CASO CLNICO BRUCELOSIS: PARADIGMA

DEL DIAGNSTICO MICROBIOLGICO

R. Daz Garca* e I. Dorronsoro Ibero**
*Departamento de Microbiologa. Servicio de Microbiologa. Clnica Universitaria. Universidad de Navarra. Pamplona. **Servicio de Microbiologa. Hospital de Navarra. Pamplona.

Introduccin
La brucelosis es una zoonosis, es decir, una enfermedad infectocontagiosa que afecta a los animales y a los seres humanos. Est producida por bacterias pertenecientes al gnero Brucella, cuyos huspedes naturales ms importantes son las cabras (B. melitensis), las ovejas (B. melitensis), las vacas (B. abortus) y los cerdos (B. suis). Estos animales excretan las brucelas a travs de la leche, exudados vaginales, orina y productos del aborto, por lo que los seres humanos pueden contagiarse de manera directa por contacto con los materiales mencionados, o de manera indirecta por ingestin de leche fresca o productos lcteos no pasteurizados. En Espaa B. melitensis es la especie responsable del 98% de los casos de brucelosis humana1 y B. abortus de los restantes. No existen datos fehacientes que hayan demostrado la existencia en nuestro pas de infecciones humanas por B. suis o B. canis. La cifra oficial del nmero de casos de brucelosis humana (fiebre de Malta) declarados en Espaa en el ao 1984 fue de 8.698 (tasa de incidencia por 100.000 habitantes de 22,9) y de 1.553 en el ao 1999 (tasa de incidencia por 100.000 habitantes de 0,72). Segn nuestra opinin, la disminucin del nmero de casos se debe a las medidas sanitarias que se han tomado para evitar la ingestin de productos lcteos no pasteurizados, hecho que est avalado por la baja incidencia de casos que ocurren en el medio urbano. Sin embargo en el medio rural, mientras no sea erradicada del ganado ovino y caprino, seguirn producindose casos aislados entre las personas que estn en contacto con estos
Medicine 2002; 8(61): 3289-3296

animales y, de vez en cuando, seguirn declarndose pequeos brotes epidmicos de origen alimentario. En el momento actual muchos mdicos jvenes no han tenido ocasin de realizar un diagnstico de brucelosis humana, enfermedad multisistmica caracterizada por un extraordinario polimorfismo en sus manifestaciones, en la que pueden ocurrir complicaciones focales graves, y que afecta a individuos de cualquier edad. Por estas razones el objeto de esta revisin es volver a llamar la atencin sobre algunos aspectos prcticos que sirvan para orientar el diagnstico, evitando las complicaciones, y tambin la realizacin de exploraciones innecesarias y costosas.

Caso 2
Mujer de 60 aos que atenda un rebao de 1.000 ovejas de su propiedad y en el que se haban producido numerosos abortos. Comenz con una lumbalgia que mejoraba con calor local y antiinflamatorios, sin embargo, a los pocos das comenz a sentir una intensa cefalea, acompaada de fiebre vespertina (38 C) sin escalofros. La enferma se autoprescribi amoxicilina (1 g/8 horas) y una combinacin antigripal refiriendo en la anamnesis que mejor, pero que a los ocho das comenz de nuevo con cefalea, fiebre alta e intensos escalofros. En ese momento acude a una consulta mdica donde sospechan que se puede tratar de un caso de brucelosis y solicitan un estudio serolgico. El laboratorio realiza una prueba de seroaglutinacin (no consta la tcnica) que resulto negativa. La enferma no recibe tratamiento especfico y ante la persistencia de la lumbalgia, la fiebre y los escalofros acude a la Clnica Universitaria donde se confirm el diagnstico de brucelosis. Solamente en uno de los tres hemocultivos practicados se aisl B. melitensis biovar 3. El ttulo de la prueba de Rosa de Bengala fue de 4.

Descripcin de casos de brucelosis

Caso 1
Varn de 35 aos, fabricante de quesos de oveja y residente en un medio rural. El enfermo sinti bruscamente la sensacin de fuertes escalofros, con subida rpida de la temperatura (40 C) y sudacin profusa. A las 18 horas inicia un tratamiento con antiinflamatorios ms una cefalosporina (Cefonicid) y una macrlido (Azitromicina). La fiebre vespertina no desaparece con el tratamiento, y a los ocho das del comienzo de la enfermedad, ingresa en la Clnica Universitaria porque haba notado que, a partir del cuarto da, el testculo derecho haba comenzado a inflamrsele. Se diagnostica de un cuadro de brucelosis aguda que se acompaa de una orquiepididimitis. En los tres hemocultivos practicados se aisl B. melitensis biovar 3. La prueba de Rosa de Bengala fue positiva con un ttulo de 32.

Caso 3
Mujer de 67 aos que habitaba en un medio rural donde la brucelosis era endmica. Comenz con un cuadro de astenia, cervicalgia, coxalgia y dorsalgia. Refera que nunca haba sentido fiebre ni escalofros. Fue diagnosticada de polimialgia reumtica y tratada con esteroides, mejorando sus sntomas generales pero no la dorsalgia. A los 6 meses se le practica en su ciudad de origen una resonancia magntica de la columna vertebral y el radilogo informa que padece una espondilo3289

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discitis infecciosa pero no pigena sino que es ms lgico que est producida por Brucella o Mycobacterium tuberculosis. La enferma acude a la Clnica Universitaria, donde se asla B. melitensis biovar 1 en los 3 cultivos realizados en medios slidos (agar sangre y agar chocolate) y en medio lquido MGIT (Becton Dickinson) de la muestra tomada de las lesiones vertebrales. Los hemocultivos fueron negativos y la prueba de Rosa de Bengala positiva con un ttulo de 8.

