
Voi muc dch nui cy thu hi enzim voi hiu sut cao, cn phai nhn ro qu trnh diu
ho sinh tng hop enzim d c cc dinh huong tc dng thch hop trong cng ngh. T
bo vi sinh vt chi tng hop enzim khi cn thit voi s luong thch hop mong mun.
2.1.1. Diu ho theo huong dng mo boi gen operator (gen diu khin) _hin
tuong trn p :
+ hin tuong trn p (uc ch) (repression): l lm giam qu trnh sinh tng hop do san
phm cui cng cua qu trnh nui cy. Hin tuong ny thuong gp di voi cc enzym
xc tc qu trnh sinh tng hop mt chiu nhu: qu trnh sinh tng hop axit amin,
nucleotit.
V du: khi thm mt axit amin no d vo mi truong nui cy th t bo s khng cn
tng hop ny nua. Do d cung s dnh chi qu trnh sinh tng hop enzym, xc tc cho qu
trnh tng hop nn chnh axit amin d. Enzym ny chi duoc tng hop tro lai khi c nhu
cu nghia l khi lm giam nng d axit amin tuong ung. Di voi h thng phn nhnh
nghia l qu trnh dn dn vic tao thnh nhiu san phm cui cng khc nhau tu mt co
cht chung ban du th co ch trn p c th duoc thuc hin theo cc cch khc nhau.
V du: Phan ung du tin cua qu trnh sinh tng hop cc axit amin lizin, methionin,
treonin du do enzym aspactokinaza xc tc. Enzym ny c 3 izoenzim.
K hiu: a
l
, a
m
, a
t
. Qu trnh sinh tng hop a
l
s bi trn p boi nng d lizin. a
m
cua
methionin. Ring di voi a
t
th treonin vua l san phm cui cng cua ca qu trnh vua l
co cht ban du d sinh tng hop izoloxin. Do d qu trnh sinh tng hop axit
t
chi bi trn
p khi ca treonin v izolexin dat nng d cao vuot qu nhu cu cua t bo. C th minh
hoa co ch trn p ny theo so d:
Trang: 6
al
am
at
A B C D Methionin
E
G
Lizin
Treonin Izoloxin
Ghi ch: A Co cht Aspartic ban du.
B, C, D, G l cc san phm trung gian c tc dung trn p.
Nhu vy o dy su trn p chi xay ra khi c su hop dng tc dung cua ca 2 san phm.
Nu trn p hop dng ny cng xay ra di voi qu trnh sinh tng hop enzym ging nhau
xc tc cho cc phan ung song song tao thnh 2 san phm cui cng khc nhau. V du:
qu trnh sinh tng hop valin v izoloxin do 4 enzym ging nhau xc tc theo so d sau:
Valin
Izoloxin
4 3 2
1
Hin nay nguoi ta cho rng ARN moi l yu t trn p thuc su cho qu trnh sinh tng
hop cc enzym xc tc d tng hop cc axit amin tuong ung.
+ Hin tuong cam ung (induction): l hin tuong nguoc lai voi hin tuong trn p lm
tng luong enzym cua t bo
(Ghi ch o so d trn: 1: u-axeto.u-oxyaxtintetaza
2: reductoizomeraza (axetolactat mutaza)
3: hydrooxyaxit dehydrataza
4: amino transpheraza
4 Phan ung
4 Phan ung
6 Phan ung
u-axetolactat
u-axeto
u-Oxybutirat
u,-Dioxy
metylvalerat
u-Xeto
- metyl
u-Xeto
izovalerat
u,-Dioxy
izovalerat
CH
3
CHO
hoat dng
Trang: 7
Nghia l khi trong mi truong nui cy c cht cam ung s kch thch cho vi sinh vt
sinh tng hop nn nhiu enzym hon so voi bnh thuong.
Cht cam ung duoc xem nhu l mt cht nn (Cht co so, b khung ccbon) d sinh
tng hop enzym. Hin nay, nguoi ta chi ra rng c th cc san phm trung gian cua qu
trnh bin di dng vai tr l cht cam ung, thm ch nhiu co cht cua enzym cung c
th l cht cam ung. Din hnh l cc gluxit (monosaccarit v polysaccarit).
Trong s cc enzim do vi sinh vt tng hop, c nhung enzim bnh thuong chi duoc
tng hop rt t oi nhung khi thm mt s cht nht dinh vo mi truong nui cy th hm
luong cua chng c th tng ln rt nhiu ln. Monod v Cohn (1925) goi cc enzim ny
l enzim cam ung, cht gy nn hiu qua ny l goi l cht cam ung. Cc enzim cam ung
thuong l nhung enzim xc tc cho qu trnh phn giai nhu: Proteinaza, amylaza,
pectinaza, penixilinaza, _galactosidaza o t bo E. coli. Khi nui cy E. coli trong mi
truong glucoza v glyxerin, vi khun chi tng hop khoang 10 phn tu _galactosidaza/t
bo. Nu nui cy trn mi truong lactoza l ngun cc bon duy nht th hm luong
enzim l 67% tng hop luong protein cua t bo. Trch ra tu t bo chua dn 6000 phn
tu enzim, nghia l tng ln gn 1000 ln so voi khi nui cy trong mi truong cu.
Su cam ung thuong c tnh cht dy chuyn. Trong h thng gm nhiu phan ung, co
cht du tin cua h thng c th cam ung qu trnh sinh tng hop tt ca cc enzim xc
tc cho qu trnh chuyn ho cua n. Diu ny duoc thuc hin theo co ch sau: Truoc ht
cht cam ung lm tng qu trnh sinh tng hop enzim tuong ung, sau d san phm ny lai
cam ung tng hop enzim d ph huy n, tip theo san phm thu 2 ny lai cam ung tng
hop nn enzim thu 3,
V du: Histidin c tc dung cam ung hng loat cc enzim xc tt cho qu trnh chuyn
ho n thnh axt glutamic (Chasin v Magasamil (1968)).
+ Co ch diu ha theo kiu trn p v cam ung:
Zocob v Monod d d ra m hnh giai thch co ch cua 2 hin tuong trn p v cam
ung trn co so di truyn. Theo m hnh ny, su trn p v cam ung sinh tng hop enzim
duoc thuc hin theo cng mt co ch chung dua trn co so diu ho hoat dng cua cc
gene duoi tc dung cua cc cht phn tu thp. Nhung cn cu chnh cua thuyt ny nhu
sau:
1) C su phn ho chuc nng cua cc giai doan khc nhau trong phn tu AND trong
nhim sc th, dua vo chuc phn cua chng trong qui trnh sinh tng hop Protein c th
chia thnh cc loai gene sau:
- Gene cu trc (k hiu: S
1
,S
2
,S
3
) : m ho phn tu protein enzim duoc tng hop, tuc
l thu tu cc axit amin trong phn tu enzim duoc tng hop l tuy thuc vo thu tu cc
nucleotit cua doan gene ny. Cc gene m ha cc enzim duoc p xp lin nhau thnh
mt nhm trn nhim sc th. Chng l khun d tng hop phn tu ARN
tt
.
- Gene Operator (k hiu: O): o canh nhm gene cu trc, khng m ho protein
nhung dam bao cho qu trnh sao chp m o gene cu trc theo co ch Dng mo tua
nhu cng tc cua mt dy dn. Qu trnh sao chp chi c th tin hnh khi gene operator
o trang thi mo (khng kt voi cht no ca) v ngung lai khi n bi dng (kt hop voi
mt cht dc bit goi l cht trn p represson). Mt gene operator c th phu trch mt
nhm gene cu trc cc gene cu trc ny cng voi gene operator cua chng hop thnh
Trang: 8
mt don vi sao chp so cp goi l mt operon. Su tng hop ARN
tt
duoc bt du o mt
du cua operon v chuyn qua cc gene cu trc d dn du kia cua operon.
- Gene Promotor (gene hoat ho k hiu P) Dng truoc gene operator l doan And m
ARN-polimeraza s kt hop v bt du qu trnh sao chp cc gene cu trc.
- Gene diu ho regulator (k hiu R): Gene ny m ho cho mt protein dc bit goi
l cht trn p (repressor). Cht trn p c vai tr dng-mo gene operator. Do d gene
diu ho c th kim tra qu trnh sao chp gene cu trc thng qua cht trn p ny.
+ Khng c repressor (san phm cui cng)
R P O S1 S2 S3 ADN
E3 E2 E1
A B C D
ARNtt
+ C repressor (san phm cui cng):
Phin m
Trang: 9
R P O S1 S2 S3 ADN
: ARN-polymeraza
: Repressor
: coreressor
R: Gene diu ho, P: Gene promotor, O: Gene Operator,
S1, S2, S3: Cc gene cu trc.
2) Trong truong hop diu ho sinh tng hop enzim theo co ch trn p, repressor do
gene diu ho tng hop cn o dang khng hoat dng (aporepessor) chua c kha nng kt
hop voi gene operator nn qu trnh sao chp cc gene cu trc tin hnh bnh thuong.
Cc enzim duoc tng hop xc tc cho cc phan ung d tao thnh cc san phm cui cng,
san phm cui cng ny lai c kha nng kt hop voi aporepessor v hoat ho n.
Aporepessor d duoc hoat ho s kt hop voi operator ngn can qu trnh sao chp cc
gene cu trc, lm ngung vic tng hop ARN
tt
tuong ung do d dnh chi qu trnh sinh
tng hop cc enzim tuong ung. Trong truong hop ny cc san phm moi duoc coi nhu l
cht trn p (repressor).
3) Di voi truong hop cam ung:
+ Khng c cht cam ung
R P O S1 S2 S3 ADN
+ C cht cam ung:
Trang: 10
ADN S3 S2 S1 O P R
ARNtt
A B C D
E1 E2 E3
So d minh hoa co ch cam ung sinh tng hop enzim
: Cht cam ung
Khi khng c mt cht cam ung, cht trn p (repressor) duoc tng hop d o trang thi
hoat dng, n kt hop voi gene diu khin operator, qu trnh sao chp m cua gene cu
trc bi bao vy nn cc enzim tuong ung khng duoc tng hop.
Khi c mt cht cam ung th cht trn p repressor bi mt hoat dng, tch khoi gene
diu khin operator v qu trnh sao chp m bt du, kt qua lm tng luong enzim duoc
tng hop.
Nhu vy ta thy hin tuong trn p v cam ung sinh tng hop enzim l hai mt di lp
cua mt qu trnh ho sinh thng nht duoc thuc hin thng qua hoat dng dng-mo
gene duoi tc dung cua cc cht phn tu thp
2.1.2. Diu ho tuong tc giua ARN-polymeraza voi gene promotor:
Nhiu du hiu thuc nghim cho thy cc gene bao dam sinh tng hop mt s enzim
cam ung xc tc cho qu trnh phn giai khng chi chiu su kim tra theo co ch cam ung
nhu d trnh by o trn m cn chiu su kim tra theo mt co ch khc nho tc dung cua
AMP vng (AMP
v
) goi l trn p phn giai (cactabolic repressor) AMP
v
c tc dung
kch thch cua AMP
v
di voi qu trnh sao chp m cua cc operon phn giai. Hin tuong
ny d duoc nghin cuu nhiu di voi operon lactoza. Theo nhiu tc gia, tc dung kch
thch cua AMP
v
di voi qu trnh sao chp m duoc thuc hin nho mt protein dc bit
lm trung gian goi l protein nhn AMP
v
, hay cn goi l protein hoat ho gene phn giai
CAP (catabolite gene activator protein). Khi AMP
v
kt hop voi CAP tao thnh phuc hop
c tc dung hoat ho gene promotor lm cho ARN-polymeraza d dng kt hop voi n d
bt du qu trnh sao chp m. Nhu vy AMP
v
c tc dung lm tng cuong qu trnh sao
chp. Cung c kin cho rng phuc hop AMP
v
-CAP-ARN-polymeraza cho php bt du
qu trnh sao chp m.
Trang: 11
CAP
P
O Z i
i Z O
ARN-Polymeraza
CAP
a)
b)
c)
i Z O
CAP
AMPv
AMPv
AMPv
ARN
Pol
Pol
ARN
CAP
O Z i
d)
ARNtt
M hnh bt du sao chp m cua operon lactoza
a Phuc hop CAP-AMP
v
chun bi kt hop vo min dc bit cua ADN.
b Sau khi phuc CAP-AMP
v
kt hop vo, n lm yu doan ADN.
c - ARN-polymeraza kt hop vo min dc bit cua n.
d - ARN-polymeraza truoc doc theo doan ADN nhu mt ci bot dn min bt du.
Nguoi ta cung nhn thy glucza v mt s loai duong khc khi thm vo mi truong
nui cy vi khun thuong lm giu luong AMP
v
trong t bo, do d lm giam qu trnh
sinh tng hop nhiu enzim cam ung, ngay ca khi n c cht cam ung trong mi truong.
Hin tuong ny cn goi l hiu ung glucoza duoc quan st thy o E. coli v mt s vi
khun. Tuy nhin cho dn nay vn chua bit r co ch lm giu AMP
v
do glucoza v cc
duong khc
2.2. Tuyn chn v cai to ging vi sinh vt cho enzim c hot lc cao:
D chon ging vi sinh vt c kha nng sinh tng hop enzim cao, nguoi ta c th phn
lp tu mi truong tu nhin hoc c th dng cc tc nhn gy dt bin tc dng ln b
my di truyn hoc lm thay di dc tnh di truyn d tao thnh cc bin chung c kha
nng tng hop dc bit huu hiu mt loai enzim no d, cao hon hn chung gc ban du.
2.2.1. Phuong php gy dt bin:
Dy l phuong php hay duoc dng nht nhm d:
- Tao nhung dt bin bi giam kha nng sinh tng hop repressor hoc tng hop
repressor c i luc thp voi gene opertor.
- Tao nhung dt bin tng hop enzim c cu trc bc 1 thay di do d c th giam d
thay di voi kiu km hm theo co ch lin h nguoc.
Du vo
Min bt du vo
Trang: 12
Nu su thay di cu trc bc 1 xay ra o vng trung tm hoat dng hoc o gn d th c
th lm thay di r rt hoat tnh cua enzim.
- Gy dt bin o doan gene hoat ho promotor d lm tng p luc cua n di voi ARN-
polymaraza do d lm tng tc d sao chp m.. Dng bin php ny c th lm tng
luong glucoza-6-phosphatdehydrogenaza ln 6 ln.
Hin tuong dt bin thuong lin h voi su thay di mt gene, chng han bi li mt
bazo khi ti tao phn tu ADN. V du o mt vi tr no d trn gene c thu tu nucleotit l
G-X, nu n bi thay th bng A-T, T-A hoc X-G th phn tu ARN
tt
duoc tng hop trn
doan gene bi li ny cung s khc voi ARN
tt
bnh thuong o vi tr tuong ung voi ch li
trn gene. Do d s tng hop nn phn tu enzim khc voi bnh thuong o mt s gc axt
amin.
D tao mt dt bin gene c th dng tc nhn vt l (tia tu ngoai, tia phng xa) hay
ho hoc (cc ho cht) tc dung ln t bo sinh vt.
2.2.2. Phuong php bin nap:
L su bin di tnh trang di truyn cua mt ni vi sinh vt duoi anh huong cua ADN
trong dich chit nhn duoc tu t bo cua vi sinh vt khc. O dy yu t bin nap l ADN.
Su chuyn vt liu di truyn (ADN) tu t bo cho dn t bo nhn c th xay ra trong ng
nghim (invitro) khi cho t bo nhn tip xc voi dich chit tu t bo cho m khng c su
tip xc giua cc t bo.
Cc t bo c th nhn bt ky loai ADN no chu khng di hoi phai l ADN tu cc
ging ho hng. Tuy nhin t bo chi c th nhn mt s doan ADN nht dinh, thuong
khng qu 10 doan. Cc doan ADN duoc di truyn trong bin nap c M=10
6
-10
7
v phai
c cu trc xon kp. T bo khng tip nhn cc doan ADN c kch thuoc nho hon hoc
cc doan khng c cu trc xon kp. Hin tuong bin nap ph bin o nhiu loi vi sinh
vt nhu: Diplococus, Staphylococus, Hemophilus, Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus,
Xantomonas.
2.2.3. Phuong php tip hop gene:
Khc voi bin nap, o dy vt liu di truyn chi duoc truyn tu t bo cho dn t bo
nhn khi hai t bo tip xc voi nhau. Do vy cc vi sinh vt c kha nng bin nap th s
khng c kha nng tham gia tip hop gene nua. Hin nay qu trnh tip hop gene d duoc
nghin cuu o mt s loi vi khun nhu E. coli, salmonella, Pseudomonas aeruginosa.
2.2.4. Phuong php tai nap:
Vt liu di truyn (ADN) duoc chuyn tu t bo cho sang t bo nhn nho vai tr trung
gian cua thuc khun th (phage). Trong qu trnh tai nap, cc doan ADN duoc chuyn tu
t bo cho dn t bo tip hop voi ADN cua t bo nhn. Do d lm bin di tnh cht di
truyn cua t bo nhn.
2.3. Phuong php bao quan ging vi sinh vt :
Khi su dung vi sinh vt d san xut enzim cn chon ging thun chung, d duoc kim
tra dy du v cc dc tnh ho sinh, vi sinh, nui cy v cn dc bit luu dn diu kin
bao quan ging. Thuc t khi bao quan ging gc trong mt thoi gian di c th tao ra cc
bin di ngu nhin khng mong mun do d dinh ky phai cy chuyn v kim tra lai cc
dc tnh ban du.
Trang: 13
2.3.1. Phuong php cy chuyn:
Dy l phuong php ph bin nht d thuc hin bng cch giu ging trn mi truong
thach (thach nghing, hp petri,) voi thnh phn mi truong nui cy v diu kin nui
cy thch hop cho ging vi sinh vt d. Sau khi ging d moc tt cn bao quan o nhit d
lanh 3-4
0
C v sau mi tun phai cy chuyn lai. Khi cy chuyn chi ly bo tu hoc
khun lac m khng nn ly ca mi truong dinh dung d bao dam khng chuyn cc san
phm trao di cht vo mi truong moi (c th gy nn nhung bin di bt loi khng th
luong ht duoc). Nu l xa khun th khng nn bao quan ging trn mi truong thach
m nn giu trong dt d khu trng.
D ko di thoi gian bao quan ging tu hng thng dn 1 nm, nguoi ta phu mt lop
paraphin long d tit trng trn b mt ging d han ch su pht trin cua n. Cn luu
chi phu lop du sau khi cy vi sinh vt dat dn d chn sinh l.
Phuong php cy chuyn rt c hiu qua d bao quan cc ging nm men, vi khun v
rt huu hiu, d dng trin khai ging ra san xut lon, han ch cc tai bin c th dn dn
hu hong ging gc.
2.3.2. Phuong php lm kh:
Bng cch giu ging trn ct, dt, silicagen trong diu kin kh ro (tt ca du duoc
khu trng cn thn). Trong diu kin nhu vy s han ch su pht trin tip tuc cua ging
khi bao quan. Phuong php ny rt hay duoc su dung d bao quan nm mc, xa khun,
mt vi loi nm men, vi khun thoi gian giu ging c th duoc 1 nm.
Phuong php lm kh cung thuc hin don gian, khng cn dung cu dt tin. Tuy nhin
ging nhu phuong php cy chuyn thoi gian bao quan tuong di ngn.
2.3.3. Phuong php dng kh:
Tuc l lm kh bng sy chn khng thng hoa (nu nguyn tc), cn goi l sy lanh
d tao nn san phm dng kh (thuc phm dng kh, cc vt phm sinh hoc, y hoc dng
kh). Dy l phuong php bao quan lu di dn 10 nm m khng lm cho ging bi
bin di dc tnh nhung di hoi cng ngh cao, thit bi dt tin, chi ph bao quan lon.
Hon nua mt s loi vi sinh vt nhu nm mc khng c bo tu v mt s loai vi rt to ra
khng thch hop khi bao quan dng kh.
2.3.4. Phuong php lm lanh dng trong nito long:
Kh nito ho long o nhit d rt thp -165
0
C dn -196
0
C nn nu bao quan vi sinh vt
o mi truong ny s rt tt v ging duoc giu bt bin trn 10 nm. Tuy nhin dy l linh
vuc cng ngh cao (cn nito nguyn cht v lanh thm d) nn chi ph bao quan rt cao.
2.4. Mi trung nui cy vi sinh vt sinh tng hp enzim:
Dy l yu t du tin anh huong truc tip dn hoat dng sng cung nhu kha nng sinh
tng hop enzim cua vi sinh vt. Mi truong chn chua dy du cc cht C, N, H, O. Cc
cht v co: Mn, Ca, P, S, Fe, K v cc cht vi luong khc.
2.4.1. Ngun ccbon:
Thuong l hop cht huu co trong d chu yu l gluxit, tuy thuc vo dc tnh cua
enzim v ni vi sinh vt m nguoi ta lua chon cho thch hop.
- Di voi cc h vi sinh vt sinh enzim amylaza: dy l enzim cam ung din hnh v
vy mi truong nui cy phai c cc cht cam ung: tinh bt, dextrin, mantoza. Qua
Trang: 14
nghin cuu nguoi ta nhn thy ba loai gluxit l ngun ccbon tt nht d sinh tng hop
amylaza dat hiu qua cao. Chng han hiu sut sinh tng hop trn mi truong gluxit khc
nhau voi mt s loai enzim amylaza nhu sau:
+ Di voi u-amylaza:
Tinh bt > dextrin > mantoza > glucoza > saccaroza > galactoza > manit > avabinoza.
+ Di voi Oligo-1,6-glucoridaza (dextrinaza):
Tinh bt > dextrin > mantoza > saccaroza > glucoza > lactoza > galactoza > orabinoza
> manit.
+ Di voi u-1,4-amyloglucoridaza :
Tinh bt > dextrin > mantoza > saccaroza, glucoza, lactoza, orabinoza > rabinoza >
lactoza > manit.
Khi nui cy theo phuong php b mt nu dng cm th khng cn b sung tinh bt,
ngun tinh bt rt ph bin, ngoi cm c th dng bt ng, bt m, bo bo.
Cn ch trong da s truong hop, mt s loai duong, din hnh nht l duong glucoza
lai kn hm sinh tng hop cc enzim thuy phn ni chung (chng han theo co ch trn p
phn giai do lm giu luong AMP
v
trong t bo).
Di voi cc h vi sinh vt sinh enzim Proteaza:
C mt s ngun gluxit khi dng nui cy nm mc c kha nng sinh tng hop enzim
Proteaza c hoat luc cao, chng han theo thu tu sau:
+ Di voi Asp. Flavus 74: fructoza > glucoza > saccaroza > ramnoza > mantoza >
galactoza > orabinoza > lactoza.
+ Di voi Asp. Awamori 200: fructoza > manit > saccaroza > orabinoza > galactoza >
lactoza.
+ Di voi Asp. Oryae 79: fructoza > saccaroza > mantoza > glucoza > manit >
orabinoza > galactoza > lactoza.
Tinh bt l ngun ccbon cua nhiu chung vi khun sinh tng hop enzim proteaza. V
du: Vi khun Bac. Subtilis c kha nng sinh tng hop proteaza o mi truong tinh bt
>8%, ging xa khun ua nhit Micromonospora vulgaricus sinh tng hop proteaza trong
mi truong 0.15-0.25% tinh bt.
Ngoi ra mt s loai hydrocacbon cung c ngun ccbon cho 125 chung vi sinh vt.
Chng han, mt s ging vi khun Pseudomonas semginosa c kha nng sinh tng hop
proteinaza hoat luc cao trn mi truong n-paraphin voi 12, 14, 16 nguyn tu C hoc
proplylenglycol, hydrocacbon thom.
- Di voi cc h vi sinh vt sinh enzim Pectinaza:
Qu trnh sinh tng hop enzim pectinaza c lin quan dn cht cam ung. D chnh l
pectin, duong nhin d l ngun ccbon. Nu su dung hn hop gluxit trong d c pectin,
d nui cy vi sinh vt th hoat luc cua pectinaza ngoai bo c th tng 4-6 ln so voi khi
nui cy khng c pectin.
Ging Asp. Niger duoc nui cy trn mi truong c nhiu ngun ccbon nhu: Pectin,
tnh bt, isulin, lactoza, saccaroza, mantoza, galactoza nng d 2, 4, 6% s cho pectinaza
c hiu sut cao. Tuy nhin nn nui cy trn mi truong chi c monosacarit v glyxerin
th hon ton khng th sinh tng hop enzim ny. Duong glucoza c tc dung kn hm
Trang: 15
(cht trn p) sinh tng hop enzim pectinaza trn mi truong nui cy l pectin v lactoza
di voi loi Asp. Niger, Asp. Awamori.
- Di voi cc h vi sinh vt sinh enzim xenluloza.
Enzim xenluloza l enzim cam ung v vy trong mi truong nui cy vi sinh vt sinh
enzim ny nht thit phai c xenluloza l cht cam ung v l ngun ccbon.
Ngun xenluloza rt phong ph: giy loc, bng, bt xenluloza, li ng, cm, mn cua,
rom ra, than bn. Ngoi ra c th k thm chit xut xenlobiozo-octa axetat, cm m,
lactoza, balixyl cung c ngun ccbon tt. Di voi ging Stachybotris atra, ngun gluxit
tt nht d sinh tng hop enzim xenluloza l tinh bt 1%.
Cc ngun ccbon khc ni chung (glucoza, xenlobioza, axetat, xitrat, oxalat,). Lai
km hm sinh tng hop xenluloza, glyxerin khng phai l cht cam ung cho enzim ny.
- Ngoi ngun gluxit l chu yu cn phai k dn cc ngun ccbon khc nhu:
+ Cc axit bo phn tu luong lon (oleic, stearic, miniotic). V du: axit oleic c tc dung
kch thch tng hop glucoamylaza ln 2.5-3.5 ln so voi nng d thch hop 2-3%.
+ Etanol v glyxerin trong nhiu truong hop nui cy duoc dng lm ccbon b sung.
+ Trong s cc axit huu co th axit lactic hay duoc vi sinh vt hp thu d tng hop
enzim. Tuy nhin nguoi ta thuong khng b sung truc tip axit ny vo mi truong nui
cy m chi b sung loai nguyn liu hay ch phm c chua n hoc s gy sinh ra n
trong qu trnh nui cy.
