P. 1
PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VẬT TRONG CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN ĐÔNG LẠNH

PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VẬT TRONG CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN ĐÔNG LẠNH

|Views: 1,794|Likes:
Được xuất bản bởimeocon290

More info:

Categories:Types, Maps
Published by: meocon290 on Jun 01, 2012
Bản quyền:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOCX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

05/27/2014

pdf

text

original

Sections

PHƢƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VẬT TRONG CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN ĐÔNG LẠNH Kiểm

tra vi sinh vật là một trong những công tác cần thiết phải tiến hành khi đánh giá chất lƣợng các sản phẩm thủy sản đông lạnh, các chỉ tiêu về vi sinh vật của các sản phẩm thủy sản đông lạnh đƣợc đề ra 1 cách nghiêm ngặt, buộc các nhà sản xuất và kiểm tra chất lƣợng sản phải nghiêm chỉnh thực hiện, đặc biệt là các sản phẩm thủy sản đông lạnh xuất khẩu. Bởi vì vi sinh vật cá khả năng gây độc và gây bệnh truyền nhiễm rất nguy hiểm. Các chỉ tiêu vi sinh vật cần kiểm tra đối với sản phẩm thủy sản đông lạnh bao gồm: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Tổng số vi sinh vật hiếu khí Tổng số coliform Số Escherichia coli Số staphylococcus aureus Số Salmonella Số Shigella

PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH (không chỉ kiểm tra vi sinh mà còn kiểm tra hóa học, kiểm tra cảm quan) 4.1. Phương pháp lấy, vận chuyển và bảo quản mẫu kiểm vi sinh 4.1.1. Lấy, vận chuyển và xử lý mẫu 4.1.1.1. Kế hoạch lấy mẫu 4.1.1.1.1. Lấy mẫu kiểm tra lô hàng Lƣợng mẫu kiễm tra lô hàng tùy thuộc vào từng sản phẩm cụ thể, nhƣng không đƣợc ít hơn yêu cầu kiểm nghiệm. Ứng với từng loại thực phẩm kèm theo một lƣợng xác định sẽ đƣợc giới hạn một số lƣợng vi sinh vật nhất định cho phép tồn tại trong mặt hàng đó. Thông thƣờng thì đối với vi sinh vật gây bệnh, yêu cầu đặt ra là “không có” hoặc “không phát hiện” trong một khối lƣợng thực phẩm xác định. Để nhận biết các mẫu thực phẩm không đạt yêu cầu, ngƣời ta thƣờng thực hiện lấy mẫu và ghi nhận kết quả theo các cấp độ đã đƣợc thiết lập nhƣ sau:  Cấp 1: cách lấy mẫu cổ điển, trong đó việc đánh giá kết quả kiểm nghiệm chỉ dựa trên một giá trị duy nhất của mẫu.  Cấp 2: kế hoạch lấy mẫu loại 2 đƣợc dùng cho các thử nghiệm tính vi sinh vật gây bệnh. Kết quả đƣợc coi là không đạt khi một trong số tổng số mẫu đã lấy bị phát hiện có vi sinh vật gây bệnh.  Cấp 3:  Kết quả đạt yêu cầu khi:

Mật độ vi sinh nhỏ hơn thông số giới hạn dƣới (có thêm điều kiện). Mật độ vi sinh lớn hơn thông số giới hạn dƣới và nhỏ hơn thông số giới hạn trên.  Kết quả không chấp nhận khi mật độ vi sinh cao hơn giới hạn trên. Thông thƣờng giới hạn trên cao hơn ít nhất 10 lần so với giới hạn dƣới. 4.1.1.1.2. Lấy mẫu kiểm tra vệ sinh công nghiệp Lƣợng mẫu phải đủ để phân tích, thông thƣờng trọng lƣợng mẫu tối thiểu đƣợc qui định nhƣ sau:  Dạng rắn (phần thịt): 200 g.  Dạng lỏng (nƣớc dùng trong chế biến): 500 ml. 4.1.1.2. Phương tiện lấy mẫu và dụng cụ chứa mẫu 4.1.1.2.1. Phương tiện lấy mẫu Để lấy mẫu hoặc khui mở bao bì, cấn thiết phải sử dụng:  Phƣơng tiện phù hợp.  Dụng cụ đƣợc chế từ vật liệu dễ làm sạch, dễ khử trùng, không tác động lên mẫu hoặc bị mẫu tác động.  Với các loại thực phẩm không bao gói, phải dùng dụng cụ vô trùng để lấy mẫu.

Trong thời gian lấy mẫu, nếu cần thiết dùng đến nhiệt kế, thì phải sử dụng các nhiệt kế chuẩn với biên độ 30 - 100oC có mức chính xác  1oC. 4.1.1.2.2. Dụng cụ chứa mẫu Dụng cụ chứa mẫu phải bảo vệ đƣợc mẫu tránh bị nhiễm và tránh các thay đổi do các yếu tố lý học, hoá học, sinh học,… gây ra. Dùng các bình chứa bằng thủy tinh, túi nhựa, hộp nhựa hoặc kim loại chuyên dụng. Trƣờng hợp cần thiết, thì các dụng cụ này phải gắn thêm nhiệt kế để đo nhiệt độ bên trong khi đến phòng thí nghiệm. Với các mẫu thực phẩm mau hƣ hỏng thì phải dùng những thùng cách li. Dụng cụ chứa mẫu phải khô, sạch, vô trùng và có kích thƣớc đủ lớn để chứa đƣợc lƣợng mẫu đến 200 g. Khi cần thiết dùng băng keo để dán thùng chứa mẫu thì nên dùng băng dính đủ chắc để không làm thay đổi mẫu bên trong. 4.1.1.3. Lấy mẫu 4.1.1.3.1. Lấy mẫu kiểm tra lô hàng Việc lấy mẫu phải do những ngƣời thạo công tác lấy mẫu thực hiện. Nhân viên phân tích tại phòng thí nghiệm cũng phải có những kiến thức cần thiết về kỹ thuật lấy mẫu để có những khuyến cáo phù hợp trong trƣờng hợp việc lấy mẫu đƣợc thực hiện bởi những ngƣời không chuyên.

