CHNG 2: I CNG V MI TR NG DINH D NG GENERAL ABOUT NUTRITIONAL MEDIUM

Mi tr ng l y u t quan tr ng cho s sinh tr ng v pht tri n c a m t

bo, l ngu n cung c p cc d ng ch t c n thi t nh m duy tr s s ng, sinh tr ng v pht tri n c a t bo trong qu trnh nui c y. S d Haberlandt, ng i u tin

x ng phng php nui c y m v t bo th c v t (1902), khng thnh cng trong cc th nghi m c a mnh v lc b y gi nh ng hi u bi t v nhu c u dinh d ng khong c a t bo th c v t cn h n ch v i u khi n sinh tr ng c bi t y . c bi t l vai tr c a cc ch t

i v i qu trnh phn chia v phn ha c a t bo cn cha

n nay, theo th ng k cc k t qu nghin c u th h u h t cc nui c y m v t bo th c v t

mi tr ng dinh d ng nhn t o c s d ng u bao g m nh ng thnh ph n sau:

2.1. Cc nguyn t mu i khong (mineral element) C nhi u lo i nguyn t mu i khong khc nhau c n thi t cho v t c cung c p d i d ng a l ng v vi l ng. Cc nguyn t nguyn t c s d ng n ng i s ng th c a l ng l cc

l n hn 0,5 mmol/L, cn cc nguyn t vi n ng nh hn 0,05 mmol/L. Khi cc

l ng l cc nguyn t mu i khong

c s d ng

c ha tan trong n c, chng tr i qua qu trnh phn ly

(dissociation) v ion ha (ionisation). Trong mi tr ng dinh d ng, m t lo i ion c th c t o ra b i m t ho c nhi u lo i mu i khc nhau. V d : trong mi

tr ng MS, ion c k t h p b i KNO3 v NH4NO3, ion K+ b i KNO3 v KH2PO4. Do , y l i u quan tr ng cch nh gi n ng so snh cc mi tr ng khc nhau b ng

t ng s c a cc ion hi n di n trong chng nh m c c

m t t ng v s thch h p c a mi tr ng cho cc m ho c cc h th ng nui c y c bi t. a l ng a l ng bao g m su nguyn t : nitrogen (N),

2.1.1. Cc nguyn t

Cc ch t dinh d ng

phosphorus (P), potassium (K), calcium (Ca), magnesium (Mg) v sulphur (S) t n t i d i d ng mu i khong, l thnh ph n c a cc mi tr ng dinh d ng khc nhau. T t c cc nguyn t ny l r t c n thi t cho sinh tr ng c a m v t bo th c v t. Mi tr ng nui c y ph i ch a t nh t 25 mmol/L nitrate v potassium. Tuy nhin, h u h t cc nghin c u u cho th y ngu n N cung c p trong mi

tr ng d i c 2 d ng nitrate v ammonium (2-20 mmol/L) l t t hn c . Trong tr ng h p ch dng ammonium, th c n ph i b sung thm m t acid d ng m ch vng (cycle acids), tricarboxylic acid ho c m t s acid khc n a (d ng mu i), nh: citrate, succinate, ho c malate sao cho m i nh h ng c do n ng c a

ammonium v t qu 8 mmol/L trong mi tr ng c gi m b t. Khi cc ion nitrate v cng hi n di n trong mi tr ng nui c y, th ion ammonium c s d ng nhanh hn. Cc nguyn t chnh khc, nh: Ca, P, S v Mg, n ng dng trong kho ng 1-3 mmol/L. 2.1.2. Cc nguyn t vi l ng Cc nguyn t v c c n m t l ng nh nhng khng th thi u cho sinh tr ng c a m v t bo th c v t c g i l cc nguyn t vi l ng (n ng d ng nh hn 0,05 mmol/L). s th ng

l cc ion: iron (Fe), manganese (Mn), zinc (Zn),

boron (B), copper (Cu), v molybdenum (Mo). Fe d ng nh thch h p hn khi c cung c p d i d ng chelate Fe, v Zn c dng bnh th ng trong cc mi tr ng nui c y. Cc d ng mu i tatrate v citrate Fe kh ha tan v th ng hay k t t a trong mi tr ng. V n ny c th kh c ph c b ng cch dng

diaminetetraacetic acid (EDTA)-chelate Fe thay cho citrate Fe,

c bi t

i v i qu nh trong

trnh t o phi. Tuy nhin, cc d ng chelate EDTA khng hon ton n mi tr ng nui c y d ng l ng.

