P. 1
BÀI 13 - ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP

BÀI 13 - ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP

|Views: 6,418|Likes:
Được xuất bản bởiJiro Ken

More info:

Published by: Jiro Ken on Jul 01, 2012
Bản quyền:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOCX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

09/28/2015

pdf

text

original

THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƢƠNG

BÁO CÁO THỰC HÀNH BÀI 13 ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP ( BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU )
I. NGUYÊN TẮC Phƣơng pháp đếm trực tiếp là phƣơng pháp định lƣợng dựa trên sự quan sát và đếm trực tiếp số lƣợng tế bào vi sinh vật bằng kính hiển vi và buồng đếm. 1.ĐỐI TƯỢNG Vi sinh vật đơn bào có kích thƣớc lớn: nấm men, tảo đơn bào, bào tử nấm mốc dễ quan sát dƣới kính hiển vi. 2. HẠN CHẾ      Không phân biệt đƣợc tế bào vi sinh vật sống và chết trong mẫu. Không phân biệt đƣợc các tế bào vi sinh vật và hạt vật thể. Hạn chế đối với huyền phù có mật độ thấp do lƣợng dung dịch đem đếm nhỏ. Độ chính xác không cao. Không thích hợp mẫu có mật độ vi sinh vật thấp.

LƯU Ý: Tùy mức độ có mặt của vi sinh vật trong mẫu ban đầu, dung dịch đem đếm cần đƣợc pha loãng đến mức phù hợp ( số tế bào phải lớn hơn hoặc bằng 2 và không quá 10 tế bào ). Nguyên tắc pha loãng: Dung dịch pha loãng mẫu thƣờng là NaCl 0.9% hay photphat đệm đã đƣợc vô trùng.

1

TRẦN THANH TÙNG – MSSV: 10243221| GVHD: Thầy TRƯƠNG VÕ ANH DŨNG

THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƢƠNG

II. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT      Dụng cụ phòng thí nghiệm. Nƣớc muối sinh lý 0.9%. Nƣớc cất vô trùng. Cồn 96o. Chủng nấm men: Saccharomyces cerevisiae.

III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM SỬ DỤNG BUỒNG ĐẾM HỒNG CẦU 1. CẤU TẠO BUỒNG ĐẾM Buồng đếm là một phiến kính trong, dày, hình chữ nhật. Giữa là phần lõm, phẳng, có kẻ một hoặc hai khung đếm gồm 400 ô nhỏ. Bên ngoài có ghi tên loại buồng đếm, và ghi các thông số kĩ thuật nhƣ hình bên. Hình 13.1 Buồng đếm hồng cầu
2 TRẦN THANH TÙNG – MSSV: 10243221| GVHD: Thầy TRƯƠNG VÕ ANH DŨNG

THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƢƠNG
2. CẤU TẠO KHUNG ĐẾM

Hình 13.2 Cấu tạo khung đếm 3. CÁCH TIẾN HÀNH

Hình 13.3 Cách tiến hành
3 TRẦN THANH TÙNG – MSSV: 10243221| GVHD: Thầy TRƯƠNG VÕ ANH DŨNG

THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƢƠNG
QUY TRÌNH:
Mẫu

Đồng nhất

Pha loãng

Chọn nồng độ pha loãng

Bơm dịch mẫu vào BĐHC

Đếm trực tiếp trên KHV

Tính kết quả

4. CÁCH ĐẾM TẾ BÀO TRONG BUỒNG ĐẾM

Hình 13.4 Cách đếm tế bào trong buồng đếm
4 TRẦN THANH TÙNG – MSSV: 10243221| GVHD: Thầy TRƯƠNG VÕ ANH DŨNG

THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƢƠNG

Hình 13.5. Những tế bào được đếm ( màu đen ) và không được đếm ( màu xanh ) trong 1 ô lớn 5. CÔNG THỨC TÍNH Gọi A là số lƣợng tế bào đếm đƣợc trong 80 ô nhỏ Số lƣợng tế bào trong 1 mm3 đƣợc tính theo công thức: Số tế bào trong 1 mm3 = Trong đó:  A: Số lƣợng tế bào trong 80 ô nhỏ  4000 = 400 x 10 ( 1/400 mm2: diện tích 1 ô nhỏ; 1/10 mm: chiều cao từ mặt buồng đếm đến tấm lamelle )  ĐPL: độ pha loãng IV. NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý  Chỉ đếm đƣợc tổng số tế bào, không thể biết tế bào nào còn sống, tế bào nào đã chết.
A  4000 ĐPL 5 16