Khi lấy mẫu cần phải đảm bảo những mẫu lấy mang tính đại diện cho lô hàng hoặc cho hoạt động cần kiểm tra và lƣợng mẫu lấy đủ để tiến hành việc phân tích. Thƣờng mẫu đƣợc lấy một cách ngẫu nhiên và bất kỳ. Mẫu kiểm từ thực phẩm không bao gói hoặc mẫu của một lô hàng lớn cần đƣợc cân lấy ít nhất 200 g hoặc không lấy ít hơn 2 đơn vị sản phẩm. Với sản phẩm bao gói, phải lấy những mẫu bao bì chƣa mở. 4.1.1.3.2. Lấy mẫu nước Trƣớc khi lấy mẫu nƣớc cần phải xác định vị trí lấy mẫu. Thực hiện:  Dùng đèn cồn đốt nhẹ xung quanh miệng vòi nƣớc để khử trùng.  Mở van cho nƣớc chảy khoảng 2 phút, điều chỉnh van sao cho nƣớc chảy đầy miệng vòi, không bắn tung tóe.  Dùng bình xịt cồn khử trùng tay.  Dùng đèn cồn đốt nhẹ xung quanh miệng bình thủy tinh chứa mẫu (bình phải đƣợc khử trùng trƣớc khi lấy mẫu).  Mở nắp bình, nhanh chóng hứng nƣớc từ vòi, lƣợng nƣớc vào khoảng 2/3 thể tích bình chứa, không để nƣớc chảy tràn ra miệng hoặc bắn ra ngoài, vặn kín nắp bình.

 Dùng cồn khử trùng bình đã chứa mẫu rồi cho bình vào túi PE vô trùng. Ghi thẻ để nhận diện mẫu và vòi nƣớc, cho thẻ vào túi chung với bình chứa mẫu. Buộc kín miệng túi bằng dây thun hoặc bấm bằng kim bấm.  Cho mẫu vào thùng cách nhiệt có chứa đá xay nhỏ phủ quanh túi mẫu. 4.1.1.3.3. Lấy mẫu bán thành phẩm trên dây chuyền Xác định vị trí và thời điểm lấy mẫu trƣớc khi tiến hành:

STT

Công đoạn

Thời điểm lấy mẫu Nguyên liệu sau khi tiếp nhận từ đại lý, chƣa qua rửa sơ bộ. Sau khi rửa xong, đang để ráo nƣớc. Lấy mẫu ngay trong khi đang sản xuất. Trong các khuôn đã xếp sản phẩm. Trƣớc và / hoặc sau khi gia nhiệt, sau khi làm nguội.

1

Tiếp nhận nguyên liệu Các công đoạn rửa Các công đoạn chế biến Công đoạn xếp khuôn Các công đoạn có gia nhiệt

2 3 4

5

6

Công đoạn chờ đông

Trƣớc, trong và / hoặc sau khi chờ đông.

Thực hiện:  Dùng cồn khử trùng tay nhân viên lấy mẫu.  Dùng kẹp vô trùng, lấy một khối lƣợng mẫu nhất định cho túi PE, không để mẫu chạm vào miệng túi. Dùng kim bấm bấm kín miệng túi.  Ghi tên mẫu và công đoạn lấy mẫu vào thẻ nhận diện mẫu. Dùng kim bấm bấm thẻ này vào miệng túi chứa mẫu.  Sau đó, cả mẫu và thẻ đƣợc cho chung vào một túi PE khác, cột kín miệng túi bằng dây thun hoặc bấm kín bằng kim bấm.  Cho túi mẫu vào thùng cách nhiệt, cho đá xay nhỏ phủ quanh túi mẫu. 4.1.1.3.4. Lấy mẫu vệ sinh không khí Xác định vị trí và thời điểm lấy mẫu trƣớc khi tiến hành: Vị trí: cần chú ý những khu vực có mức độ ô nhiễm cao. Thời điểm lấy mẫu: trƣớc và / hoặc trong khi đang sản xuất. Thực hiện:

 Dùng cồn khử trùng tay và bề mặt vị trí cần lấy mẫu.  Đặt đĩa Petri có chứa môi trƣờng thạch thích hợp (đã khử trùng) vào vị trí cần lấy mẫu. Để hở hoàn toàn đáy đĩa và gác gờ nắp lên gờ đáy đĩa Petri.  Sau khoảng thời gian quy định (15 - 30 phút), đậy nắp lại, cho đĩa vào túi PE vô trùng. Dùng kim bấm bấm kín miệng túi.  Ghi nhận thời gian và địa điểm lấy mẫu vào thẻ nhận diện mẫu. Dùng kim bấm bấm thẻ này vào miệng túi chứa mẫu.  Sau đó, cả mẫu và thẻ đƣợc cho chung vào một túi PE khác, cột kín miệng túi bằng dây thun hoặc bấm kín bằng kim bấm.  Cho túi mẫu vào thùng cách nhiệt, cho đá xay nhỏ phủ quanh túi mẫu. Ngoài những loại mẫu đƣợc lấy nhƣ trên, tùy thuộc vào quy định của mỗi xí nghiệp, còn có thể tiến hành lấy những loại mẫu nhƣ: tay / găng tay công nhân; bề mặt dụng cụ, thiết bị tiếp xúc trực tiếp với sản phẩm;… 4.1.1.4. Ghi nhãn và hồ sơ mẫu 4.1.1.4.1. Ghi nhãn trên mẫu Mẫu cần đƣợc ghi nhãn ngay trƣớc hoặc sau khi lấy mẫu. Nhãn phải ghi cho phù hợp với hồ sơ lấy mẫu. Nhãn ghi phải chịu đƣợc ánh sáng, không thấm nƣớc.

Nhãn đã ghi không đƣợc thay đổi và tẩy xoá trong thời gian bốc xếp, bảo quản và vận chuyển. Nhãn phải có kích thƣớc đủ lớn để ghi nhận mọi thông tin cần thiết. 4.1.1.4.2. Ghi nhãn trên vật dụng chuyển mẫu Trên vật dụng chuyển mẫu, nhãn cần đƣợc ghi:  Tên, địa chỉ, số điện thoại của ngƣời nhận. Nếu cần gửi lại, tên ngƣời gửi cũng phải đƣợc ghi trên nhãn.  Các chú ý cần thiết khác nhƣ: dể vỡ, thực phẩm cần trữ lạnh, mẫu kiểm nghiệm, mặt tên,… 4.1.1.4.3. Hồ sơ mẫu Mỗi mẫu phải đƣợc đính kèm theo một hồ sơ mẫu, xác định rõ mẫu phù hợp với nhãn ghi trên mẫu hoặc thùng chứa mẫu. Hồ sơ mẫu đƣợc coi là hợp lệ khi có chữ ký của ngƣời lấy mẫu và ngƣời chủ lô hàng thực phẩm có mẫu đƣợc lấy. Hồ sơ mẫu cần có những thông tin sau:  Ngƣời yêu cầu phòng thí nghiệm thực hiện lấy mẫu để phân tích: tên, địa chỉ, số điện thoại,..  Tên, địa chỉ, số điện thoại của ngƣời lấy mẫu.  Địa điểm và thời gian lấy mẫu.

