Introduccin a los Cultivos Celulares

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Un poco de historia
1880-1910: Primeros ensayos de sobrevida de clulas fuera de organismos enteros (Roux, Haberlandt, etc.) 1907: El zologo americano R.G. Harrison es considerado el iniciador de los cultivos de tejidos animales.
Fue el primero que emple tcnicas in vitro para el estudio de fenmenos in vivo, realizando cultivos de mdula espinal embrionaria de anfibios. Pudo observar el crecimiento de los axones de los neuroblastos, y estableci que el axn se formaba por expansin a partir del cuerpo neuronal y no por fusin de una cadena de clulas. El cultivo se realizaba en una gota de linfa del anfibio que colgaba de un cubreobjetos sobre una cmara sellada. 100 aos de Cultivos Celulares

Un poco de historia
1920-1940: Se establecen lneas celulares de diversos rganos animales 1940-1955:
Se replican virus sobre clulas cultivadas Se producen las primeras vacunas virales en cultivos celulares Se definen las condiciones para congelar clulas en nitrgeno lquido (Alan Parks, 1949) Se establece la lnea HeLa (1 de origen humano, 1952) Se desarrollan los primeros medios de cultivo qumicamente definidos Se cultivan las primeras clulas de insectos

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Un poco de historia
1960s: Se desarrollan las tcnicas de hibridizacin en cultivos 1970s:
Los cultivos celulares se incorporan a la ingeniera gentica Desarrollo de grandes reactores de cultivos en suspensin

Reciente:
Modificacin gentica controlada de clulas Desarrollo de medios de cultivo libres de suero Desarrollo de medios de cultivo libres de componentes animales

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Cultivos celulares Propagacin de clulas fuera del organismo de origen Pueden ser de origen vegetal o animal, y dentro de stas, pueden provenir de distintos tejidos de vertebrados o invertebrados Los cultivos celulares producen clones, por lo que todas las clulas de un cultivo poseen el mismo genotipo, excepto que se produzcan mutaciones durante el proceso

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Para qu cultivar clulas in vitro ?

Investigacin
Comprender la fisiologa celular Toxicologa, virologa, etc.

Ingeniera de tejidos
Piel, hgado Hueso y cartlago

Produccin de biolgicos
Anticuerpos monoclonales Hormonas (FSH) Enzimas Vacunas virales (polio, aftosa, parvo, moquillo, etc.)

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Ventajas
Un solo tipo bien definido de clulas en cada cultivo Fcil de manipular, condiciones controladas Establecimiento de lneas internacionales de fcil acceso Alternativa al uso de animales
Sistema para estudiar principios fisiolgicos Chequeo posterior en un nmero reducido de animales

Pueden obtenerse grandes cantidades de clulas Permite trabajar en pequea, media y gran escala Las clulas pueden mantenerse congeladas por largos perodos de tiempo con mnima prdida de viabilidad
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Sin embargo... Cuidado que no son animales enteros

Las clulas no estn organizados en verdaderos tejidos No hay interrelacin con otros tejidos El comportamiento es distinto a la organizacin tridimensional

El entorno es distinto Las condiciones de crecimiento son distintas Las conclusiones de los ensayos deben ser debidamente acotadas
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Componentes de un cultivo

CLULAS

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Tipos de cultivo
Cultivo primario: clulas, tejidos u rganos tomados directamente de un animal. Cultivo de rganos, explantes: mantenimiento de rganos o parte de rganos in vitro. Cultivo de tejidos: mantenimiento de tejidos in vitro. Cultivo de clulas: mantenimiento de clulas dispersas. Lneas celulares: clulas mantenidas por subcultivos sucesivos comenzando por un cultivo primario. Cultivos continuos: clulas que han logrado sobrevivir a muchos subcultivos. Expectativa de vida infinita.
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Lneas celulares contnuas: algunos ejemplos

BHK: Fibroblastos de rin de hamster sirio dorado CrFK: Fibroblastos de rin de gato domstico MDCK: Epitelio de rin canino (Cocker Spaniel) CHO: Epitelio de ovario de hamster chino VERO: Fibroblastos de rin de mono verde africano HeLa: Epitelio tumoral de cuello uterino humano MDBK: Epitelio de rin de bovino adulto HUVEC: Endotelio de vena umbilical humana FHBE: Endotelio de corazn fetal bovino Etc., etc., etc.

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Colecciones internacionales ms importantes

Sigla ATCC DSMZ ECACC GEIMM Nombre u organismo
American Type Culture Collection Human and Animal Cell Cultures

Ciudad, pas
Minassas, USA Braunschweig, Alemania

N de cultivos

800 500 1000 2300

European Collection of Cell Salisbury, Cultures Wiltshire, UK Istituto Giannina Gaslini Genova, Italia

Fuente: www.biotech.ist.unige.it/cldb/indexes.html

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Banco de clulas espaol

El Banco Nacional de Lneas Celulares se configura como una estructura en red con varios nodos coordinados por un central, que tendr como objetivo garantizar en todo el territorio nacional la disponibilidad de lneas de clulas troncales humanas embrionarias y adultas para la investigacin biomdica. El Banco de Lneas Celulares est adscrito a la Subdireccin General de Investigacin en Terapia Celular y Medicina Regenerativa del Instituto de Salud Carlos III, Link a la Web del Banco Nacional de Clulas:
http://www.cultek.com/link/link.asp?link=http://www.isciii.es/htdoc s/terapia/terapia_bancocelular.jsp 100 aos de Cultivos Celulares

Componentes de un cultivo

SOPORTE

CELULAS

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Soporte

Lquido: Clulas en suspensin

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Bioreactores

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Soporte Slido: Clulas adheridas a superficies plsticas, membranas, polmeros, vidrio etc.