M t s mi tr ng nui c y c lm giu b ng cobalt (Co), iodine (I) v sodium (Na), nhng cc yu c u nghim ng t v cc nguyn t ny cho sinh tr ng c a t bo khng c thi t l p. Ni chung, n ng d ng th ng c s

i v i Cu v Co l 0,1 mol/L, Fe v Mo l 1 mol/L, I l 5 mol/L, Zn l

5-30 mol/L, Mn l 20-90 mol/L v B l 2-5100 mol/L c b sung vo mi tr ng nui c y ty thu c vo yu c u c a t ng th nghi m. Nhu c u c a cy i v i nguyn t vi l ng l r t th p. Do v y nh ng cc n ng tng ng. H u h t cc

nguyn t ny cng c m t trong mi tr ng nguyn t vi l ng s d ng

l ng nmol. M t s nguyn t vi l ng c nhu c u

nh hn c th thay th d dng b ng s l n t p ng u nhin c a chng trong cc thnh ph n c a mi tr ng nh agar, cc ch t b sung nh n c d a, d ch chi t n m men (yeast extract), cc mu i v n c. T m quan tr ng c a m t s nguyn t vi l ng trong thnh ph n mi tr ng cn cha c hi u m t cch r rng. Co, Al, Ni... c th c l i i v i th c v t nhng cng c th l khng c n thi t. Trong

th c t , h u h t cc nguyn t vi l ng ch c ph n khong c a mu i (cation) l quan tr ng, cn vai tr cc anion c th l khng c n thi t 2.2. Ngu n cacbon (Cacbon source) Do c u trc khng hon ch nh nh c th th c v t trong t nhin nn h u h t cc m v t bo th c v t nui c y in vitro s ng ch y u theo phng th c d d ng, m c d nhi u tr ng h p chng c th s ng bn d d ng nh i u ki n

nh sng nhn t o v l c l p c kh nng quang h p. V v y, vi c a vo mi tr ng nui c y ngu n carbon h u c l i u b t bu c cung c p nng l ng.

Th m ch cc m b t

u l c ha ho c hnh thnh di p l c t d i cc i u ki n

c bi t trong su t qu trnh nui c y khng t d ng carbon. Vi c b sung ngu n carbon bn ngoi vo mi tr ng lm tng phn chia t bo v ti sinh cc ch i xanh. Ngu n carbon thng d ng nh t c ki m ch ng l sucrose, n ng thch h p ph bi n l 2-5%, song cng cn ph thu c vo m c ch nui c y m thay i c khi gi m xu ng t i 0,2% (ch n dng t bo) v tng ln n 12% (c m

ng stress n c). S th y phn t ng ph n sucrose xu t hi n khi mi tr ng c kh trng. Cc t bo v m nui c y sinh tr ng trn mi tr ng c sucrose c kh trng b ng autoclave t t hn trn mi tr ng c sucrose c kh trng b ng mng l c (filter). i u ny cho th y cc t bo thch h p v i ngu n d tr c s n c a glucose v fructose do th y phn sucrose khi kh trng b ng autoclave.

Glucose cng th ng c b sung vo mi tr ng nui c y v cho hi u qu tng ng sucrose (glucose th ng dng cho nui c y

protoplast), cn fructose cho hi u qu km hn. Sucrose, trong khi kh trng mi tr ng, b bi n t bo, i thnh glucose v fructose. Trong qu trnh s ng c u c s d ng v sau l fructose. Cc

u tin glucose s

carbohydrate khc, nh: lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose, melibiose v trehalose cng c th nghi m, nhng t ra km hi u qu v ch c dng trong nh ng tr ng h p c bi t.