 Thông tin về thực phẩm đƣợc lấy mẫu: tính chất thực phẩm, ngày sản xuất, thời hạn sử dụng, điều kiện bảo quản, dạng bao bì,…  Nguyên nhân lấy mẫu: kiểm tra, bị khiếu nại,…  Phƣơng pháp lấy mẫu: lấy ngẫu nhiên trong lô hàng, lấy ngẫu nhiên từ số mẫu có sẵn,…  Các chỉ tiêu cần phân tích: E.coli, Salmonella, Shigella,… Ngoài ra còn có thêm nhiều thông tin khác. 4.1.1.5. Vận chuyển và bảo quản mẫu Mẫu sau khi lấy, cần chuyển về phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt. Khi vận chuyển, bảo quản cần đảm bảo sao cho không có biến đổi đáng kể nào xảy ra trƣớc khi phân tích. Mẫu cần đƣợc bảo quản tốt để chống lại sự nhiễm khuẩn và những thay đổi trong thành phần vi sinh vật. Đồng thời việc vận chuyển mẫu cần thu xếp sao cho mẫu về đến phòng thí nghiệm trong vòng 18 giờ và nhƣ vậy việc phân tích có thể bắt đầu trong vòng 24 giờ kể từ khi lấy mẫu. Đối với những mẫu thực phẩm mau hƣ hỏng thì cần đƣợc vận chuyển nhanh, bảo quản trong những thùng cách li đóng kín có kèm theo phƣơng tiện làm lạnh hoặc thùng nhựa chứa đá (hoặc băng khô CO2 rắn) để duy trì nhiệt độ của mẫu (nhiệt độ mẫu càng thấp càng tốt). Tránh để mẫu tiếp xúc trực tiếp với đá hay băng để không bị đông đá.

Đối với các mẫu hàng đông lạnh, cần đƣợc đƣa vào các bình chứa đã làm lạnh từ trƣớc và giữ trong trong ngăn đá ngay sau khi lấy mẫu. Chúng đƣợc chuyển đi trong các thùng cách li. Nếu thời gian vận chuyển quá lâu làm xảy ra hiện tƣợng rã đông, cần dùng băng khô làm chất hạ nhiệt. Khi vận chuyển mẫu dạng khô hoặc đồ hộp thì không cần thiết làm lạnh, có thể vận chuyển trong các túi nylon, song trong thời gian vận chuyển và bảo quản mẫu không đƣợc để nhiệt độ vƣợt quá 45oC và không giữ mẫu trong môi trƣờng có độ ẩm quá cao. 4.1.2. Tiếp nhận mẫu tại phòng thí nghiệm Ngƣời gửi mẫu tới phòng thí nghiệm phải thông báo trƣớc cho phòng thí nghiệm thời điểm mẫu đến. Đống thời phòng thí nghiệm cũng cần đƣợc thông báo về loại mẫu sẽ kiểm và các phép phân tích cần thực hiện. Khi đến phòng thí nghiệm, mẫu phải đƣợc kiểm tra:  Nhãn ghi trên mẫu có phù hợp với số của hồ sơ mẫu trong sổ theo dõi không.  Nhiệt độ và thời gian khi mẫu đến, riêng với nhiệt độ thì:  Đo nhiệt độ ngay trên mẫu chính: nhúngnhiệt kế vào dung dịch hypochlorine chứa không dƣới 100 mg / l chlorine hoạt tính (mục đích để khử trùng) hoặc dung dịch khử trùng chứa halogen có tính sát khuẩn tƣơng đƣơng. Sau đó tráng lại nhiệt kế bằng nƣớc vô trùng, lau khô bằng khăn vô trùng trƣớc khi sử dụng.  Đo nhiệt độ trên một mẫu phụ (mẫu phụ đƣợc xử lý nhƣ mẫu chính).  Bình chứa mẫu có rò rỉ không, có đƣợc đóng kỹ không, có bị nứt, thủng gây nhiễm vào mẫu không.

 Với mẫu đóng gói dạng chân không, cần kiểm tra kỹ tình trạng chân không trong mẫu: có khí tạo ra trong các bao bì kín không, bao bì có hở, thủng hoặc nứt không, điều kiện lý tính bên trong có bình thƣờng không,…  Nếu bao bì bị hƣ hỏng cần ghi nhận vào báo cáo phân tích. Trong trƣờng hợp nhận thấy bằng cảm quan mẫu đã bị hỏng hoặc bị nhiễm trong thời gian vận chuyển có thể xem xét và từ chối nhận mẫu, trừ khi muốn thẩm tra lại kết quả phân tích về mặt vi sinh.  Kiểm tra những mẫu nghi ngờ gây dịch bệnh. Khi chấp nhận mẫu, thì mẫu đƣợc bảo quản tránh khỏi các tác nhân hoá, lý, cơ học có thể làm biến đổi mẫu. Phòng thí nghiệm cần có đầy đủ phƣơng tiện trữ lạnh đủ lớn để chứa mẫu và mẫu lƣu. 4.1.3. Xử lí mẫu sơ bộ tại phòng thí nghiệm Do mẫu đƣợc lấy về một lƣợng khá lớn so với lƣợng đem đi phân tích, đồng thời còn kèm theo nhãn, bao bì,…hoặc trƣờng hợp cần phải rã đông mẫu,…nên mẫu cần đƣợc xử lí sơ bộ trƣớc khi tiến hành phân tích. 4.1.3.1. Xác định hệ vi sinh vật bên trong các loại thực phẩm rắn Khử trùng bề mặt sản phẩm bằng bản kim loại đốt nóng hoặc ngọn lửa. Dùng dụng cụ vô trùng gỡ bỏ các nhãn hiệu trên bề mặt. Lấy một lƣợng mẫu bên trong, ít nhất khoảng 10 g.