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Otros soportes de Cultivo

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Soporte
Titulacin de virus en microplacas con tincin final

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Soporte Superficies cubiertas con sustancias que favorecen el crecimiento celular

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Microcarriers

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Extrado de From Space to the Clinical Bedside En Internet: slsd.jsc.nasa.gov/bso/resources/ lectures/npLectureMechCulture.pdf

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Componentes de un cultivo

SOPORTE

FASE GASEOSA

CELULAS

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Fase gaseosa La concentracin de oxgeno necesaria depende de los requisitos de las clulas La concentracin de dixido de carbono depende de la capacidad buffer del medio de cultivo Usualmente el equilibrio dixido de carbono (en la fase gaseosa) - bicarbonato (en la fase lquida) acta como buffer del cultivo

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Componentes de un cultivo

SOPORTE

FASE GASEOSA

CELULAS

Materiales

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Medios de cultivo celulares

CUALIDADES: Especfico para la clula a cultivar Nutritivo pH adecuado Capacidad buffer Isotnico Estril

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Componentes de los medios de cultivo

Agua Sales Glucosa cidos grasos Vitaminas Suero Pptidos Micro y oligoelementos Aminocidos esenciales Factores de crecimiento Otro regulador de pH Indicador de pH Antiespumante Antibiticos?

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Organizacin de un subcultivo
El objetivo de un subcultivo (pasaje) es mantener las clulas en condiciones de replicacin normal. En el subcultivo se renueva el medio de cultivo y se lleva la relacin clulas/medio/superficie de soporte, a la inicial. Las clulas adheridas a soportes slidos deben ser primero despegadas de este soporte y separadas enzimticamente (tripsina). Luego se resuspenden, se tien con colorante vital (Azul Tripan) y se cuentan en cmara de Neubauer. Si se parte de un cultivo de clulas en suspensin directamente se procede a contar las clulas.
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Organizacin de un sub-cultivo Una vez conocida la concentracin de clulas en el material de origen, se definen las condiciones del subcultivo deseado y se realiza el pasaje.
Ejemplo
Material de origen: 2x106 cl/ml Destino: tres botellas de 175 cm2 con una concentracin inicial de 35000 cl/cm2 Necesidad: 3 x 175 x 35000 = 1.8x107 clulas 1.8x107 clulas / 2x106 cl/ml = 9 ml ( 3 ml / botella )

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Factores crticos Suero:

Ventajas: Gran aporte de nutrientes bsicos, protenas, factores de crecimiento, hormonas, promotores de adhesin, inhibidores enzimticos, etc. Desventajas: Composicin indefinida, variabilidad entre lotes, interferente en procesos de purificacin de protenas, interferente en procesos de multiplicacin viral, vehculo de entrada de contaminaciones, etc.

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Factores crticos Temperatura de cultivo: depende del origen de las clulas. Mamferos: 37C, peces e insectos: 18-22C, aves: 38.5C, etc. Contaminaciones: gran complicacin en los laboratorios de cultivos celulares, principalmente a escala industrial. Pueden ser por levaduras, hongos miceliares, virus, bacterias, micoplasmas, otras clulas, etc.

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Factores crticos no biolgicos Orden Limpieza Higiene personal Vigilancia microscpica Estudio adecuado de los problemas Anlisis de problemas potenciales Trazabilidad de los cultivos Protocolizacin exhaustiva

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Equipamiento Adems del equipamiento usual de cualquier laboratorio, se requiere:

Microscopio invertido Cmara de conteo de clulas Flujo laminar de caractersticas adecuadas al trabajo a desarrollar Sistema de filtracin esterilizante de soluciones, lquidos y medios de cultivo Material de soporte estril Espacio fro de 4, -20, -75 y 196C Estufas de cultivo con o sin atmsfera de CO2
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Componentes de un cultivo

SOPORTE

FASE GASEOSA

CELULAS
Catlogo Materiales

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Medios de cultivo Medios para Cultivo Celular

Hyclone, pinche aqu Biochrom, pinche aqu.

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Agitacin
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Reactor de produccin de hibridomas

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Manejo de lquidos
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Cultivos robotizados
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Despegador celular magntico-mecnico

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Cabinas de flujo laminar

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Incubadores de CO2
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Congeladores -80 C
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Almacenamiento de muestras
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Oferta completa para Cultivos Celulares

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SOPORTE

FASE GASEOSA

CELULAS
Catlogo Materiales Aplicaciones actuales

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Hibridomas: produccin Anticuerpos Monoclonales

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Celulas Madre (Stem Cells)

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Fertilizacin In Vitro
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Soporte tcnico
(pinche sobre imagen)

Manuales Protocolos Referencias Guas de ususario Artculos tcnicos

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Nuestras marcas
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Seminarios conmemorativos del Centenario de las tcnicas de Cultivo Celular

Seminarios conmemorativos del Centenario de Cultivos Celulares (pinche para ver el programa)

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