2.4.2. Ngun nito:
- Di voi h vi sinh vt sinh enzim amylaza:
O nhiu loi nm mc, ngun nito tt nht l NaNO
3
v NH
4
NO
3
, nng d nito duoi
muc 0.05% nm mc vn pht trin duoc nhung sinh tng hop amylaza rt km.
Ty l ti uu giua tinh bt v NaNO
3
trong mi truong Zapec nui cy nm mc sinh
tng hop amylaza dat hiu qua cao nht l 18:1.
Cc mui amoni v co (NH
4
H
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
, NH
4
Cl), mt s ngun nito huu co
(gelatin, cazein, cao ng) cho hiu qua sinh tng hop amylaza thp.
Trong thuc t, nguoi ta thuong dng ngun nito l cc axit amin c ngun gc tu dich
thuy phn protein (dich tu phn nm men, nuoc chm, cao ng, dich chit malt) dy vua
l ngun nito vua l ngun ccbon v cht cam ung sinh enzim.
Cc axit amin c tc dung tt nht trong nhung truong hop ny l asparagin, axit
glutamic; D,L serin, histamin, alanin. Trong khi casein thm ch l uc ch th dich thuy
phn casein lai cam ung sinh tng hop amylaza ln gp 2 ln so voi ban du.
- Di voi h vsv sinh enzyme proteaza:
Ngun nito su dung rt phong ph, bao gm 2 nhm: v co v huu co.
+ Di voi mt s loi nm mc thuc ho Asp. (oryzae, awamori, niger, flavas) nu mi
truong c ngun nito huu co th s sinh tng hop proteinaza axit tnh cao. Trn mi
truong Czapek nu thay NaNO3 bng cazein th hoat luc proteinaza c th tng ln 3,5
ln. Sinh tng hop enzyme proteaza duoc nng cao khi mi truong nui cy c ca hai
ngun nito huu co v v co. Nu mi truong chi c ngun nito v co s dn dn ngung
sinh tng hop enzyme ny.
+ Trong qu trnh nui cy vi khun, trong s cc ngun nito v co th NH
4
, H
2
PO
4
l
tt hon ca. Cc mui amon v nitrat khc du lm giam hoat luc enzyme.
Trang: 16
+ Di voi xa khun ua nhit Actynomyces Vulgaris U2 th pepton l cht cam ung d
sinh tng hop enzyme proteaza l tt nht.
+ Cc axit amin c anh huong r rt nht dn qu trnh sinh tng hop enzyme vsv ni
chung. Chng han glyxin, alanin, metionin, loxin lm tng hoat luc proteaza cua chung
dt bin Asp. Oryzae 251-90 ln 16% v chung nguyn thuy Asp. Oryzae 132-63 ln 7 -
14%. Nhiu axit amin lai c tc dung uc ch sinh tng hop enzyme nhu: valin, axit
glutamic, izoloxin, treonin. Ni chung c khoang 10 axit amin nhu vy. Axit amin c tc
dung kch thch sinh tng hop enzyme khi trong t bo vsv khng tu tng luong du luong
axit amin tu do so voi mi truong nui cy.
+ Ngoi ra, cc bazo purin nhu A (adenin), G (guanin) v cc dn xut cua chng,
ARN v cc san phm thuy phn cung lm tng dng k sinh tng hop proteinaza vsv.
- Di voi h vsv sinh tng hop enzyme pectinaza:
Cung ging nhu di voi h vsv sinh tng hop enzyme proteaza, nu dng kt hop nito
huu co v v co s c tc dung tt dn qu trnh sinh tng hop pectinaza. Tuy nhin,
mui nitrat kim loai kim lai kim hm enzyme ny. Di voi Asp. Niger, ngun nito tn
km nht d sinh tng hop pectinaza la NH
4
H
2
PO
4
. Di voi Asp. Awamori th lai l
(NH
4
)
2
SO
4
. Trong khi d th N tu pepton, cazein thuy phn l hon ton uc ch su tao
thnh enzyme.
- Di voi nm mc Asp. Foetidus th (NH
4
)
2
SO
4
, nuoc chit cm, nuoc chit nm men
c tc dung nng cao hoat luc polygalacturonaza. Ni chung, ti l thch hop nht di voi
C/N khi tng hop pectinaza trong khoang 7/1- 13/1.
- Di voi h vsv sinh enzyme xenlulaza.:
Ngun nito thh hop nht di voi nhm vsv ny l ngun mui nitrat. Trong d NaNO
3
lm cho mi truong kim ho tao diu kin thun loi cho su tao thnh xenlulaza. Cao ng
v cao nm men ( k ca nuoc chit nm men) cung c tc dng khc nhau dn kha nng
sinh tng hop xenlulaza tuy thuc ging vsv. Cc mui amoni d c tc dung thm ch uc
ch qu trnh sinh tng hop v chng lm cho mi truong bi axit ho gy uc ch qu trnh
sinh tng hop thm ch lm mt hoat tnh enzyme ngay sau khi tao thnh trong mi
truong.
2.4.3. Ngun cc nguyn t khong v cc yu t (cht) kch thch sinh truong:
- Mui khong rt cn thit cho hoat dng cua vsv, dc bit l di voi cc qu trnh
sinh tng hop cc enzyme kim loai. D sinh tng hop -amylaza v glucoamylaza, nng
d MnSO
4
thch hop nht l 0,05%. Nu thiu mui ny v mui photphat kali th vsv
khng th sinh tng hop duoc dextrinaza. Hoat luc -amylaza v dextrinaza duoc nng
cao o nng d KH
2
PO
4
1% v hoat luc glucoamylaza o nng d KCl 0,05%, dextrinaza o
nng d thch hop nht l 0,15%.
-Ion Mg
2+
c tc dung sinh tng hop v n dinh cc enzyme c hoat tnh o nhit d
cao. Dc bit Ca
2+
c trong thnh phn cua -amylaza (trong 1 phn tu gam -amylaza
cua Asp. Oryzae c 20g Ca, cua Bac. Subtilis c 4g Ca). Trong mi truong nui cy Ca2+
nng cao kha nng tng hop -amylaza, bao v enzyme ny khoi su anh huong cua
proteaza.
-Luu huynh S voi ngun chu yu l cc axit amin chua S nhu metionin, cystein, sistin,
v cc mui sunphat (CuSO
4
). Cc mui khong c Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu anh huong
Trang: 17
dn kha nng sinh tng hop xenlulaza. Trong da s truong hop biotin (VTM H) v mt s
VTM cung rt cn thit cho qu trnh sinh tng hop enzyme .
Khi lua chon mi truong cn ch dn ca thnh phn dinh tnh v dinh luong sao cho
qu trnh sinh tng hop enzyme mong mun l cao nht. Mun vy nguoi ta c th su
dung mt s phuong php sau:
1) Phuong php ti uu ho quy hoach thuc nghim ton phn (du yu t): di hoi
nhiu thoi gian v khng duoc chnh xc lm.
2) Phuong php ton hoc m hnh ho thuc nghim: cho php xc dinh nhanh chng
v dng dn ti l cc thnh phn mi truong nui cy v cc yu t cng ngh bao dam
cho hoat dng sng v sinh tng hop enzyme cao nht.
2.4.4. Cc loai mi truong nui cy vi sinh vt sinh tng hop enzyme :
C th chia lm 2 loai: mi truong tng hop v mi truong tu nhin (phuc hop).
- Mi truong tng hop: l mi truong bao gm cc cht voi liu luong xc dinh (qua
tm hiu, nghin cuu), chng han ngun cacbon c th l tinh bt, xenlulolaza, duong,
axit, ruou, ngun Nito v co hoc huu co (axit amin, peptin...). Loai mi truong ny
duoc su dung cho muc dch nghin cuu (c khi n mang tn nh nghin cuu ra n:
Czpk-Dobrovonxki, Hasen...).
- Mi truong tu nhin: thuong dng cc loai ph liu, nguyn liu( da s trong d l
thuc phm) c chua cc ngun cacbon, nito, khong(da luong, vi luong), cc yu t sinh
tng hop truong. Mt khc, cc nguyn liu ny lai c sn, re tin nn duoc su dung rt
nhiu trong cng nghip san xut cc ch phm enzyme vi sinh vt.
- Cc nguyn liu d chun bi lm mi truong tu nhin bao gm: cm v bt hat cc,
nuoc chit ng, dich p hoa qua, rau, kh du, b ruou, ri duong, san phm phn huy nm
men bia, tru, li ng( d lm cht dn, tao xp). Khi lua chon su dung mi truong cn
ch dn cc cht c tc dung diu ho sinh tng hop enzyme, dc bit cc cht cam
ung. Bng thuc nghim, nguoi ta thy rng cht cam ung (tng cuong sinh tng hop
enzyme) thuong l co cht chu yu, cc san phm thuy phn cua n hoc cht tuong tu co
cht. O trn ta d bit l cht cam ung thuong kt hop voi cht trn p repressor lm cho
n khng hoat dng( mt kha nng kt hop voi gene diu khin operator). Nhu vy, cht
cam ung phai di vo bn trong t bo do d khng th l nhung cht dai phn tu nhu
protein, tinh bt, xenluloza, pectin. Theo mt s tc gia th cc co cht ny l cc co cht
'tin cam ung', duoi tc dung cua enzyme gc chng bi thuy phn mt phn tao thnh
cht c phn tu luong b hon d dng vai tr l cht cam ung thuc su. Chng han, tu nm
1972 Iurikievits cho rng cht cam ung thuc su cua -amylaza khng phai l tinh bt m
l san phm thuy phn mt phn cua n: erytrodextrin. Tuong tu nhu vy, cht cam ung
cua enzyme proteinaza l cc polypeptin, protein c phn tu luong nho.
- Khi lua chon mi truong nui cy v dc bit l cht cam ung cn xem xt cn thn
cc yu t chi ph, gi thnh san xut ra san phm.
2.5. Cc phuong php nui cy vi sinh vt:
V nguyn tc c 2 phuong php nui cy vsv thu enzyme l: phuong php nui cy
b mt (cn goi l phuong php ni) v phuong php b su (cn goi l phuong php
Trang: 18
nui cy chm), trong d o phuong php b su cn c th chia ra 2 phuong php cu th
hon: l nui cy chm 1 buoc (1pha) v nui cy chm 2 buoc (2 pha).
2.5.1. Phuong php nui cy b mt:
- Phuong php ny rt thch hop d nui cy cc loai nm mc (sinh tng hop cc h
enzyme amylaza, xenlulaza, pectinaza, proteaza) do kha nng pht trin nhanh, manh,
nn t bi tap nhim. Khi nui, nm mc pht trin bao phu b mt hat cht dinh dung
rn, cc khun ty cung pht trin dm su vo lng mi truong d duoc tit trng, lm m
(khun ty co cht). Di voi mt s muc dch dc bit, nguoi ta nui vsv truc tip trn b
mt hat gao (san xut tuong), hat du tuong (du tuong ln men - mis) d duoc nu chn
trn hat cc cn sng (lm men thuc bc, men dn tc, lm tuong).
- Nguoi ta thuong dng cm m, cm gao, ng manh, bt ng, manh hat bo bo c cht
phu gia l tru. Cm, tru, c b mt tip xc lon, mng, tao duoc d xp nhiu, khng
c nhung cht gy anh huong xu dn su pht trin cua nm mc. Ti l cc cht phu gia
(cht dn) phai bao dam so cho hm luong tinh bt trong khi nguyn liu khng duoc
thp hon 20%, c th b sung thm ngun nito v co ((NH
4
)
2
SO
4
, (NH
4
)
2
CO), photpho
(P
2
O
5
, H
3
PO
4
k thut), nito huu co v cc cht kch thch sinh truong nhu malt, nuoc
chit ng, nuoc loc b ruou.
*Quy trnh cng ngh:
Nguyn liu
Trn
Lm m
Thanh trng bng nhit
Lm ngui, lm toi
Gieo ging vsv Nui cy ging
Chuyn vo dung cu nui cy
Nui cy, theo di, xu l
+ Lm m mi truong :
C nghia quan trong, trong diu kin san xut lon, hm m ti uu cua mi truong
cm l 58-60%. Khi duoc nui cy trong diu kin tit trng nghim ngt th s dat hoat
d enzyme cao nht khi hm m 65-68%. Tuy nhin nu mi truong qu m s bi dnh
bt (khi hp thanh trng, lm toi, khi nui cy), d bi nhim vi sinh vt tap (bi ln men
ruou, ln men dm.....). D lm m c th dng nuoc trn voi nguyn liu (nho) ri
thanh trng hoc lm m so b ri thanh trng sau d dng nuoc v trng (nuoc ngung
tu, nuoc dun si d ngui) d diu chinh lai d m cua khi nguyn liu. Cch sau c th
Trang: 19
rt ngn thoi gian lm ngui, khng ch duoc d m chnh xc hon nhung di hoi phai
thanh trng o nhit d v p sut sao hon.
+ Thanh trng bng hoi nhit:
Lm cho mi truong duoc tinh khit hon v phuong din vsv v lm cho chn (bin
hnh) mi truong (tinh bt, protein). Thng thuong nguoi ta thanh trng bng hoi nuoc
truc tip o nhit d 120- 130
0
C trong 2-3h.
+ Lm ngui v lm toi mi truong d gieo ging:
Khi mi truong vua hp xong cn nng v dnh bt. V vy phai lm ngui v lm
toi d thun tin cho vic gieo ging v phn phi vo cc dung cu nui. Yu cu thoi
gian ny phai ngn d han ch nhim khun tu bn ngoi. Nhit d yu cu dat duoc d
gieo ging l 35-39
0
C.
+ Nui cy nm mc ging:
Nhm du luong bo tu ging cho ton b mi truong nui cy. Quy trnh cng ngh
thuc hin tuong tu nhu trong san xut lon nhung phai thuc hin cc diu kin k thut
dc bit v khc khe hon nhu: nguyn liu phai tt, giu cht dinh dung hon, diu kin
nui cy khng ch nghim ngt hon, thoi gian nui cy di hon (gn gp di) d nm
mc hnh thnh nhiu bo tu v du.
+ Tin hnh qu trnh nui cy :
Sau khi gieo ging v phn phi vo cc dung cu nui (mnh hay khay duc l) ri
chuyn vo phng nui c diu chinh nhit d v d m tuong di cua khng kh ()
cung nhu muc d thng kh. Qu trnh nui cy nm mc ko di 33-48h/me duoc trai
qua 3 giai doan:
*Giai doan 1: Tu khi nui cy mc gng dn gio nui thu 10-12. Xay ra su truong no
bo tu v xut hin cung nm. D bao dam su nay mm nhanh v han ch nhim tap,
cn giu d m nguyn liu 55-60%, =96-100%, T=30-32
o
C.
*Giai doan 2: ko di trong 10-18h. Nm mc pht trin manh, lan khp b mt v
trong ton khi mi truong truong (khun ty n su vo co cht) dn dn hin tuong kt
bnh. Qu trnhh hp v toa nhit manh lm mi truong truong bi kh xp, tng hm
luong CO
2
, nhit d phng nui tng ln dn 38-40
o
C. D khng ch nhit d thch hop
28-30
o
C cn thng gi (quat) v bo ho m khng kh phng nui.
Giai doan 3: ko di trong 10-20h v dc trung nht v tao ra enzyme nhiu nht.
Cuong d trao di cht giam di cht t, nhit toa ra t hon nn tc d bc hoi nuoc cua
mi truong nui cy cung giam theo. Qu trnh nui cy duoc chm dut khi nm mc dat
d gi chn sinh l v bt du tao thnh bo tu.
2.5.2. Phuong php nui cy chm:
- Vi sinh vt duoc nui cy trong mi truong long voi co cht chu yu trong da s
truong hop l tinh bt. Chi c mt s t ging vsv dng ngun co cht cacbon l duong
glucoza, saccharoza. Thuc t, trong mt s truong hop nguoi ta duong ho so b tinh bt
truoc khi thanh trng (bng ch phm enzyme amylaza). Khi d duong maltoza duoc tao
thnh l cht cam ung tt, mi truong truong bi giam d nhot nn d dng cho qu trnh
khuy trn v suc kh.
-Mt s loai mi truong dinh dung d san xut ch phm enzyme amylaza dung trong
CNSX ruou etylic nhu sau:
Trang: 20
+Mi truong nui cy 40m
3
cua Trung Quc:
Bt khoai lang : 400kg
Bt bnh m : 240kg
Cm : 160kg.
NaNO
3
: 1,2kg
Nuoc vua du hm luong cht kh:3,33%
+ Mi truong san xut thu o nh my ruou H Ni:
Nuoc b ruou trong : 100 phn
Bt ng min :1,5-2 phn
Nuoc duong ho tu ng16% : 5-10 phn
(NH
4
)
2
SO
4
: 0,4-0,5 phn
P
2
O
5
: 0,4-0,5 phn
MgO : 0,15-0,20 phn
Diu chinh pH dat 5-5,5
- Phuong php nui cy b su di hoi phai duoc v trng tuyt di o cc khu v sinh
tng hop, thanh trng thit bi, thanh trng mi truong dinh dung, thao tc nui cy ,
khng kh cung cp cho qu trnh nui cy .
Cc giai doan cua qu trnh nui cy chm 1 buoc (1pha) gm: chun bi mi truong
nui cy, nui cy nm mc ging, nui cy nm mc san xut.
+ Chun bi mi truong nui cy :
Sau khi d phi trn dng ti l cc thnh phn s duoc khuy trn k ri thanh trng
bng hoi nhit (truc tip hay gin tip bng ni 2 vo), nhit d 118-125
o
C, thoi gian 15-
60pht, sau d duoc lm ngui dn nhit d 30
o
C th tin hnh gieo cy nm mc ging
vo.
+ Nui cy nm mc ging:
Duoc tin hnh qua 2 cp d (buoc), phng th nghim v men ging trung gian. O cp
PTN duoc thuc hin trong cc bnh cu, tit trng mi truong lm ngui, cy ging ri
nui trn my lc (150-200ln/pht). Nm mc su dung oxy khng kh qua nt bng v
qu trnh lc, thoi gian nui 46-50h. O cp pht trin ging trung gian nguoi ta chuyn
nuoc ging PTN vo thit bi nui d chua sn mi truong tit trng v lm ngui. Nui
cy c suc kh v trng voi luu luong 15-20m
3
/m
3
h, thoi gian 36-40h. Th tch dich men
ging bng 10% so voi dich men san xut v sau.
+ Nui cy nm mc san xut:
Trong qu trnh nui cy cn phai suc kh v trng v khuy trn, tip du ph bot nu
c hin tuong tao bot tro ra khoi ni ln men. Thoi gian nui 1-4 ngy tuy theo ging vi
sinh vt. Vic khng ch pH, ch d suc kh v bao dam v trng l nhung yu t quan
trong quyt dinh hiu qua qu trnh. Chng han nu mi truong duoc thm mui amni
cua NH
4
NO
3
th khi NH
4
+
duoc vi sinh vt su dung s chuyn mi truong v axit. Nu
su axit ho thu dng ny c anh huong su dn sinh tng hop enzym th cn phai b sung
CaCO
3
d trung ho hoc duy tr tu dng pH
opt
cho sinh tng hop. Nu ngun NaNO
3
th
khi vi sinh vt su dung NO
3
-
s cn lai Na
+
s kim ho mi truong, lc d lai phai dng
axit d trung ho. Tri s pH ban du cua mi truong nui cy c anh huong nht dinh dn
Trang: 21
su tao thnh enzym. V du: di voi enzym u-amylaza th pH
opt
cua ccloai vi khun l 7,
cua cc loai nm mc l 5.65.7.
2.5.3. Phuong php nui cy chm 2 buoc: (ln men 2 pha)
Vi sinh vt duoc nui trong thit bi du tin (giai doan du, buoc du tin, pha thu
nht) d pht trin dn muc d cn thit, sau d duoc chuyn sang thit bi ln men tip
theo (giai doan sau, buoc thu hai, pha thu hai) c thnh phn khc voi thit bi du d sinh
tng hop enzym.
Pha thu nht duoc goi l pha sinh truong (trophophase), pha thu hai duoc goi l pha
ch tao enzym (idiophase).
Din hnh cho phuong php ny xut pht tu vic pht minh qu trnh ln men cht
khng sinh streptomixin boi xa khun streptomyces griseus vo nm 1944 boi Schatz,
Bugie v Waksman.
Ngun gluxit m ging xa khun ny dng ho duoc d sinh tng hop streptomixin l:
glucoza, tinh bt, dextrin, mantoza, galactoza, mannoza. Ngun Nito duoc su dung l
protein cua bt du nnh, bt c, men kh, bt hat bng, gluten bt m (nhm xa khun
sinh tng hop khng sinh streptomixin ni chung du c hoat luc proteaza rt manh d
thuy phn cc protein ni trn thnh cc axit amin cn thit). Ngun Nito v co bao gm
cc mui amoni, photpho ho tan.
Ban thn qu trnh ln men streptomixin l cc qu trnh ln men 2 pha din hnh. Pha
sinh truong manh, bo tu ny chi v moc thnh soi sau 6-8
h
. Pha thu 2, khun ty pht
trin v bt du sinh tng hop khng sinh. Trong qu trnh ny (o pha thu 2) dng thoi
tao thnh mt phuc cua mannoza voi streptomixin goi l manozilostreptomixin c hoat
tnh khng sinh km hon 6 ln so voi streptomixin v c th coi dy l tap cht khng
mong mun trong qu trnh sinh tng hop. Tuy nhin phuc ny duoi tc dung cua enzym
u- manozilostreptomixinaza c tnh D-manoza d giai phng streptomixin vo nm 1969
Inamine v cc cng su d nghin cuu san xut enzym u- manozilostreptomixinaza theo
phuong php ni cy chm 2 buoc nhu sau:
Pha thu nht: T bo streptomyces gricus duoc nui trong mi truong dinh dung c
khuy trn v suc kh trong 17
h
o nhit d 28
0
C d tao nhiu bo tu. Sau d bo tu duoc
rua sach v chuyn sang thit bi tip theo.
Pha thu 2: Tip tuc nui cy d sinh tng hop enzym u- manozilostreptomixinaza
trong 18-24
h
. Lc ny tc d pht trin cua vi khun chm lai, nhung su chuyn ho phuc
cht manozidosteptomixin nhanh chng din ra duoi tc dung cua enzym thnh khng
sinh streptomixin.
2.5.4. So snh phuong php nui cy vi sinh vt sinh tng hop enzym :
- Phuong php nui cy b mt c nhung uu nhuoc dim sau:
+ Nng d enzym tao thnh cao hon nhiu ln so voi dich nui cy chm sau khi d
tch t bo vi sinh vt. Trong cng nghip ruou mun duong ho 100kg tinh bt chi cn
5kg ch phm nm mc b mt nhung phai cn dn 100lt nm mc chm d loc b v t
bo vi sinh vt.
+ Ch phm d dng sy kh m khng lm giam dng k hoat tnh enzym, ch phm
kh, d bao quan, vn chuyn, nghin nho hoc su dung truc tip nu khng cn khu
tch v lm sach enzym.
Trang: 22
+ Tn t nng luong (Din, hoi nuoc, cng nhn) thit bi, dung cu nui cy don gian,
c th thuc hin o qui m gia dnh, trang trai cung nhu o qui m lon dn 20T/ngy.
+ Nui cy trong diu kin khng cn v trung tuyt di v trong qu trnh nui cy
nu c nhim trng phn no, khu vuc no th chi cn loai bo canh truong phn d.
+ Tuy nhin phuong php b mt c nng sut thp, kh co kh ho, tu dng ho, cn
din tch nui lon, cht luong ch phm o cc me khng dng du.
- Phuong php nui cy b su c nhung uu nhuoc dim sau:
+ Phuong php nui cy hin dai (cng ngh cao) d co kh ho, tu dng ho, nng
sut cao, d t chuc san xut tit kim din tch san xut.
+ C th nui cy d dng cc chung vi sinh vt dt bin c kha nng sinh tng hop
enzym cao v lua chon ti uu thnh phn mi truong, cc diu kin nui cy, enzym thu
duoc tinh khit hon, dam bao diu kin v sinh, v trng.
+ Tuy nhin do thu duoc canh truong c nng d enzym thp nn khi tch thu hi
enzym s c gi thnh cao (c dt truoc). Tn din nng cho khuy trn, nu khng bao
dam v trng s bi nhim hng loat, ton b gy tn tht lon.
2.6. Tch v lm sch ch phm enzym :
(xem so d tng qut o trang 200 cua gio trnh)
- Muc dch yu cu: Cc ch phm enzym duoc su dung o cc dang khc nhau theo
muc d tinh khit (hoat d ring). Trong mt s truong hop, canh truong nui cy vi sinh
vt c chua enzym duoc su dung truc tip duoi dang th khng cn tch tap cht nu
chng khng gy anh huong dng k dn san phm v quy trnh cng ngh sau ny (V
du: san xut ruou, nuoc chm thuc vt, da). Cung c khi nguoi ta cn su dung ch phm
enzym tinh khit trong cng nghip dt, cng nghip mach nha, y hoc, nghin cuu khoa
hoc.
Enzym ni chung rt d bi giam hoat tnh duoi tc dung cua cc tc nhn bn ngoi do
d khi tch v tinh ch enzym d trnh su bin hnh protein anh huong lon dn hoat tnh
enzym cn tin hnh nhanh chng o nhit d thp, d pH thch hop khng c mt cc
cht gy bin hinh enzym.
2.6.1. Thu dich enzym :
- Di voi truong hop enzym cn nm trong t bo (enzym ni bo nui bng phuong
php b mt) th cn phai giai phng enzym bng cch ph v t bo thu nhiu cch nhu:
+ Nghin nho, nghin voi ct, nghin voi vun thuy tinh, nghin bi.
+ D t bo tu phn huy.
+ Dng tc dung cua siu m hoc tao p sut thm thu cao, trch ly (chin) bng
mui, dung dich mui trung tnh, dung mi huu co
+ Kt tua enzym bng cc cht din ly thch hop.