Chuyển mẫu vào bao, rót dịch pha mẫu và cân, tỷ lệ mẫu : dịch pha mẫu là 1 : 9. Đồng nhất mẫu trong túi dập mẫu trong 30 giây với mẫu dễ dập và 1 phút với mẫu khó dập. Pha loãng mẫu ở nồng độ thích hợp để tiến hành phân tích ngay. 4.1.3.2. Xác định hệ vi sinh vật bề mặt các loại thực phẩm rắn Đánh dấu một khu vực bề mặt mẫu bằng khuôn và dao mổ, lấy một lớp mỏng bề mặt dày 1 - 2 mm với diện tích tối thiểu là 10 cm2. Cho vào bao, pha loãng theo tỉ lệ 1 : 9, 10 g + 90 ml dung dịch pha loãng. Đồng nhất mẫu trong túi dập mẫu trong 30 giây với mẫu dễ dập và 1 phút với mẫu khó dập. 1 ml dịch pha loãng tƣơng đƣơng với số vi sinh vật trên 1 / 100 bề mặt đã chọn (1 ml ứng với 0,1 cm2 khi bề mặt lấy mẫu là 10 cm2) và có thể dùng để cấy vào trong hoặc lên trên các cơ chất tƣơng ứng. 4.1.3.3. Xác định hệ vi sinh vật trong các loại thực phẩm lỏng Trộn mẫu bằng cách đảo ngƣợc chai 10 lần (hoặc theo hƣớng dẫn cụ thể tuỳ từng phƣơng pháp). Dùng pipetman cấy chuyển vào môi trƣờng thích hợp. Có thể pha loãng mẫu nếu cần. Sau khi lấy mẫu và xử lý sơ bộ, mẫu cần đƣợc phân tích càng sớm càng tốt, thời gian phân tích tối đa trong vòng 24 giờ kể từ khi lấy mẫu.

4.2. Quá trình phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật Sau đây là một số vi sinh vật thƣờng đƣợc kiểm tra trong hàng thủy sản: 4. .1. ng s i hu n hiếu h

4.2.1.1. Định nghĩa và nguyên tắc Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trƣởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxi phân tử. Qui trình phân tích bao gồm các bƣớc: cân mẫu, đồng nhất mẫu, pha loãng mẫu, chuyển và phân phối đều một thể tích xác định mẫu lên bề mặt môi trƣờng rắn trong đĩa Petri, ủ ở điều kiện nhiệt độ và thời gian quy định. 4.2.1.2. i trư ng và h a chất

Môi trƣờng Plate Count gar (PC ) có pH ,0  0,2. Ngoài ra có thể sử dụng các môi trƣờng khác: Tryptose Glucose gar, Nutrient gar. Dung dịch nƣớc muối pepton SPW (Saline Pepton Water). 4.2.1.3. ui tr nh ph n t ch 4.2.1.3.1. hẩn ị mẫu trước hi ph n t ch Trƣớc khi tiến hành phân tích, thực hiện việc đồng nhất mẫu nhƣ sau:

 Đối với mẫu rắn:  Cân chính xác 10 g mẫu vào trong bao PE, thêm vào lƣợng mẫu này 0 ml dung dịch SPW pha loãng.  Thực hiện đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Thời gian dập mẫu không quá 2,5 phút.  Thực hiện đồng nhất mẫu trong trƣờng hợp không có máy dập mẫu: Xay nhuyễn mẫu trong điều kiện vô trùng. Cân chính xác 10g mẫu, cho vào bình tam giác. ổ sung vào trong bình 0 ml nƣớc SPW đã đƣợc hấp khử trùng. Lắc đều trong 2 phút.  Đối với mẫu dạng lỏng: hút 10ml mẫu cho vào bình tam giác chứa 0 ml nƣớc SPW đã đƣợc hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi đƣợc làm đồng nhất bằng một trong các phƣơng pháp trên, dung dịch mẫu thu đƣợc có độ pha loãng là 10-1 so với ban đầu. Nếu cần, thì tiến hành pha loãng dịch mẫu đến độ pha loãng cần thiết. 4.3.1.3.2. ấy mẫu Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa 25 - 250 tế bào vi sinh vật trong 1 ml để cấy lên đĩa Petri. Dùng pipet vô trùng hoặc pipetman với đầu tip vô trùng chuyển 1 ml dung dịch pha loãng đã chọn vào giữa đĩa. Ứng với mỗi độ pha loãng cấy ít nhất 2 - 3 đĩa.

Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10 - 15 ml môi trƣờng PC môi trƣờng bằng cách xoay

đã đƣợc đun chảy và ổn định ở 45oC. Trộn đều dịch mẫu với

tròn đĩa Petri ngay sau khi đổ môi trƣờng. Đặt các đĩa trên mặt ph ng ngang cho thạch đông đặc. Lật ngƣợc và ủ các đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 30  1oC trong 2 giờ. 4.3.1.3.3. ách t nh ết quả Chọn các đĩa có số đếm từ 25 - 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Mật độ tổng vi sinh vật hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫu đƣợc tính nhƣ sau: A (CFU / g hay CFU / ml) = N / ( n1Vf1 + …+ niVfi) Trong đó: : số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu. N: tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên đĩa đã chọn. ni: số lƣợng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i. V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. fi: độ pha loãng tƣơng ứng. Các kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí thƣờng đƣợc biểu diễn dƣới dạng số mũ của cơ số thập phân.

4. . . h

li

s

gi ng Escherichia coli

4.2.2.1 Định nghĩa oliforms, oliforms chịu nhiệt, oliforms ph n và E. coli Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid khi đƣợc ủ ở 37oC trong môi trƣờng canh Lauryl Sulphate và canh Brilliant Green Lactose Bile Salt. Nhóm Coliforms gồm 4 giống: Escherichia với 1 loài duy nhất là E. coli, Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter. Tính chất sinh hoá đặc trƣng của nhóm này đựơc thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges Proskauer (VP) và Citrate (iC) thƣờng đƣợc gọi chung là IMViC. Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi đƣợc ủ ở 44oC trong môi trƣờng canh E. coli medium (EC). Coliforms phân (E.coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indol khi đƣợc ủ 24 giờ ở 44,5oC trong canh Trypton. E. coli là Coliforms phân, cho kết quả thử nghiệm IMViC là (+ + - -). 4.2.2.2. Định lư ng oliforms, oliforms chịu nhiệt, oliforms ph n và E. coli ng phương pháp P

4.2.2.2.1. guyên tắc Phƣơng pháp MPN đƣợc dùng trong những thực phẩm có chứa lƣợng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E. coli với mật độ thấp. Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc:  Mẫu đƣợc pha loãng thành một dãy thập phân.  3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng liên tiếp đƣợc ủ trong ống nghiệm chứa môi trƣờng thích hợp có ống bẫy khí Durham.  Lặp lại 3 đến 5 ống với mỗi nồng độ pha loãng.  Theo d i và ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dƣơng tính (sinh hơi và đổi màu) ở mỗi nồng độ pha loãng.  Dựa vào bảng MPN, suy ra số lƣợng nhóm vi sinh vật tƣơng ứng hiện diện trong 1 g ( hoặc 1 ml) mẫu ban đầu. 4.2.2.2.2. i trư ng và h a chất

Môi trƣờng lỏng Lauryl Sulphate roth LSB ( canh Lauryl Sulphate). Môi trƣờng lỏng rilliant Green Lactose ile Salt (canh G L). Môi trƣờng lỏng E. coli ( E.coli medium, canh EC).