Caso 4
Varn de 58 aos de profesin ganadera, que acude al Hospital de Navarra por presentar un cuadro de ictericia. En los antecedentes no cuenta haber sido nunca diagnosticado de brucelosis, pero refiere que aos atrs fue tratado de un episodio de alergia al ganado con broncoespasmo. Se confirma que padece una colestasis obstructiva debido a la existencia de una masa slida en la cabeza del pncreas. Se le coloca un tubo de drenaje biliar endoscpico y desaparece la ictericia. Un mes despus, en la fecha programada, fue intervenido quirrgicamente y se encontr una masa en la cabeza del pncreas con adenopatas retroportales y en el pedculo de la arteria heptica y tronco celaco, con gran inflamacin retroportal y con presencia de material de aspecto caseoso. Lo ms destacado del examen anatomopatolgico fue la demostracin de una pancreatitis crnica granulomatosa, con una imagen sugestiva de tuberculosis, en la que no se pudo demostrar la presencia de bacilos cido-alcohol resistentes. Sin embargo, el cultivo bacteriolgico del material caseoso en el medio 12B del sistema BACTEC460TB fue positivo para B. melitensis biovar 3, y mediante una PCR-IS6501PCR se demostr en dicho material la presencia de cidos nucleicos especficos del gnero Brucella. Los hemocultivos fueron negativos y el ttulo de la prueba de Rosa de Bengala fue de 16.

ticulares y se solicita un estudio serolgico. Los resultados obtenidos fueron los siguientes; Rosa de Bengala: ttulo 4; seroaglutinacin: ttulo 320; Coombs (realizado con un suero antiinmunoglobulinas totales): ttulo 1.280, la contrainmunoelectroforesis con protenas citoslicas fue negativa. Los resultados de las exploraciones radiolgicas no revelaron lesiones seas significativas, pero teniendo en cuenta los resultados de la serologa la paciente fue tratada de brucelosis. En el ao 1982 acude de nuevo a la consulta porque sigue quejndose de dolores articulares. Se realiza una gammagrafa y no se encuentra ningn tipo de lesin y los resultados del resto de las exploraciones, incluyendo las analticas fueron normales, por lo que se descart que esta enferma padeciese una brucelosis, a pesar de que los resultados del estudio serolgico fueron similares a los obtenidos en el ao 1979. No se pudo demostrar la presencia de Y. enterocolitica 0:9 en el cultivo de las heces y manifest no haber pasado ningn cuadro diarreico.

Diagnstico
Los resultados del anlisis de los antecedentes epidemiolgicos, de la forma de comienzo y de los sntomas y signos son de gran ayuda para orientar el diagnstico clnico, que siempre debe ser confirmado mediante pruebas bacteriolgicas y serolgicas.

Anlisis de los datos epidemiolgicos

Los datos epidemiolgicos correspondientes a los dos primeros pacientes indican que estaban expuestos continuamente a un posible contagio. El primero, en el momento de descargar la leche de oveja en la fbrica o durante el proceso de la fabricacin de los quesos, y el segundo, durante el manejo de las 1.000 ovejas donde se haban producido numerosos abortos. En estos casos el contagio pudo producirse por va respiratoria, conjuntival o a travs de la piel. El aislamiento del agente etiolgico (B. melitensis) indica, casi con toda probabilidad, que la fuente de contagio fue el ganado ovino. En el tercer paciente no existen datos epidemiolgicos que indiquen con claridad la

va de contagio. La paciente viva en una zona endmica y, por lo tanto, es posible que se contagiase por va digestiva al ingerir leche cruda o algn alimento fabricado con leche no pasteurizada (queso fresco, helados, natillas, cuajada, etc.). El dato epidemiolgico ms significativo en el cuarto paciente es que era ganadero y que refera haber sido tratado de un episodio de alergia al ganado, que se manifest por la aparicin de un broncoespasmo. Como este sntoma ha sido asociado con cuadros de brucelosis con localizacin pulmonar2, es posible que sufriese una infeccin pulmonar que en ese momento cur aparentemente sin necesidad de tratamiento especfico, pero al ser una bacteria de multiplicacin intracelular facultativa, cabe la posibilidad de que algunas permaneciesen vivas dentro de un macrfago, y que un da, al romperse el equilibrio husped-parsito a favor de la bacteria, se produjera como consecuencia la lesin inflamatoria local que presentaba este paciente. Sin embargo, aunque no existen datos sobre el nmero de personas que se infectan y curan sin tratamiento, la experiencia adquirida por nosotros durante el estudio de un brote familiar en la dcada de los 70, nos permite afirmar que este hecho sucede. En este brote 5 miembros de la familia pasaron la enfermedad, confirmada mediante el aislamiento del agente etiolgico (B. melitensis bivar 1), y en tres ocurri una conversin serolgica, es decir, que las pruebas de Rosa de Bengala, aglutinacin y Coombs resultaron positivas, pero nunca presentaron sntomas o signos de brucelosis y, adems, las pruebas mencionadas se negativizaron al cabo de dos aos. Finalmente hay que decir que en el quinto paciente no se encontraron datos epidemiolgicos que indicasen haber estado en contacto con brucelas.