- Di voi truong hop enzym tit ra mi truong (enzym ngoai bo nui theo phuong
php chm), nguoi ta thuong tch sinh khi v cn b khoi canh truong bng cch
loc li tm, loc p c su dung tc nhn tro loc (diatomit, dt hoat tnh) hoc cc tc
nhn tro kt tua (V du: hn hop CaCl
2
+(NH
4
)
2
SO
4
CaSO
4
: lng cn ko theo
sinh khi nn loc d hon)
Trang: 23
2.6.2. Thu nhn ch phm k thut:
Ch phm k thut l ch phm enzym chua duoc tinh ch; c th chua mt vi loai
enzym chu yu, mt s loai protein khng phai enzym, cc cht n dinh v cc tap cht
khc. Dich enzym thu duoc o trn thuong c nng d cht kh thp 4-6g/l, buoc du
nguoi ta c dc chn khng o nhit d 35
0
C dn nng d 15-20g/l ri tip tuc xu l nhu
sau:
- Tip tuc c dc chn khng o nhit d 40-45
0
C d dat nng d cht kh 30-35g/l,
b sung thm cht bao quan nhu NaCl, glyxerin, sorbitol, benzoat ta s thu duoc
ch phm enzym k thut o dang c th bao quan o nhit d thuong duoc 1-2 nm.
- B sung thm cc cht n dinh d dat nng d cht kh 30-40g/l ri sy phun o
nhit d 120
0
C (nhit d kh thai 60
0
C), ch phm k thut thu duoc o dang bt .
- Kt tua enzym bng cc dung mi thch hop nhu: dung mi huu co (etanol,
izopropanol, axeton), dng mui trung tnh ph bin nht l (NH
4
)
2
SO
4
dung dich
bo ho. Sau khi li tm tch kt tua c th trn thm cc cht n dinh ri sy kh
v nghin min d thu duoc ch phm dang bt.
2.6.3. Thu ch phm enzym tinh khit:
Vic tinh ch enzym c th tin hnh bng nhiu phuong php qua nhiu giai doan:
- Ho tan ch phm k thut vo nuoc hoc dung dich nui CaCl
2
o nng d thch
hop hoc dung dich dm, kt tua tro lai bng etanol, axeton hay (NH
4
)
2
SO
4
. Qu
trnh ny cn tin hnh nhanh chng o nhit d thp d trnh su v hoat enzym.
Ngoi ra mui NaCl cung duoc hay duoc dng d kt tua cc enzym ngun gc
dng vt. Kt tua o pH gn dim dng din cua enzym. Sau khi kt tua cc mui v
co duoc loai di bng phuong php thm tch, thm thu nguoc hoc loc gel.
- Tch enzym bng phuong php hp phu chon loc:
Cho dich enzym chay tu tu qua ct cht hp phu (thuong l hydrat oxit-nhm,
silicagel) cc enzym khc nhau s duoc hp phu voi kha nng khc nhau, sau d dng cc
dung dich dm thch hop d chit rt enzym ra khoi ct. Phuong php dng d lm dm
dc enzym.
- Tch enzym bng phuong php trao di ion:
Dua vo su trao di ion giua enzym c din tch voi cc ion tri du cua cht nhua khi
cho dung dich enzym chay tu tu qua ct chua cc cht nhua trao di ion. Sau khi ct d
no (ht hiu luc) cho dung dich rua (dung dich cht din giai) c nng d tng dn chay
qua ct d dy ra khoi nhua cc enzym vua lin kt voi chng. Khi d enzym no c p
luc (lin kt) voi nhua km nht s bi dy ra khoi ct nhua truoc. Nhu vy cc enzym
khc nhau s duoc chit ra khoi ct theo tung phn chit khc nhau trong d cua phn
chit chua enzym cn thu voi nng d cao nht.
Cc nhua trao di ion thuong l cc cht nhua tng huu co : Dowex, Amberlit,
Wolfatit, Permuit, cc dn xut cua xenluloza.
Sau khi lm sach cn sy kh chn khng o nhit d thp hoc sy thng hoa. Enzym
tinh khit c hoat tnh cao hon nhiu so voi ch phm ban du. Nhung do qu trnh lm
sach rt khc khe v tn km nn loai ny chi duoc dng trong y hoc, trong nghin cuu
khoa hoc d xc dinh khi luong phn tu, cu trc enzym.
Trang: 24
Chuong 3: KY THUAT SAN XUT CHE PHAM T HAT CC NAY
MAM (MALT)
Malt l loai hat ho thao (hat cc) ny mm trong nhung diu kin nhn tao (nhit d,
d m, thoi gian) xc dinh goi tc l qu trnh u malt. Muc dch chnh trong qu trnh u
malt l trch lu duoc mt luong lon cc enzym (chu yu l enzym amylaza) trong hat,
duoc su dung trong cc linh vuc sau:
- Trong cng nghip san xut ruou etylic (cn, ruou etylic) tu nguyn liu tinh bt.
Malt l tc nhn duong ho tinh bt (phuong php san xut ruou ny c tn l
phuong php maltaza hay phuong php malt). C th dng cc loai hat nhu: dai
mach, la mach den, yn mach, k, ng d san xut malt loai ny.
- Trong cng nghip san xut bia malt vua l tc nhn duong ho tinh bt vua l
nguyn liu chnh (cng voi hoa houblon v nuoc) v c th c nguyn liu thay
th (Khng phai malt dai mach). Malt bia chu yu duoc san xut tu dai mach, ngoi
ra nguoi ta c th dng mt ty l malt thay th nhu thc mm.
- Trong cng nghip san xut mt tinh bt (duong nha, mach nha): malt vua l tc
nhn duong ho tinh bt vua l nguyn liu chnh. Malt loai ny duoc san xut tu
la, la m, ng, dai mach, k thm ch tu cu khoai lang ny mm. Mach nha san
xut tu malt vn l ngon nht, cho cht luong tt nht.
- Trong mt s ngnh san xut thuc n sinh dung, thuc n kin (cho nguoi bnh,
nguoi gi, tre em, gia xc, gia cm non). Malt duoc dng d phi ch vo thuc don
cua thuc n.
Qu trnh san xut malt bao gm cc khu sau:
Thu nhn, xu l, lm sach, phn loai v bao quan hat,
Rua, xt trng v ngm hat.
Uom mm (ny mm) ta s thu duoc malt tuoi.
Sy malt tuoi.
Xu l v bao quan malt kh.
3.1. Nguyn liu di mch:
Dai mach l cy hat cc o cc nuoc n doi, c khoang 30 ging khc nhau nhung chi
c mt ging c nghia kinh t l dai mach ma (Hordeum sativum) cn lai du l dai
mach dai. Hin nay din tch trng v san luong dai mach trn th gioi dung vi tr thu 4
sau la m, la, ng. Thuc ging dai mach ma c 130 loai khc nhau v duoc chia lm
3 nhm chnh: dai mach nhiu hng (6 hng v 4 hng)-Hordium hexatichum; dai mach 2
hng (Hordium disstichum) v dai mach trung gian (H. intermedium). Nhm c gi tri
trong san xut malt v bia l dai mach nhiu hng.
Dai mach sau khi thu hoach duoc phoi sy dn d m duoi 13% d bao quan cng
ging nhu cc hat ho thao khc, cu tao hat dai mach gm vo tru, vo qua, vo hat,
alorng, ni nhu v phi. Ti l trung bnh trong cc phn nhu sau:
Trang: 25
Tn b phn hat % khi luong ton hat
Vo tru
Vo qua
Vo hat
Alorng
Phi
Ni nhu
12
3,5 4
2 2,5
12 14
2,5 3
64,5 6,8
Thnh phn ho hoc trung bnh cua dai mach theo % cht kh nhu sau:
B
phn hat
Protein
(N*5,7)
Chtbo tinh
bt
Pentosan Xenluloza Tro
Hat
Vo
Phi
13,4
7,1
28,6
2,0
2,1
7,6
54,0
8,2
46,0
9,0
20,0
20,0
5,7
22,6
1,1
3,0
10,0
10,0
Khi luong 1000 hat dc trung cho d my cua hat nm trong khoang 15 60 gam v
nguoi ta chia thnh cc loai:
-Dai mach hat nhe: Khi luong 1000 hat toi 30 gam
-Dai mach tuong di nhe: Khi luong 1000 hat toi 31 40 gam
-Dai mach nng: Khi luong 1000 hat toi > 51gam
Kch thuoc hat di 8 10 mm, rng 3 4 mm, dy 2 3 mm.
Chi s cht luong quan trong cua dai mach d san xut malt v bia l d ny mm v
nng luc ny mm. Ngoi ra, dai mach cn duoc dc trung boi d chit v hm luong
protein. dai mach tt c d chit dat toi 82% v hm luong protein khng qu 12%. Nu
hm luong dat qu 12 % th d chit s thp, bia s bi duc; cn nu hm luong protein
qu thp s lm giam d bot v vi bia.
3.2. Lm sch v phn loi ht:
Khi hat c chua nhiu tap cht (bui, tap cht nhe nhu co, rom ra; tap cht nng nhu
soi d, vun kim loai...) do d cn phai duoc lm sach truoc khi dua vo san xut. Mt
khc, khi hat phai dam bao dng du d qu trnh ngm v ny mm duoc thun loi v
dng du.
Thng thuong nguoi ta lm sach v phn loai bng cc h thng sng thch hop:
- Sng kh dng: dng d tch tap cht v phn loai hat theo chiu dy, chiu rng cua
n theo cc tnh cht khi dng (dng quat).
Nu hat duoc phn loai theo chiu dy hat d san xut malt bia, nguoi ta duoc 3 nhm:
+ Loai I : b dy hat > 2,5 mm Dng d san xut malt bia tt nht.
+ Loai II : b dy hat > 2,2 2, 5 mm Dng d san xut malt bia tt nht.
+ Loai III : b dy < 2,2 mm Dphi liu, duoc dng d lm vic khc.
- Sng ng (Trier): D phn loai hat theo chiu di
- Tch tap cht kim loai dng nam chm kin trng.
Trang: 26
- So d cng ngh lm sach v phn loai hat
3.3. Rua, st trng v ngm ht:
3.3.1. Rua v st trng hat:
Hat duoc rua sach trong qu trnh ngm, cc cht bn theo nuoc v tap cht nhe s ni
ln d duoc tho ra ngoi. Trong qu trnh bao quan hat s bi nhim vi sinh vt, trng bo,
hat cht v hu hong khc. V vy, khi ngm nguoi ta thuong kt hop voi rua, st trng d
khi hat duoc sach, dng nht, kch thch su ny mm.
Mt s cc ho cht dng d st trng hat khi ngm:
- CaOCl
2
, Ca(OCl)
2
, HCHO 40 %: 700 gam/m
3
H
2
O
- H
2
SO
4
, KmnO
4
: 10 15 gam/m
3
H
2
O
- Ca(OH)
2
: 2 3 lit/100 gam hat
Trong d, Ca(OCl)
2
st trng manh, kch thch su ny mm nn hay duoc dng. Liu
luong 40 g Ca(OCl)
2
33% / 100 kg hat.
Ca(OH)
2
bo ho chi dng rua st trng ln thu 2, khng duoc cho vo ni o giai doan
ngm v n hay bm ln vo hat lm anh huong dn cht luong cua malt v bia. C th
dng H
2
O
2
d st trng v kch thch ny mm: liu luong 3 lit/m
3
H
2
O. Ch phm
Giberelia kch thch thuc vt duoc su dung ln du tin o nht Ban vo nm 1940 voi liu
luong 40 200 mg/1 tn dai mach, rt ngn thoi gian ny mm tu 8 ngy xung cn 5
ngy, giam gi thnh Malt 12 15 %. O Anh, 90 % ch phm Giberelia duoc dng trong
cng nghip malt.
3.3.2. Ngm hat:
- Muc dch d hat ht du nuoc cn thit d chun bi ny mm, ny mm v pht trin
mm.
- Bin di cua hat khi ngm:
+ Truoc khi ngm, hat c d m trung bnh 13 % du d duy tr kha nng sng.
+ Khi ngm, nuoc ngm (thm thu qua vo) vo hat, khi d m cua hat qu 15 % th
trong hat xut hin nuoc tu do, hat truong no dn (th tch hat tng trung bnh khoang
1,45 ln so voi ban du). Nuoc tu do thc dy cc qu trnh ho sinh c lin quan dn
hoat dng sng, h hp v hoat ho enzim.
+ Bin di ho hoc khi ngm khng dng k, hat h hp vn rt yu nn tiu tn
gluxit rt t, mt luong nho cc cht ho tan vo nuoc ngm: duong, pentosan, cht
khong, tiu hao cht kh khoang 1 %.
+ Hat ht nuoc th nng luc h hp tng, khi ngm hat tiu thu 63 mg O
2
/kg hat.h v
thai ra 86 mg CO
2
/kg hat. nu khng du luong oxi hat s h hp ym kh tao ra C
2
H
5
OH,
CO
2
, cc axit huu co... Da s l cc cht dc voi t bo, kim hm qu trnh sng bnh
thuong, dn dn ph huy cu trc t bo v hin tuong tu phn huy (gy hu hong hat, thi
rua, nhim vi sinh vt).
+ Tc d ngm nuoc phu thuc vo nhit d ngm nuoc, muc d thay nuoc, thng kh,
kch thuoc cua hat. Nhit d cua nuoc ngy cng cao th nuoc thm vo t bo ngy cng
nhanh. V khi d nhit d s lm tng su truong no cc cht keo (protein, tinh bt,
xenluloza,...), tng vn tc khuch tn (do chuyn dng nhit), giam d nhot, tng d h
Trang: 27
hp cua hat dng thoi tng kha nng nhim v pht trin cua vi sinh vt tap, nhu cu oxi
cua khi hat cung tng ln nhiu.
Dua vo nhit d cua nuoc ngm, nguoi ta chia ra cc ch d ngm nhu sau:
Ch d ngm Nhit d nuoc ngm
Ngm lanh < 10
o
C
Ngm thuong 10 15
o
C
Ngm m 20 40
o
C
Ngm nng 50 55
o
C
Trong d ch d ngm thuong duoc su dung rng ri nht, ngm m duoc su dung
trong ma dng, ngm nng thuong kt hop voi ngm thuong hay ngm m d xu l hat
(kiu ngm 3 si 2 lanh).
*Qu trnh ht nuoc cua hat dai mach khi ngm din ra theo d thi:
D thi biu din su thay di d m cua hat khi ngm
Khi d m khi hat dat khoang 40 % th tc d ht nuoc cua hat d bt du giam. Sau
96 h ngm d m khi hat dat cao nht khoang 47%. Dy cung chnh l muc d ngm
cuc dai cn thit.
+Cc thnh phn khong trong nuoc ngm anh huong dn tc d ngm hat. Nuoc
mm ngm nhanh hon nuoc cung, tt nht su dung nuoc c d cung 7mg duong
luong/lit. In Ca
2
+
lin kt voi polyphenol trong vo hat tao mui t tan c cu trc th keo
tao thnh bong bng trn vo ngn can su thm nuoc, mui Na
2
CO
3
lm tng vi malt cho
bia. Cc mui st gy kt tua dang Fe(OH)
3
, tc dung voi polyphenol lm cho hat c mn
nu. NaCl lm chm qu trnh ngm v ny mm, nng d mui ny qu cao c th git
cht mm.
- Cc phuong php v ch d cng ngh ngm hat: c nhiu phuong php ngm hat:
50
40
30
20
10
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
D m hat
(%)
Thoi gian ngm(h)
Trang: 28
+ Ngm trong nuoc-khng kh gin doan: Hat lc duoc ngm trong nuoc, lc duoc
ngm trong khng kh, mi chu ky ko di 3 6 h. Khng kh nn duoc thi cp cho ca
chu ky, mi ln thi tu 3 5 pht, cu 30 pht lai thi kh mt ln.
+ Ngm trong lung nuoc v khng kh lin tuc: Dng nuoc d bo ho khng kh
duoc phun lin tuc vo b ngm hat (cn c thit bi bo ho khng kh). Voi phuong
php ny muc d ngm hat duoc nhanh, rt ngn duoc qu trnh ny mm.
+ Ngm hat trong lung nuoc phun: Khi hat duoc phun nuoc lin tuc chay thm qua
lop hat tu trn xung duoi ri chay vo rnh thot nuoc. Nhu vy nuoc chi luu lai trong
hat mt thoi gain nht dinh no d. Phuong php ny cho php hat duoc thng kh tu
nhin lin tuc, mm hat mau xut hin v pht trin.
+Ngm hat trong lung khng kh - nuoc phun: Dy l phuong php kt hop giua
ngm trong nuoc lin tuc v giu hat o tang thi hiu kh (di moi khng kh) bng cch
ht kh cua khi hat.
Sau khi rua xong, hat duoc phun tuoi nuoc trong 15 pht. Sau d ht khng kh tu
pha duoi (bng quat hay bom ht) trong 15 pht ri d yn trong khng kh mt gio, ri
lai phun tuoi nuoc...cu nhu th cho dn khi hat dat d m yu cu.
D san xut matl bia, muc d ngm dai mach khoang 42 48 %. D san xut matl
duong ho khi san xut ruou etylic th thoi gian ngm thuong ngn: dai mach, la mach,
yn mach: 12 18 h; mach den: 12 14 h, ngm nuoc 15 20
0
C cho dn muc d ngm
3840 %. Hat k, la l ging ua m nn ngm trong nuoc 2530
0
C trong 2224
h
dn khi
dat duoc muc d ngm 3537%.
Thuong qu trnh ngm kt thc th thy r con xut hin.
3.4. Ny mm:
Thuc t qu trnh ny mm c th bt du o giai doan ngm khi muc d ngm hat dat
25 ( 30 %. Lc d cc h enzim tu trang thi nghi duoc dnh thuc tro lai hoat dng o
diu kin nhit d, d m thch hop. Kt qua l cc polyme du tru khng tan (tinh bt,
protein, hemixenluloza, xenluloza) bi thuy phn mt phn (bin hnh) thnh cc cht tan
c kha nng nui sng mm v r.
Trong giai doan du cua qu trnh ny mm, trong hat xay ra cc qu trnh sinh l, ho
sinh tuong tu nhu khi hat ny mm tu nhin (trong dt khi gieo hat), trong dung dich dinh
dung (thuy canh), duoi tc dung cua d m, nhit d, kh CO
2
trong khng kh, phi hat
pht trin s tao nn mm v r phi, cht dinh dung nui phi hat duoc ly tu ni nhu
cua hat. i d, duoi tc dung cua h enzim s chuyn ho cc cht o vi tr cao phn tu v
dang cc cht ho tan don gian d phi hp thu duoc. Tuy nhin, khi phi hat cng pht
trin th tiu hao cht kh trong hat (chu yu o ni nhu) cng lon. Bng cch khng ch,
tc dng cc diu kin cng ngh d phi hat (mm v r) pht trin mt cch hop l nht
d tiu hao hm luong cht kh l nho nht nhung cho php tch lu duoc nhiu enzim
nht (tru h enzim oxy ho). Dy l muc dch chu yu cua qu trnh san xut matl, v
cung l dim khc bit giua ny mm nhn tao v ny mm tu nhin.
Khi ny mm, trong hat dai mach s xay ra cc qu trnh chu yu sau:
- Qu trnh sinh l: Su pht trin cua phi xay ra dng thoi voi su h hp v tng hop
mt s cht moi, m quan trong nht l mt s enzim cn thit.
Trang: 29
- Qu trnh sinh ho: Thuy phn cc cht du tru trong ni nhu.
- Qu trnh ho hoc: Tc dung tuong h giua cc cht tao thnh khi thuy phn, hnh
thnh cc cht thom, cht c vi matl.
- Qu trnh vt l: Vn chuyn m v cc cht du tru ho tan tu ni nhu di nui phi v
nguoc lai.
3.4.1. Su hnh thnh v hoat dng cua cc h enzim dng thoi nhung qu trnh
xay ra trong qu trnh ny mm:
Hat dat d chn v kh (W_13%) th cc enzim trong hat o dang lin kt (khng hoat
dng) nm trong t bo cua hat. Trong qu trnh ny mm chng duoc giai phng ra o
dang tu do hoat dng, dng thoi hat cng c kha nng hnh thnh nn nhung enzim hoat
dng moi.
- H enzim oxy ho - khu:
Hoat dng cua h enzim ny l buoc chun bi ban du cho qu trnh ho sinh tip theo
cua su ny mm.
C th k dn cc enzim oxy ho hon: oxydaza, peroxydaza v catalaza san phm
phan ung xc tc o qu trnh h hp cua hat bao gm: H
2
O, CO
2
v O
2
. Cuong d h hp
phu thuc rt nhiu vo nhit d v luong O
2
tham gia. Trong khoang nhit d 1030
0
C,
nhit d tng s lm tng cuong d h hp, dng thoi hoat tnh cua da s cc enzim cung
tng dn dn lm tng su tn tht cht kh.
Qu trnh h hp km theo su thai nhit: 673 kcal/phn tu gam duong.
Trong hat ngm c 23 % duong (tnh theo hm luong cht kh), trong qu trnh ny
mm do thuy phn nn luong duong tng thm khoang 20%. Khoang 910% luong
duong tn hao do h hp, 35% tn hao do su pht trin cua mm v r, cn lai di vo
thnh phn cua malt. Nhu vy, ta thy qu trnh h hp tiu thu mt luong duong kh lon
nn luong nhit toa ra nhiu.
Mt s axit huu co c sn v hnh thnh trong qu trnh ny mm nhu: oxalic, xitric,
malic, lactic, formic, axetic, propionic,... Nu oxi khng cung cp dy du (trang thi ym
kh) dc bit o giai doan du cua qu trnh ny mm s xay ra hin tuong h hp ym kh
tao nn ruou etylic C
2
H
5
OH v CO
2
. Nu hm luong C
2
H
5
OH sinh ra lon dn muc d
nht dinh s uc ch t bo sng v dnh chi su pht trin cua mm. Tip d, cc san phm
tuong h cua ruou v axetic l este tao ra trong malt tuoi c mi dc trung.
D dc trung cho muc d h hp nguoi ta dng h s h hp k=CO
2
/O
2
. Chng han su
oxi ho duong trong diu kin hiu kh duoi tc dung cua enzim oxydaza:
C
6
H
12
O
6
+ 6O
2
6 + 6H
2
O + 2322kJ
K=
2
2
O
CO
= 1
Khi oxi ho cht bo : K = 0,5 ; protein K = 0,8
Khi h hp ym kh K > 1
Su khc nhau giua qu trnh ngm v nay nm l o ch h s h hp k khi ngm
thuong > 1 , khi ny mm K = 0,74-1,00. Tu d nguoi ta khng dinh khng phai su hao
tn cht kh v luong nhit thai ra do h hp trong qu trnh ny mm l hon ton tu
gluxit (tinh bt v duong)
Trang: 30
- Enzim Sitaza: dy l tp hop enzim gm sitoplastaza v sitaza chng hoat dng du
tin ngay khi hat vua ny mm v duoc goi l qu trnh sitoliza. Nhung enzim ny phn
ct hemixenluloza v polisacarit khc o dang gel d hnh thnh cc san phm c gc C
5
,
C
8
,... Su phn ct hemixenluloza nho enzim sitaza khi ny mm dng vai tr rt quan
trong trong san xut malt. Nho d mng ngn cch giua ni nhu v vo tru bi ph v tao
diu kin cho cc enzim amylaza v proteaza d dng hoat dng trong lng ni nhu.
-Enzim amylaza: Nhm enzim ny trong dai mach ny mm bao gm u-amylaza, -
amylaza v amylofattaza tp trung chu yu trong ni nhu, chi c mt s t trong mng
ngn giua ni nhu v vo tru.
+Hoat tnh u-amylaza tng sau khi ny mm 36 ngy v hoat tnh ny dat duoc
cuc dai phu thuc nhit d ny mm:
O: t
nm
= 1214
0
C H
dmax
= 1112 ngy
t
nm
= 1820
0
C H
dmax
= 67 ngy
t
nm
= 2528
0
C H
dmax
= 45 ngy
+-amylaza c sn trong hat dai mach o dang lin kt v tu do. Trong qu trnh
ny mm hoat tnh -amylaza tu do tng ln 34 ln.
+Amylophotphataza tu do khng c trong dai mach m chi duoc hnh thnh sau
ngy ny mm thu 2, sau 8 ngy th dat cuc dai nn hoat tnh tng 150200 ln.
Su tng hoat tnh chung cua amylaza sau khi ny mm - k hiu l DC (hoat luc
diastaza) duoc xc dinh bng luong duong maltose tao thnh, c th biu din theo don
vi Vindich-Cotback (
0
Wd ) hay theo don vi Lintner (
0
L ) voi quan h:
o
L=
5 , 3
16 + Wd
o
Tc dung cua amylaza dn cc qu trnh ho sinh nhu ny mm v dc bit trong qu
trnh duong ho sau ny c nghia dn suc quan trong trong qu trnh san xut bia
ruou, mach nha.
Muc dch cua qu trnh ny mm chu yu d tch tu tht nhiu amylaza hoat dng d
khi duong ho chng c th chuyn tinh bt (cua chnh malt v cua cc nguyn liu thay
th malt) thnh cc san phm trung gian (dextrin) v cc duong nhu maltotriaza,
maltotetroza, maltodextrin, glucoza, maltoza. Ngoi ra khi ny mm cn tao thnh mt
luong dng k duong saccaroza v mt t duong fructoza (tng hop trong phi). Tt ca
cc loai duong lm cho malt c vi ngot, hm luong cua chng trong malt tng ln 34 ln
so voi trong hat ban du
( trong hat ban du c 2,32,5% duong, trong malt tuoi c 8,59% duong ).
Trong thoi gian ny mm c khoang 10% tinh bt bi bin di, trong d khoang
4,55% tinh bt bi hao tn do h hp v tao r, mm phi, luong tinh bt cn lai bi bin
hnh (thuy phn c muc d) nhu o trn d trnh by. Kt qua lm cho tnh cht tinh bt
cua malt khc voi tinh bt ban du: kch thuoc hat tinh bt giam, d rng (xp) giua cc
hat tinh bt tng ln, ti l Am/Ap cung c thay di,
-Enzin proteaza: C hoat tnh trong hat ban du khng dng k nhung khi ny mm d
tng ln 48 ln, tng nhanh hon hoat tnh amylaza v dat cuc dai vo khoang ngy ny
Trang: 31
mm thu 5. Su thuy phn protein bt du bng tc dung cua proteinaza d tao thnh
albumoza, polypeptit, pepton v sau d duoi tc dung cua peptidaza tao thnh cc axit
amin. Tuy nhin su bin di ny thuong khng hon ton (dn cc san phm cui cng
l cc axit amin) v cc diu kin ny mm (cc thng s ny mm) thuong khng phai
l diu kin ti thch cho hoat dng cua h enzim proteaza cua hat.