Các môi trƣờng lỏng trên đƣợc chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa ống Durham úp ngƣợc. Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham. Canh Tryptone và canh MR-VP. Môi trƣờng rắn Simmon Citrate gar ( thạch Simmon Citrate). Dung dịch nƣớc muối pepton SPW ( Saline Pepton Water). Thuốc thử Kovac’s, Methyl Red,  - napthol. 4.2.2.2.3. ui tr nh ph n t ch Chuẩn bị dịch đồng nhất hoá hoặc pha loãng mẫu ở độ loãng cần thiết. a. Định lư ng Coliforms Cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10 ml canh LS . Thực hiện tƣơng tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2 và 10-3. Ủ ở 3 oC. Ghi nhận số ống có kết quả (+) (có sinh hơi). Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LS (+) sang các ống chứa canh G L. Ủ ở 3  1oC trong 4 giờ. Ghi nhận số ống có kết quả (+) ứng với mỗi độ pha loãng.

. Định lư ng oliforms chịu nhiệt Dùng que cấy vòng cấy chuyển một vòng dịch mẫu từ các ống canh LS (+) sang môi trƣờng canh EC, ủ ở 44,5  0,2oC trong 24  3 giờ. Đếm số lƣợng các ống cho kết quả (+) ở mỗi độ pha loãng. c. Định lư ng Coliforms phân Cấy ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trƣờng canh EC sang môi trƣờng thạch đĩa EM . Ủ các đĩa này ở 3 oC trong 24 giờ. Chọn khuẩn lạc Coliforms phân hay E.coli giả định (đặc điểm: tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím) có đƣờng kính lớn hơn 1 mm, cấy chuyền vào canh Trypton, ủ ở 44,5  0,2oC trong 24 giờ. Nhỏ thuốc thử Kovac’s vào các ống nghiệm đã ủ. Phản ứng dƣơng tính khi có màu đỏ xuất hiện trong môi trƣờng trong vòng vài phút. Ghi nhận số lƣợng các ống cho kết quả (+) trên môi trƣờng Trypton ứng với mỗi độ pha loãng. d. Định lư ng E. coli Cấy ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trƣờng canh EC sang môi trƣờng thạch EMB. Ủ các đĩa này ở 3 oC trong 24 giờ.

Chọn khuẩn lạc E. coli giả định (đặc điểm: tròn, dẹt hình đĩa,có ánh kim tím) có đƣờng kính lớn hơn 1 mm và cấy vào các môi trƣờng MRVP, Simmon Citrate gar để thực hiện các thử nghiệm IMViC. Ống cho kết quả (+) trong canh EC và khuẩn lạc E. coli giả định trên môi trƣờng EM IMViC là + + - - là ống có E. coli (+). Ghi nhận ống nghiệm có E. coli (+) cùng với độ pha loãng. 4.2.2.2.4. ách đ c ết quả cho kết quả thử nghiệm

Tra bảng MPN để tính mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dƣới dạng trị số MPN / g hay MPN / ml mẫu ban đầu chƣa pha loãng. 4.2.2.3. Định lư ng oliforms, oliforms ph n 4.2.2.3.1. guyên tắc Cấy một lƣợng nhất định mẫu đã đƣợc đồng nhất hóa lên môi trƣờng thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose, muối mật,.... Ủ ở 3  1oC trong 24 - 4 giờ. Đếm số khuẩn lạc Coliforms lên men lactose và sinh acid thông qua đặc điểm: khuẩn lạc có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đƣờng kính 0,5 mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật. ng phương pháp đếm huẩn lạc

Việc kh ng định Coliforms đƣợc thực hiện bằng cách nuôi cấy khuẩn lạc trên trên môi trƣờng canh chọn lọc BGBL. Để định lƣợng Coliforms phân, thực hiện tƣơng tự nhƣng thay đổi nhiệt độ ủ là 44oC. 4.2.2.3.2. i trư ng và h a chất

Môi trƣờng Tryptone Soya gar (TS ). Môi trƣờng Violet Red ile gar (VR ). Môi trƣờng canh rilliant Green ile Lactose roth ( G L). Môi trƣờng canh EC roth và môi trƣờng canh Trypton roth. Thuốc khử Kovac’s hay Indol. 4.2.2.3.3. uy tr nh ph n t ch Đồng nhất hóa và pha loãng mẫu sao cho tổng tế bào Coliforms ít hơn 100 trong 1ml dung dịch pha loãng. Chuyển 1 ml dịch mẫu pha loãng vào đĩa Petri. ổ sung vào mỗi đĩa đã cấy mẫu khoảng 5 ml môi trƣờng TS chảy và ổn định ở 45oC). Lắc tròn đĩa petri để trộn đều dịch mẫu với môi trƣờng. Để ở nhiệt độ phòng 1 - 2 giờ để hồi phục các tế bào bị tổn thƣơng. Thêm vào mỗi đĩa 10 - 15 ml môi trƣờng thạch VR (45oC) lên trên môi trƣờng TS . Chờ môi trƣờng trong đĩa đông đặc, lật ngƣợc đĩa và ủ ở 3  1oC trong 24 - 4 giờ. Làm tƣơng tự với 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, lặp lại ít nhất 2 đĩa ứng với mỗi nồng độ pha loãng. Thử nghiệm kh ng định Coliforms: (đã đun

 Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc bị nghi ngờ là Coliforms.  Trƣờng hợp kh ng định Coliforms tổng số:  Dùng que cấy vòng cấy sang các ống chứa môi trƣờng G L.  Ủ các ống nghiệm ở 3  1oC trong 24 - 4 giờ.  Kết quả kh ng định (+) khi Coliforms tăng trƣởng làm đục môi trƣờng và sinh hơi trong ống Durham.  Trƣờng hợp kh ng định Coliforms phân:  Dùng que cấy vòng cấy sang các ống chứa môi trƣờng EC.  Ủ các ống nghiệm ở 44oC trong 24 - 4 giờ.  Các khuẩn lạc cho kết quả (+) trên EC đƣợc thực hiện thử nghiệm Indol ở 44 oC. Thử nghiêm kh ng định Coliforms phân chỉ đƣợc xem là (+) khi vừa (+) trên môi trƣờng EC vừa (+) trên thử nghiệm Indol.  Tính tỉ lệ kh ng định là tỉ số giữa số khuẩn lạc cho kết quả (+) với khuẩn lạc đƣợc dùng trong thử nghiệm kh ng định. 4.2.2.3.4. ách t nh ết quả Dựa vào số khuẩn lạc đếm đƣợc và tỉ lệ kh ng định, tính mật độ Coliforms, Coliforms phân theo công thức sau: A (CFU / g hay CFU / ml) = (NR) / (n1vf1 +…+ nivfi) Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc.