Formas de comienzo
El comienzo de la enfermedad en el primer caso se puede considerar como clsica. Se observa aproximadamente en la mitad de los pacientes, y se caracteriza por la repentina aparicin de escalofros, elevacin rpida de la temperatura y sudacin profusa. Este paciente desarroll, adems, una orquiepididimitis, sntoma frecuente en la brucelosis humana2. La forma de comienzo del segundo paciente la podemos considerar, hasta cier-

Caso 5
Se trata de una paciente de 42 aos que acude en el ao 1970 por primera vez a la Clnica Universitaria, pero cada vez que acude a consulta manifiesta sentir molestias en diferentes rganos y sistemas. En el ao 1979 se queja de dolores poliar3290

CASO CLNICO BRUCELOSIS: PARADIGMA DEL DIAGNSTICO MICROBIOLGICO

to punto, como insidiosa, siendo tpico este tipo de comienzo y evolucin en el tercer paciente, que adems, manifest no haber sentido fiebre en ningn momento. Debido al tiempo que transcurri entre las primeras manifestaciones y el diagnstico definitivo, desarroll una espondilodiscitis localizada en las vrtebras dorsales. El cuarto paciente acudi a la consulta mdica por haber desarrollado un cuadro de colestasis obstructiva. En este caso el diagnstico correcto de brucelosis solamente se pudo establecer despus de conocer los resultados del estudio anatomopatolgico y bacteriolgico. El enfermo no refera haber padecido ningn cuadro de tipo febril, es ms, en la primera consulta se le coloc un tubo de drenaje biliar endoscpico, que favoreci la desaparicin de la ictericia y pudo hacer vida normal durante un mes sin ninguna manifestacin que indicase el padecimiento de un proceso infeccioso, por lo que se pudo realizar la intervencin quirrgica en la fecha programada. Este caso es representativo de una de las mltiples complicaciones focales que pueden ocurrir durante el curso de la brucelosis, y que eran frecuentes antes de la introduccin de los antibiticos. Entre stas hay que descartar las osteoarticulares (sacroileitis y espondilitis), neurolgicas (meningitis), hepatoesplnicas (abscesos), cardiovasculares (la ms grave es la endocarditis), genitourinarias (abortos en mujeres embarazadas), hematolgicas (coagulacin intravascular diseminada, aunque muy rara), sin olvidar las psiquitricas. Finalmente queremos sealar que existe la posibilidad de que se inicie la enfermedad con un cuadro maligno (sptico-txico) con afectacin heptica. Respecto a la brucelosis infantil, hay que recordar que el cuadro clnico puede confundirse con un cuadro de fiebre tifoidea, y al revs, por lo que siempre ser necesario establecer el diagnstico diferencial entre estas dos enfermedades.

esta prueba siempre se deber realizar en el caso de que el paciente: a) por su profesin est o haya estado en contacto con animales (ganaderos, matarifes, veterinarios, etc.); b) si consume o ha consumido queso fresco o productos lcteos no pasteurizados; c) si vive o ha viajado recientemente a una regin donde esta enfermedad es endmica; d) si en el pasado ha padecido esta enfermedad, y e) si refiere padecer dolores articulares o de tipo reumtico.

Confirmacin diagnstica
Pruebas bacteriolgicas
Aislamiento del agente etiolgico En dos pacientes se confirm el diagnstico mediante el aislamiento del agente etiolgico a partir de una muestra de sangre (hemocultivo). El porcentaje de hemocultivos positivos segn distintos autores vara entre el 17% 3 y el 87% 4; sin embargo, en pacientes con fiebre alta, el porcentaje puede llegar a ser del 90%4. Nosotros aconsejamos, si es posible, realizar tres hemocultivos durante 24 horas (uno cada 8 horas) y siempre deben ser manipulados en una cabina de seguridad biolgica tipo II (cabina de flujo laminar), y si se utiliza el medio bifsico descrito por Ruiz-Castaeda con 10% de CO2 debe ser incubado durante 45 das, aunque la mayora resultan positivos entre la primera y tercera semana4. Los medios semiautomticos (BACTEC 9204 o BACT/ALERT) tienen la ventaja de que el crecimiento bacteriano se detecta con ms rapidez, sin embargo, segn nuestra experiencia, el sistema de deteccin puede fallar en algunas ocasiones, y por lo tanto, es obligatorio realizar subcultivos al cabo de seis semanas antes de descartarlos como negativos. Adems, en el caso de que un hemocultivo resulte positivo despus de tres das de incubacin y aparezca contaminado con alguna de las bacterias que forman parte de la microbiota normal, antes de ser descartados como negativos, debe de realizarse una tincin de Stamp5. En los pacientes 3 y 4 los hemocultivos fueron negativos, pero el agente etiolgico (B. melitensis) se aisl en los cultivos realizados con las muestras tomadas del foco de la lesin. Mencionamos este hecho para recordar de nuevo, que esta bac-

teria se puede aislar a partir de muestras de abscesos, mdula sea, lquido cefalorraqudeo, ganglios linfticos, bazo, etc; y que las colonias en los medios slidos no se observan con claridad hasta despus de 4 5 das de incubacin. Por lo tanto, es recomendable no descartar los cultivos realizados con muestras de este tipo antes de los 5 das de incubacin, sobre todo si proceden de pacientes que viven en zonas endmicas. Es ms, el hecho de que en los pacientes 3 y 4 se recuperase la bacteria en los medios de cultivo utilizados para el aislamiento de Mycobacterium tuberculosis, nos ha enseado que si estos medios estn inoculados con muestras procedentes de tejidos normalmente estriles, y aparecen contaminados, no deben descartarse como tales, sin identificar la bacteria contaminante, porque la positividad puede ser debida al crecimiento de brucelas. Nuestra recomendacin es teir una preparacin con el mtodo de Stamp y realizar subcultivos en medios slidos. Mtodos de amplificacin de cidos nucleicos (PCR) La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) ha comenzado a ser utilizada para la deteccin de cidos nucleicos de Brucella en las muestras enviadas al laboratorio. La ms utilizada es la sangre y los resultados publicados por Queipo-Ortuo et al6 son muy prometedores. Recientemente Zerva et al7 han demostrado que la PCR puede ser realizada tambin con el suero. Estos resultados, ms el obtenido con la muestra del material caseoso del paciente nmero 4, indican que en el futuro se deber prestar una atencin particular a las tcnicas de biologa molecular con el fin de conocer sus lmites y ventajas.