Chng han: t
opt
peptidaza < 50
0
C pH
opt
peptidaza = 7,68
t
opt
proteinaza = 60
o
C pH
opt
peptidaza = 4,5 5
t
ny mm
_ 60
0
C pH
hat
= 6,87
Tuy nhin, v nhit d ny mm tuong di thp v thoi gian ny mm ko di s c su
thuy phn protein tuong di su sc d tao thnh mt luong dng k cc polypeptit v
axit amin. Tc dng ny chi din ra voi ni nhu, trong khi protein o lop ngn cch ni
nhu voi vo v ca phn vo malt th khng bi bin di ca trong cc qu trnh ch bin v sau
(sy malt tuoi, bao quan malt, nu v duong ho khi san xut bia, mach nha). Chng s
tn tai trong b malt khi lng, loc dich duong.
Su thuy phn protein boi enzim proteaza lm tng luong nito ho tan (albumiza,
pepton, polypeptit, axit amin), mt phn cc cht ny d bi kt tua khidun si dich duong
(voi hoa hublon - tuc qu trnh hublon ho trong san xut bia). Phn khc vn tn tai o
dang ho tan, phn ny dc bit c gi tri trong san xut bia (l ngun nito huu co cho
nm nem, tao bot, kt tua d tu lm trong, tao vi bia...) voi ti l thch hop, nu qu cao th
bia d bi duc v duc tro lai khi tn tru bia.
Su bin di cc san phm thuy phn proteaza khi ny mm dai mach duoc th hin
trong bang 4 (trang 139-1)
Qua bang ny, ta thy trong khoang nua thoi gian cua qu trnh ny mm (tu ngy 1 (
4), san phm thuy phn protein tng lin tuc, dn nua thoi gian sau th dung lai hoc giam
dn. C th giai thch diu ny l do hoat tnh cua enzim proteaza giam dn v s n dinh,
v mt phn san phm thuy phn duoc dng vo vic tao mm v r phi (chim 1112%
luong protein cua hat).
Chi s quan trong dc trung cho qu trnh thuy phn protein khi ny mm ni ring v
muc d thuy phn cua malt ni chung l luong nito formol (luong san phm nito bc thp
duoc tao thnh c chua nhm axit cacboxylic _COOH tu do nhu axit amin, peptic...).
Hoat tnh enzim proteaza duoc xc dinh theo chi s ny (phuong php chun d formol)
bng hiu s cua luong nito formol tng cng (chung) khi duong ho (tai thoi dim cn
xc dinh hoat d enzim) v luong nito formol ban du.
- Enzim esteraza: Xc tc cho qu trnh este ho, trong dai mach chu yu l nhm
enzim photphotaza bao gm: fitaza, saccarofotfataza, glicero fotfataza, nucleotidaza v
amylofotfataza.
+Bin di quan trong dc trung l su thuy phn phitin duoi tc dung cua enzim
fitaza d giai phng ruou inozit, mui fotfat v axit fotforic tu do.
+Saccaro fotfataza, glicero fotfataza, nucleotidaza thuy phn mi lin kt este cua
cc cht huu co chua fotfat tuong ung v giai phng ra axit fotforic tu do.
Trang: 32
+Amylofotfataza ct gc axit fotforic cua phn tu amylopectin. Do kt qua cua
qu trnh tch tu v bin di enzim m luong cc cht ho tan (cht chit) tng dng k:
ban du chi c 6,58%, khi ny mm tng ln 26% (tnh theo cht kh) nhung do tn hao
h hp v tao mm nn cn lai trong malt l 1415%.
Cuong d h hp v cc qu trnh bin di ho sinh khi uom mm phu thuc vo muc
d thng kh, tuc l phu thuc vo ti l O
2
/CO
2
trong khi hat dang uom mm. Trong
khoang nua du thoi k uom, xay ra su tch lu enzim lon nht th su thng kh l cn
thit (ngy 14). Sau d nn dung thng kh d giu luong CO
2
lai (nng d khng qu
20% trong hn hop kh) d han ch ti da su h hp cua phi (nhm han ch su hao hut
ti da do h hp). Khng kh thi cho khi hat cn c d m W=98 100% v nhit d
phai b hon nhit d uom 23
0
C.
3.4.2. Dc dim uom mm cua cc loai hat khc nhau:
Nhu trn d ni, voi muc dch su dung malt khc nhau m nguoi ta dng cc loai hat
khc nhau d san xut voi ch d cng ngh ph hop.
- Trong san xut malt dng lm tc nhn duong ho trong cng ngh ruou etylic th
cht luong malt duoc dng gi bng hoat tnh tng qut cua h enzim amylaza. Nu uom
mm o nhit d 1416
0
C trong t
tg
trong thoi gian di th s tch lu duoc rt nhiu cc
enzim u,_amylaza, dextrinaza. Chng han: Dai mach 10 ngy, yn mach 1012 ngy,
mach den 78 ngy, k 56 ngy.
-Trong san xut bia, d san xut malt sng mu (malt vng) nguoi ta uom mm o nhit
d khng qu 18
0
C. D san xut malt den (malt caramen) nguoi ta uom mm o nhit d
cao hon nhung khng vuot qu 25
0
C, thoi gian uom di hon d qu trnh thuy phn tinh
bt v protein duoc su hon.
- Trong san xut mach nha, malt cung l tc nhn duong ho (chnh thuc hoc b sung
- duong ho so b), nu yu cu thoi gian uom mm di hon, o nhit d cao hon la :12
ngy, k: 7 ngy, ng: 8 ngy, to=2832
0
C.
3.4.3. Cc phuong php ny mm:
- Ny mm khng thng gi:
Dy l phuong php c din hin vn cn su dung nhiu trong cc co so san xut malt
bia cung nhu malt mach nha, nng sut tu loai rt nho dn rt lon (vi trm tn hat /
ngy). Sn uom mm bng xi mng phng, nhn, hoi nghing d d thot nuoc. Trong
phng uom cn dt quat dy, quat ht d luu thng khng kh v h thng diu ho nhit
d nhn tao (nu sn uom chm mt nua s duoc loi v nhit d diu ho nhung kh thot
nuoc v vn hnh).
Hat sau khi ngm duoc d thnh dng trn sn ri san du thnh lop dy ban du
khoang 40 cm, sau d giam dn cho dn 1012 cm o giai doan cui. Thuong xuyn dao
trn lop malt, thng gi d dui CO
2
v cung cp khng kh moi. C th chia lm 3 thoi
k ny mm nhu sau:
+ Thoi k 1: (2 ngy du) tng dn nhit d dn 1314
0
C, dao trn 23 ln / ngy.
+ Thoi k 2: (3 ngy tip theo):nhit d khi hat tng nhanh do h hp manh. Nhit
d cao nht cho php di voi malt vng 1617
0
C, malt den 1920
0
C, dao trn 34 ln /
ngy.
Trang: 33
+ Thoi k 3: (2 ngy cui) cuong d h hp v ny mm giam, dao trn 23 ln /
ngy. R mm bng 1/5 ln chiu di hat, mm di 3/4 ln chiu di hat.
- Ny mm thng gi trong ngn:
Phng ny mm gm cc ngn ho hnh chu nht: di 1015 m, rng 34 m, cao 1,82
m, dy hoi nghing d d thot nuoc, cch dy 60 cm dt mt luoi sn c l voi din tch
l 1520 % din tch sn, mi ngn c th chua duoc 1012 tn hat kh.
Hat ngm xong d vo cc ngn ri san du theo chiu dy cua lop malt trong ngy
ny mm, luong nuoc ngm thua trong hat theo l luoi sn xung dy ri ra ngoi. Malt
duoc dao trn nho my dao truc vt xon thng dung. Thi khng kh kh vo lop hat
(qua sn dy) sau 1820h th thi khng kh lanh v m ri dao trn. Ch d lm vic cua
ngn ny mm xem o bang sau. (bang 5-trang 115).
Sau khi ny mm xong, malt tuoi duoc vn chuyn dn l sy (nu d san xut bia hay
mach nha), hoc my nghin sua malt (lm tc nhn duong ho trong san xut ruou, tinh
bt).
- Ny mm thng gi trong thng quay:
Thit bi l thng hnh tru bng thp, dt nm ngang trn hai gi d v quay duoc trn
hai gi ny nho dng co quay thng voi h thng truyn dng bnh rng. C hai loai
thng quay: kn v ho. Trong d, thng dung hon l loai thng quay kn, chiu di thng
46 m, duong knh 2,33 m dam bao d ny mm duoc 1012 tn hat kh. (xem hnh 47
trang 156).
Hat ngm xong duoc dua vo qua cc cua pha trn thng ri phn b du trn luoi
thp. Khng kh lanh v m thi vo thng qua cc lop malt dang quay theo thng ri
theo cc ng gp ra ngoi thng (nho quat dy - ht). Thoi gian ny mm 7 ( 10 ngy, tc
d quay thng 2,53 h/vng.
Sau khi ny mm xong cho thng quay vo vi tr nguoc voi lc nap hat ri mo cua
chn d tho hat ra qua chnh cua nap ban du.
- Ny mm theo phuong php bn lin tuc v lin tuc: (xem ti liu tham khao)
- Dnh gi cht luong malt tuoi:
Cht luong malt tuoi duoc dnh gi qua phuong php phn tch cam quan, hoat d
enzim v thnh phn ho hoc v thuong duoc gn lin voi muc dch su dung malt (san
xut ruou, bia hay mach nha). Malt tuoi tt c mi dua chut, nu malt c mi ch, vi
thiu c th do malt bn, bi nhim VSV, khi ny mm khng dng ch d cng ngh. Hat
malt phai mm, nu hat cn cung hay nho nt th coi nhu phm cht xu.
Yu t quan trong d dng gi cht luong malt l ti l ny mm v chiu di, d lon
cua mm, r. Malt tt c ti l ny mm trn 85%, di voi malt vng chiu di mm
2/33/4 chiu di hat, malt den c chiu di mm 1/21 chiu di hat, r di 1,22 cm.
Chi tiu quan trong cua malt l hoat tnh enzim. Sau dy l bang chi tiu hoat tnh
enzim di voi malt dng cho san xut ruou.
Tt Kh Trung bnh
Loai malt AC
(g/g.h)
DC
(mg/g.h)
AC
(g/g.)h
DC
(mg/g.h)
AC
(g/g.h)
DC
(mg/g.h)
Trang: 34
Dai mach
Yn mach
Malt den v la my
K
>6
>5
>7
>3
>35
>45
>35
>100
4-6
3-5
4-7
2-3
25-35
35-45
25-35
70-100
3-4
2-3
3-4
1-2
15-25
25-35
15-25
50-70
Ghi ch:
AC - hoat tnh amylaza: kha nng thuy phn tinh bt thnh mantoza v cc dextrin
khng lm di mu dung dich it, don vi =g tinh bt / g malt trong 1 h o nhit d 30 oC.
DC - Nho kha nng thuy phn cc dextrin thnh maltoza, don vi = g dextrin / g malt o
nhit d 30
0
C.
Cht luong malt dng d san xut bia truoc ht l hoat tnh amylaza (AC) duoc biu
thi bng luong maltoza tao thnhtu tinh bt duoi tc dung cua enzim c trong 100 g malt
vng tuoi tt c AC bng 300 - 400, malt den tuoi tt c AC = 400 - 500.
3.5. Sy malt:
Malt tuoi c d m cao (42 - 45%) nn khng th bao quan duoc (tru malt tuoi dng)
trong san xut ruou s duoc dem di nghin thnh sua malt - l ch phm enzim duong
ho. Mt khc, mi vi v thnh phn ho hoc, cu trc cua malt tuoi khng thch hop cho
vic san xut bia (trong mach nha) nhu: hu nhu khng c cht mu, cht thom (thm
ch c cht thom phan tc dung voi bia), thnh phn protein c th lm giam d bn ho
l cua bia (bia d bi duc, bot khng bn), khng c tnh cht nghin v thnh bt...Va lai
malt vn l nng san ch bin c thi truong ton cu (thuong mai th gioi) nn nht thit
phai sy malt.
Khi sy phai ch dn giu lai duoc du luong enzim (d tch lu duoc trong qu trnh
ny mm) cho san xut bia (hay mach nha). Mun vy khi xy dung d thi sy malt phai
hiu r quan h giua nhit d sy v d m cua malt (c tnh dn d bn cua enzim do
nhit d v d m. D m malt khi sy cng cao th enzim v hoat cng nhanh).
V du: Khi sy malt vng: o giai doan hat c d m 30% th nhit d sy cho php l
40
0
C. khi sy o nhit d 50
0
C th d m malt phai giam cn12%. Nu nhit d sy tng
dn 60
0
C th d m malt cn 8%.
Malt den c th sy o nhit d cao hon malt vng, tuy nhin nhit d sy khng duoc
qu 104
0
C d khng ph huy nhiu enzim .
Khi malt c d m cao, nu tng nhit d sy cao s tao nn malt dang keo kh v o
khoang nhit d 60 oC xay ra hin tuong h ho tinh bt, nu tip tuc nng nhit th tinh
bt chuyn sang trang thi thoi ho - tao thnh hat cung. Trong khi d, mt s protein bi
tc dung boi enzim proteaza s ho tan v thm vo hat tinh bt v chuyn sang dang
keeo khi bi mt nuoc. Malt dang keo kh do tinh bt v protein bi bien hnh nn giam d
ho tan, giam d chit.
3.5.1. Nhung bin di cua malt trong qu trnh sy:
Theo d tng dn cua nhit d khi sy m ta c th chia ra lm 3 thoi k nhu sau:
- Thoi k sinh l: nhit d sy tng dn v dat dn 45
0
C: malt v r vn tip tuc pht
trin, d m cn khoang 30%, su bin di do thuy phn, do enzim vn tip tuc.
-Thoi k men (enzim ): Nhit d sy tng dn tu 45 - 70
0
C: Cc qu trnh sng bi
ngung lai: khng h hp, mm r khng cn pht trin nhung su thuy phn v nhung
Trang: 35
bin di khc trong ni nhu vn xay ra rt manh v nhit d ti thch cua da s men nm
trong khoang 45 - 60
0
C. O thoi k ny, d m cua malt den tu 20 - 30
0
C, cua malt vng
cn 10 %.
-Thoi k ho hoc: Nhit d sy tng tu 70 -105
0
C: O nhit d > 75
0
C th cc hoat dng
cua enzim bi ngung tr v mt s enzim bi v hoat mt phn (do nhit d cao), s co lai
bi cc cht keo cua hat hp thu v chuyn sang trang thi khng hoat dng. V du: O
nhit d > 40
0
C, enzim peptidaza ngung hoat dng, o nhit d 60
0
C cc enzim sitaza v
phytaza mt hoat tnh v enzim amylaza giam hn hoat tnh. Ring di voi enzim
proteinaza do kha nng chiu nhit rt lon nn hoat tnh giam rt t khi sy malt vng.
Thoi k ho hoc duoc dc trung bng su tao thnh cc cht thom, su bin hnh protein,
su lm yu hay v hoat tung phn cc enzim.
Qu trnh quan trong nht xay ra trong qu trnh sy l phan ung melanoidin do tc
dung tuong h giua nhung cht chua nhm cacbonyl (-COO) voi nhung cht c nhm
amin (-NH
2
). Kt qua malt sy tro nn c mu ti (sm) hon, c mi vi dc trung cua
malt bia (hay malt mach nha). Theo Hydge, qu trnh tao melanoit trong khi sy malt c
th tin trin theo 3 giai doan:
+ Giai doan du: c dc (nng cao nng d) cc cht duong v axit amin do mt
nuoc khi sy d tao thnh cc tinh th khng mu.
+ Giai doan giua: xay ra su khu hydro, be gay phn tu duong, phn tu axit amin d
tao thnh cc cht khng mu hoc c mu vng nhat, c tnh khu manh, tiu biu l mt
s cht nhu:CH(OH)C(OH)CHO, hydroquinon (khi bi khu hydro chng
tro v dang quinon ban du). Nhung cht khu ny cng voi nhung cht khu duoc tao
thnh trong cc qu trnh nu bia (duong ho, dun si dich duong voi hoa hublon) dng
vai tr rt quan trong trong qu trnh oxy ho - khu cua cng ngh bia. Chng truc tip
tao nn mi vi, d bot cho bia, l cc cht bao v chng lai su oxy ho, chng lai su kt
tua keo lm cho bia duc
+ Giai doan cui: tao thnh nhung cht c mu sm.
Tc d phan ung melanoit phu thuc vo nhit d, pH, thoi gian, thnh phn cc cht
tham gia. Trong s cc axit amin tham gia manh nht l glixin v alanin, san phm
melanoit cua chng cho mu rt dm v c mi bia, cho mi thom manh hon ca l valin
v loxin, phenylalanin v valin cho san phm c mu ti, mi hoa hng nhe, loxin cho
san phm nhat mu v c mi bnh my r. Trong s cc duong tham gia phan ung
melanoit theo thu tu l: arabinoza > glucoza > galactoza > fructoza, trong d cc pentoza
manh nht l duong cexitoza. Thnh phn nguyn t cau melanoit nhu sau: C= 54 - 60%,
O= 31,3 - 35,1%, H=4,9 - 5,2, N= 3,5 - 5,3%
Chng c chua cc nhm -CO, -COOH, -OH, M - 1480. Ttrong ngnh bia, melanoit
c nghia rt quan trong: gy mu v mi thom dc bit, do c kha nng hoat dng b
mt rt manh nn l nhung cht tao bot tt, dng vai tr bao v cc keo d ngn can su
kt tua keo khng bn vung, c kha nng khu manh lm tng d bn, chng hin tuong
duc bia do bi oxy ho.
3.5.2. Cc phuong php v ch d cng ngh sy malt:
- L sy nm ngang hai tng hoat dng tun hon:
Trang: 36
Dy l loai l sy c din voi phuong php sy di luu cung buc, hin nay vn duoc
su dung rt ph bin o nhung nuoc c san xut malt. Dy l mt to nh cao 20 - 25 m
hnh vung hay chu nht c 5 tng voi cc chuc nng: tng 1 dt l dt, tng 2 l bung
nhit c dt clorifer, tng 3 la bung trn khng kh de sy, tng 4 l mt sng luoi v
tng 5 l mt mt sng sy trn cng c ng ht v quat ht d thai m ra ngoi. Sng sy
lm bng luoi thp dan dy voi din tch l chim 30 - 35% din tch sng.
+ Tin hnh sy malt vng:
Malt tuoi nho gu tai chuyn ln sng sy trn voi chiu dy lop malt 14 - 22 cm. tng
nhit d sy du dn sau 6 gio dat 30 - 35
0
C, d m cn 2%. Sau 6 h tip tuc dat 50
0
C, d
m xung cn 8 - 10 %. Nhu vy phn lon m cua malt duoc tch ra tai dy. Diu kin
quan trong d thu duoc malt vng cht luong tt l nhit d sy khng duoc qu 40
0
C
khi d m chua ha xung duoi 12 - 14%.
Sau 12
h
sy o sng trn, malt duoc chuyn xung tip tuc sy kit o sng duoi. Sau 11
- 12
h
, nhit d sy tung ln 55 - 80
0
C, d m cn 2,5 - 3,3%. Sau khi sy xong, malt duoc
dn dng lai d chuyn sang khu gia cng tip tuc. Ch d sy malt vng (xem o bagn 6
- trang 170 cua gio trnh).
+ Tin hnh sy malt den:
Malt den sy lu hon v phuc tap hon malt vng. Du tin malt tuoi cung duoc d vo
v trai du ln sng sy trn voi lop malt dy 22 -30 cm. Giai doan du di 14h tng
nhanh nhit d dn 40
0
C, d m xung 20%. Trong 3- 5h tip theo tng dn nhit d 60
- 65
0
C, tng cuong dao trn. Sau 24
h
th sy xong o sng trn, malt s duoc chuyn
xung sy o sng duoi. Tip tuc thoi k sy thu nht trong 9 - 10h o nhit d 50 -55
0
C, d
m xung cn 8 - 10%.Thoi k thu hai nhit d tng ln: trong 4 - 6
h
nhit d tip tuc dat
75
0
C, d m xung cn 5%, trong 3 - 4
h
. Sau nhit d tng dn ln 100 -105
0
C cho dn
khi sy xong voi hm m cui cng dat 1,5 - 2%.
V malt den san xut lu hon, hao tn cht kh nhiu hon nn gi thnh malt den v
bia den dt hon malt vng v bia vng. D phn no ha gi thnh, nguoi ta san xut mt
s loai malt dc bit nhu malt caf, malt mecan d thay th mt phn hay ton b malt
den khi san xut bia den.
Ch d sy malt den (xem bang 7 - trang 171 cua gio trnh).
- L sy nm ngang mt tng:
Dy l loai l sy tuong di moi theo phuong php sy di luu cung buc. Tuc l tc
nhn sy l khng kh nng duoc thi cung buc qua lop malt c d dy 8 - 10cm m
khng dao trn. Tin hnh sy theo phuong php nguoc chiu tinh d tit kim nhit v
dat d m cui cng cua malt. Nghia l tc nhn sy ban du duoc dem di sy cho lop
malt d duoc sy kh bng sng thu hai bc hoi tc nhn sy mang m cua chnh sng
du tin ny. Sau khi malt sy xong chuyn di gia cng tip th lai chuyn malt tuoi dn
d sy so b tip tuc (di chiu tc nhn sy)
- L sy hoat dng lin tuc:
Trn co so nhung loai thit bi sy hat kiu thp d loi dung tnh tu chay cua khi hat,
Vin Hng Lm Nng Nghip latvia (mt nuoc Cng Ho thuc Lin X cu) d thit k
v ung dung thit bi sy malt hoat dng lin tuc kiu thp, goi tt l LCXA. Thp sy cao
Trang: 37
15 m duoc chia thnh 3 khu chnh: khu tip nhn v sy so b malt tuoi, khu sy v khu
cp nhit - thu nhn san phm. Cu tao cua l sy xem hnh 51 - trang 173 cua gio trnh.
Thit bi sy lm vic nhu sau:
Malt tuoi duoc gu tai chuyn ln bonke chua v tai dy n duoc sy nng so b o
nhit d 30
0
C, d m ban du cua malt tuoi khoang 44%. Nho cc van diu chinh, malt
tu roi thnh duong lin tuc xung thn thp. Tai dy duoc chia thnh 4 vng nhit sy
(khng kh nng qua calorifer duoc trn voi khng kh ngoi troi nho quat ri cp cho
cc vng sy), malt di qua cc vng sy ny v dat duoc d m sau dy:
Vng sy Nhit d khng kh
o
C D m cua malt %
Ban ke sy so b (malt tuoi)
Vng syI
Vng sy II
Vng sy III
Vng sy IV
30
50
67
81
85
44
26
12
6
3
Malt lin tuc chay qua cc cua thu, vo ban ke chua o dy ri nho vt tai ra ngoi.
Tng thoi gian vn chuyn nguyn liu, san phm v sy trong khoang 9,5 - 10h (thoi
gian sy 8 h), c th tu dng ho hon ton qu trnh sy.
3.6. Tch mm, r, bao quan malt:
- Tch mm, r malt:
Mm v r malt kh c tnh ht nuoc manh, c vi dng kh chiu, v vy phai tch bo
mm r d han ch su ht m, lm dep mt hng malt, dam bao cht luong malt, d nu
bia khng gy nn vi dng kh chiu. Tch mm v r malt phai tin hnh ngay sau khi
sy, v nu d lu r s ht m tro nn dai rt kh tch khoi malt.
D tch mm v r malt nguoi ta dng thit bi ct l mt luoi thp hnh tru quay chm
v dt hoi nghing trong mt thng kn, l luoi c kch thuoc 25x15 mm. Bn trong c
truc quay cng chiu nhung nhanh hon, trn c gn cc quat c cc l thp nho mp hoi
cong d ct mm, r (xem hnh o sch tham khao). Khi quay thng th mm, r s bi ct
cng voi hat ra ngoi luoi, ri nho quat ht bui mm, r ra ngoi.
- Bao quan malt:
Hat malt v nht l vo tru sau khi sy rt kh v dn, thnh phn chua n dinh, nn
nu dem di san xut bia th s khng tt lm (khi nghin d bi nt vo tru nn khi nu
kh loc, dich duong c th ln men chm, bia km bn). V vy nguoi ta thuong bao
quan malt sau khi sy xong t nht l 3 -4 tun, nhiu nht dn 2 nm. Trong qu trnh
bao quan nhu vy, d m malt tng ln 5 -6% nn vo tru tro nn dai hon, hat deo hon,
th tch hat tng ln cht t, malt s n dinh v thnh phn ho hoc v hoat tnh enzim.
Tt nht l malt duoc bao quan trong thng st ty, dinh k thng gi, nhit d bao quan
20
0
C.
i nuoc ta hin nay, ton b luong malt cho san xut bia du phai nhp khu nn
thuong d qua qu trnh bao quan, chuyn cho (bng tu thuy) rt lu, bao quan trong
Trang: 38
nuoc nhit doi d m cao nn d m cua malt khi dem san xut bia thuong cao dn 8-9%,
nn malt bi giam cht luong nhiu.
- Dnh gi cht luong malt kh:
Dai mach ban du
Malt sau khi sy
Malt sau khi bao
quan
100lit 100kg d m 15%
90lit 75kg d m 2%
100lit 78kg d m 4%
+Cam quan:
Mu sc: Malt vng : vng tuoi
Malt den : ti sm, vo ng nh
Kch thuoc, hnh dng tuong tu nhu dai mach
Mi vi: Dc trung cho tung loai malt
Malt vng : ngot diu
Malt den : vi caf, ngot manh
+ D sach: Khng ln tap cht
Hat v ti da 0,5%
Hat khng ny mm: 5%
+ Chi s co hoc:
* Dung trong:
Malt rt nhe: 480 - 500 g/l
Malt nhe: 500 - 530 g/l
Malt trung bnh: 530 - 560
Malt nng: >560 g/l
* Trong luong 1000 hat: 25 - 38 g
* Chi s ho sinh v ho hoc: xem gio trnh (trang 181, 182)
3.7. K thut san xut mt s loi malt d}c bit:
D lm tng cht luong bia, san xut nhung loai bia dc bit, nguoi ta thuong dng
nhung loai malt cht luong dc bit sau dy:
- Malt caramen: dng d san xut bia den lm cho bia c vi caramen, mi thom manh,
mu cnh gin, tao bot tt. Malt caramen duoc ch bin tu malt tuoi hay malt kh nho
qu trnh duong ho phu v sy o nhit d cao hon dn 110 170
0
C.