ni: số đĩa có số khuẩn lạc đƣợc chọn tại mỗi độ pha loãng. v: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa. fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc đƣợc chọn tại các đĩa đếm. R: tỉ lệ kh ng định. 4.2.2.4. Định lư ng E. coli 4.2.2.4.1. guyên tắc Mẫu đã đƣợc đồng nhất hóa đƣợc cấy một lƣợng nhất định lên môi trƣờng thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose, ủ ở 44oC trong 24 giờ. Đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc trƣng của Coliforms. Kh ng định các khuẩn lạc đã đếm là E. coli bằng thử nghiệm IMViC. 4.2.2.4.2. i trư ng và h a chất ng phương pháp đếm huẩn lạc

Môi trƣờng canh Tryptone Soya gar (TS ) và môi trƣờng thạch Violet Red ile gar (VR ). Môi trƣờng canh Lactose Tryptone Lauryl Sulphate roth (LST roth). Môi trƣờng canh Tryptone roth và môi trƣờng canh MR - VP Broth. Môi trƣờng thạch Simmon Citrate.

Thuốc khử Kovac’s. 4.2.2.4.3. ui tr nh ph n t ch Mẫu đƣợc đồng nhất pha loãng và định lƣợng tƣơng tự nhƣ phần Coloforms phân, riêng bƣớc kh ng định đƣợc tiến hành nhƣ sau:  Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ là E. coli. Dùng que cấy vòng cấy sang môi trƣờng canh EC, ủ ở 44  0,5oC trong 24 giờ.  Chọn các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) và dùng que cấy vòng cấy sang các môi trƣờng sau : canh Tryptone, canh MRVP, thạch Simmon Citrate.  Ủ các môi trƣờng trên ở 44 0,5oC trong 24 giờ.

 Thực hiện thử nghiệm IMViC và ghi nhận số khuẩn lạc E. coli (+). 4.2.2.4.4. ách t nh ết quả Tính tỉ lệ kh ng định và tính mật độ E. coli (CFU / ml hay CFU /mg) theo công thức tƣơng tự mục 4.2.2.3.4 ở trên. 4.2.3. Staphylococcus aureus 4.2.3.1. Định nghĩa và nguyên tắc Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu, gram dƣơng, có thử nghiệm coagulase, phosphatease (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose.

Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trƣởng trong môi trƣờng chứa đến 15 % NaCl. Hầu hết các dòng đều tạo sắc tố vàng sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trƣờng có nhiệt độ trên 15oC. S. aureus có thể nhiễm vào trong thực phẩm qua con đƣờng tiếp xúc giữa ngƣời với thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm. S. aureus đƣợc xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trƣởng và phản ứng đông huyết tƣơng của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trƣng trên môi trƣờng phân lập. 4.2.3.2. i trư ng và hoá chất

Môi trƣờng canh Mannitol Salt Broth (MSB). Môi trƣờng thạch máu. Môi trƣờng thạch Baird Parker Agar (BPA). Môi trƣờng thạch Tellurite Glycine Agar (TGA). Môi trƣờng Brain Heart Infusion (BHI). Huyết tƣơng thỏ. 4.2.3.3. Ph n t ch định tính Staphylococcus aureas

Cấy 2 ml dung dịch vào mẫu ống nghiệm chứa

ml môi trƣờng MSB, trộn đều và ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Dùng que cấy vòng cấy ria dịch mẫu từ ống (+) (môi trƣờng chuyển từ đỏ sang vàng) lên môi trƣờng phân lập (thạch TGA), ủ ở 37oC trong 24 giờ. Tìm khuẩn lạc đặc trƣng của S. aureus trên môi trƣờng phân lập: có màu đen nhánh, sáng, tròn, lồi, đƣờng kính 1 - 1,5 mm có vòng sáng chung quanh khuẩn lạc . Chọn khuẩn lạc đặc trƣng, cấy vào ống môi trƣờng BHI, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0,3 ml huyết tƣơng và ủ ở 37oC trong 24 giờ để thử phản ứng đông kết. Thực hiện thêm một ống đối chứng không đƣợc cấy dịch vi sinh vật. Mẫu đƣợc kết luận là có S. aureus khi thử nghiệm coagulase (+) (có sự xuất hiện của khối đông trong khi ống đối chứng không có). 4.2.3.4. Định lư ng S. aureus b ng phương pháp đếm khuẩn lạc 4.2.3.4.1. Đồng nhất mẫu và pha loãng Cân chính xác 10  0,1 g mẫu ttrong túi PE vô trùng, thêm 90 ml dung dịch pha loãng, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây. Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp, sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa P sẽ xuất hiện khoảng 10 - 100 khuẩn lạc / đĩa.

4.2.3.4.2. Phân lập trên môi tru ng ch n l c Cấy 0,1 ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trƣờng BPA. Dùng que cấy tam giác thủy tinh trải đều mẫu lên bề mặt môi trƣờng cho đến khi khô. Cấy mẫu trên 3 đĩa môi trƣờng P có độ pha loãng khác nhau. Thực hiện tƣơng tự với môi trƣờng thạch máu. Lật ngƣợc đĩa, ủ ở 37  1oC trong 24 - 48 giờ đối với môi trƣờng BPA và 24 giờ đối với môi trƣờng thạch máu. Trên môi trƣờng thạch BPA:  Sau 24 giờ, khuẩn lạc S. aureus có đƣờng kính khoảng 0,5 - 1 mm, lồi, đen bóng có vòng sáng rộng khoảng 1 - 2 mm bao quanh. Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm trên và tiếp tục ủ đến 48 giờ.  Sau 48 giờ, khuẩn lạc S. aureus có đƣờng kính 1 - 1,5 mm, màu đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng 2 - 4 mm quanh khuẩn lạc. Có một số dòng S. aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc nhƣ trên. Cần đếm và đánh dấu cả hai dạng khuẩn lạc. Trên môi trƣờng thạch máu, sau 24 giờ ủ, S. aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục, lồi có màu xám hay vàng nhạt, đƣờng kính 1 - 2 mm. 4.2.3.4.3. Khẳng định

Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trƣng và 5 khuẩn lạc không đặc trƣng từ môi trƣờng thạch P lên môi trƣờng thạch TSA, ủ ở 37oC. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tƣơng sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. Tính tỉ lệ kh ng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trƣng và không đặc trƣng. Thực hiện tƣơng tự với các khuẩn lạc đặc trƣng trên môi trƣờng thạch máu. Kết quả thử nghiệm là (+) khi có khối dòng huyết tƣơng hình thành (mọi mức độ đông kết đều đƣợc xem là (+)). Kết quả là (-) khi không có hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất nhƣ ống không cấy. 4.2.3.4.4. Cách tính kết quả Mật độ S. aureus trong mẫu đƣợc tính nhƣ sau: Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = [ 10 (NtHt + NaHa) ] / ( F1 + F2) Trong đó: F: độ pha loãng. Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trƣng. Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trƣng. Ht: tỉ số giữa số khuẩn lạc đặc trƣng cho thử nghiệm kh ng định (+) so với khuẩn lạc đặc trƣng.