Cc d ng polysaccharide nh tinh b t, pectine, dextrine cng c th dng cho nui c y, tuy nhin nh ng lo i t bo c nui trn mi tr ng c ch a m t trong cc polysaccharide trn nh t nh ph i th hi n kh nng

th y phn thng qua cc enzyme ch ng h n nh amylase. Trong th c t , c nh ng ch ng t bo nui c y gi i phng ra mi tr ng ch a tinh b t kh

nhi u amylase. Chuy n chng ln mi tr ng ch ch a sucrose l ng amylase th i ra s gi m ngay. Glycerin cng c th c t bo s d ng. Mannitol ho c sorbitol hon

ton trung tnh v khng thm nh p vo bn trong t bo, nhng chng c s d ng r ng ri trong nui c y huy n ph v nui c y protoplast v i ch c nng l ch t n c dng nh p su t th m th u, ho c tng t sucrose chng cng

c m ng stress n c. Cc lo i r u nh ethanol, methanol t c.

hi u qu , cn propanol v butanol th r t

Acid h u c th ng khng ph i l ngu n carbon thch h p cho t bo nui c y. Th nghi m v i cc acid: folic, succinic, pyruvic v keto-glutaric ch t 15% sinh tr ng so v i sucrose.

2.3. Cc vitamin (vitamines) Th c v t t t ng h p cc vitamin v chng c s d ng nh nh ng ch t xc tc trong cc qu trnh trao i ch t khc nhau. Khi cc t bo v m

th c v t sinh tr ng trong i u ki n in vitro, m t s vitamin khng th thay th c t ng h p nhng th ng khng v l ng, do ph i b sung

thm t bn ngoi vo,

c bi t l cc vitamin thu c nhm B (B1, B2, B6).

2.3.1 Vitamin B1 (Thiamin) Thiamin l m t vitamin cn b n c n thi t cho s tng tr ng c a t t c cc t bo. Thiamin th ng c s d ng v i n ng bi n thin t 0,1-10

mg/l. L m t ch t b sung r t c n cho mi tr ng nui c y. Khi kh trng b ng cch h p nhi t cao vit B1 b nhi t phn thnh pyrimidin v thiazol

l hai c u t c a vit B1, nhng t bo nui c y c kh nng t ng h p l i

chng thnh phn t vit B1. V v y c th kh trng mi tr ng ch a vit B1 b ng autoclauve. 2.3.2. Vitamin B2 (Riboflavin, Lactoflavin) C th kh trng b ng nhi t, nhng l i d b nh sng phn hu . nui c y sng ch dng n ng th tng ln 10-50 ppm. 2.3.3. Vitamin B6 (Pyridoxine, Adermin) Pyridoxine th ng c b sung vo mi tr ng nui c y nhng cng khng c n thi t cho s tng tr ng c a t bo nhi u loi th c v t. L ti n ch t c a pyridoxal-phosphate-cofactor c a cc nhm enzyme nh carboxylase v transaminase. Khi kh trng nhi t cao ph n ng x y ra nh sau: 0,01 ppm, nhng iv i

i v i nui c y trong t i c

Pyridoxin + Phosphat Pyridoxalphosphate 2.3.4. Myo-Inositol (Bios I) M c d y l m t carbohydrate ch khng ph i l vitamin, n c ch ng minh c tc d ng kch thch cho s tng tr ng c a t bo a s loi th c v t. Ng i ta cho r ng myo-inositol ascorbic v peptine v c c phn tch ra thnh acid

ng ha thnh phosphoinositide v

phosphatidylinositol c vai tr quan tr ng trong s phn chia v t ng h p thnh t bo t bo. Myo-inositol th ng c s d ng trong mi tr ng nui c y m v t bo th c v t n ng 50-5000 mg/l. Inosit l ch t b n v ng

khi kh trng. Myo-inositol th ng c pha chung v i dung d ch m c a vitamin. Khi phn tch thnh ph n c a n c d a ng i ta th y s c m t c a phn t inosit.