Pruebas serolgicas
En la tabla 1 se exponen las tcnicas que con ms frecuencia se emplean en el diagnstico de la brucelosis humana, as como los antgenos e isotipos de inmunoglobulinas que intervienen en las mismas. El lipopolisacrido (LPS) est situado en la superficie de la bacteria, y es el antgeno que interviene en las pruebas en las que se emplean clulas enteras, como la de Rosa de Bengala, seroaglutinacin, Coombs y fijacin de complemento8,9. Los resulta3291

Consejos prcticos
Ante un enfermo con un cuadro de fiebre prolongada de origen desconocido, o que por presentar alguna de las manifestaciones generales o focales anteriormente mencionadas planteen al mdico la duda de que pueda tratarse de una brucelosis, nuestro consejo es que se solicite siempre una prueba de Rosa de Bengala. Adems,

ENFERMEDADES INFECCIOSAS (I)

TABLA 1 Diagnstico serolgico. Antgenos e isotipos de inmunoglobulinas que intervienen en las pruebas indicadas
Prueba Rosa de Bengala Seroaglutinacin 2-mercaptoetanol Coombs Fijacin de complemento ELISA CIEP IDR Ouchterlony Preparacin antignica Clulas enteras Clulas enteras Clulas enteras Clulas enteras LPS/clulas enteras LPS/clulas enteras Citosol HN LPS Isotipo que interviene M, G, A M, G, A G G, A M, G M, G, A G M, G M, G Antgeno que interviene LPS LPS LPS LPS LPS LPS Protenas HN LPS/HN

CIEP: contrainmunoelectroforesis; IDR: inmunodifusin radial; LPS: lipopolisacrido; HN: hapteno nativo.

dos obtenidos en nuestro laboratorio han demostrado que los anticuerpos IgM, IgG e IgA aglutinan las suspensiones de Brucella, tanto a pH neutro como a pH cido, pero los anticuerpos IgG e IgA no aglutinantes (denominados incompletos) muestran mayor actividad aglutinante a pH cido10. Por otra parte, los anticuerpos IgM y los IgA con capacidad aglutinante a pH neutro son sensibles a los agentes que reducen los puentes disulfuro10,11 fenmeno que no ocurre con los anticuerpos IgG12. Para determinar el nivel de la clase de anticuerpo que se reacciona con el LPS, las tcnicas ms adecuadas son las inmunoenzimticas (ELISA), pero sin olvidar que no sirven para diferenciar los anticuerpos IgG e IgA aglutinantes de los no aglutinantes (denominados incompletos), problema que s puede resolverse utilizando en combinacin la prueba de seroaglutinacin y la prueba de Coombs. Un hecho que hay que recordar es que el LPS de Brucella contiene determinantes antignicos comunes con el LPS de otras bacterias gramnegativas, como Y. enterocolitica 0:9. Citamos solamente esta bacteria porque, desde el punto de vista prctico, es la nica que plantea problemas en el diagnstico serolgico diferencial entre brucelosis y yersiniosis, cuando se emplean tcnicas basadas en la demostracin de anticuerpos frente al LPS, pero hay que

recordar, que en Espaa hasta el momento actual y segn nuestro conocimiento, nicamente han sido descritos dos casos de aislamiento de Y. enterocolitica 0:9 en humanos13. Comentarios sobre las pruebas serolgicas En la tabla 2 se exponen los resultados de las pruebas serolgicas realizadas con los sueros de los pacientes objeto de nuestro anlisis. Rosa de Bengala. En los cuatro pacientes con brucelosis y en el paciente nmero 5 la prueba de Rosa de Bengala result positiva. Como no pudo confirmarse que el paciente nmero 5 padeca un cuadro de brucelosis, el resultado obtenido en este paciente debe ser considerado como representativo de un caso falso positivo. Sobre la prueba de Rosa de Bengala hay que recalcar que es la prueba tamiz ms econmica, sencilla de realizar y til. Su superioridad sobre otras pruebas rpidas de aglutinacin se debe a que las brucelas estn resuspendidas en un tampn con un pH cido (pH 3,6) que evita la aparicin de fenmenos de zona y de bloqueo 14. Desde 1976, ao en el que demostramos la estrecha correlacin (r = 0,96; p < 0,001) entre los ttulos de se-