Ht: tỉ số giữa số khuẩn lạc không đặc trƣng cho thử nghiệm kh ng định (+) so với khuẩn lạc không đặc trƣng. 4.2.3.5. Định lư ng S. aureus b ng phương pháp P

Phƣơng pháp này đƣợc dùng để định lƣợng mẫu có mật độ S. aureus thấp nhƣng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao. Dung dịch mẫu đƣợc pha loãng ở 3 mức: 10-1, 10-2, 10-3; thực hiện với hệ thống 9 ống nghiệm (3 lần lặp lại ở mỗi độ pha loãng). Cấy 1 ml dịch mẫu có độ pha loãng khác nhau vào ống nghiệm có chứa 10 ml môi trƣờng canh MSB, ủ ở 37oC trong 48 giờ. Chọn các ống (+) (môi trƣờng bị đục) tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn, ủ ở 37oC trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trƣng để thực hiện thử nghiệm kh ng định S. aureus (tiến hành tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp đếm khuẩn lạc). Tra bảng MPN, suy ra mật S. aureus độ trong mẫu (MPN / g hay MPN / ml). 4.2.4. Salmonella

4.2.4.1. Định nghĩa và nguyên tắc Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, di động, không tạo bào tử, lên men glucose và sinh acid, không lên men saccharose và lactose, không phân giải ure, hầu hết các chủng đều sinh H2S. Salmonella khi phân tích định tính đƣợc phát hiện qua 4 bƣớc:  ƣớc tăng sinh: tuỳ theo đặc tính của mẫu, cần chọn qui trình tăng sinh phù hợp. Thông thƣờng tỉ lệ giữa mẫu và môi trƣờng tăng sinh là 1 : (tuỳ từng trƣờng hợp cụ thể tỷ lệ này có thể thay đổi).

 ƣớc tăng sinh chọn lọc: các môi trƣờng tăng sinh chọn lọc thƣờng để phát hiện Salmonella trong mẫu thực phẩm là Rappaport Vassiliadis (RV), Selenite Cystein roth, Tetrathionate Mueler Kauffmann roth (TT),…  ƣớc phân lập: môi trƣờng XLD đƣợc khuyến khích sử dụng để phân lập Salmonella, nhằm tách và nhận dạng

Salmonella khỏi quần thể vi sinh vật khác trong mẫu.  Bƣớc kh ng định: thực hiện các thử nghiệm sinh hoá và huyết thanh đặc trƣng của Salmonella để xác nhận lại các khuẩn lạc Salmonella. 4.2.4.2. i trư ng và hoá chất

Nƣớc pepton đệm ( Buffered Peptone Water, BPW). Tetrathionate Mueler Kauffmann Broth (TT).

Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD). Thạch Hektoen Entric Agar (HE). Thạch Bismuth Sulphite Agar (BS) và Triple Sugar Iron (TSI). Thạch Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS). Canh Rappaport Vassiliadis Soya Pepton (RV). Canh Malachite Green Magnesium Chloride (canh RV cải tiến). Canh Urea, Tryptone, Lysine Decarboxylase. Canh Phenol Red Broth Base gồm 3 loại: Mannitol, Sucrose, Sorbitol. Thuốc thử Kovac’s và kháng huyết thanh Salmonella đa giá. 4.2.4.3. ui tr nh ph n t ch định tính Salmonella trong thực phẩm 4.2.4.3.1. Tăng sinh Đối với các loại mẫu thông thƣờng:  Cân 25 g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225 ml dung dịch BPW.  Đồng nhất mẫu bằng Stomacher và ủ ở 37  1oC trong 18 - 24 giờ.

Đối với một số thực phẩm có chứa các chất có thể gây độc hoặc ứng chế sự tăng trƣởng của Salmonella, cần thực hiện qui trình tăng sinh đặc biệt:  Đối với mẫu gia cầm tƣơi sống: đặt mẫu vào bao PE lớn, thêm 1 lít môi trƣờng tăng sinh khoảng 30 giây để môi trƣờng thấm đƣợc vào trong toàn bộ mẫu.  Đối với sữa khô: cho 25 g mẫu vào túi PE vô trùng, thêm 225 ml môi trƣờng PW, để yên 60 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó lắc cho sữa tan hết.  Đối với dừa và các mẫu có hàm lƣợng chất béo cao: đồng nhất mẫu với BPW, thêm vào 2 - 3 giọt Triton X - 100 và ủ tăng sinh. 4.2.4.3.2. Tăng sinh ch n l c Lắc đều dịch tăng sinh, chuyển 0,1 ml sang 10 ml môi trƣờng tăng sinh RV đã đƣợc ủ ấm đến 42oC. Ủ ở 42oC  0,2oC trong 18 - 24 giờ. Mỗi môi trƣờng tăng sinh chọn lọc đƣợc ủ ở một nhiệt độ nuôi cấy khác nhau và mỗi loại môi trƣờng chỉ có tác dụng trên một đặc điểm phát triển của Salmonella. 4.2.4.3.3. Phân lập và nhận diện Dùng que cấy vòng cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trƣờng chọn lọc nhƣ XLD, HE, … PW, lắc bằng máy lắc

Các biểu hiện của Salmonella trên từng môi trƣờng chọn lọc khác nhau là khác nhau, thể hiện ở hình thái khuẩn lạc Salmonella, ví dụ:  Môi trƣờng XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hoặc không có tâm đen.  Môi trƣờng HE: khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dƣơng đến xanh lục, có hoặc không có tâm đen.  Môi trƣờng BS: khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kim tím. Môi trƣờng xung quanh khuẩn lạc chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển màu đen nếu kéo dài thời gian ủ.  Môi trƣờng BPLS: khuẩn lạc màu hồng nhạt, trong suốt, xung quanh khuẩn lạc môi trƣờng có màu đỏ. Sau khi cấy, các đĩa đƣợc ủ ở 37oC trong 22 - 26 giờ. 4.2.4.3.4. Khẳng định Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc bị nghi ngờ là Salmonella, cấy sang môi trƣờng không chọn lọc, ủ 37oC trong 18 - 24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trƣờng này đƣợc dùng cho các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh. Các chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm sinh hóa nhƣ sau:  Thử nghiệm H2S (TSI hay KIA): xuất hiện các vệt màu đen trong môi trƣờng, có hiện tƣợng làm vỡ thạch môi trƣờng (do sinh hơi).