2.3.5. Biotin (Bios II) C n thi t cho s phn bo c a m t s lo i m. Ch s d ng th p t 0,001-0,01 ppm. 2.3.6. Acid pantothenic (Bios III, Vit B5) c t bo th c v t s d ng trong thnh ph n c a coenzyme A. Trong nui c y m t s t bo th vi c b sung vit B5 l khng c n thi t. 2.3.7. Cc vitamin khc Nicotinic acid v pyridoxine th ng c b sung vo mi tr ng nui c y nhng c th thay th b ng cc vitamin khc cho s sinh tr ng c a t bo nhi u n ng r t

loi. Cc vitamin khc nh folic acid, ascorbic acid, vitamin E (tocophenol), v aminobenzoic acid cng c s d ng trong nui c y m v t bo, bo sinh tr ng m t c bi t khi t

qu n th r t th p. Ni chung, cc vitamin ny c b

sung trong kho ng 0,1-10,0 ppm.

2.4. Cc ch t h u c b sung (additional organics) 2.4.1. Cc amino acid M c d t bo c kh nng t ng h p t t c cc amino acid c n thi t nhng s b sung cc amino acid vo mi tr ng nui c y l tng tr ng c a t bo trong nui c y protoplast v bo. Vi c s d ng amino acid kch thch s

hnh thnh cc dng t

c bi t quan tr ng trong mi tr ng nui c y

t bo v nui c y t bo tr n. Amino acid cung c p cho t bo th c v t ngu n amino acid s n sng cho nhu c u c a t bo v ngu n nitrogen ny c t bo h p thu nhanh hn nitrogen v c.

Cc ngu n nitrogen h u c th ng s d ng trong mi tr ng nui c y t bo th c v t l h n h p amino acid nh casein hydrolysate, L-glutamine, L-asparagine v adenine. Khi amino acid c cung c p ring r th c n ph i c n th n v n c th c n tr s tng tr ng c a t bo. M t v d v amino acid trong mi tr ng nui c y lm tng s tng tr ng c a t bo l glysine 2 mg/l, glutamine n 8 mM, asparagine 100 mg/l, L-arginine v cysteine 10 kch thch s

mg/l v L-tyrosine 100 mg/l. Tyrosine cng c s d ng

pht sinh hnh thi trong nui c y t bo nhng ch nn s d ng trong mi tr ng c agar. Cung c p adenine sulfate vo mi tr ng nui c y c th kch s tng tr ng c a t bo nui c y v kch thch m nh s t o ch i. D a vo nh ng k t qu phn tch cc h n h p ch t t nhin ni trn nhi u tc gi ra nh ng cng th c pha ch h n h p amino acid nhn t o

b sung vo mi tr ng dinh d ng. K t qu s d ng cc h n h p ny cn r t khc nhau, c th do yu c u amino acid c a t ng lo i t bo l khng gi ng nhau. Trong mi tr ng l ng nui callus la v mi tr ng ti sinh

cy la t callus th proline l m t thnh ph n quan tr ng 2.4.2. Cc ch t h u c b sung c thnh ph n khng xc a/ N c d a Cng b u tin v s d ng n c d a trong nui c y m thu c v Van nh (undetermined)

Overbeek v c ng s (Van Overbeek cs, 1941,1942). Sau , tc d ng tch c c c a n c d a trong mi tr ng nui c y m, t bo th c v t c nhi u tc gi ghi nh n. N c d a c xc nh l r t giu cc h p ch t

h u c, ch t khong v ch t kch thch sinh tr ng (George, 1993; George, 1996). N c d a c s d ng kch thch phn ha v nhn nhanh ch i

nhi u loi cy. N c d a th ng c l y t qu c a cc gi ng v cy ch n l c s d ng ti ho c sau b o qu n. N c d a c m t s cng ty

ho ch t bn d i d ng ng chai sau ch bi n v b o qu n. Thng th ng n c d a c x l lo i tr cc protein, sau c l c qua mng l c

kh trng tr c khi b o qu n l nh. T n d protein trong n c d a khng gy nh h ng n sinh tr ng c a m ho c t bo nui c y, nhng c th d n t i c l c b ho c

k t t a dung d ch khi b o qu n l nh. Ch t c n c th l ng d i y bnh r i g n b ph n c n. Phn tch thnh ph n c a n c d a t non d a c:

n gi cho th y trong n c

- Amino acid t do t 190,5-685,0 ppm trong n c d a t non n gi. Khi kh trng nhi t cao cn l i kho ng 70 ppm.