Nguoi ta dng malt tuoi hay malt kh c d chit cao (hoat luc enzim cao) tuoi nuoc
10 15 lit/100g - d yn 12h d din ra qu trnh thuy phn nhung cht ni tai trong malt,
sau d malt duoc sy trong l dc bit c kha nng nng nhit d sy ln dn 170
0
C, thoi
gian sy 2 3h.
Tu 100g malt kh thuong s thu duoc 90 95 kg malt caramen, dung trong 400 450
g/l, d m 5 6 %.
- Malt c ph: ch bin tu malt vng c qu trnh duong ho phu v sy o nhit d cao
220 225
0
C. Malt ngm vo nuoc nhit d 70
0
C trong 12h d tao thu phuy phn cht
mu. Sy o nhit d cao trong 2 2,5h, ha nhanh nhit d sau khi sy. Hat malt phai c
Trang: 39
mu ging mu hat c ph rang, mi thom c ph rang. Tu 100kg malt thuong thu duoc
85 90 kg malt c ph dung trong 400 450 g/l, d m sau khi sy 2 3%.
- Malt melanoit: cn goi l malt meland duoc ch bin tu dai mach c hm luong
proteincao (>12%). Ny mm o nhit d cao 20
0
C trong giai doan cui 24h, u dng sau 1
2 ngy d nhit d tng ln 50 52
0
C, tip tuc u trong 16 24h. Sau d tin hnh sy
nhu sy malt den.
Trang: 40
Chuong 4: SAN XUT ENZIM T THJC VAT
Enzim tu thuc vt cung chim mt ty l thch dng trong cng ngh san xut v su
dung enzim ni chung. Mt s loai enzim d duoc su dung nhiu trong y hoc, thuc phm
v cng nghip. Dc bit trong nghin cuu khoa hoc nguoi ta rt ch trong chit tch v
xc dinh co ch tc dung cua cc enzim trong cc m thuc vt nhu nhm enzim
glycoxydaza, nhm enzim oxy ho khu polyphenoloxydaza (EPPO) d mang lai nhung
gi tri l thuyt v thuc tin rt cao trong thoi gian gn dy.
4.1. San xut ureaza t du ra:
Chi ho du Canavalia o chu phi, o Vit Nam c loi Canavalia ensifomis - duoc goi
l cy du rua, du tc; hat dng chua bnh lui hn, nc cut, yu thn. Trong hat du rua,
hm luong ureaza c th dat dn 20% cht kh do d day l ngun nguyn liu quan
trong d thu nhn ureaza.
- V mt ung dung: ureaza duoc su dung trong y t d xc dinh hm luong ur trong
huyt, bng quan, c trong thnh phn cua thuc chng thn nhn tao. Trong ch bin
mt s loai c c mi khai (dui, nhm, mp) th dng ureaza d khu mi khai rt hiu
qua.Ureaza c th xc tc thuy phn ur ca trong v ngoi t bo (c th).
+ Chit xut ly enzim:
Nghin k bt du trong dung dich HCl 0,4% c thm EDTA (trilon B, complexon III)
5.10
-3
M v L.cystein 5.10
-3
M. Sau d ly tm tch b ly dich chit.
+ Xu l nhit: Nng nhit nhanh dn 60
0
C, giu trong 30 pht dem ly tm tch bo cn
kt tua.
+ Siu loc: dich ly tm duoc loc qua mng siu loc d loai bo peptit v polypeptit c
trong luong phn tu b (M>500)
+ Kt tua bng axeton:
Dich loc duoc xu l bng axeton lanh (ty l 1:1), ly tm tch kt tua. Phn kt tua dem
ho tan trong trisbuffer 0,1M, pH = 7 chua EDTA v L.cystein 5.10
-3
M.
+Sc k trao di ion
Dich enzim duoc chay sc k trao di ion trn ct chua DEAE xenluloza voi gradien
nng d NaCl tu 0 1M. Phn doan chua enzim duoc sy thng hoa (dng kh) voi cht
sacaroza lm cht n dinh voi ty l 2,5mg/1mg enzim.
Ch phm thu duoc c hoat tnh tng 25 ln so voi ban du v hiu sut thu hi 43%.
Xem bang 8 cua gio trnh (trang 186). Mt s thng s cua qu trnh thu nhn ureza
tu du rua.
4.2. Thu nhn bromelain t da:
- Gioi thiu qua dua: tn latinh: Bromelia ananas-L: thuc chi dua n qua. Ngoi ra
cn c chi dua dai (d ly soi ).
(NH
2
)
2
CO + H
2
O ureaza 2NH
3
+ CO
2
Trang: 41
Bromelain c nhiu trong ph liu dua nhu vo, li, chi, li du.
Gioi thiu dc dim ch phm Bromelain (Xem qu trnh trang 187-189).
Nguyn tc chung d thu nhn Bromelain.
Ghi ch: kt tua bng (NH
4
)
2
SO
2
lanh hay axeton lanh ti l 1:1.
- Thu nhn Bromelain bng phuong php nhanh su dung CMC.
Thu nhn Bromelain bng phuong php m ta nhu o trn di hoi thoi gian lu, kh
loc, luong dich lon, kh bao quan. Hin nay mt s nh nghin cuu d dng phuong php
nhanh tch Bromelain bng CMC. Cho php thu duoc Bromelain bt trng c hoat tnh
cao, thoi gian nhanh, don gian nhu sau:
+ Cng ngh ch tao CMC (xem gio trnh trang 191).
Ch : c th thay vai mn (hay gat) bng bng nn ( Xenluloxa ~ 100%).
+ Tch chit Bromelain tu dich chit dua bng CMC.
CMC duoc tm uot bng dung dich dm photphat 0,05 M, pH= 6,1. Cho dich chi dua
( chi dua nghin p loc nuoc dich) vo, thinh thoang khuy trn. Emzim
Bromelain s hp thu ln b mt cua CMC. Sau 2 gio ly ra vt nuoc loai bo cn bn
bm vo CMC, rua tri cc prtin khng phai enzim bng dm photphat o pH=6,5. Sau
d cho phn hp thu ln 1. Dung dich phn hp thu l dm photphat pH=7,1, NaCl 0,5 N
khuy trn. Sau 2 gio ly ra vt duoc dung dich dm dc chua bromelain. Tip tuc phn
hp thu nhu ln thu hai ri gp chung dich chit cua ca hai ln kt tua enzim bng axeton
hay cn lanh.
Voi phuong php ny hiu xut thu hi dat 0,1% so voi chi dua tuoi, ch phm c
hoat tnh 24 don vi (mg ch phm enzim. So voi phuong php kt tua tu ban du bng
(NH
4
)
2
SO
4
th d sach cao hon hai ln, thoi gian nhanh hon, tin hnh thun loi hon.
- Mt s ung dung cua ch phm bromelain:
+ Thuy phn gan b:
Gan b duoc xu l bng ch phm bromelain trong10 gio o 1-55
0
C, sau d v
hoat enzim o 100
0
C trong 3-4 pht. Dich duoc loc v dng kh thnh dang bt l ch
phm hn hop axit amin y t (san xut cc dich truyn dam y t). Thnh phn axit amin
cua ch phm thuy phn gan b boi bromelain duoc trnh by o bang 12 (trang 193 cua
gio trnh).
+Su dung bromelain lm dng sua:
D lm dng sua trong phuong php truyn thng (trong CN-SX photphat) nguoi ta su
dung renin thu duoc tu ngn thu 4 cua da dy b. Hin nay, luong renin chua dp xung
du nhu cu cua cng ngh. Trong nhung nm gn dy xu huong su dung proteaza thuc
vt d thay th mt phn renin trong ch bin phomat dang duoc pht trin. Trong d
Ph liu dua lm dp chit loc ly tm kt tua ly
tm loc ch phm k thut Sc k trao di ion sy thng
hoa san phm tinh khit .
Trang: 42
dng k nht l 2 loai ch phm: ficin tu cy co ficus v bromelain tu dua. Kt qua ung
dung xem bang 13 (trang 194 cua gio trnh)
+ Su dung bromelain d thu nhn cc cht uc ch proteaza.
Trong mt s loai co quan dng vt, thuc vt tn tai cc cht uc ch enzim, trong
d c cht uc ch proteaza, chng c ban cht protein nhu enzim. Din hnh nhu trong
cc hat ho du: du tuong, du xanh, du vn, hat mt, ni tang cua muc nang, dia, trong
dua (tn tai song song voi bromelain). Cc cht uc ch thuong tc dng manh ln mt s
enzim, trong d c ca enzim trong duong tiu ho (cua nguoi v dng vt) nhu: ficin,
bromelain, tripxin. D thu hi duoc cc cht uc ch ny, nguoi ta dng phuong php hin
dai, hin nay l dng enzim c dinh. Bromelain sau khi thu nhn bng CMC nhu trn
duoc c dinh trong gel sepharoza ri nhi vo tao ra ct phan ung. Dich nghin, loc ph
liu dua duoc cho chay qua ct ny: du tin o pH photphat 4,6, sau d pH = 7,6 7,8,
tip d xay ra qu trnh lin kt giua bromelain voi cc cht uc ch. Thu hi cht uc ch
bng NaOH 0,01N + NaCl 0,1N voi pH = 11,5 12; c dotinh sach, hoat tnh cao (xem
bang 14 trang 195 cua gio trnh). Ngoi ra bromelain c su dung trong qu trnh lm
mm thit, san xut nuoc mm ngn ngy, bt c.
- Thu nhn papain tu nhua du du:
Cy du du (carica papaya.L), qua dng lm thuc phm. nhua qua du du lm thuc
giun, chai chn, mun com, sung khop, eczema. R lm thuc cm mu, soi thn. Hoa
chua ho, vim cung phi, l chua ung thu phi. Papain c M = 20.700, t
op
= 80
0
C, pH
op
= 5 5,5. Bi uc ch v mt hoat tnh boi H
2
O
2
, Iodoaxetat, I
2
, fericianua. Duoc hoat ha
boi -CN, cystein, H
2
S v glutation.
+ Thu nhn papain th:
Dng cc loai qua du du cn non, du du gi (chua chn), dng khn lau sach vo, ly
dao cao sach nhung duong khng qu su, hung nhua (catex) vo cc ri lm kh bng
cc phuong php khc nhau, ta thu duoc ch phm papain th c hoat tnh nhu bang 15
(trang 196 cua gio trnh).
Kt qua cho thy hoat tnh papain sau khi chit tch cao hon khi d d 3 thng.
Phuong php phoi nng cho kt qua hoat d enzim thp nht, sy chn khng dung mi
(axeton hay ruou etylic lanh) cho hoat tnh cao nht. Ch phm cn bao quan lanh 6
10
0
C moi duy tr hoat tnh.
+ Thu nhn papain thuong phm:
Ngm papain th ho tan nhua tuoi (catex) trong nuoc ct c b sung glyxerin d tng
d ho tan, loc qua vai mn. Kt tua bng axeton lanh voi ty l 2:1 so voi th tch dich
loc. Ly tm lanh ly kt tua, sy 45 50
0
C (sy chn khng hay phoi kh), dem nghin
thnh bt.
O nuoc ta hin nay vin cng ngh sinh hoc d san xut thnh cng ch phm papain
thuong mai dang dng kh. Bang 16 so snh hoat tnh (trang197) cua papain thuong mai
quc t voi papain tuoi v dng kh Vit Nam. Kt qua din di d (trn gel
Trang: 43
polyacrilamit), th hin trn hnh 56 (trang 198). Hoat tnh thnh phn cc enzim trong
ch phm papain duoc trnh by o bang 17 (trang 199).
+ Ung dung cua papain: lm dng sua, thuy phn protein nhu san xut bt c thuc
phm, san xut nuoc mm ngn ngy, lm mm thit.
- Gioi thiu kt qua nghin cuu ch phm EPPO (bt axeton) trong l ch v hat ca cao
Trang: 44
Chuong 5: ENZIM C DJNH
5.1. Gii thiu chung:
Enzim c dinh (hay enzim khng tan) l enzim c su tham gia hoat dng trong mt
khng gian bi gioi han. Su gioi han hoat dng vn linh hoat cua enzim bng cch gn n
vo mt pha cch ly tch roi khoi pha long tu do v o d n vn c kha nng tip xc
duoc voi cc phn tu co cht, effector hay inhibitor (cht uc ch ). Pha gn enzim thuong
khng tan trong nuoc nhung cung c th l cc polyme ua nuoc.
Enzim khng tan duoc nghin cuu v ung dung tu nhung nm 1950. D ch tao enzim
c dinh c th dng cc phuong php hp phu, lin kt ho tri d gn kt enzim. Cht
dng d gn kt enzim goi l cht mang (enzim), hin nay nguoi ta thuong dng
xenluloza, tinh bt, rephadex, agaroza, alghinat canxi, gel polyacylamit, bt thuy tinh,
nilon..Ch phm enzim khng tan c th o dang bt, hat, phin, mng mong.
Trong mt s truong hop khng cn thit phai gn enzim vo cht mang m c th giu
n o bn trong mang luoi polyme bao quanh ly phn tu enzim. Mang luoi d c mt nho
khng cho php enzim thot ra khoi mang nhung vn du lon d co cht v san phm tao
ra qua lai d dng.
Theo thng k, du nm 1995 nguoi ta d ch tao duoc trn 100 ch phm enzim c
dinh .
Loi ch cua vic su dung enzim c dinh:
- Giam gi thnh do enzim duoc su dung lp lai nhiu ln voi cng mt kiu phan ung
xc tc, ch phm bn hon trong cc diu kin pH, nhit d, p xut thm thu ti uu, tc
d phan ung lon, d t chuc san xut o muc d tu dng ho cao.
- Ch tao enzim tuong di d, du tu xy dung v san xut tuong di t, san phm phan
ung khng ln ln voi enzim (chi mt s t bi rua tri theo dng chay cua tc nhn), c
th d dng t chuc san xut cc san phm ln men bng enzim ngoai bo nhu: ruou
etylic, axit huu co, axit amin, vitamin.
5.2. Mt s phuong php chu yu ch to enzim c d|nh :
5.2.1. Microencapsulation ( gi enzim trong bao cuc nho )
Duoc nghin cuu boi Chang et al(1967-1968)
Ci mng polymer thm thu dy 200A
0
(xenluloza, polysacarit, phi tinh bt ) tao
thnh hat dung vung 10-12M chua cc phn tu enzim bn trong. Lop mng ny cho php
co cht v san phm phan ung enzim duoc qua lai tu do nhung cc phn tu enzim khng
th qua lai duoc v cc phn tu qu lon. Nhu vy nu co cht c phn tu luong qu lon
nhu: poly saccarit, protein cung khng th qua lai mng duoc do d khng th thuc hin
phan ung enzim duoc.
5.2.2. Lin kt enzim vo cht mang khng tan (silman v katchalski-1966)
Cc cht mang nay thuong l: CMC, silicagen. Lc d enzim duoc gn vo cht mang
tao mt s vi tr xa voi trung tm hoat dng cua n. Nhu vy dc tnh cua enzim phn no
bi thay di khng cn nhu khi n o trang thi ho tan tu do trong h nhu: d pH
op
, t
op
...
dn dn su thay di cc tri s K
m
, V
m
Trang: 45
5.2.3. Dinh vi enzim trong pha long cua h thng 2 pha (Reese and
Mandels.1958)
Enzim duoc ho tan trong pha long v duoc giu lai trn ct cua cht rn khng tan nhu
xenluloza. Co cht nm trong pha long khc (pha dung mi) khuch tn vo pha long
chua enzim v xay ra phan ung voi enzim. Cc san phm phan ung khuch tn nguoc lai
di ra ngoi ct. H thng ny gn ging voi phuong php microen capsule m pha dung
mi dng vai tr nhu mt mng bn thm.
5.2.4. Giu enzim bng mng siu loc:
Enzim duoc ho tan tu do trong dung dich v tin hnh phan ung enzim ngay trong
dung dich ny. San phm phan ung duoc tch ra nho mng siu loc chon loc cn co cht
v enzim duoc giu lai o pha bn kia cua mng.
(Xem hnh v trang 204 v giai thch trang 205 cua gio trnh)
5.3. Mt s lin kt trong vic c d|nh enzim.
5.3.1. Lin kt ho tri: (cng ho tri)
Cht mang trong phuong php ny l cc polyme tu nhin v cc san xut cua chng
nhu: xenluloza, agaroza, alginic acid, chitin, collagen, keratin, cc polyme tng hop: axit
acrylic, polyme tan, N Vinylpyrolidon...
Ban cht cua phuong php c dinh enzim bng kin kt cng ho tri l enzim duoc ni
voi cht mang thng qua cu ni c cuc no d. Cu ni ny c kch thuoc vua phai,
mt du gn voi cht mang polyme, du kia gn voi enzim.
V du: cyanuric chloride (tricloro triazin) c 3 nhm c kha nng tao lin
kt dp ung duoc yu cu trn, trong d c mt nhm s lin kt manh voi polyme, nhm
thu 2 voi enzim, nhm thu 3 c th lin kt voi ca 2 uu th dc bit cua cht ny l o ch
din tch cua n quyt dinh cc tnh cht ion cua phuc enzim xenluloza. Phuc ny c
th trung tnh, m (anion), duong (cation) phu thuc vo ban cht cua cht gn voi
thu 3
Trong khi d mt s cc phuong php c dinh enzim khc chi do phuc mono ion
(cation hoc anion).
- Glutaraldehyt cung hay duoc su dung lm cu ni d gn enzim v n chua 2 nhm
CHO o hai du, o pH trung tnh s kin kt duoc voi cc nhm amin NH
2
tu do.
Nhu vy mt du s gn vo cht mang, cn du kia gn vo enzim.
5.3.2. Hp phu vt l:
Cht hp phu v enzim duoc trn ln voi nhau trong mt khoang thoi gian nht dinh
d su hp phu xay ra nho tuong tc b mt nhu: lin kt ion, lin kt ua bo (ki nuoc),
lin kt hidro, luc Vandewaals. Nhuoc dim cua phuong php ny chnh l qu trnh hp
phu enzim c th xay ra do su thay di pH, nhit d, thnh phn ion.
- Cc cht mang huu co dng cho hp phu vt l: dn xut polyme tu nhin, DEAE
xenluloza, DEAF sephadex. Dy l cc amonit (mang din (-))
- Cht st k xotein - ky nuoc nhu: agaroza cai bin c gn cc nhm mang din o
du chui cacbon hydrat cua n (hai loai luc hp phu l luc tinh din v luc ky nuoc gn
Trang: 46
kt khng thun nghich voi nhiu enzim). Nhm enzim thch hop nht cho co cht loai
ny l lipaza (co cht ki nuoc, khng tan trong nuoc (ua bo).
- Cc cht mang v co: kim loai kim th, Al
2
O
3
, TiO
2
nhu: thuy tinh xp, silicagel,
silochrom. Uu dim cua loai cht mang ny l d xp lon, tnh hp phu cao, ch tao o
dang hat d tao reactor ct (ct phan ung).
5.3.3. Nhung diu cn luu khi thuc hin vic c dinh enzim:
Khi lua chon phuong php v thu nghim c dinh enzim cn luu cc diu sau:
- Enzim phai n dinh trong nhung diu kin xay ra phan ung: quan trong nht l
hoat luc enzim v d bn cua n theo thoi gian phan ung, diu ny quyt dinh hiu sut
phan ung, hiu sut tng thu hi v hiu qua cua ton b qu trnh (gi thnh, gi tri khoa
hoc v thuc tin, gi tri kinh t - x hi)
- Nu c th duoc th cc hop cht tham gia phan ung tao lin kt ngang (giua cht
mang v enzim) s chu yu chi tuong tc voi nhung nhm chuc nng nm ngoi tm hoat
dng cua enzim. Nu diu kin ny khng thuc hin duoc hon ton th cht tham gia
phan ung tao lin kt ngang phai c kch thuoc lon khng cho php n xm nhp, anh
huong dn trung tm hoat dng cua enzim.
- Trung tm hoat dng cua enzim phai lun lun duoc bao v (nu thuc hin duoc)
bng cc phuong php khc nhau. Chng han nu enzim voi tm hoat dng c nhm
SH th cn phai xu l so b bng glutation hay systein v chi ti hoat ho enzim sau khi
d gn n vo cht mang. Hoc c th che chn tm hoat dng bng cch b sung vo
hn hop phan ung co cht d duoc bo ho boi enzim (nng d co cht cao nht m
enzim c th thuc hin duoc phan ung xc tc)
- Khi rua thit bi phan ung d phuc hi enzim, khng duoc lm anh huong xu dn
hoat tnh enzim d duoc gn vo cht mang.
- Khi lua chon cht mang (h c dinh) cn phai d dn phan ung enzim s din ra
cu th sao cho khng lm anh huong thm ch huy hoai ngay ban thn cht mang v san
phm phan ung khng duoc uc ch hoat dng cua enzim. Chng han khng th gn
enzim xenluloza vo chnh cht mang l xenluloza v cc dn xut cua n cung khng th
tin hnh phan ung thuy phn xenluloza trn chnh cht mang ny.
- D dn d bn cua cht mang (bn co hoc, thuy luc hoc (rua tri), bn nhit, bn
gel) nht l khi phan ung trong nhung ct cng sut lon.
5.4. Anh huong cua s c d|nh dn hottnh cua enzim.
Khi gn vo cht mang, enzim s bi gioi han hoat dng trong mt pahm vi mi truong
xc dinh, lc d cu trc khng gian cua phn tu enzim (v cua ca t hop) c th bi thay
di do d c th lm bin di mt s tnh cht cua enzim ban du. V du c th thay di
khoang pH hoat dng, nhit d hoat dng (v do d c th thay di pH
op
, t
op
), tnh dac
Trang: 47
hiu cua enzim cung nhu hng s Michoelis. Tt nhin nhung thay di ny phu thuc
nhiu vo ban cht cua cht mang, ni chung enzim c dinh thuong troe nn bn voi cc
yu t gy bin tnh hon (v n d duoc lm bn phn no boi cht mang) nhung d
hoat dng ring thuong thp hon enzim ban du.
5.4.1. Hoat tnh cua enzim c dinh phu thuc vo ban cht cua cht mang:
Khi enzim duoc gioi han trong pham vi mi truong cht mang xc dinh s xay ra mt
s kiu tuong tc khc nhau cua cht mang ln mi truong hoat dng vi m bao xung
quanh phn tu enzim c dinh
- Kiu thu nht duoc goi l hiu ung phn phi (hay hiu ung dy ko) trong
d cht mang polyme nho nhung tnh cht dc trung s li ko toi b mt cua n, hoc
dy khoi c co cht,san phm phan ung v cc cht khc lm tng hay giam tuong di
nng d cua chng trong pham vi mi truong vi m nm st canh enzim.
- Kiu thu hai duoc goi l hiu ung ngn chn tuc l ban thn cht mang polyme
ngn can su khuch tn tu do cua cc phn tu huong toi enzim (trong d c co cht) cung
nhu di khoi enzim (trong d c san phm phan ung). Tu d anh huong truc tip hay gin
tip dn hiu qua xc tc cua enzim.
V du din hnh l truong hop enzim duoc c dinh bng cht mang polyanion (poly ion
mang din (-)), lc d cht mang s tc dng manh dn co cht cation (mang din (+)).
Khi d co cht kiu ny s tp trung xung quanh truong tc dung vi m cua cht mang
lm cho mt d (nng d) cua n s cao hon so voi mt d trung bnh trong ton h.
Dng thoi cht mang cung s li ko bt ky cation no khc, chng han nhu cc proton
H
+
hay hidroxoni H
3
O
+
(do nuoc c tnh din ly yu ). Nghia l
nng d H
+
tng ln xung quanh truong tc dung cua cht mang (v cung l cua enzim)
lm cho pH giam xung thp hon so voi pH trung binh trong ton h. Trong truong hop
polyme cht mang v co cht mang din ging nhau th qu trnh trn lai xay ra hon ton
nguoc lai. Nghia l nng d H
+
lai giam di xung quanh truong tc dung cua cht mang
(v cung l cua enzim) lm cho pH tng ln cao hon so voi pH trung bnh trong ton h.
Nhu vy ta nhn thy l khi su dung polyme dang polyion lm cht mang s khng c
su phn b du cc ion trong h, lc d nng d ion trong mi truong vi m xung quanh
enzim s khc voi nng d cua chng trong h. Diu d lm cho qu trnh dng hoc cua
enzim s rt phuc tap, s c su sai khc (nhiu khi l dng k) cc thng s lin quan
nhu: nng d co cht, san phm phan ung, pH, t
0
...
Mt v du khi khao st su c dinh papain trn mng xenluloza nitrat d thuy phn
gelatin cho kt qua tn hon so voi khi enzim o dung dich tu do (hoat d enzim c dinh
thp hon hoat d enzim tu do). D l do c cht mang xenluloza nitrat d hp thu gelatin,
bin tnh so b n d tao diu kin thun loi cho su thuy phn cua enzim dnh km.
D thi m ta hiu ung phn b lai proton lm giam pH xung quanh enzim c dinh
(cht mang l polyanion) nhu sau:
Gia su pH
op
cua enzim tu do trong dung dich phan dung l 8 v duong cong 1 m ta
vn tc phan ung phu thuc vo pH c dang hnh chung nhu trn. Duong cong 2 m ta
vn tc phan ung phu thuc vo pH khi enzim c dinh t bo trn poly polianion. Trong
2H
2
O
H
3
O
+
+ OH
Trang: 48
khi o pH = 8 ta c vn tc phan ung bng 50%V
max
, d dat duoc gi tri ny gi tri pH bn
trong (pH xung quanh mi truong vi m cua enzim) chi cn l 7. Nhu vy mc d d pH
h thng bng 8 nhung thuc t enzim d hoat dng o dh pH thp hon (=7) m o d hoat
tnh cua n bng 50% gi tri cuc dai (dim A). Do vy phai tng gi tri pH
e
(pH of effect)
toi 9 d khi d pH
i
= 8 th enzim s th hin hoat tnh ti da cua n (dim B)
Nhu vy ta d thy c hin tuong x dich (sai khc) gi tri trong h. D khc phuc
nguoi ta thm vo h nhung phan ung trao di ion din hnh (luc ion, d phn ly cao) d
ngn can anh huong cua cc nhm ion anh huong dn cht mang v lm dich chuyn pH
hoat dng cung nhu pH
op
. Cung c th dng dung dich dm nng d cao d khc phuc
duoc hin tuong ny.