 Thử nghiệm LDC (+): môi trƣờng chuyển thành màu nhƣ ban đầu.  Thử nghiệm Urea (-): môi trƣờng giữ nguyên màu vàng cam.  Lên men mannitol, sorbitol (+): môi trƣờng chuyển sang màu vàng.  Thử nghiệm Indol và VP: (-). Các thử nghiệm kháng nguyên đƣợc thực hiện song song với mẫu đối chứng bằng dung dịch nƣớc muối sinh lý. Phản ứng (+) khi chủng thử nghiệm tạo ngƣng kết với kháng huyết thanh nhƣng không có ngƣng kết với nƣớc muối sinh lý. 4.2.4.3.5. Báo cáo kết quả Báo cáo kết quả là “có” hay “không có” Salmonella trong 25 g mẫu. 4.2.5. Shigella 4.2.5.1. Định nghĩa và nguyên tắc Shigella là trực khuẩn gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, cho thử nghiệm catalase (+), lên men glucose không sinh hơi, không lên men lactose, không sinh H 2S, không có enzyme lysine decarboxylase. Giống Shigella gồm 4 loài:  S. dysenteriae không lên men mannitol, thuộc nhóm kháng huyết thanh A.

 S. flexneri thuộc nhóm kháng huyết thanh B.  S. boydii lên men mannitol sinh hơi, thuộc nhóm kháng huyết thanh C.  S. sonnei lên men mannitol, thuộc nhóm kháng huyết thanh D. Shigella là tác nhân gây bệnh shigellosis, là bệnh nguy hiểm lây lan rất nhanh từ ngƣời sang ngƣời qua đƣờng thực phẩm (thịt băm, thủy sản,..) và nƣớc uống. Shigella gây ngộ độc thực phẩm với liều lƣợng là rất thấp. Shigella đƣợc phát hiện bằng cách cấy một lƣợng mẫu xác định vào môi trƣờng lỏng không chọn lọc, sau đó chuyển vào môi trƣờng tăng sinh chọn lọc. Dịch khuẩn sau khi tăng sinh chọn lọc đƣợc cấy phân lập trên ít nhất 2 đĩa môi trƣờng thạch khác nhau. Khuẩn lạc nghi ngờ đƣợc kiểm tra bằng thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanh. 4.2.5.2. i trư ng và hoá chất

Canh Tryptose Soya và Gram Negative (GN). Dulcitol Phenol Red Broth (DPR). Lysine Decarboxylase Broth (LD). Mannitol Phenol Red Broth (MPR). Thạch Hektoen Enteric (HE) và Triple Sugar Iron (TSI). Thạch Deoxycholate Citrat Agar.

Thạch MacConkey (MAC) và Xylose Lysine Desoxycholate (XLD). Môi trƣờng Tergitol - 7 Agar (T7A). Môi trƣờng thử nghiệm tính di động. Thuốc thử oxidase và catalase. Kháng huyết thanh gồm 4 loại: polyvalent A, B, C, D. 4.2.5.3. Qui trình phân tích 4.2.5.3.1. Tăng sinh Tăng sinh: lấy 25 g mẫu cho vào túi dập mẫu, thêm 225 ml canh Tryptone Soya, đồng nhất mẫu, đo pH và chỉnh về 7  0,2, buộc chặc miệng túi, ủ ở 37oC trong 16 - 20 giờ. Tăng sinh chọn lọc: chuyển 0,1 ml dịch tăng sinh sang 10 ml canh tăng sinh GN, ủ ở 37oC trong 16 - 20 giờ. 4.2.5.3.2. Phân lập Dùng que cấy vòng cấy dịch tăng sinh lên các đĩa môi trƣờng thạch chọn lọc. Sử dụng ít nhất hai loại môi trƣờng thạch phân lập khác nhau, một số môi trƣờng thông dụng nhƣ: T Ủ các đĩa môi trƣờng ở nhiệt độ 37oC trong 24 - 48 giờ. Biểu hiện của Shigella trên các môi trƣờng phân lập nhƣ sau: , XLD, HE, M C,…

 Môi trƣờng T7A: khuẩn lạc Shigella có màu xanh nhạt.  Môi trƣờng HE: khuẩn lạc Shigella có màu xanh nhạt, trong suốt.  Môi trƣờng XLD: khuẩn lạc Shigella có màu đỏ, trong suốt.  Môi trƣờng MAC: khuẩn lạc Shigella có màu nâu đỏ, trong suốt. 4.2.5.3.3. Khẳng định Shigella b ng thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trƣờng phân lập, cấy lên môi trƣờng thạch không chọn lọc, ủ ở 37oC trong 20 - 24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trƣờng này đƣợc sử dụng để tiến hành các thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh. Thử nghiệm sàng lọc:  Cấy ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trƣờng TSI, cách cấy nhƣ sau: trƣớc hết cấy ria trên mặt nghiêng, sau đó đâm sâu xuống ống nghiệm. Ủ ống ở 37oC trong 24 giờ.  Kh ng định Shigella: Shigella cho màu đỏ trên mặt nghiêng, màu vàng ở phần đáy ống nghiệm và không tạo H2S trong môi trƣờng. Thử nghiệm kh ng định :  Shigella đƣợc kh ng định bằng các thử nghiệm sinh hóa ứng với các kết quả:

Thử nghiệm sinh hóa Simmon citrate Arginine decarboxylase Lisine decarboxylase Urease Malonate MR VP

Kết quả + -

Thử nghiệm sinh hóa Salicine Xylose Cellobiose Adonitol Dulcitol Inositol

Kết quả -

-

4.2.5.3.4. Khẳng định Shigella b ng thử nghiệm kháng huyết thanh Thực hiện thử nghiệm kháng huyết thanh bằng huyết thanh đa giá , , C, D từ các dòng đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thạch không chọn lọc. Tiến hành song song với mẫu đối chứng (dùng nƣớc muối sinh lí).

Phản ứng (+) khi chủng thử nghiệm tạo ngƣng kết với kháng huyết thanh nhƣng không có ngƣng kết với nƣớc muối sinh lý. 4.2.5.3.5. Báo cáo kết quả Kết quả báo cáo là “có” hay “không có” Shigella trong 25 g mẫu.

You're Reading a Free Preview

Tải về
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->