- Amino acid trong protein. - Acid h u c. - ng. - RNA v DNA . Ngoi ra, n c d a cn ch a cc h p ch t quan tr ng bo nui phn l p nh: - myo-inositol. - Cc h p ch t c ho t tnh auxin. - Cc cytokinin d ng glycoside. N c d a th ng c s d ng n ng t 5 n 20 % (v/v). iv it

b/ D ch chi t n m men (yeast extract-YE)

V i d ch n m men, White (1934) l n

u tin nui thnh cng r c chua

trong ng nghi m ko di v th i h n. Thnh ph n ha h c c a d ch n m men t c ch phn tch. Ch y u ch a: ng, nucleic acid, amino acid, vitamin, auxin, mu i khong. Tc d ng c a YE v i r r t t t nhng v i callus th khng r rng. c/ B t chu i B t chu i kh ho c b t nghi n t qu chu i xanh c s d ng trong nui c y m m t s cy tr ng nh phong lan, d a. Hm l ng s d ng vo kho ng 40g b t kh/l. cch t t r i khu y trnh ng c c, c n b sung b t vo dung d ch m t u. N c chi t t kho ng 100 g th t qu chu i xanh

cng c s d ng b sung vo mi tr ng. d/ M t s h n h p dinh d ng h u c ph c t p khc N c c t c chua, d ch chi t khoai ty nghi n, d ch chi t m ch nha, casein thu phn (casein hydrolysate, th ng c s d ng v i n ng 0,1%) cng c s d ng 0,05-

lm tng s pht tri n c a m s o hay c quan i t ng.

nui c y. nh h ng r r t c a cc h p ch t ny ty thu c vo 2.4.3. Than ho t tnh (active choral)

Than ho t tnh ni chung nh h ng trn 3 m t: ht cc h p ch t ht cc ch t i u ha sinh tr ng ho c t o

c,

t i cho mi tr ng. Ng i ta

cho r ng tc d ng c n s tng tr ng c a m c y khi c s hi n di n c a than ho t tnh trong mi tr ng l do n ht ch t i u ha sinh tr ng c trong mi tr ng. NAA, kinetine, IAA, BAP, 2iP lin k t v i than ho t tnh. Kh nng kch thch s tng tr ng c a than ho t tnh l do n k t h p v i cc

h p ch t phenol

c ti t ra trong th i gian nui c y. Than ho t tnh th ng 0,5-3% (w/v). B sung AC vo cc loi hoa lan, thu c l,

c b sung vo mi tr ng v i n ng

mi tr ng nui c y kch thch sinh tr ng v phn ha

c r t, dy th ng xun v c chua. Tuy nhin, n l i gy c ch

u tng v cc loi thu c chi Camellia. Ni chung AC c r a acid v trung ha tr c khi b sung vo mi tr ng. 2.4.4. Ch t lm r n mi tr ng (soliding) Cc tc nhn lm r n ho c t o gel c s d ng ph bi n chu n b

cc mi tr ng nui c y m d ng r n (solid) ho c d ng s t (semi-solid). Trong nui c y d ch l ng m ho c t bo b ng p trong mi tr ng v ch t do thi u oxy. Cc gel t o m t gi cho m sinh tr ng trong i u ki n tnh

(static conditions). i u thu n l i khi lm vi c v i cc h p ch t t o gel nhn t o l chng t o ra cc gel s ch cc n ng tng i th p (1,25-2,5 g/L)

v n c th gip pht hi n s nhi m b n c pht tri n trong su t th i gian nui c y. Cc m u v t sinh tr ng t t hn trn agar ho c cc tc nhn t o gi th khc ph thu c vo lo i m v t ng loi khc nhau. Agar l m t lo i polysaccharide thu c t m t s loi t o (ngnh t o -Rhodophyta), chng c u i m hn cc tc nhn t o gel khc. Tr c tin, gel c a agar khng ph n ng v i cc thnh ph n c a mi tr ng. Th hai, chng khng b th y phn b i cc enzyme th c v t v duy tr s t t c cc nhi t n nh