5

TRẦN THANH TÙNG – MSSV: 10243221| GVHD: Thầy TRƯƠNG VÕ ANH DŨNG

THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƢƠNG
 Nồng độ dịch huyền phù pha loãng sao cho mật độ mỗi ô nhỏ không quá 10 tế bào.  Sử dụng xong phải rửa buồng đếm ngay và lau khô.  Để đạt độ chính xác cao, số tế bào trung bình đếm đƣợc trong 1 ô nhỏ: 2 ≤ a ≤ 10. V. BÁO CÁO THỰC TẬP Trình bày nguyên tắc và cách tiến hành của phương pháp định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp. NGUYÊN TẮC: Phƣơng pháp đếm trực tiếp là phƣơng pháp định lƣợng dựa trên sự quan sát và đếm trực tiếp số lƣợng tế bào vi sinh vật bằng kính hiển vi và buồng đếm. Đếm số lƣợng tế bào vi khuẩn có trong một đơn vị thể tích của phòng đếm, từ đó suy ra số lƣợng tế bào có trong 1ml dung dịch, nhân với độ pha loãng để biết số tế bào có trong dung dịch ban đầu. CÁCH TIẾN HÀNH:  Pha loãng huyền phù tế bào vi sinh vật sao cho trong mỗi ô lớn chỉ từ 10 - 50 tế  bà o ).  Lắc mạnh dịch huyền phù tế bào (đã pha loãng), dùng pippet Pasteur để hút dịch huyền phù này.  Đậy buồng đếm bằng một phiến kính mỏng.  Nhẹ nhàng dùng đầu pippet (chứa một giọt huyền phù vi sinh vật), đặt vào cạnh buồng đếm (nơi tiếp giáp với phiến kính mỏng). Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Buồng đếm đƣợc chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm đƣợc phủ bởi dịch huyền phù tế bào, c ò n c á c r ã n h c h u n g q u a n h thì k h ô n g b ị d í n h ƣ ớ t.  Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các khoang. Khi đó, d ịc h n ằ m tr o n g k h o a n g c ó đ ộ d à y k h o ả n g 0 .1 m m.  Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính x10 để tìm buồng đếm. Chỉnh  thật rõ, sau đó chuyển qua vật kính x40 để đếm.  Đ iề u c h ỉ n h c ƣ ờ n g đ ộ á n h sá n g b ằ n g c ử a s ậ p đ ể c ó th ể q u a n s á t r õ r à n g c ả tế b à o lẫn các đƣờng kẻ. Tuỳ vào số lƣợng tế bào mà có thể chọn cách đếm tất cả các tế bào có trong ô trung tâm hay chỉ đếm các tế bào có trong một số ô vuông lớn đại diệ n . Thông thƣờng ta chọn 1 ô trung tâ m và 4 ô nằm ngoài bìa.  Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt dịch từ 3 - 5 phút; phải đếm các tế bào nằm t r ê n 2 đ ƣ ờn g k ẻ k ề n h a u đ ƣ ợc c h ọ n c ủ a t ừ n g ô .
6 TRẦN THANH TÙNG – MSSV: 10243221| GVHD: Thầy TRƯƠNG VÕ ANH DŨNG

THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƢƠNG

Phương pháp định lượng vi sinh vật bằng cách đếm trực tiếp thường áp dụng cho những đối tượng vi sinh vật nào? Giải thích ĐỐI TƯỢNG Vi sinh vật đơn bào: nấm men, tảo đơn bào, bào tử nấm mốc,... GIẢI THÍCH:     Những vi sinh vật nêu trên có kích thƣớc lớn. Dễ quan sát dƣới kính hiển vi. Chúng thƣờng tồn tại với mật độ cao trong mẫu vật cần kiểm tra. Đa số không cần nhuộm màu ( nếu là vi khuẩn thƣờng nhuộm xanh metylen hoặc màu phù hợp với vi khuẩn đó ).  Do quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính x40, nghĩa là độ phóng đại lên 400 lần nên chỉ có thể đếm đƣợc những vi sinh vật có kích thƣớc lớn.

7

TRẦN THANH TÙNG – MSSV: 10243221| GVHD: Thầy TRƯƠNG VÕ ANH DŨNG

You're Reading a Free Preview

Tải về
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->