Cht mang phn tu luong cng lon th cng giam dng k hoat tnh enzim gn vo d
so voi cht mang c phn tu luong cng nho. Diu ny duoc giai thch boi su can tro
khng gian cua phn tu cht mang di voi phn tu co cht trong vng trung tm hoat
dng cua enzim.
5.4.2. Hoat tnh enzim c dinh phu thuc vo su khuch tn cua co cht, san
phm v cc phn tu khc:
Tc d khuch tn cua co cht, san phm v cc cht khc phu thuc vo cc yu t:
kch thuoc l gel cua cht mang polyme; trong luong phn tu cua co cht; su sai khc do
hiu ung phn phi (sai khc v nng d, pH, t
0
hoat dng...). Trong d duong knh l
gel cua cht mang polyme v trong luong phn tu cua co cht dng vai tr quan trong
nht.
Hiu ung phn phi lm xut hin gradien nng d co cht v san phm trong khi tin
hnh phan ung, c th do dac v vit cc phuong trnh dng hoc cho chng. Nhung gioi
han khuch tn c th duoc th hin hai dang hng ro khuch tn bn ngoi v bn
trong.
Hng ro khuch tn bn ngoi c duoc do c su tn tai cua lop mong dung mi khng
bi pha trn bao xung quanh hat polyme. Su hnh thnh n nhu c su kt hop cua khuch
tn phn tu thu dng (chuyn dng Brown) v su di luu (do su xut hin gradien nng
d hay gradien nhit d). D dy cua lop khuch tn bn ngoi phu thuc rt nhiu vo
tc d khuy trn dung mi, dy l yu t ht suc quan trong khi tin hnh phan ung
enzim c dinh.
Hng ro khuch tn bn trong do chnh cht mang tao ra v chi c su khuch tn phn
tu thu dng (chuyn dng Brown), khng bi anh huong boi tc d pha trn. Hng ro ny
s to ra c anh huong to lon hon nu enim duoc c dinh vo trong lng cht mang chu
khng phai gn n vo b mt cua cht mang.
Nhung gioi han khuch tn ny cng voi hiu ung phn phi lm cho cc thng s
cng ngh thay di (c khi l kh lon) so voi khi tin hnh voi enzim tu do, dy l diu
cn ch khi m hnh ho, thit lp quy trnh cng ngh.
5.5. Cc reactor cha enzim c d|nh:
Reactor (ct phan ung) chua enzim duoc su dung d tao tip xc giua enzim v co
cht trong mt khoang thoi gian du lon d tin hnh phan ung xc tc, dng thoi tch san
phm phan ung - d lai enzim.
Trang: 49
5.5.1. Reactor hoat dng theo chu ky.
Thuc t d l nhung b lon hay bn chua enzim v co cht c trang bi mng khuy.
Nhu vy dung tch lm vic, hiu sut chuyn ho duoc c dinh v nguoi ta cho phan ung
tin hnh trit d theo tnh ton. Sau d tho can ton b d tch san phm khoi enzim
(nhu vy l xong 1 chu ky lm vic) ri lai chun bi tin hnh me khc. Trong truong hop
enzim tan (ln ln co cht cn du, san phm phan ung voi enzim) th d tch san phm
nguoi ta thuong lm bin tnh enzim (v du bng cch xu l nhit). Phuong cch su dung
ny c hiu qua kinh t nu dng enzim re tin m san phm phan ung lai c gi tri,
enzim dng xong khng thu hi lai duoc. D reactor kiu ny c th dng enzim dt tin
c th thu hi d dng lai truoc ht cn phai c dinh n thnh enzim khng tan. Sau chu
ky phan ung, ch phm enzim khng tan duoc tch ra bng ly tm hay loc. M trong thuc
t quy trnh thu hi enzim ny c th lm ph huy cu trc cua ch phm enzim khng
tan, nghia l ph huy enzim. V vy reactor hoat dng theo chu ky thuong duoc su dung
voi enzim tan re tin, khng cn thu hi enzim, chi ph san xut thp hon so voi cc
phuong php khc.
5.5.2. Reactor hoat dng theo kiu dng chay:
Nguyn tc hoat dng cua reactor dng chay l su b sung co cht (lin tuc hay gin
doan, theo chu ky) theo dng nht dinh (tc d nap, dung tch nap) v san phm phan ung
cung duoc ly ra theo hnh thuc tuong tu voi qu trnh nap co cht.Nguoi ta chia ra 2
nhm reactor dng chay: nhm c khuy trn v nhm khng khuy trn khi hoat dng.
- Reactor dng chay c khuy trn l mt b (bn hay thit bi) c mng khuy, c
duong dn nap co cht v duong ly hn hop hay san phm phan ung ra khoi b (nguyn
tc chemistat trong nui cy vi sinh vt). Cc thng s hoat dng cua thit bi nhu: dung
tch, tc d b sung co cht, hoat tnh enzim, tc d tho san phm, thoi gian duy tr phan
ung v chu ky lm vic thuong duoc ti uu ho theo nhung muc tiu d dinh.
Tuy nhin do su khuy trn nn cc hat enzim c dinh phn b trong ton dung tch
lm vic cua thit bi v duoc tho ra ngoi cng voi san phm phan ung. D duy tr
enzim c dinh cn phai lin tuc hay dinh ky b sung mt luong ch phm enzim c dinh
bng cch: tch enzim ra khoi san phm bng cch loc, hoat ho tro lai ri dua vo thit
bi; hoc c dinh enzim truc tip trn cnh khuy, dinh ky b sung, thay th moi.
Reactor dng chay c khuy trn c th kt hop voi qu trnh siu loc, diu ny cho
php su dung enzim c dinh o dang tan trong cc reactor, dc bit thch hop voi co cht
khng tan hay o dang keo.
- Reactor dng chay khng khuy trn (xem hnh 63 trang 218 cua gio trnh).
Enzim c dinh duoc nhi vo ct, dich co cht chay tu trn xung ngm qua lop enzim
v du duoi s nhn duoc dich san phm xc tc. Mt reactor dng chay l tuong khi lop
co cht chay qua ton b din tch mt ct ngang cua ct voi tc d khng di - dy l h
thng reactor tch - dy l tuong. Trong thuc t dich co cht cung c th dua tu duoi ln,
chay trn qua ct cn san phm ly ra tu trn.
So d v nguyn tc lm vic xem hnh 63.
Trang: 50
5.6. . Su dng enzim c d|nh trong y hc v trong cng nghip:
Vic ung dung enzim c dinh d cho php tao ra mt s cng ngh hon ton trong y
hoc v cng nghip.
- Trong y hoc
+ Su dung enzim c dinh d lm cc ni quan gia nhu: bng quan, nim mac.
+ Su dung enzim duoi dang micro capsul d dua enzim vo chua bnh thiu enzim
nhung khng gy nn cc phan ung phu.
+ Ngin cuu cu trc phn tu enzim, cu tao mng t bo, m hnh ho h thng enzim
trong t bo.
- Trong cncg nghip
+ Su dung reactor dng chay khng khuy trn: Nakhapetian (1976) d cho dung dich
tinh bt h ho 35% lin tuc qua ct chua glucoamylaza khng tan d duong ho. Sau
22,6 ngy phan ung o t = 45
0
C, hoat d enzim trong ct vn cn 50%. Hin nay l thoa
mn nhu cu v mach nha cua ca nuoc.
+ Cc ch phm enzim khng tan dng trong cng ngh thuc phm: catalaza d khu
trng sua, glucoizomeraza d dng phn ho san xut fructoza, glucooxydaza d san xut
axit glutamic, pectinaza d lm trong nuoc qua, san xut hn hop duong khu glucoza
fructoza dng glucoizomeraza c dinh.
5.6.1. Su dung aminoacylaza c dinh d san xut axit amin.
Trong qu trnh tng hop ho hoc hay ln men (sinh tng hop) d san xut cc axit
amin nhung nhuoc dim lon nht cua phuong php ny cho ra cc san phm raxemic, tuc
l hn hop cua 2 dang dng phn quang hoc D v L trong d chi c dang L moi c hoat
tnh sinh hoc cao, c nghia trong khoa hoc ho sinh. Nu su dung phuong php ho hoc
hay kt hop voi sinh tng hop (ln men 2 pha) s rt tn km, khng kha thi.
Tu nm 1969 hng Tanabe Seizaku (Nht Ban) su dung enzim c dinh amino acylaza
(AACD: enzim dng phn ho chuyn tu dang D sang dang L cua axit amin) d chuyn
ho hn hop D,L axit amin. Trong d enzim aminoacylaza duoc c dinh trn DEAE.
Sephadex bng lin kt ion voi thoi gian bn huy l 65 ngy o 50
0
C.
- Phuong php c dinh: 1000-1700 lt dich enzim lc du voi DEAE. Sephadex trong
lo o 35
0
C, pH=7.0 sau d loc v rua sach, enzim sau khi gn vo cht mang c hoat tnh
50-60% hoat tnh enzim tu do. Ch phm enzim c dinh sau d duoc nhivo ct phan
ung (bioreactor) sau 65 ngy lm vic s duoc ti sinh voi dich enzim moi, cu nhu vy
sau 8 nm moi phai thay cht mang moi.
So d cng ngh san xut L axit amin cua hng TANABE SEIZAKY.
Acyl-D-axitamin
Raxemat ho
Ly tm
kt
tinh
L, axit amin tinh
th
bc
hoi
xu l nhit
loc
hn hop acyl-
L,D-axit amin
Trang: 51
Phan ung trong bioreactor xay ra o pH=7.0, t=50
0
C, b sung 5.10
-4
M Co
2+
. Vn tc
dng chay 2000 lt /h voi dung tch cua bioreactor l 1000 lit.
V du: qu trnh san xut L_ metionin: nng d ban du cua hn hop acetyl D,L
metionin l 0,2mol. Sau khi chay qua ct phan ung thu duoc 2000 lit dung dich. Sau khi
cho bay hoi v kt tinh thu duoc 27Kg L_metionin (hiu sut thu hi 91%). Dich acetyl
D metionin duoc xu l o 60
0
C voi axetaldehyt (raxemet ho), diu chinh pH=1,8 d
chuyn v hn hop D,L-metionin.
Bang 19 - Mt s loai axit amin san xut boi enzim c dinh aminvacylaza trn PEAE-
Sephadex (ct dung tch 1m
3
) cua hng TANABE SEIZAKU.
Axit amin vn tc nap 1000lit/h san phm axit amin/24h-Kg
L-Alanin
L-metionin
L-
phenylalanin
L-triptofan
L-valin
1,0
2,0
1,5
0,9
1,8
214
715
594
441
505
Hin nay hng ny san xut 700-1000 Kg axit amin/ngy voi chi ph 60% so voi qui
trnh cu su dung enzim ho tan.
Qui trnh tuong tu duoc hng SNAM-Progetti(Italy) ung dung trn co so c dinh
enzim aminoacylaza trong soi triaxetat xenluloza. Ch phm hoat dng lin tuc 50 ngy
chi mt ti da 30% hoat tnh. Cu 1Kg enzim c dinh cho php san xut duoc 400Kg L-
triptofan.
5.6.2. San xut L-axit aspartic bng enzim asparza c dinh.
L co cht trung gian cua rt nhiu qu trnh chuyn ho ho sinh tng hop cc axit
amin khc rt quan trong trong dinh dung dng vt v ch bin thuc phm (san xut axit
L-valin, tng hop axit -xetoglutaric (tin cht d chuyn ho thnh axit L-glutamic)).
Co ch ho sinh cua su tao thnh axit aspartic l qu trnh tao lin kt dng ho tri giua
NH
3
voi axit fumaric boi enzim aspartaza:
HOOC CH
2
CH COOH
Axit L-aspatic
NH
2
HOOC CH = CH COOH + HOOC CH
2
CH COOH
NH
2
NH
3
E.aspartaza
Trang: 52
Tu nm 1973, hng TANABE SEIZAKY d su dung t bo c chua enzim aspartaza
(ni vi khun Brevibacterium flavum nui cy trn mi truong ri duong giu biotin) v
gi n trong gel polyacrylamit voi bn chu ky hoat dng l 120 ngy o 37
0
C.
Phuong php c dinh nhu sau: 10 Kg t bo ho tan 40lit dung dich sinh l (saccaroza
+NaCl tng cng 1%). Thm 7,5 Kg acryamit, 0,4 Kg bis-acryamit. 5lit dimetyl
aminopronitri) 5%. 5 lit amonium persulfat 2,5 %
hn hop d o 40
0
C trong 10 12 pht, gel tao thnh duoc ct thnh mung nhu hnh
vung 2 3 mm. Nguyn liu ban du d san xut l hn hop axit fumaric-amonisulfat
ha tan trong MgCl
2
0,1N voi nng d 1mol/lit dung dich MgCl
2
. Phan ung thuc hin o
pH = 8,5, t
0
= 37
0
C, vn tc dng chay l 0,6V bioreactor/h. Dich sau khi qua ct duoc
chuyn v pH = 2,8 bng H
2
SO
4
60% o 90
0
C. Sau d lm ngui xung 15
0
C trong 2h.
Tinh th axit aspartichinhf thnh duoc lng, ly tm v rua bng nuoc.
Voi ct bioreactor dung tch 1m
3
trn d san xut duoc 1700 kg axit L-aspartic/ngy
voi chi ph bng <60% so voi cng ngh cu (chuyn ho bng phuong php ho hoc)
5.6.3. San xut axit L-malic bng enzim fumaraza c dinh:
Axit malic duoc su dung d thay th
axit xitric
trong cng nghip thuc phm v
duoc phm.
Duoi tc dung cua enzim fumaraza, axit fumaric duoc chuyn ho thnh axit malic
(phan ung phu tao thnh axit sucxinic):
Phan ung s cn bng khi chuyn ho duoc khoang 80% axit fumaric. Qui trnh dudoc
thuc hin nm 1984 boi hng TANABE SEIZAKU.
Enzim fumaraza duoc c dinh trong gel polyacriamit, d uc ch phan ung phu tao axit
suxinic, t bo c dinh duoc xu l bng axit uric 0,2% o 37
0
C, pH = 7,5 trong 20h. Ch
phm c bn chu ky hoat dng l 55 ngy o 37
0
C. Co cht duoc su dung l mui Na.
fumarar nng d 1mol/lit, pH = 7, t=37
0
C, vn tc dng chay 0,2 th tch bioreactor/h.
(HOOC CH
2
CH COOH
)
OH
(HOOC CH
2
C CH
2
COOH )
OH
COO
H
HOOC CH= CH COOH
E.
fumaraza
+ H
2
O
HOOC CH
2
CH COOH: axit malic
OH
pu phu: h bin +
H
E. sucxinatdehydrogenaza
HOOCCH
2
CH
2
COOH: axit sucxinic
Trang: 53
Hng SNAM Progetti lai su dung truc tip enzim fumaraza c dinh trong soi triaxetat
xenluloza. Sau khi chay qua ct axit malic duoc thu hi bng cch kt tua voi CaCO
3
.
5.6.4. San xut nhm penixilin-axit 6 amino penicillinic (6-APA) bng enzim c
dinh penicillinamidaza.
Penicillin l mt nhm cht c tnh khng sinh, cu tao chung l:
Voi R l gc axyl th ta c penicillin G l penicillin thuong mai v sinh
hoat ph bin nht hin nay.
Enzim penicillinamidaza xc tc thuy phn benzyl penicllin (penicillin G)
d tao thnh nhm penicillin 6-APA v axit phenyl axetic.
6 APA duoc su dung rng ri trong cng nghip duoc phm d san xut
cc loai khng sinh ho penicillin. Hin nay ton b 6 APA cua th gioi du duoc san
xut bng phuong php su dung enzim penicillinamidaza c dinh. Dy l enzim ni bo
khi sinh tng hop boi vi khun Esterichia-Coli, Bacterium faecalic, alacaligus voi mi
truong cazein thuy phn, cao ng, glucoza, axit phelnylaxetic lm cht cam ung.
Phuong php gi enzim cua hng SNAM Progetti (Italy) nhu sau:
10 lit dung dich penicillinamidaza pH=8 trn voi 5kg triaxetic xenluloza
trong 71,4kg clorimetylin o 4
0
C, lc k cho dn khi tao gel c cc soi. Mi kg soi thnh
phm duoc nhi trong cc ct kch thuoc 43 x 14 cm. 26lit penicillin G (mui kali) cho
chay lin tuc qua ct o pH = 8,2 cho dn khi dat muc chuyn ho 97% 6-APA.
Cng ngh cua hng TANABE SEIZAKU: su dung bioreactor t bo c
dinh chua penicillinamidaza trong gel polyacriamit nhu sau: dung dich penicillin G
0,65M o pH=8,5 cho chay qua ct voi tc d 0,12 0,14 th tch ct/h. Hiu sut phan
ung dat 80%.
5.6.5. Thuy phn lactoza bng enzim lactaza c dinh:
Lactoza l disaccarit c trong sua nn duoc goi l duong sua. Loai duong nu c d
ngot thp (bng 30% voi duong saccaroza o cng nng d), d ho tan km (gy nn
hin tuong san duong trong sua), mt b phn nguoi su dung sua khng c kha nng tiu
ho hp thu duoc sua ny. Mt khc duong sua hu nhu duoc thai cng voi sua nu dem
ch bin cc san phm sua chua, phomat s gy nhim mi truong. Nhu vy nu thuy
phn lactoza d tao thnh 2 monosaccarit cu thnh n l glucoza v galactoza s mang
lai hiu qua to lon. Lc d sua s c cht luong cao hon, loai bo hin tuong san sua, nng
cao d tiu ho, cc monosaccarit s duoc vi sinh vt su dung khi ln men sua (cc san
phm sua chua v phomat)
Enzim lactaza duoc sinh tng hop tu mt s ni nm mc v nm men. Ni duoc san
xut duoi dang ch phm c dinh thuong mai (xem bang 22 trang 228 cua gio trnh).
Hng SNAM Progetti (Italy) su dung bioreactor dung tch 10 lit chua 4kg lataza c
dinh trong soi axetat xenluloza. Truoc ht sua duoc tit trng cuc nhanh (142
0
C, 3s), lm
lanh nhanh dn 4 7
0
C ri cho chay qua bioreactor voi vn tc 7lit/pht. San phm sua
bao quan tt trong 3 4 thng o 4
0
C. Hin nay hng san xut hng ngy 10 tn sua khng
Trang: 54
c lactoza. Hng Corning Glass tu nm 1978 su dung enzim lataza lin kt dng ho tri
voi silicagel d xu l dich trong sua voi cng sut 30 tn/ngy.
Trang: 55
Chuong 6: GII THIJU MT S LOAI ENZIM CHU YEU V KHA
NNG UNG DJNG
6.1. Amylaza.
H enzim amylaza l mt trong s cc h enzim duoc su dung rng ri nhiu trong
cng nghip,y hoc v nhiu linh vuc khc.
O cc nuoc phuong Dng, nht l o Trung Quc, Vit Nam, Nht Ban nguoi ta d bit
dn amylaza c trong mc tuong , mis (du tuong ln men) tu rt lu. O Trung Cn
Dng v phuong Ty nguoi ta cung bit nu bia, ruou uyt.xki.
Enzim amylaza c trong nuoc bot, dich tiu ho cua nguoi v dng vt, trong hat, cu
nay mm, nm mc, vi khun v mt s ni nm men. Hin nay nguoi thu nhn enzim
amylaza thuong mai v cng ngh tu canh truong vi khun, nm mc theo phuong php
nui cy b mt v b su.
Hin nay nguoi ta bit r c 6 loai enzim amylaza (3 loai thuy phn lin kt u
1-4
, 3 loai
thuy phn lin kt u
1,6
glucozit). Cc enzim amylaza tu cc ngun, cc ging vi sinh vt
tng hop khc nhau th khc nhau v tnh cht, co ch, diu kin, san phm thuy phn.
6.1.1. X-amilaza ( tn h thng u-1,4 glucan-hidrolaza; m s 3.2.1.1.EC).
- Xc tc thuy phn lin kt u
1-4
glucozit nm o bn trong phn tu c cht (tinh bt,
glycogen) v th duoc goi l enzim amylaza ni phn (endoamylaza). Duoi tc dung
cua u-amylaza, amiloza (Am) kh nhanh thnh oligosaccarit gm 6 7 gc glucoza. Sau
d cc oligosaccarit ny la tip tuc bi phn ct thnh maltotetroza, mantotrioza v
mantoza (hnh 64 trang 234). Qua mt thoi gian tc dung di boi enzim, amiloza s bi
thuy phn thnh 23% glucoza v 87% maltoza. Tc dung cua u-amylaza lm amylopectin
(AP) cung xay ra tuong tu nhung v n khng phn ct duoc lin kt u
1-6
glucozit o mach
nhnh cua AP nn sau mt thoi gian lu th san phm s l 72% maltoza, 19% glucoza,
dextrin thp phn tu v izomaltoza (8%).
- Tuy nhin thng thuong trong mt thoi gian ngn 30 60 pht (thoi gian nu so b
nguyn liu tinh bt hay duong ho so b khi nu trong san xut ruou elylic). u-amylaza
chi thuy phn tinh bt chu yu thnh dextrin phn tu thp v mt t duong maltoza, kha
nng dextrin ho cao ny l tnh cht cua enzim dc trung cua enzim ny. V vy nguoi ta
cn goi loai enzim ny l amylaza dextrin hay amylaza dich ho.
- u-amylaza l mt metaloenzim (enzim co kim), trong phn tu enzim c tu 1 6
nguyn tu C, chng tham gia vo su hnh thnh v n dinh cu trc bc 3 cua enzim, duy
tr cu hnh hoat dng cua enzim, quyt dinh tnh bn nhit cua enzim.
- u-amylaza cua vi sinh vt c nhung dc tnh rt dc trung v co ch tcdung, kha
nng chuyn ho tinh bt v kha nng chiu nhit:
+ Th hin hoat tnh trong vng axit yu: u-amylaza nm mc c pH
op
= 4,5 4,9,
cua vi khun pH
op
= 5,9 6,1. O pH<3 enzim bi v hoat hon ton tru u-amylaza cua
Trang: 56
Asp. Niger c th chiu duoc pH = 2,5 2,8 (trong mi truong sinh tng hop axit xitric
bng phuong php ln men b mt).
+ u-amylaza cua nm mc c kha nng dextrin ho (dich ho) cao lai vua tao ra
mt luong lon glucoza v maltoza. u-amylaza cua vi khun lai c hai loai: u-amylaza
dich ho v u-amylaza duong ho.
+ Nhit d hoat dng cua u-amylaza tu cc ngun khc nhau l khc nhau. (bang
III-4 trang 108 Enzim VSV - Tp I). Trong d dng ch hon ca l u-amylaza cua vi
khun c th chiu duoc o nhit d cao, c th giu duoc hoat luc ngay ca khi dun si trong
nuoc mt thoi gian ngn. Tnh bn nhit ny l mt uu dim lon duoc su dung d xu l
nguyn liu o cc cng doan phai dng nhit d cao, hoc mi truong nhit doi nhu o
nuoc ta. Da s cc ch phm enzim thuong mai thuc nhm amylaza du c tnh chiu
nhit cao.
Nhung chung vi sinh vt c kha nng sinh tng hop u-amylaza duoc su dung trong
cng ngh: Asp. Oryzae, Asp. Awamori, Asp. Usami, Asp. Batatae, Asp. Niger, Bacillus
subtilic, B. lichemiformis, Endomycopsis fibuliger
6.1.2. -amylaza (tn h thng u-1,4-glucan-maltohidrrolaza m s 3.2.1.2 EC)
- Xc tc thuy phn lin kt u
1-4
glucozit (hinh 65 trang 235 gio trnh). Tun tu
tung gc maltoza mt tu du khng khu cua mach v do maltoza tao ra cu hnh v th
enzim ny duoc goi l -amylaza.
- Hu nhu khng thuy phn hat tinh bt nguyn m chi thuy phn tinh bt h ho,
c kha nng thuy phn 100% amylaza thnh maltoza v 54 58 % amylopectin thnh
maltoza. Qu trnh thuy phn AP bt du tu du khng khu cua nhnh ngoi cnh, mi
nhnh ny c 20 26 gc glucoza nn s tao ra duoc 10 -13 phn tu maltoza. Khi gp
lin kt u
1-4
dung k cn lin kt u
1-6
th -amylaza ngung tc dung. Phn cn lai khng
bi tc dung ny goi l -dextrin chua tt ca cc lin kt u
1-6
: cho mu tm do voi It.
- Nu cho ca u v -amylaza cng dng thoi thuy phn tinh bt th hiu sut thuy
phn dat toi 95%.
- -amylaza l mt albumin, enzim ngoai phn (exoenzym), chi c trong malt, vn
giu duoc hoat tnh khi khng c C, km bn o nhit d cao, bi v hoat hon ton o 70
0
C.
pH
op+
trong dich tinh bt thun khit l 4,6 , cn trong dich n tinih bt l 5,6. t
op
trong
dich tinh bt thun khit l 40-50
0
C, cn trong dich nu tinh bt l 60-65
0
C.
6.1.3. Glucoamilaza (tn h thng u-1,4-glucan-glucohidrolaza, m s 3.2.1.3.EC)
cn goi l amyloglucozidaza.
- Thuy phn lin kt u
1-4
v u
1-6
, v th cc nh nghin cuu Nht (Onoetal, 1964)
d nghi dt tn h thng l u
1-4
:1,6-glucan-4:6-glucohidrolaza. Enzim ny duoc cc nh
khoa hoc Nht tch ra ln du tin tu Asp. Awamori (katihara, karushima, 1956). Sau d
duoc tm thy o Rhizopus delemar, Asp. Niger, Asp. Oryzae, cc vi sinh vt khc, m
dng vt.