roaglutinacin y los de la prueba de Rosa de Bengala15, la utilizamos como prueba diagnstica. Cuando la prueba es positiva con el suero total, realizamos doble diluciones del mismo (desde 1:1 a 1:512) y se analiza cada dilucin. En la tabla 3 se exponen los resultados obtenidos con los sueros de 209 pacientes y con 105 muestras de suero tomadas del mismo nmero de personas sanas, pero que estaban en contacto con animales infectados (ganaderos, matarifes y veterinarios). Se observa que la prueba de Rosa de Bengala fue positiva en el 99,5% de los pacientes infectados, con ttulos iguales o superiores a 8 en el 93,3% de los casos. En contraste, en las personas sanas que por su oficio estaban o haban estado en contacto con animales infectados, la prueba de Rosa de Bengala fue positiva en el 20% de los casos, pero este porcentaje no es representativo de lo que debe ocurrir en la poblacin general, si tenemos en cuenta el estudio realizado en Navarra con 6.371 muestras de donantes voluntarios de sangre, que demostr que nicamente 33 (0,48%) resultaron positivos en la prueba de Rosa de Bengala6. Sin embargo, tambin pueden ocurrir casos falsos negativos. En la serie de pacientes estudiados en el ao 1976, el porcentaje de casos falsos negativos fue del 1,5% 15, pero este porcentaje puede aumentar en relacin con el tipo de preparacin comercial que se emplee, porque no todas son de la misma calidad8. Aglutinacin y prueba de Coombs. En los resultados obtenidos con la prueba de aglutinacin, llama la atencin que el ttulo del suero nmero 4 fue menor de 20, es decir, menor de 10 unidades internacionales (UI). Por lo tanto, este hecho indica, en primer lugar, que la propuesta del Comit de Expertos de la WHO en su tercer informe17, que recomienda

TABLA 2 Resultados de las pruebas serolgicas realizadas con los sueros de los pacientes analizados en las historias clnicas
SAT-M Nmero 1 2 3 4 5 RB 32 4 8 16 4 PBS 2.560 640 320 < 20 320 DTT 80 40 320 < 20 80 Coombs IgG Neg Neg 5.120 40.960 Neg IgA Neg Neg 1.280 20.480 1.280 FC 32 Neg 64 128 Neg Precipitacin IDR Pos Neg Neg Pos Neg CIEF 2/1 2/2 5/16 6/32 Neg Absorcin IgA NR 160 NR NR < 20 IgA+IgM NR 20 NR NR NR Dipstick IgM Pos Neg Neg Neg Neg IgG 40 160 1.280 NR < 40 ELISA IgA NR 640 NR NR 2.560

SAT-M y Coombs-M: pruebas realizadas en placas de microtiter; NR: prueba no realizada; Coombs negativo: significa que no aument el ttulo de la SAT-M con el antisuero anticadenas gamma o alfa; CIEF: nmero de bandas de precipitacin/ttulo. RB: Rosa de Bengala; FC: fijacin de complemento; PBS: amortiguador fosfatosalino, DTT: ditiotreitol; IDR: inmunodifusin radial, CIEF: contrainmunoelectroforesis; Neg: negativo; Pos: positivo.

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CASO CLNICO BRUCELOSIS: PARADIGMA DEL DIAGNSTICO MICROBIOLGICO

TABLA 3 Resultados de la prueba de Rosa de Bengala con sueros de pacientes y de personas en contacto con animales infectados
Ttulo 8 Personas Enfermos Contacto Total 210 105 Positivos 209 21 % 99,5 20 Positivos 195 1 % 93,3 0,9

considerar como ttulo diagnstico aquellos que son iguales o superiores a 100 UI no siempre es vlida, y en segundo lugar, que la confirmacin de un caso de brucelosis no puede estar basada en los resultados obtenidos con una sola prueba serolgica. Reddin et al12 en el ao 1965, teniendo en cuenta la capacidad que tienen los mercaptanos de reducir los enlaces disulfuro, propusieron realizar la prueba de aglutinacin en presencia de 2-mercaptoetanol (2ME), para diferenciar los anticuerpos IgM (sensibles) de los IgG (resistentes). Sin embargo, los resultados de la aglutinacin obtenidos con los sueros nmero 2 y nmero 5 en presencia de ditiotretiol (DTT) han confirmado los publicados recientemente11, y demuestran que la reduccin de los ttulos de aglutinacin en estos sueros se debi a la despolarizacin de los anticuerpos IgA (polimricos?). En efecto, en todos los sueros menos en el nmero 3 se observ una reduccin del ttulo de la seroaglutinacin en presencia de DTT, pero solamente en el suero nmero 1 se demostr la presencia de anticuerpos IgM con sistema de dipstick-IgM desarrollado por Smits et al18. Posteriormente se confirmaron estos resultados mediante un ELISA. El ttulo del ELISA del suero nmero 1 fue de 2.560 y del suero nmero 2 fue de 160 (resultados no incluidos en la tabla 2). Del mismo modo, mediante experimentos de absorcin con un suero anticadenas , con la consiguiente eliminacin de las inmunoglobulinas de la clase A, se demostr que el ttulo de aglutinacin del suero nmero 5 se redujo de 320 a menos de 20, sin embargo, para obtener el mismo efecto con el suero nmero 2 fue necesario absorberlo con sueros especficos anticadenas y ms anticadena . El problema que plantean estos resultados es que obligan a revisar el significado que han dado algunos autores de Amrica del Norte al fenmeno de la reduccin del ttulo de aglutinacin en presencia de un