nui c y c ti n hnh. Bnh th ng, t 0,5-1% agar t o gel r n ch c pH c trng cho mi

c dng trong mi tr ng

tr ng nui c y m v t bo th c v t. Trong nh ng nghin c u v dinh d ng, vi c s d ng agar c trnh b i v agar thng ph m khng s ch do

c ch a m t s ion Ca, Mg, K, Na v m t s nguyn t khc nhin, cc ch t b n ni trn cng c th

d ng v t. Tuy

c lo i b b ng cch r a agar v i 60oC trong 24 40oC

n c c t hai l n t nh t l 24 gi , trng trong c n v lm kh gi . Ni chung,

80oC agar ng m n c chuy n sang tr ng thi sol v

tr v tr ng thi gel. Kh nng ng m n c c a agar cao t 6-12 g/L n c. Gelatin n ng cao (8-10%) cng c hi u qu t o gel nhng b h n nhi t th p (25oC). Cc h p ch t khc

ch s d ng b i v n nng ch y

c th nghi m thnh cng bao g m methacel, alginate, phytagel v gelrite. Cng ty FMC Corp. g n y pht tri n m t lo i agarose c tinh s ch cao g i l Sea Plaque(k), lo i ny c th protoplast c dng ph c h i cc c l

n (single protoplast) trong nui c y. Cellophane

(perforated cellophane), c u gi y l c (filter paper bridge), b c gi y l c (filter paper wick), b t polyurethane (polyurethane foam) v x p polyester (polyester fleece) l cc phng th c thay tr ng nui c y m ho c t bo. i gi th c dng trong mi

Cellophane

cl

Gelatin thng m i

Agar thng m i

2.4.5. Cc ch t khng sinh (antibiotics) B sung cc khng sinh vo mi tr ng nui c y ni chung th ng c trnh do s hi n di n c a chng trong mi tr ng lm ch m sinh tr ng c a m v t bo. Tuy nhin, m t s t bo th c v t b nhi m m t cch h

th ng cc vi sinh v t.

ngn ch n sinh tr ng c a b n vi sinh v t ny, i u

khng th thay th l lm giu mi tr ng b ng khng sinh. Streptomycin ho c kanamycin n ng th p ki m sot hi u qu hi n t ng nhi m c tnh

h th ng v mi tr ng c b sung cc khng sinh ny khng gy b t l i cho s sinh tr ng c a t bo nui c y. 2.5. Cc ch t i u khi n sinh tr ng th c v t (Plant growth regular) Trong mi tr ng nui c y m v t bo th c v t thnh ph n ph gia quan tr ng nh t quy t nh k t qu nui c y l cc ch t i u khi n sinh i u khi n sinh tr ng chung l auxin,

tr ng. C b n nhm ch t

cytokinin, gibberellin v abscisic acid, nh ng ch t ny c vai tr quan tr ng trong nui c y m. S sinh tr ng, phn ha v pht sinh c quan c a m nui c y tr nn thu n l i ch khi b sung m t ho c m t s ch t thu c b n nhm trn vo mi tr ng nui c y. Tuy v y, yu c u thay i v i nh ng ch t ny

i tu theo loi th c v t, lo i m, hm l ng ch t i u ha sinh tr ng

n i sinh c a chng. Cc ch t i u ho sinh tr ng th c v t c chia thnh cc nhm chnh sau y: 2.5.1. Auxin (hormone sinh tr ng) Auxin l nhm ch t i u ha sinh tr ng th c v t c s d ng th ng xuyn trong nui c y m t bo th c v t. Cc auxin khc nhau th ng s d ng trong nui c y m t bo l: 1H- indole-3-acetic acid (IAA), 1-

naphthaleneacetic acid (NAA), 1H-indole-3-butyric acid (IBA), 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) v naphthoxyacetic acid (NOA). IAA l auxin t nhin c trong m th c v t; cn l i NAA, IBA, 2,4-D v NOA l cc auxin nhn t o, th ng th cc auxin nhn t o c ho t tnh m nh hn v do