- Glucoamylaza l enzim ngoai bo (exoenzim), c kha nng thuy phn lin kt u
1-
2
, u
1-3
glucozit (Sawasaki, 1960; Ueyamaetal, 1965; Watanabe Fukimbara, 1960). N c
kha nng thuy phn hon ton tinh bt, glicogen, Am, Ap, dextrin cui, izomaltoza,
mantoza dn san phm cui cng l glucoza.
Trang: 57
- Da s glucoamylaza du thuc loai chiu axit, pH
op
=3,5 5, t
op
= 50 60
0
C, mt
hoat tnh o t>70
0
C. Hin nay enzim ny o vi tr hng du v hiu luc thuy phn tinh bt
v cc san phm trung gian. V th vic su dung cc ch phm glucoamylaza tch tu cc
chung vi sinh vt hoat dng trong san xut ruou, bia, mach nha, glucoza c mt trin
vong, nghia v cng to lon.
Nhung chung vi sinh vt c kha nng sinh tng hop glucoamylaza duoc su dung trong
cng ngh l: Asp. Awamori , Asp. Niger, Asp. Usami, Asp. Oryzae, Endomyces sp,
Endomycopsis Cpularis, Endomycopsis fibuliger, Rhizopus delemar, Rhizopus
Javanicus, Rhizopus niveus, Rhizopus peka, Rhizopus tonkinensis.
6.1.4. Oligo-1,6-glucozidaza hay dextrinaza toi han (dextrin-6-glucanhidrolaza.
3.1.1.10. EC)
- Thuy phn cc lin kt u
1-6
glucozit trong izomaltoza, panoza, cc dextrin toi han v
c th chuyn ho chng dn cc loai duong c th ln men duoc. Cc ni nm mc Asp.
Awamori, Asp. Usami, Asp. Oryzae sinh tng hop rt manh m loai enzim ny cho nn
nu duong ho tinh bt d nu chn (trong san xut ruou etylic) bng ch phm enzim
nui cy tu cc ni vi sinh vt ny s thu duoc dich duong c kha nng ln men cui (ln
men dai) rt trit d, gp phn nng cao hiu sut gy men v hiu sut tng thu hi ruou.
Ngoi ra enzim ny cung c trong malt, trong m dng vt v ca nm men, dc bit
chng cn c cc enzim khc cng ho hng voi enzim ny l: amylopectin-1,6-
glucozidaza (amylopectin-1,6-glucanhidrolaza 3.2.1.9) v dextrin-1,6-glucozidaza
(dextrin-1,6-glucanhidrolaza 3.2.1.33). Ca 2 enzim ny thuy phn dextrin su sc hon ca
u v -amylaza
Ca 3 enzim k trn (dextrinaza) du hoat dng o t
op
= 40
0
C, pH
op
= 5,1.
6.1.5. u-glucozidaza hay maltaza (u-D-glucozit-glucohidrolaza 3.2.1.20 EC)
C nhiu loi nm mc sinh tng hop ra enzim ny, tc dung thuy phn duong maltoza
thnh glucoza nhung khng thuy phn duoc tinh bt. Nhu vy ging nhu dextrinaza,
enzim ny gip cho qu trnh ln men cui chuyn duong thnh ruou etylic gp phn
nng cao hiu sut ln men.
6.1.6. Transglucozilaza (u-1,4-glucan: D-glucoza-4-glucozil transferaza
2.4.1.3.EC)
Enzim ny thuong tn tai song song voi glucoamylaza (trong ch phm nm mc
Aspergillus), n c hoat tnh thuy phn v hoat tnh vn chuyn nhm. Nghia l n khng
nhung chi thuy phn maltoza thnh glucoza m cn tng hop nn izomaltoza, izotrioza v
panoza, tuc l c kha nng chuyn gc glucoza dn gn n vo phn tu maltoza hoc
phn tu glucoza boi lin kt u
1-6
glucozit d tao thnh cc glucozit ni trn.
Su c mt cua enzim ny trong cc ch phm enzim amylaza dng d bin hnh tinh
bt (mach nha, duong glucoza, ruou etylic) l diu khng mong mun v n xc tc su
tng hop lai cc izosaccarit tu chnh cc san phm thuy phn tinh bt, lm giam hiu sut
duong ho, dich thuy phn c vi dng khng mong mun.
Trang: 58
6.2. Proteaza.
Nhm enzim proteaza (peptit hidrolaza 3.4) xc tc qu trnh thuy phn lin kt
peptit (-CO-NH-)
n
trong phn tu protein, polypeptit dn san phm cui cng l cc axit
amin. Ngoi ra, nhiu proteaza cung c kha nng thuy phn lin kt este v vn chuyn
axit amin.
Theo h thng phn loai quc t th nhm enzim ny duoc chia lm 4 phn nhm
1/ Aminopeptidaza: thuy phn lin kt peptit o du nito amin ( NH
2
) cua mach
polypeptit.
2/ Cacboxypeptidaza: xc tc thuy phn lin kt peptit o du cacbon cua mach
polypeptit. Hai phn nhm ny thuc toai exo-peptitdaza (enzim ngoai phn)
3/ Dipeptit hidrolaza: thuy phn cc lin kt peptit
4/ Proteinaza: xc tc su thuy phn lin kt peptit ni mach (endo-peptitdaza)
Cc proteaza kh ph bin o dng, thuc vt v vi sinh vt, trong d dng ch hon ca
l c nhiu vi sinh vt c kha nng sinh tng hop manh m proteaza. Cc enzim ny c
th o trong t bo (proteaza ni bo) hay duoc tin vo mi truong nui cy (proteaza
ngoai bo). Ging nhu amylaza, mt s loai proteaza d duoc dn tc cc nuoc chu ,
trong d c Vit Nam su dung trong mt s ngnh san xut cc san phm thuc phm
truyn thng nhu: san xut nuoc mm v cc loai mm, san xut tuong v chao, mt s
loai nem, tr. Bang II-3 trang 131, 132 (Enzim VSV- tp I) gioi thiu mt s loai VSVc
kha nng nui cy sinh tng hop v thu nhn enzim proteaza. Theo bang ny ta thy mt
s ni vi khun thuc ging Bacillus, xa khun thuc ging Streptomyces, nm mc
thuc ging Aspergillus, Penicillium, Rhizopus l c kha nng sinh tng hop enzim
proteaza manh nht. Cn cu vo co ch phan ung, d pH
op
, Hartley (1960) d phn loai
cc proteinaza vi sinh vt thnh 4 nhm: proteinaza-serin, P.tiol, P.kim loai v P.axit
(Bang II-6 trang 156, 157 Enzim VSV- Tp I). Trong luong phn tu cua 4 nhm ny
tuong di b: chng han M
P-serin
=20000 27000, tuy nhin nhm ny c mt s c M lon
hon nhu enzim cua penicillium M = 44000. Asp. Oryzae 5038 v M = 52000, M
P.kim loai
=
33800 48400, M
P.tiol v axit
= 30000 40000.
V d bn th P.serin bn trong gioi han pH rng, tu 5 10 o diu kin nhit d thp.
P.serin cua Bacillus.pumilus kh bn trong mi truong kim o pH=11 vn giu duoc 80%
hoat d ban du. O nhit d 360
0
C nhm ny bi mt hoat tnh nhanh chng. Tuy nhin
cc P.serin cua Streptomyces fradiae v Stre.reatus lai bn nhit o 70
0
C trong 30 pht chi
bi mt 10 -15% hoat tnh. Cc proteinaza kim loai km bn nht trong s 4 nhm ny,
bn trong pham vi pH = 6 9, nhanh chng bi mt hoat tnh ngoi khoang pH ny. Ca
lm tng d bn cua nhm enzim ny.
Cc proteaza-axit bn trong pham vi pH
axit
= 2 6, trong mi truong axit chng kh
bn nhit.
Cc proteaza ni chung duoc ung dung rt rng ri trong nhiu linh vuc:
- Trong ch bin thuy san: khi san xut nuoc mm (v mt s loai mm) thuong
thoi gian ch bin thuong l di nht, hiu sut thuy phn (d dam) lai phu thuc rt
nhiu vo dia phuong, phuong php gi nn, nguyn liu c. Nn hin nay quy trnh san
xut nuoc mm ngn ngy d duoc hon thin trong d su dung ch phm enzim thuc vt
Trang: 59
(bromelain v papain) v vi sinh vt d rt ngn thoi gian lm v cai thin huong vi cua
nuoc mm. Tuy nhin vn cn mt s tn tai cn phai hon thin thm v cng ngh.
- Trong ch bin thit, proteaza duoc su dung d lm mm thit v tng huong vi thit.
(ngm thit vo dinh dung preteinaza o pH v nhit d xc dinh phuong php ny ph
bin v thun loi nht; Tm hn hop lm mm thit (enzim, mui, bt ngot). Tim dung
dich enzim vo thit; tim dung dich enzim vo con vt truoc khi git m). Su dung
proteinaza d san xut dich dam: tu Streptomyces fradiae tch duoc ch phm keratineza
thuy phn duoc keratin rt c gi tri d san xut dich dam tu da, lng vu. Nu dng axit
d thuy phn s mt di hon ton cc axit amin chua luu huynh, nu dng kim d thuy
phn s bi raxemic ho (chuyn dang L sang D lm giam gi tri sinh hoc cua axit amin).
D thuy phn su sc v trit d protein (trong nghin cuu, ch tao dich truyn dam y t)
cn dng cc proteinaza c tnh dc hiu cao v tc dung rng, mun vy nguoi ta thuong
dng phi hop ca 3 loai proteinaza cua 3 loai: vi khun, nm mc, thuc vt voi ti l tng
cng 1 2% khi luong protein cn thuy phn. Uu dim cua vic thuy phn protein boi
enzim l bao ton duoc cc vitamin cua nguyn liu, khng tao ra cc san phm phu,
khng lm sm mu dich thuy phn.
- Trong ch bin sua: nguoi ta chi su dung cc proteaza cua vi sinh vt c tnh cht
tuong tu renin hoc chi thay th 25 50% renin. (renin l enzim lm dong tu sua duoc
san xut tu da dy b) nhu cc ging lin kt Aspergillus Candidus, Penicillium
roqueforti, Bacillus mesentericus... duoc ung dung d san xut phomat. Ngoi ra c th
su dung proteinaza d thu cazein k thut (tu sua) d san xut vectri, cht mu, keo dn,
huong liu.
- Trong ch bin bia v nuoc giai kht: proteinaza duoc dng d lm trong bia v
nuoc qua.
- Trong cng nghip dt: papain v proteinaza vi sinh vt duoc su dung d lm sach
to tm, ty to nhn tao (cc soi nhn tao duoc bng cc dung dich cazein, gelatin) d soi
duoc bng, d nhum.
- Trong cng nghip da: proteinaza duoc dng d lm mm, lm sach v ty lng
da, lm tng tnh dn hi, cai thin diu kin lm vic, trnh nhim mi truong.
- Trong cng nghip x phng, cc cht ty rua, m phm: thm enzim proteinaza
trong cc loai x phng dit khun, kem dung da, x phng c tnh ty rua cao.
- Trong y hoc: su dung nhiu enzim proteinaza d san xut thuc h tro tiu ho,
nu cao dng vt, chua bnh nghn mach mu, tiu vim vt thuong.
Trang: 60
6.3. Pectinaza
- Pectin l co cht cua enzim pectinaza. Pectin rt ph bin trong thuc vt, l hop cht
polime tu nhin tn tai c 3 dang: protopectin, pectin v axit pectinic.
Protopectin khng tan c dang thuc vt xanh, tao cho rau qua xanh c d cung nht
dinh, bi thuy phn boi axit hay nhit d, enzim s chuyn thnh pectin ho tan (qu trnh
chn cua qua c th goi l qu trnh chuyn ho ny). Pectin l este metila cua axit
polygalacturonic. Tnh cht quan trong nht cua pectin l d tao gel o nng d dich
duong cao 65% trong mi truong 1% axit. Axit pectinic l mt axit polygalacturonic
nhung chi duoc este ho mt phn nho boi metanol. Cn axit putic hay polypectic l axit
d duoc giai phng khoi nhm mety ( OCH
3
). Mui tuong ung c tn l pectinat
v pectat. Lin kt chnh trong pectin l u
1-4
glucozit.
- Hin nay, h thng enzim pectinaza duoc chia thnh 2 nhm chnh: hydrolaza v
transeliminaza voi dc dim chung nht l lm giam d nhot cua dung dich pectin v lm
giam phn tu luong cua cc san phm tao thnh.
6.3.1. Hydrolaza: (pectihydrolaza)
Thuc nhm ny c 2 enzim chu yu l: pectinesteraza v polygalacturonaza.
- Pectinesteraza: (3.1.1.11.EC) - goi tt PE: enzim xc tc thuy phn lin kt este
trong phn tu pectin ho axit pectinic d giai phng san phm l metanol v axit
polygalacturonic. PE chi phn ct cc nhm metoxy dung canh nhm COOH tu
do.
Vi tr tn cng nhm metoxy o vi tr 5 d hon o vi tr 3 v 7 (2 gc COOH ). D
pH
op
cua PE thu duoc tu cc ngun khc nhau: Tu vi sinh vt : 4,5 5,5
Tu thuc vt : 5,0 8,0
PE cua nm mc c t
op
= 30 45
0
C, bi v hoat o t = 55 62
0
C, PE duoc hoat ho boi
Ca
2+
v Mg
2+
.
- Polygalacturonaza (PG. 3.2.1.15.EC; poly u
1,4
galacturonit glucanhidrolaza)
Enzim ny t gp trong thuc vt, chu yu c trong vi khun v nm mc. Dy l mt
phuc h enzim v thuong c tnh dc hiu cao di voi co cht. Dua vo d nguoi ta chia
ra 4 kiu sau:
+ Polymetyl-galacturonaza (PMG - poly u
1,4
galacturonit metyl este
glucanhidrolaza. 3.2.1.41EC). PMG lai duoc phn thnh 2 nhm nho phu thuc vo vi tr
phn ct lin kt u
1,4
o trong hay o cui v du mach.
Endo glucozidaza polymetyl galacturonaza kiu I (endo PMG I). Dy l enzim
c tnh cht dich ho, pectin c muc d metyl ho cng cao (nhiu gc metoxy OCH
3
)
COOCH
3
COOCH
3
COOH COOCH
3
COOH COOCH
3
COOCH
3
COOCH
3
COOCH
3
1
2 3 4 5 6 7 8 9
Trang: 61
th bi thuy phn cng nhanh v trit d. Trong mi truong khi c mt pectinesteraza (PE)
th enzim ny thuong bi giam hoat luc.
Endo PMG I rt ph bin trong cc ni nm mc: Asp. Niger, Asp. Awamori,
Botrytis cinezea, Neurispora crassa.
Co ch tc dung nhu hnh v:
Exo - glucozidaza polymetyl galacturonaza kiu III (exo PMG III). Dy l
enzim c tnh cht duong ho, c kha nng ct tung gc monome axit galacturonic ra
khoi mach bt du tu du khng khu c nhm metoxy ( OCH
3
)
+ Enzim tc dung ln axit pectinic hay axit pectit - goi l polygalacturonaza (PG)
cung duoc phn thnh 2 nhm nho:
Endo glucozidaza polygalacturonaza kiu II (endo PG II). Dy l enzim c
tnh cht dich ho, chi thuy phn co cht khi c mt nhm COOH tu do. Hoat d cua
endo PG II tng ln nhiu khi co cht duoc xu l truoc bng pectinesteraza (d tao ra
nhiu gc COOH tu do). Nm mc v vi khun tng hop duoc enzim ny.
Exo - glucozidaza polygalacturonaza kiu IV (exo PG IV).
Thuy phn cc lin kt gn voi nhm COOH tu do o du hay mi mach
COOCH
3
COOCH
3
COOH COOCH
3
COOCH
3
COOCH
3 COOCH
3
1
2 3 4
5 6
7
COOCH
3
COOCH
3
COOH COOH COOCH
3
COOCH
3
COOCH
3
1
2 3
4
5 6
7
COOCH
3
COOH COOCH
3
COOCH
3
COOH COOCH
3 COOH
1
2 3 4
5 6
7
COOH COOCH
3
COOH COOH COOH
COOCH
3 COOH
1
2 3
4
5 6
7
COOH
8
Trang: 62
6.3.2. Transeliminaza (TE)
Dy l nhm enzim duoc tm ra cch dy chua lu lm (khoang nm 1960 1961) bao
gm protopectinaza xc tc su phn ct araban, galactan khoi protopectin d tao thnh
pectin ho tan v enzim transeliminaza phn ct phi thuy phn (khng c su tham gia cua
phn tu H
2
O) pectin d tao ra cc gc galacturonic c ni kp giua nguyn tu C
4
v C
5
.
Phan ung xay ra d dng o mi truong trung tnh hay kim yu.
6.3.3. Mt s ung dung cua ch phm pectinaza.
Cc ch phm enzim pectinaza thuong duoc su dung trong san xut nuoc qua, san xut
ruou vang, trch ly dng duoc (sc thuc) v trong chn nui.
- Ung dung ch phm pectinaza trong san xut nuoc qua:
C cc mt hng nuoc qua trong, nuoc qua duc, nuoc qua c thit qua, tt ca du duoc
san xut tu nuoc p (chit rt) cua qua. Do d hiu qua thu dich qua cua phu thuc vo
H
O
H OH
OH
H
C
H H
O
O
O CH
3
O
H
O
H OH
OH
H
C
H H
O
O CH
3
O
H
O
H OH
OH
H
C
H H
O
O
O CH
3
O
H OH
OH
H
C
H
O
O CH
3
OH
H
+
Trang: 63
tnh cht cua nguyn liu qua (cu tao, d chn, thnh phn dinh tnh v dinh luong cua
pectin trong qua, phuong php p, chit rt)
+ Khi ch bin nuoc qua trong th ch phm pectinaza phai c endo v exo
polygalacturonaza (endo PGII v exo PGIV). Enzim pectinesteraza v proteinaza. Hai
loai enzim du lm giam d nhot dich qua, cn PE gp phn vo tc dung cua enzim ny,
cn protein thuy phn protein cua vo t bo thuc vt lm cho dich qua d thot ra, cn v
b d lng hon. Voi cc loai qua c nhiu protopectin nhu to, l, i th ch phm khng
duoc c enzim protopectinaza v nu c s phn huy protopectin lm mm ho m qua,
tng d nhot cua dich qua nn lm giam hiu sut ly nuoc qua trong. Ngoi ra, nuoc qua
khng duoc php chua cc enzim oxy ho (ascobatoxydaza, polyphenoloxydaza,
peroxydaza) lm hao tn vitamin C v sm mu, bin php su dung nhit (dun nng) s
v hoat h enzim ny.
+ D thu duoc nuoc qua voi hiu sut cao, nguoi ta thuong nghin thit qua, xu l bng
ch phm enzim pectinaza, sau d moi dem vt, ly tm hay p. Chng han: nu xu l to
nghin bng 0,03% ch phm pectinaza (200 don vi hoat d) PMG (gam) sau 2 4 h s
tng hiu sut thu dich qua 20 25%. Khi p nho m khng su dung ch phm pectinaza
th hiu sut p l 65% nhung nu sau khi nghin ch qua v xu l bng 0,2% ch phm
pectinaza trong 3h o 45
0
C s nng cao hiu sut p ln 77 82%.
Dng pectinaza cn c tc dung lm trong do su ph huy h keo trong nuoc qua, vi
cua qua tt hon v t bi duc tro lai.
- Ung dung ch phm pectinaza trong san xut ruou vang:
Ruou vang duoc san xut tu cc loai qua ngot (qua c duong): nho, to, du, chui,
dua, mo, mn, anh do, son tra (to mo) bao gm cc giai doan chu yu: diu ch dich
qua ln men, ln men dich qua , xu l v tng tru vang. Ch phm pectinaza dng trong
cng ngh vang d lm tng hiu sut thu dich qua v d lm trong. Mun vy, ch phm
phai bao ton duoc hoat d trong diu kin nng d ruou trung bnh 10 12% v d pH
hoi axit (4 5). Khi xu l b nho bng pectinaza s lm tng hm luong catechin trong
ruou (cht cht). Catechin c hoat tnh cua vitamin P nhu vy d lm tng gi tri sinh hoc
cua vang. Ngoi ra vang cn c d thun thuc (thnh truong ageing) nhanh hon, huong
thom manh hon, vi diu hon do c nhiu glyxezin v este.
- Ung dung pectinaza trong trch ly cc duoc liu dng y (thuc bc, thuc nam). Cc
duoc liu c ngun gc thuc vt, trong thnh phn cua chng ngoi cc hoat cht
th lun lun c pectin. Tu truoc dn nay d thu nhn duoc cc thnh phn hoat
cht trong duoc liu (d tri bnh cp thoi (ngay lc d), d diu ch dang cn
(ruou), thuc (ung v xoa bp), d diu ch dung dich thuc, vin nn, vien nang,
dc bit hin nay d san xut thuc tim v dich truyn tu chnh cc vi thuc dng
y, cc thuc phm chuc nng (fuctional food)) nguoi ta dng cc phuong php: chit
rt bng nuoc nhit (cn goi l sc thuc v dy l phuong php ph bin
nht),bng cn (ngm ruou thuc), trch ly bng dung mi thch hop (axeton, ete,
nito long, axeton lanh). Do c thnh phn pectin nn qu trnh sc thuc kh khn,
khng trch ly duoc trit d hoat cht, dich thuc bi bin cht sau mt thoi gian
ngn. D khc phuc nhung kh khn ny, nguoi ta dng ch phm enzim pectinaza
d phn giai cc m thuc vt d cc hoat cht duoc giai phng ra d dng v trit d
Trang: 64
hon khi sc thuc. Tuy nhin, v su dung cho muc dch san xut thuc chua bnh
nn khi dng ch phm enzim phai c d tinh khit rt cao d khng mang theo
nhung hoat cht la vo thuc, phai c hoat d cao d chi dng voi mt luong ti
thiu. C th tin hnh theo so b so d cng ngh sau:
- Ung dung ch phm pectinaza trong chn nui:
Khu phn n cua gia sc, gia cm thuong chua mt luong thuc n th, thuc n xanh
nht dinh (rom ra, co, thn cy, cm...) trong khi d o duong tiu ho cua chng lai thiu
cc enzim phn giai xenluloza, hemixenluloza, pectin. Chi c nhung dng vt nhai lai c
da co pht trin dy du (trn 6 thng tui) hay gia cm c manh trng di (ngng, d diu)
moi c h vi sinh vt sng cng sinh trong da co l c kha nng sinh ra cc h enzim d
gip dng vt tiu ho mt phn cc cht dinh dung ny, tuy vy khoang 1/3 nhm cht
ny khng duoc dng ho. D nng cao kha nng tiu ha hp thu, nguoi ta c th thm
vo thuc n chn nui cc ch phm enzim phn giai nhm gluxit ny - du l ch phm
c hoat tnh pectinaza, xenluloza v hemixenluloza cao.
+ Di voi cc dng vt nhai lai (tru, b, d, cuu, ngua): do c h vi sinh vt sng
trong da co tham gia tch cuc vo qu trnh tiu ho thuc n. Khi thm ch phm enzim
pectinaza v xenluloza cao o d pH = 6 7 (axit tnh) s c loi lm tng d tiu ho cua
thuc n.
+ Di voi ngng v ngan (vit xim): dy l 2 loi gia cm nui ly thit, dc bit l c
loi d san xut ra gan bo (gan nguyn liu san xut ra mt hng pete gan rt ni ting).
Hai loi ny c nng luc sinh truong rt cao, nguoi ta c gng nui d dat d tng trong
cao v thoi gian ngn (o d tui gia cm non tui c gi tri thuong phm cao). Mun vy
nguoi ta nui v bo bng cch nhi thuc n c su dung cc ch phm pectawamorin
0,04% so voi khu phn.
6.4. Xenluloza:
- Hng nm c khoang 230 ti tn cht huu co duoc tng hop bng qu trnh quang hop
o thuc vt, trong d c ti da 70 ti tn (30%) xenluloza. Dy l polyme tu nhin -D-
glucoza duoc ni voi nhau qua lin kt -D-1,4-glucan, muc d polyme ho cua phn tu
xenluloza: 200 15000, trung bnh 3000, trong luong phn tu 50.000 2.500.000.
Xenluloza l hop cht tu nhin kh bn, khng tan trong nuoc, chi bi truong phng do
ht nuoc, bi phn huy khi dun nng voi kim hay axit hoc do cc enzim duoc goi chung
l xenluloza.
Duoc liu Lm nho Trn enzim Thuy phn ln 1 Hm
Trn enzim Thuy phn ln 2 Hm chit Dun nng Loc
Diu chinh v pha ch C dc Dng chai Thanh trng
Trang: 65
- Theo nhung hiu bit hin nay th qu trnh phn huy xenluloza nho enzim duoc thuc
hin nho phuc h xenluloza, bao gm cc enzim C
1
, C
x
v -glucosidoza. Enzim C
1
c
tnh cht khng dc hiu. Duoi tc dung cua C
1
, cc loai xenluloza bi hp thu nuoc,
truong ln v chun bi cho su tc dng cua cc enzim khc. Nu tch ring C
1
cho hoat
dng dc lp th tc dung ny lai khng thy r rng. V vy nguoi ta cho rng d chi l
mt yu (factor), khng phai l enzim C
x
cn goi l enzim -1,4 glucanaza, thuy phn cc
xenluloza ngm nuoc boi C
1
ni trn (polyanhydroglucoza hydrat ho) thnh xenluloza.
Chu x c nghia l enzim gm nhiu thnh phn khc nhau v nguoi ta thuong chia lm 2
loai chnh l: exo--1,4 glucanaza v endo--1,4 glucanaza. Exo--1,4 glucanaza xc tc
vic tch lin kt cc don vi glucoza tu du khng khu (non-reducing end) cua chui
xenluloza (hnh trang 122 VSV tp II). Endo--1,4 glucanaza phn ct lin kt -1,4
glucozit o bt ky vi tr no cua chui xenluloza.