mercaptano19, sobre todo si tenemos en cuenta que los anticuerpos IgM son los primeros en desaparecer tras el inicio del tratamiento20. Adems, la demostracin de que la capacidad aglutinante del suero nmero 5 se deba a la accin exclusiva de anticuerpos IgA, y que este suero fue obtenido de un paciente libre de signos y sntomas de brucelosis, obliga a prestar ms atencin a esta clase de anticuerpos en el futuro, con el fin de comprender su significado. Respecto a los resultados obtenidos con la prueba de Coombs hay que sealar que esta tcnica es vlida para determinar el nivel de anticuerpos no aglutinantes IgG e IgA, como ocurri con los sueros nmero 2 y 4. Sin embargo, cuando el nivel de los anticuerpos IgM e IgA aglutinantes supera el nivel de anticuerpos IgG o IgA (aglutinantes y no aglutinantes), el mejor mtodo para su cuantificacin es la utilizacin de una tcnica inmunoenzimtica. Por ejemplo, en los sueros nmero 1 y 2, en los que se reduca el ttulo de aglutinacin en presencia de DTT, se pudo demostrar mediante un ELISA-IgG la presencia de anticuerpos IgG no aglutinantes a ttulos bajos. Finalmente queremos sealar que los resultados obtenidos con las pruebas de aglutinacin y Coombs estn de acuerdo con lo descrito por Foz et al 21, que demostr repetidamente que en la fase aguda los ttulos de la prueba de Coombs pueden ser iguales o ligeramente superiores a los de la seroaglutinacin (sueros 1 y 2) y que, en los enfermos con un perodo largo de evolucin, los ttulos de la seroaglutinacin pueden ser iguales o menores de 160 (suero nmero 4), pero los de la prueba de Coombs los pueden superar en ms de 16 veces (suero nmero 4). Fijacin de complemento. La utilidad de esta reaccin fue confirmada repetidamente por Foz et al21. De los resultados descritos por este autor, el ms significativo fue la demostracin de que en los pa-

cientes con un tiempo corto de evolucin, y con ttulos de seroaglutinacin altos, la prueba de fijacin de complemento puede ser negativa. En efecto, en el suero nmero 2, que perteneca a un paciente con un mes de evolucin, la prueba de fijacin de complemento fue negativa. En este suero predominaban los anticuerpos aglutinantes IgA sobre los IgM e IgG, y si tenemos en cuenta que los IgA no fijan el complemento, se explica que con este suero la reaccin de FC fuese negativa. Del mismo modo se explican los resultados de la FC obtenidos con el suero nmero 5, en que su actividad aglutinante dependa slo exclusivamente de la presencia de anticuerpos IgA aglutinantes. Tcnicas inmunoenzimticas (ELISA). En primer lugar hay que decir que si la confirmacin serolgica de un caso sospechoso de brucelosis no se resuelve con el empleo de las tcnicas de seroaglutinacin y Coombs, tampoco se resuelve con el empleo de tcnicas inmunoenzimticas. Nosotros utilizamos esta tcnica como herramienta de trabajo, para resolver algunos de los problemas que a veces plantean los resultados obtenidos con las pruebas clsicas. Si se adopta un ELISA como nica prueba de diagnstico, es necesario tener en cuenta que debe ser estandarizada utilizando sueros de pacientes con brucelosis humana (con cultivos positivos y negativos), sueros de donantes sanos y de personas en contacto con animales. Tambin tendrn que decidir sobre el modo de expresar los resultados, pues no existe consenso en este sentido. Una forma, aunque ms costosa, es la realizacin de esta prueba empleando dobles diluciones del suero y expresar los resultados como se hace con los de la aglutinacin. Segn nuestra experiencia si se hace de esta forma, los mdicos comprenden mejor los resultados de un ELISA. Pruebas de precipitacin en gel. Polisacridos. Cuando se analiza una preparacin de LPS de B. melitensis biovariedad 1, mediante inmunoelectroforesis (fig. 1A) o doble difusin en gel (fig. 1B) con sueros humanos o de animales infectados, se puede observar la formacin de dos bandas de precipitacin. Una corresponde al LPS y la segunda al denominado hapteno nativo (HN)22. El HN es un homopolmero de formilperosamina, con la misma den3293

ENFERMEDADES INFECCIOSAS (I)

Fig. 1. Reacciones de precipitacin en gel. A: resultados del anlisis inmunoelectrofortico del lipopolisacrido (LPS) de B. melitensis biovar 1 utilizando sueros de conejos infectados con B. melitensis 16M (canal superior) y B. abortus 2308 (canal inferior). B: resultados de la prueba de Ouchterlony; pocillo central: suero de paciente con brucelosis, pocillos perifricos: 100, 50 y 25 g de LPS de B. melitensis 16M. C: resultados de la prueba de IDR realizada con placas (Ingezim Brucella IDR) preparadas por Ingenasa (Madrid). D: resultados de una prueba de CIEF realizada con un suero de un paciente con endocarditis y protenas citoslicas solubles en agua obtenidas de la cepa rugosa. B. melitensis 115. IDR: inmunodifusin radial inversa.

sidad epitpica y estructura que la cadena O, cuando sta se obtiene mediante hidrlisis cida del LPS, y con la que da una reaccin de total identidad en las pruebas de precipitacin en gel22. No es necesario utilizar de manera rutinaria una prueba de precipitacin en gel para la demostracin de anticuerpos frente al LPS, porque es ms sencillo hacerlo utilizando la prueba de Rosa de Bengala o seroaglutinacin. Sin embargo, como nunca hemos obtenido una reaccin de precipitacin positiva con frente al LPS con sueros de personas en contacto con brucelas, si es positiva indica con toda probabilidad de que se trata de un paciente con brucelosis. Una prueba que recomendamos realizar, si es posible, es la de inmunodifusin radial inversa (IDR), para el anlisis de la presencia de anticuerpos frente al NH (fig. 1C), porque la demostracin de la presencia de anticuerpos frente al HN en el suero de un paciente, segn nuestra experiencia, tiene el mismo significado que el de un hemocultivo positivo. Esta reaccin es positiva cuando existen anticuerpos de alta afinidad, que aparecen nicamente cuando se infectan animales o personas con clulas vivas, y nunca cuando se inmunizan animales con clulas muertas. En nuestra experiencia, esta prueba es positiva aproximadamente en el 40% de los casos de brucelosis y guarda correlacin con los resultados de los hemocultivos. Protenas citoslicas solubles en medios acuosos. Desde el ao 197123 venimos insistiendo en la utilidad de estudiar la presencia de anticuerpos frente a protenas citoslicas de Brucella, porque un resultado positivo indica que ha ocurrido o est ocurriendo un estmulo antignico intenso, y adems, porque no dan reaccin cru3294