c i m phn t c a chng nn cc enzyme oxy ha auxin (auxin-oxydase) khng c tc d ng. Nh ng auxin c hi u l c ring bi t trong nui c y t bo th c v t l 4-chlorophenoxyacetic acid (4-CPA) ho c p-chlorophenoxyacetic acid (PCPA), 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T), 2-methyl-4chlorophenoxyacetic acid (MCPA), 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (picloram), v 3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid (dicamba). c i m chung c a cc auxin l tnh ch t phn chia v ko di t bo. i v i nui c y m t bo, auxin c s d ng cho vi c phn chia, phn ha t bo v phn ha r . Trong s cc auxin, IAA, IBA v NAA ch y u s d ng cho mi tr ng ra r v ph i h p v i cytokinin s d ng cho mi tr ng ra ch i. 2,4-D v 2,4,5-T r t c hi u qu callus, pht sinh phi v tnh. M c d, nh ng chi ti t m c phn t v ho t ng c a auxin v n i v i mi tr ng t o v pht tri n

cha c bi t nhi u, nhng m t s nghin c u v di truy n v phn t

cung c p nh ng k t qu m i th v . Trong nh ng nm qua, m t s gen m ha cho cc protein lin k t auxin (auxin binding proteins) c t o dng (cloning) v kh o st cc c i m c a chng, v thng tin m i v gen c m

ng auxin (auxin-induced gene) cng thu c. Auxin c tc d ng ho t ha cc ion H+ tr c ti p ho c gin ti p (thng qua s nh h ng ln cc

enzyme) lm tng tnh n h i c a thnh t bo, tng tnh gi n n c a t bo trong ph n ng v i p su t trng. Auxin cng c nh h ng hi n gen v kch thch qu trnh t o r . Vi c quy t c y ph thu c vo: nh s d ng lo i v n ng auxin trong mi tr ng nui m c bi u

- Ki u tng tr ng ho c pht tri n c n nghin c u - Hm l ng auxin n i sinh c a m u c y - Kh nng t ng h p auxin t nhin c a m u c y - S tc ng qua l i gi a auxin ngo i sinh v auxin n i sinh

c tnh c a auxin

Ni chung, cc auxin c ha tan ho c trong ethanol ho c trong NaOH long. 2.5.2. Cytokin (hormone phn bo) Cytokinin l cc d n xu t c a adenine, y l nh ng hormone lin quan ch y u n s phn chia t bo, s thay i u th ng n v phn ha ch i

trong nui c y m. Cc cytokinin c s d ng th ng xuyn nh t l 6benzylaminopurine (BAP) ho c 6-benzyladenin (BA), 6- - -dimethylaminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine (kinetin), v 6(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin). Zeatin v 2-iP l cc cytokinin t nhin, cn BA v kinetin l cc cytokinin nhn t o. M t s h p ch t c pht hi n trong th i gian g n y c ho t tnh gi ng cytokinin l N,N-diphenylurea (DPU), thidiaziron, N-2-chloro-4-puridyl-N-phenyl urea (CPPU) v m t s d n xu t khc c a diphenyl urea. Cytokinin lin quan t i s phn chia t bo, phn ha ch i v.v Trong mi tr ng nui c y m, cytokinin c n cho s phn chia t bo v phn ha ch i t m s o ho c t cc c quan, t o ch i b t nh, gy t o

phi v tnh, tng c ng pht sinh ch i ph , c ch s hnh thnh r ,C ch ho t ng c a cytokinin l cha c bi t r rng m c d c m t s k t

qu v s c m t c a cc h p ch t mang ho t tnh cytokinin trong RNA v n chuy n (transfer RNA). Cc cytokinin cng c ho t tnh t ng h p RNA, tng ho t tnh enzyme v protein trong cc m nh t nh.