C tc gia (Ogawa v Toyama, 1967) cho rng cn c mt enzim trung gian C
2
giua
C
1
v C
x
. Enzim ny truoc ht tc dng vo xenluloza d bi lm truong nuoc boi C
1
ri
thuy phn thnh cc dextrin xenluloza ho tan. Sau d C
x
s tip tuc thuy phn cc xenlo
dextrin ny thnh xenlobioza.
-glucosidoza l enzim rt dc hiu, thuy phn xenlobioza tthnh xenlohexoza (D-
glucoza) m s enzim ny l: 3.2.1.21 EC.
- Ngun enzim xenluloza:
C th ni qu trnh phn giai xenluloza boi vi sinh vt l mt trong nhung chu trnh
quan trong nht cua tu nhin. Nguoi du tin nghin cuu kha nng phn giai xenluloza
cua cc vi sinh vt ky kh l popov vo nm 1875, tip d l omelianxki. Cc mi truong
nghin cuu phn lp vi sinh vt loai ny tro thnh kinh din. Cn nguoi du tin pht hin
kha nng phn giai xenluloza boi vi khun hiu kh l G.Van Iterson vo nm 1903.
Truoc d, hoat dng phn giai xenluloza boi vi sinh vt sng trong da co cua cc dng
vt nhai lai d duoc chung minh (1955). Dn nm 1971, nguoi ta d phn lp duoc mt
s loi vi sinh vt c kha nng phn giai xenluloza trong da co (trang 126, VSV, tp II).
Trong d c 2 giai doan nghin cuu k hon ca l Ruminococus v R.flavefacicus.
V sau ny, rt nhiu vi sinh vt phn giai xenluloza duoc tm thy trong dt, nuoc,
phn bn huu co. Dng ch hon ca l vic ung dung vi khun thuc nhm
celludomonas vo vic ln men phn giai b ma v rc thai thuc vt. Suu tp ging QM
(QM collection) cua HHTH Massachusetts cung c khoang 14000 chung nm c kha
nng phn giai xenluloza, trong d cc chung ni ting nhu trichoderma viride,
Sporotrichum P.ruinosum, penicllium pusillum, Aspergillus fumigat, Asp.terreus...
- Ung dung cua xenluloza:
+ Ph v thnh t bo (cellwall) thuc vt d nui cy cc t bo trn (t bo khng c
mng) d lai tao chng voi nhau nhm tao ging thuc vt
+ San xut truong glucoza thuc phm, nguyn liu cng nghip hoc nui cy nm
men gia sc.
O Nht, hng Megiseika d su dung Trichoderma.Konigii v hng Kinkiyakylt d su
dung T.viride nui cy theo phuong php b mt d san xut xenlulaza. So d phn
xuong th dim (pilot) san xut siro glucoza tu cc ngun xenluloza ph liu nho
xenluloza cua T.viride nhu sau. (hnh V-13 trang 164 VSV hoc - tp II)
Trang: 66
+ Ln men duong chuyn ho (tao thnh boi su thuy phn xenluloza do enzim) thnh
etanol nhin liu dng co dt trong (xe hoi, xe my)
+ Tch tinh bt ra khoi hat v cu bng cch dng cc enzim tch t bo (cell separating
enzyme CSE). Dy l h thng enzim tc dng vo phn protopectin cua vo (hat, cu) d
giai phng tinh bt, mt s chung nm Rhizopus sinh tng hop loai enzim ny.
+ San xut t hop EM (Effect Microbiology vi sinh vt huu hiu) trong xu l rc
thai.
6.5. Saccaraza v glucooxydaza.
- Saccaraza: dy l mt nhm enzim bao gm: invertaza, dextranaza, levansaccaraza...
xc tc thuy phn cc lin kt glucozit cua saccaroza v mt vi loai duong khc. Trong
s cc enzim ny th invertaza (B-D-fructofaranozit fructohidrolaza, m s 3.2.1.26 EC)
l c nghia khoa hoc v thuc tin hon ca. Enzim ny rt ph bin trong nm men v
nm mc: Saccharomyces cerevisiae, Sach. Carlsbergensis, Sach. Pastenriabus,
Aspergillus Oyae, Asp. Niger...
Invertaza l enzim ni bo (endoenzyme), pH
op
= 4,5, t
op
= 65 70
0
C.
Invertaza duoc su dung rng ri trong cng ngh thuc phm d nghich dao duong
chng hin tuong kt tinh duong (lai duong) trong san xut bnh keo (dung dich duong
nng d 65% th kt tinh nhung c invertaza th o nng d 80% vn khng kt tinh), tng
d ngot khi thuy phn duong saccaroza thnh glucoza v fructoza, san xut bt my nhn
tao, san xut dich duong y t (dich truyn glucoza).
- Enzim oxy ho: glucooxydaza catalaza.
+ Glucooxydaza (B-D-glucoza: O
2
oxydoreductaza; 1.1.3.4 EC) l enzim oxy ho -
khu, chi tc dung ln B-D glucoza khi c mt oxy, oxy ho glucoza thnh gluconic v
H
2
O
2
:
+ Catalaza: mt enzim oxy ho khu hay di cng enzim glucooxydaza d khu ho
H
2
O
2
tip tuc:
Tng hop ca (1) v (2) ta c:
C
6
H
12
O
6
+ O
2
+ H
2
O
Glucooxydaza
C
6
H
12
O
7
+ H
2
O
2
(1)
H
2
O
2
catalaza H
2
O + 1/2O
2
(2)
C
6
H
12
O
6
+ 1/2O
2
C
6
H
12
O
7
(3)
Trang: 67
Tuc l cu 1 phn tu gam glucoza cn 0,5 ptg O
2
. Tnh cht ny cua enzim c mt
nghia thuc t rt lon l phuc h enzim ny c th loai bo oxy trong mi truong phan ung,
trnh duoc su oxy ho boi chnh oxy khng kh (mi truong). Nhu vy c th ko di
thoi gian bao quan m khng cn phai tc dng cua bin php ht chn khng (dng gi
chn khng).
Glucooxydaza c nhiu o cc loi nm mc Penicilium notatun, Pen.chrysogenum,
Pen.vitale, Aspergillus.Niger.
+ Ch phm enzim glucooxydaza v dc bit l nu dng kt hop voi ch phm
Catalaza c rt nhiu ung dung trong thuc tin:
1) Chng ri mt trong cc bao b kim loai
2) Nng cao gi tri cua bt lng trng trung (albumin): Trong albumin c mt
luong duong glucoza tu do 0,5%, luong duong ny l tc nhn tham gia phan ung
Maillard lm sm mu bt trung trong thoi gian bao quan. C th loai tru tc dng ny
bng ch phm enzim glucooxydaza nhu trn.
3) Bao quan bt sua, d cung khng c ruou, c ph, du m, phomat, d hp.
4) Giu tuoi rau qua truoc khi dm chn nhu: chui, c chua, to,...Mun vy nguoi
ta gi enzim cng voi glucoza, cht dn ri cho vo giua khi qua tuoi dang bao quan
kn. Enzim s loai tru oxy trong mi truong bao quan d giu cho qua tuoi lu.
5) Tin hnh cc phn tch ho sinh chn don bnh nhu: phn tch duong trong
huyt, nuoc tiu (bnh tiu duong, tng, ha duong huyt).
Trang: 68
Chuong 7: PHUONG PHP XC DJNH HOAT D MT S LOAI
ENZIM
(Copfacto: cht phi hop hay cht cng tc cua enzim
DEAE celluloza: diethylamino athylcelulose)
7.1. Don v| do hot d:
Muc d hoat dng cua enzim trong ch phm l thng tin quan trong v luong enzim
trong di tuong nghin cuu, v rng trong nhung diu kin xc dinh, tc d phan ung
enzim ti l voi luong enzim trong hn hop phan ung. Luong enzim theo quy uoc quc t
duoc biu din bng don vi enzim:
Don vi tiu chun enzim l luong enzim c kha nng xc tc chuyn ha 1 micro mol
co cht sau 1 pht o nhung diu kin xc dinh cho truoc
- Trong truong hop enzim chi phn giai mt s lin kt cua phn tu co cht (v du
proteinaza voi co cht protein, amilaza voi co cht tinh bt) th don vi hoat d tiu chun
cua enzim khng tnh micromol co cht bi chuyn ho m tnh bng micromol duong
luong cua cc nhm tuong ung duoc tao thnh. Tuc l tnh theo s lin kt (peptit hay
glucozit) bi phn giai.
- Trong truong hop phan ung giua 2 loai phn tu theo kiu th
don vi enzim l luong enzim xc tc chuyn ha 1 micromol co cht A hoc B, hoc 2
micromol co cht A (hoc B) nu A=B sau 1 pht.
- Khi xc dinh hoat d enzim trong pha long (dich th) th tnh s don vi enzim trong
100 ml.
- Co cht dng cc don vi dn xut cua don vi d biu din: mili don vi, kil don vi.
- Trong qu trnh tch v lm sach (tinh ch) enzim th d dnh gi hiu qua cua qu
trnh ny, nguoi ta dng don vi hoat ring: d l s don vi enzim tnh trn 1 mg protein.
Don vi ny dnh gi muc d thun khit cua enzim.
- Nu bit chnh xc trong luong phn tu cua enzim th c th xc dinh duoc hoat d
phn tu cua n: l s phn tu co cht (hoc s duong luong cc nhm tuong ung) bi
chuyn ho duoi tc dung cua 1 phn tu enzim sau 1 pht.
- Nu bit duoc s trung tm hoat dng trong phn tu enzim c th bit duoc hoat d cua
trung tm xc tc. D l s phn tu co cht bi chuyn ho do 1 trung tm xc tc cua
enzim sau 1 pht. Nhu vy nu enzim chi c mt trung tm xc tc th dai luong ny
trng voi hoat d phn tu enzim.
- Nng d enzim trong dung dich duoc biu din bng s don vi hoat dng trong 1 ml.
- Nhung diu cn luu khi xc dinh hoat d enzim:
+ Ban cht cc enzim l protein nn thuong khng bn vung, rt nhay cam voi cc
tc nhn l, ho. V vy khi lm th nghim voi enzim cn trnh cc yu t c th gy
A + B C + D
Trang: 69
bin tnh v hoat enzim nhu: t
0
cao, pH qu axit, qu kim, kim loai nng v mui cua
chng...trnh tao bot trong dung dich v mt s enzim c th bi km hm trn b mt phn
chia pha.
+ Cc diu kin (thng s) phan ung (t
0
, pH, p sut...) phai o trong gioi han
enzim c th tn tai bn vung v duoc giu c dinh trong sut thoi gian phan ung. Mun
vy phai tin hnh phan ung trong dung dich c pH xc dinh, bnh phan ung phai dt
trong my siu n nhit, cc cht phan ung (co cht, cofacto...) phai c nhit d cua bnh
phan ung truoc khi nap vo.
+ Phan ung enzim duoc tin hnh trong diu kin du co cht v cofacto. Cn tnh
truoc d sao cho khi kt thc phan ung chi c d 20% co cht ban du bi chuyn ho.
truoc d cn xc dinh nng d co cht thch hop cho phan ung bng cc th nghim qui
hoach dng.
+ Thoi gian xc dinh hoat d khng nn qu lu, thuong trong khoang 5 30 pht.
Tt nht l xc dinh tc d phan ung o pht du tin (30 60s) v tc d phan ung n
dinh enzim chua bi cc tc dng anh huong nhiu dn hoat d. Trong mt s truong hop
nu hoat d enzim qu thp hay cn nghin cuu anh huong cua mt s yu t ho hoc,
ho sinh (kim loai, gc axit, bazo...) cn phai u enzim voi co cht c yu t khao st
trong thoi gian du lu (>1h).
+ Khi xc dinh hoat d enzim, bn canh mu th nghim (enzim tc dung voi co
cht) cn lm mu kim tra (kim chung, mu trng) trong d enzim d bi mt hoat dng
(hoc khng c enzim) truoc khi tip xc voi co cht. Mu ny cung thuc hin ging mu
th nghim nhung chi khc l phai v hoat (dnh chi hoat d) enzim hoc l khng thm
enzim. Hoat d enzim duoc tnh bng hiu s luong co cht (hay san phm phan ung)
giua mu th nghim v kim tra.
7.2. Cc phuong php xc d|nh hot d enzim:
C th phn chia thnh 2 loai phuong php: lin tuc v gin doan.
- Phuong php lin tuc: su dung my mc, thit bi dc bit hoat dng tu dng lin tuc
(chun d, so snh, do dac) voi co cu tu dng ghi lai lin tuc su bin di cua cc cht v
cc thng s phan ung (hin thi bng bang, biu, d thi, biu d, enzim d...) trong sut
thoi gian tc dung cua enzim.
Nhu vy phuong php ny c nhiu uu dim, hon ton tu dng, c kt qua ngay, cng
mt lc c th c nhiu mu theo mt chuong trnh dinh sn. Dy l xu huong v thuc
tin hin nay voi cng ngh cao (high tech)
- Phuong php gin doan: cho enzim tc dung voi co cht, sau nhung khoang thoi gian
nht dinh th ly mu phan ung d phn tch kt qua.
Trang: 70
C th goi phuong php ny l phuong php c din nhung hin nay vn cn duoc su
dung ph bin truong nghin cuu thm d, so b, th nghim dai cuong, dinh tnh. Chi c
mt s t thao tc voi enzim tinh khit duoc xem l hin dai.
Sau dy ta xem xt mt s phuong php cu th.
7.2.1. Phuong php do d nhot:
Thuong dng co cht cua enzim c d nhot lon hon (hoc nho hon) san phm phn
huy cua n. Su bin di d nhot ny l thuoc do hoat d enzim. Phuong php ny thuong
dng d xc dinh hoat d enzim thuy phn cho amylaza, proteinaza.
7.2.2. Phuong php phn cuc k:
Thuong dng khi co cht cua enzim hoc san phm phn giai cua n c kha nng lm
quay mt phng nh sng phn cuc v gc quay ring cua chng c khc nhau. Nguoi ta
thuong dng phuong php ny d xc dinh hoat d cua saccaraza. Co cht cua enzim ny
l duong saccaroza c gc quay ring l +66,5
0
(pha phai). San phm thuy phn cua n
l glucoza (gc quay ring +52,5
0
) v fructoza (gc quay ring l -92,4
0
- pha tri). Khi
enzim tc dung ln saccaroza theo muc d thuy phn m gc quay tng cng giam dn v
chuyn tu phai sang tri. Dy l phan ung nghich dao duong rt kinh din trong nghin
cuu dng hoc phan ung, duong tao ra goi l duong nghich dao (tu phai sang tri mt
phng nh sng phn cuc). Tc nhn xc tc thng thuong (khng phai enzim) l axit v
co (HCl, H
2
SO
4
).
7.2.3. Phuong php p k:
Duoc dng khi phan ung enzim tao thnh hay hp thu kh, chng han cc loai phan
ung oxy ho c su tham gia cua phn tu oxy (oxy ho hiu kh), decacboxy ho, deamin
ho (loai CO
2
, NH
3
). Ngoi ra c th dng phuong php ny d xc dinh hoat d cua
enzim trong qu trnh phan ung khng truc tip lm bin di th tch nhung kho thng
qua cc phan ung trung gian tip theo (th hin gin tip hoat dng cua enzim v do d
th hin hoat d cua n) lai tao thnh hoc hp thu kh.
V du: - Cc phan ung tao axit huu co do enzim oxy ho khu lipaza xc tc c th
dung dich dm bicacbonat (HCO
3
-
) d tao thnh CO
2
(theo phan ung
- Cc phan ung deamin ho duoi tc dung cua enzim peptithydrolaza, sau phan ung
cho tc dung voi axit nitoro d tao thnh N
2
- Cc phan ung ln men c din (ym kh v hiu kh) c th thuc hin trong bnh
Enron, hp thu CO
2
bng dung dich BaSO
4
.
7.2.4. Phuong php ph quang k:
Thuong dng d xc dinh hoat d cc enzim m co cht, coenzim hoc san phm phan
ung c kha nng hp thu nh sng khc nhau o nhung buoc sng xc dinh. Su bin di d
hp thu o buoc sng y trong qu trnh phan unh l do hoat d enzim. Phuong php ny
duoc su dung rng ri d nghin cuu cc enzim thuc nhm oxy ho khu
oxydoreductaza, chng han:
- Cc dehydrogenaza voi coenzim NAD
+
hoc NADP
+
. Tc d phan ung enzim duoc
xc dinh theo muc d khu hoc oxy ho coenzim cua chng. Dang khu NADH, NADPH
v dang oxy ho cua cc coenzim ny khc nhau r rt v kha nng hp thu o buoc sng
H
+
+ HCO
3
-
H
2
O + CO
2
)
(NH
3
+
HNO
HNO
3
+
N )
Trang: 71
340 nm, su bin di ny phan nh muc d chuyn ho giua 2 dang v cung chnh l tc
d v hoat d phan ung enzim.
- Enzim tyrosunaza xc tc su oxy ho cc hop cht phenol thnh cc quinon. Phan ung
ny lm tng d hp thu o buoc sng 280 nm. Dy l phuong php xc dinh hoat d
tyrosinaza (goi l phuong php A hay phuong php tyrosin 280). Tuong tu nhu trn,
EPPO xc tc oxy ho co cht pyrpcatechin.
Phuong php ny chi cn luong nguyn liu nghin cuu rt t, lai c d nhay cao, cho
php xc dinh nhanh chng, chnh xc hoat d enzim. V vy dy l mt trong nhung
phuong php duoc su dung ph bin nht d nghin cuu enzim hoc. Thm ch c truong
hop phan ung enzim khng lm bin di r rt quang ph hp thu th mt tc nhn khc
(enzim hay mt tc nhn khc) tc dung lm san phm pahm ung d thay di su hp thu.
7.2.5. Phuong php chun d lin tuc:
Duoc dng d nghin cuu cc phan ung enzim m kt qua cua n tao thnh axit hoc
bazo. Lc d dng thit bi tu dng thm kim hoc axit vo d giu pH mi truong phan
ung c dinh, dng thoi tu dng ghi duong biu din luong kim hoc axit d tiu tn vo
phan ung trung ho. Luu luong kim hoc axit ny phan nh tc d phan ung enzim.
Phuong php ny c th duoc m ta mo rng ra d nghin cuu cc di tuong khc
nhung trn nguyn tc lin tuc dinh luong (san phm tao thnh hay luong co cht tiu
hao), chng han gin tip do th oxy ho khu voi din cuc tiu chun khi nghin cuu cc
enzim oxy ho.
7.2.6. Phuong php sc k:
Dy l phuong php hin dai, hin nay duoc su dung rt nhiu v trong nhiu truong
hop dng d tinh ch enzim. Tt ca cc phuong php sc k du c th p dung d xc
dinh hoat d enzim. Tu phuong php lu doi nht nhu sc k giy, sc k trao di ion cho
dn cc phuong php hin dai nhu sc k long cao p, sc k kh kt hop voi cc phuong
php phn tch hin dai khc (phn tch axit ami tu dng, cng huong tu hat nhn, cuc
ph). Luong enzim v co cht cung nhu san phm phan nh rt t cung cho kt qua chnh
xc, nhanh chng.
7.2.7. Phuong php ho hoc:
Dng cc phan ung ho hoc khc nhau d dinh luong co cht bi hao hut hoc san
phm phan ung tao thnh duoi tc dung cua enzim. Cc phan ung ny thuc loai ato mu
dc trung, tao mu voi thuc thu dc trung, ....ni chung l mt du hiu d ni ln muc
d hay thoi dim kt thc phan ung. (v du dim tuong duong khi dinh phn axit bazo
duoc xc dinh boi su di mu fenolftalein, qu tm...)
Trong tt ca cc phuong php vua nu, tuy theo diu kin, yu ccu nghin cuu thuc t
m quyt dinh phuong thuc tin hnh (chng han tin hnh trong diu kin thoi gian nhu
nhau, hay nng d enzim, nng d co cht khng di ...) qui hoach thuc nghim d xc
dinh cc thng s ti uu.
7.3. Chun b| d|ch chit enzim d xc d|nh hotd.
Ch phm enzim c th o dang rn, long, bao gm gi th (co cht, cht dn, hat cc)
cc b phn khc nhau cua co th sinh vt sinh enzim (m, t bo, khun ty, bo tu...) v
Trang: 72
mi truong sinh tng hop enzim (chu yu l nuoc) c th chua ca enzim trong d. Trong
qu trnh nui cy, ny mm, enzim c th tin hnh vo mi truong (enzim ngoai bo)
hoc enzim tn tai trong t chuc co th sinh vt (m, t bo), v vy phai cn xu l nhm
ly enzim d xc dinh.
- Voi enzim ngoai bo:
+ Nu qu trnh nui cy hay tch lu enzim bng phuong php b su trong mi
truong long. Sau khi ly mu xong cn lm sach nhanh chng xung 0
0
C ri ly tm tc
d cao 5000 6000 vng/pht d thu duoc dung dich trong sut.
+ Nu qu trnh nui cy hay tch lu enzim bng phuong php b mt trn mi truong
rn (hay hat cc) th ly mu 10 20 gam, chit rt bng dung dich dm tuong ung voi
pH xc dinh trong diu kin lanh (0
0
C) d enzim khkng bi bin tnh hay giam hoat tnh,
luong dung dich ny khoang 200 ml (gp 10 20 ln ch phm). Loc qua phu hay ly
tm vt d thu duoc dung dich trong sut.
- Voi enzim ni bo:
Phai ph v t bo d giai phng enzim tu do bng nhiu phuong php:
+ Phuong php co hoc: ph bin nht l nghin thng thuong (trong ci su, thuy tinh,
my nghin quay tay, my nghin c dng co), nghin voi ct, vun thuy tinh.
+ Phuong php vt l: dng sng siu m d ph v cu trc t bo, m.
+ Phuong php ho sinh: dng enzim thch hop (xenluloza, pectinaza) d phn huy
mng t bo, m d giai phng enzim (truoc ht c th nhn duoc t bo trn rt c gi tri
trong nghin cuu t bo hoc, enzim hoc).
Tip d c th dng cc phuong php chit rt thch hop (dng dung dich dm, dng
(NH
4
)
2
SO
4
, axeton...) v hoc d nhn duoc dung dich trong sut
Trong truong hop sau khi xc dinh xong hoat d cua dich chit cn tnh ton hoat d
cua ch phm ban du (qui v hm luong cht kh tuyt di)
Trang: 73
TI LIEU THAM KHAO
1- Nguyn Trong Cn (chu bin), Nguyn Thi Hin, D Thi Giang, Trn Thi
Huyn, Cng ngh emzim, NXB Nng Nghip TPHCM, 1998.
2- Nguyn Ln Dung, Pham Thi Trn Chu, Nguyn Thanh Hin, L Dnh Luong,
Don Xun Muon, Pham Vn Ty - Mt s phuong php nghin cuu vi sinh vt
hoc, tp III NXBKH v k thut, H Ni 1987.
3- L ngoc t (chu bin) v cc tc gia - ho sinh cng nghip NXBDH v THCN
1977.
4- L ngoc t (chu bin) v cc tc gia - enzym vi sinh vt, tp I, II - NXBKH v k
thut, H Ni 1982.
Trang: 74
Mc lc
Chuong 1: NGUYN LIEU THU ENZIM V PHN BO....................................................................3
1.1. Ngun dng vt: ........................................................................................................................................3
1.2. Ngun gc thuc vt:..................................................................................................................................4
1.3. Ngun vi sinh vt:......................................................................................................................................4
Chuong 2: SAN XUAT CC CHE PHAM ENZIM TU VI SINH VAT............................................5
2.1. Diu ho qu trnh sinh tng hop enzim trong mi truong nui cy vi sinh vt..............................5
2.2. Tuyn chon v cai tao ging vi sinh vt cho enzim c hoat luc cao:...............................................11
2.3. Phuong php bao quan ging vi sinh vt :..........................................................................................12
2.4. Mi truong nui cy vi sinh vt sinh tng hop enzim: ......................................................................13
2.5. Cc phuong php nui cy vi sinh vt:................................................................................................17
2.6. Tch v lm sach ch phm enzym :....................................................................................................22
Chuong 3: KY THUAT SAN XUAT CHE PHAM TU HAT COC NAY MAM (MALT).........24
3.1. Nguyn liu dai mach:............................................................................................................................24
3.2. Lm sach v phn loai hat:.....................................................................................................................25
3.3. Rua, st trng v ngm hat:....................................................................................................................26
3.4. Ny mm:.................................................................................................................................................28
3.5. Sy malt:....................................................................................................................................................34
3.6. Tch mm, r, bao quan malt:...............................................................................................................37
3.7. K thut san xut mt s loai malt dc bit:.........................................................................................38
Chuong 4: SAN XUAT ENZIM TU THUC VAT..................................................................................40
4.1. San xut ureaza tu du rua:.....................................................................................................................40
4.2. Thu nhn bromelain tu dua:..................................................................................................................40
Chuong 5: ENZIM CO DINH.......................................................................................................................44
5.1. Gioi thiu chung:......................................................................................................................................44
5.2. Mt s phuong php chu yu ch tao enzim c dinh :......................................................................44
5.3. Mt s lin kt trong vic c dinh enzim. ............................................................................................45
5.4. Anh huong cua su c dinh dn hoattnh cua enzim...........................................................................46
5.5. Cc reactor chua enzim c dinh:...........................................................................................................48
5.6. . Su dung enzim c dinh trong y hoc v trong cng nghip:.............................................................50
Chuong 6: GII THIEU MOT SO LOAI ENZIM CHU YEU V KHA NNG UNG
DUNG 55
6.1. Amylaza....................................................................................................................................................55
6.2. Proteaza.....................................................................................................................................................58
6.3. Pectinaza....................................................................................................................................................60
6.4. Xenluloza:.................................................................................................................................................64
6.5. Saccaraza v glucooxydaza. ..................................................................................................................66
Chuong 7: PHUONG PHP XC DINH HOAT DO MOT S LOAI ENZIM............................68
7.1. Don vi do hoat d:...................................................................................................................................68
Trang: 75
7.2. Cc phuong php xc dinh hoat d enzim:.........................................................................................69
7.3. Chun bi dich chit enzim d xc dinh hoatd....................................................................................71

Cong Nghe Enzyme

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Cong Nghe Enzyme

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

CNG NGHE ENZIM GVC: Ths.

Trn Xun Ngach

You might also like