zada con las protenas citoslicas de aquellas bacterias con las que las brucelas comparten epitopos comunes en su LPS. Sin embargo, recientemente hemos estudiado la presencia de anticuerpos frente a protenas de Brucella en 20 sueros de pacientes infectados con Bartonella hemselae que nos envi el profesor D. Raoult. Los resultados obtenidos demostraron que dos sueros fueron positivos en la prueba de contrainmunoelectroforesis (CIEF) realizada con las protenas de Brucella, pero en ninguno de los 20 se pudo poner en evidencia la presencia de anticuerpos frente al LPS de esta bacteria. Esta reaccin cruzada, entre protenas citoslicas de Brucella y Bartonella, se explica si tenemos en cuenta que el gnero Brucella est incluido en el subgrupo alfa-2 de la clase Proteobacteria, donde tambin estn incluidas las especies bacterianas anteriormente mencionadas24. Para la demostracin de anticuerpos frente a protenas utilizamos en la actualidad la tcnica de CIEF, porque los resultados se obtienen entre una y dos horas. La lectura de los resultados se debe hacer despus de lavar el gel durante 20 minutos en una solucin del 5% citrato trisdico, con el fin de eliminar las bandas de precipitacin inespecficas que a veces aparecen. La figura 1D es una reproduccin fotogrfica de los resultados de una CIEF rea-

lizada con un suero de un paciente con endocarditis. En este suero se podan contar hasta 12 bandas de precipitacin. Con esta tcnica no slo se analiza el nmero de bandas, sino que si se analizan distintas diluciones de suero, se puede calcular el ttulo de la dilucin mxima que desarrolla, al menos, una banda de precipitacin. Esto es importante porque el nmero de bandas y el ttulo dependen de la intensidad del estmulo antignico, y generalmente, con el tiempo de evolucin de la enfermedad. Con esta tcnica el porcentaje de sueros en los que se demuestran anticuerpos frente a protenas vara entre un 93,3%25 y un 100%26. Es ms, en la tabla 4 se exponen los resultados obtenidos con los sueros indicados en la tabla 3. Se observa que 6 muestras de suero, correspondientes al grupo de personas en contacto con animales, desarrollaron una banda de precipitacin cuando se emple el suero sin diluir, pero en el 94,3%de los enfermos el ttulo de la dilucin del suero que desarroll bandas de precipitacin en la CIEF fue igual o superior a 2. En relacin con los resultados obtenidos con los sueros objeto de nuestro anlisis, hay que sealar que esta prueba fue negativa con el nico suero (nmero 5) que no corresponda a un caso de brucelosis.

Diagnstico de la neurobrucelosis
Aunque no hemos presentado ningn caso de neurobrucelosis es necesario recordar que para realizar el cultivo del lquido cefalorraqudeo (LCR), la tcnica ms sencilla es inocular en un frasco de hemocultivo la mayor cantidad de lquido posible. Para la demostracin de anticuerpos en el LCR frente al LPS se pueden emplear las pruebas de Rosa de Bengala, seroaglutinacin, fijacin de complemento y Coombs25 y ELISA27. Tambin se pueden poner en evidencia anticuerpos frente a protenas citoslicas mediante CIEF y

TABLA 4 Resultados de la prueba de contrainmunoelectroforesis con sueros de pacientes y de personas en contacto con animales infectados
Ttulo 2 Personas Enfermos Contacto Total 210 105 Positivos 194 4 % Positivos 183 0 % 94,3 0

CASO CLNICO BRUCELOSIS: PARADIGMA DEL DIAGNSTICO MICROBIOLGICO

TABLA 5 Pauta a seguir para realizar un diagnstico de brucelosis humana
Ante un enfermo con fiebre de origen desconocido o con sntomas y signos que puedan corresponder a un cuadro de brucelosis humana, para poder orientar el diagnstico es conveniente: 1. Investigar en la anamnesis Profesin (veterinario, pastor, matarife, etc.) Contacto con animales (fundamentalmente cabras y ovejas) Tipo de producto lcteo ingerido (pasteurizado o no) Viajes a zonas endmicas Si anteriormente ha sido diagnosticado de fiebre de Malta Si manifiesta sentir dolores articulares 2. Laboratorio Solicitar la realizacin inmediata de una prueba de Rosa de Bengala a. Si es positiva: realizar los hemocultivos pertinentes y completar el estudio serolgico con el resto de las pruebas que que se empleen en el laboratorio b. Si es negativa: consultar con el laboratorio. Nuestro consejo es que si existen datos epidemiolgicos y sntomas y signos de sospecha, se deben realizar los hemocultivos y completar el estudio serolgico con otras pruebas

TABLA 6 Hemocultivo en la brucelosis

Siempre debe realizarse El porcentaje de hemocultivos positivos vara entre el 86,5% (pacientes febriles) y el 28,5% (enfermos apirticos) (Ariza, Tesis doctoral) En los laboratorios sin cabinas de seguridad biolgica deben utilizarse frascos de cultivos bifsicos (Ruiz-Castaeda). Evitan las resiembras a ciegas y el riesgo de infecciones Si se realizan tinciones de muestras de los hemocultivos, emplear el mtodo de Zhiel-Neelsen modificado por Stamp Los pacientes deben de estar si tomar antibiticos En los casos de recidivas, repetir los hemocultivos

Algunas biovariedades de B. abortus necesitan 10% de CO2. No deberan de deshecharse los frascos negativos antes de 30 das Las cepas de Brucella son parcialmente cido-alcohol resistentes

fijacin de complemento 25, ELISA e inmunoblotting28.

Evolucin de las pruebas serolgicas

Ha sido demostrado20 que existe correlacin entre los ttulos de seroaglutinacin y ELISA IgM al inicio de la enfermedad, y que nicamente en el 6,6% de los pacientes no se puede demostrar la presencia de anticuerpos IgM. Una vez iniciado el tratamiento, los anticuerpos IgM son los que descienden con mayor rapidez y existe una correlacin entre los resultados del ELISA-IgG e IgA con la prueba de Coombs. En el 85% de los pacientes se demuestran ttulos altos de anticuerpos IgG e IgA hasta los 18 meses despus de la desaparicin de los sntomas y signos clnicos de la enfermedad y las recidivas se caracterizan por un aumento del nivel de anticuerpos IgG e IgA, y no de IgM. En nuestra experiencia la primera prueba que se negativiza tras iniciar el tratamiento es la IDR con HN, despus la de doble difusin en gel con LPS, seguida de la seroaglutinacin y de las pruebas que detectan anticuerpos IgM (ELISA IgM y DipstrickIgM). Las pruebas de Coombs-IgG y el ELISA IgG pueden permanecer positivas a

ttulos bajos durante ms de dos aos, y en muchos casos de contacto con brucelas, en los que los ttulos de la seroaglutinacin son muy bajos o negativos, los de la prueba de Coombs y ELISA pueden plantear problemas de interpretacin. En estos casos, en los que no existen sntomas de enfermedad la prueba de CIEF es negativa. En relacin con los anticuerpos antiprotenas citoslicas, hay que tener en cuenta que su nivel desciende lentamente, que en ocasiones, su presencia se puede demostrar a los 12 meses de haber finalizado el tratamiento y que aumentan en las recidivas. Finalmente no hay que olvidar que existen situaciones que plantean problemas, como la interpretacin del hallazgo de un nivel bajo de anticuerpos IgG no aglutinantes mediante las pruebas de Coombs y ELISA-IgG, en pacientes tratados sin sntomas o signos de brucelosis, o en personas que han estado en contacto con brucelas, as como la interpretacin de manifestaciones clnicas muy difcil de cata-

logacin que presentan algunos pacientes tratados, y en los que los resultados de las pruebas serolgicas no son significativos29.

Conclusin
Hemos revisado los mtodos de cultivo y algunas de las numerosas pruebas serolgicas que pueden ser utilizadas en el diagnstico de la brucelosis humana. Es indudable que la investigacin dirigida a mejorar los mtodos de diagnstico debe proseguir, pero tambin es cierto, que utilizando racionalmente las pruebas que poseemos, junto con un anlisis exhaustivo de la historia epidemiolgica y clnica del paciente, es posible establecer un diagnstico correcto en el 99% de los casos (tablas 5, 6, 7 y 8). Pero no queremos dejar de llamar la atencin sobre el hecho de que en las dcadas de los aos 70 y 80 esta enfermedad la padecieron en Espaa miles de personas, y adems que las brucelas son microor-

TABLA 7 Otras muestras biolgicas en el diagnstico de brucelosis

Lquido cefalorraqudeo Pus de abscesos, exudados y tejidos Muestras contaminadas No centrifugar. Inocular 1 o 2 ml en un frasco de hemocultivo Inocular placas de agar sangre y chocolate, tambin si es posible, un frasco de hemocultivo Inocular placas de medio selectivo (medio de Farrell y de Thayer-Martin con colistina, vancomicina, nistatina y nitrofurantona18 Al menos 5 das. Las colonias comienzan a ser visibles a los tres das Trabajar siempre en cabinas de seguridad biolgica tipo II Es importante saber si una cepa de Brucella aislada de un veterinario corresponde a B. melitensis Rev 1 o B. abortus 19. Guardar las cepas aisladas para poder estudiar su sensibilidad a nuevos antibiticos, factores de virulencia, etc.

Incubacin Atencin Identificacin a nivel de gnero: son cocobacilos gramnegativos, Stamp positivos, oxidasa y ureasa positivos y aglutinan con un suero anti-Brucella. Enviar a un laboratorio de referencia para su identificacin a nivel de especie y biovariedad

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ENFERMEDADES INFECCIOSAS (I)

TABLA 8 Estudio serolgico de la brucelosis
1. Pruebas serolgicas que detectan anticuerpos frente al LPS Casos agudos: Rosa de Bengala, seroaglutinacin en tubo o en microplaca. ELISA-IgM o Dipstick-IgM. Si es posible, analizar la presencia de anticuerpos frente al hapteno nativo Casos subagudos (tambin los denominados crnicos): Rosa de Bengala, SAT en tubo o en microplaca, FC, Coombs, IgG o ELISA IgG. Si es posible, analizar la presencia de anticuerpos frente al hapeno nativo 2. Pruebas serolgicas frente a protenas citoslicas En todos los casos: Contrainmunoelectroforesis
LPS: lipopolisacrido; SAT: seroaglutinacin; FC: fijacin de complemento; CIEF: contrainmunoelectroforesis.

ganismos de multiplicacin intracelular facultativos. Como no se sabe si con el tratamiento especfico se logra erradicar en un determinado paciente todas las bacterias fagocitadas, tampoco sabemos el nmero de personas en las que ocurrir durante los prximos aos alguna de las complicaciones tpicas de esta enfermedad. La publicacin de Ariza et al28 es un ejemplo claro y representativo de esta idea.

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