Tng t nh auxin, vi c b sung cytokine vo mi tr ng nui c y ph thu c vo: ki u tng tr ng ho c pht tri n c n nghin c u, hm l ng auxin n i sinh c a m u c y, kh nng t ng h p auxin t nhin c a m u c y, s tc l i gi a auxin ngo i sinh v auxin n i sinh, ng qua

c tnh c a auxin. Tuy nhin, c n ch i v i s pht sinh hnh i v i s pht sinh phi

t l cytokin/auxin. T l auxin/cytokinin r t quan tr ng thi (morphogenesis) trong cc h th ng nui c y. (embryogenesis),

t o callus v r c n c t l auxin/cytokinin cao, trong khi n s sinh s n ch i v ch i nch. V n quan tr ng

tr ng h p ng c l i s d n khng km l n ng 2,4-D cng v i BA nhng n u dng

c a hai nhm ch t i u khi n sinh tr ng ny. Ch ng h n n ng 5,0 ppm kch thch s t o thnh callus Agrostis

n ng

0,1 ppm chng s kch thch t o ch i m c d trong c 2

tr ng h p t l auxin/cytokinin l b ng 1.

i u khi n nui c y in vitro

c tnh c a m t s cytokine th ng s d ng:

- Kinetin c phn l p t ch ph m DNA c ho c nucleic acid m i sau khi kh trng nhi t cao hay un si. Trong c th s ng khng c kinetin

t n t i, s n ph m ny kch thch s pht sinh ch i c a cy thu c l nui c y, nhng n u ph i h p x l cng auxin t l n ng thch h p th s kch thch cc m khng phn ha.

qu trnh phn chia t bo (do c tn l kinetin)

- Tng t cc cytokinin khc, zeatin cng l m t d n xu t c a adenin. Letham l ng i u tin phn l p, tinh ch v cho k t tinh thnh cng d ng s a c a h t ng. Trong c bi t

hormone phn bo t nhin t n i nh ang

th c ti n nui c y m ng i ta ch dng zeatin trong nh ng tr ng h p v gi thnh r t

t, th ng thay th zeatin b ng kinetin ho c m t s n ph m

t ng h p nhn t o khc. - 6-Benzylaminopurine (BAP) ho c 6-Benzylamino (BAP): Ho t l c c a BAP cao hn nhi u so v i kinetin v b n thn BAP b n v ng hn zeatin d i tc ng c a nhi t cao. BAP c kh nng lm tng hnh thnh cc s n ph m cc l m m, kch thch s n y m m c a th ng s d ng (0.5-10mg/l) cho cc

th c p v tng kch th c c a t bo h t v qu trnh trao m c ch khc nhau. 2.5.3. Giberillin i ch t. N ng

Gibberellin c pht hi n vo nh ng nm 1930. L ch s pht hi n nhm hormone ny b t 1926, xc u t 1895 khi ng i Nh t ni v b nh la von. Nm n

nh c b nh l do loi n m Gibberella fujikuroi gy ra. c ho t ch t,

nh ng nm 30, m i phn l p v tinh ch

c g i l

gibberellin. Mi sau chi n tranh th gi i th II nm 1950, ng i Anh v ng i M m i bi t n cng trnh ny c a ng i Nh t. T i nay, ng i ta

pht hi n c trn 120 lo i thu c nhm gibberellic acid, nhng ch c m t s lo i gibberellic acid l c ho t tnh sinh l nh: GA1, GA3, GA4, GA7 Trong i s ng th c v t gibberellin ng vai tr quan tr ng i

v i nhi u qu trnh sinh l nh: sinh l ng ngh c a h t v ch i, sinh l pht tri n c a hoa, lm tng sinh tr ng chi u di c a th c v t. Trong nui c y m v t bo th c v t tc d ng c a gibberellic acid cha th t r rng. Nhi u tc gi c s d ng v coi l thnh ph n khng th thi u c a m t lo i mi tr ng chuyn d ng no . GA3 kch thch ko di ch i v n y m m c a phi v tnh. So v i auxin v cytokinin, gibberellin t khi c s d ng hn. GA3 c tnh ho tan trong n c.

nh h ng ko di ch i c a Gebberellin

Leaf buds of Japanese pear were collected in early June and early November and regarded as summer and winter dormant buds, respectively. Bud explants with and without scales were prepared from each of them, and cultured in vitro for 75 days at 25C with 14 h photoperiod, on a medium

either without growth regulators, or supplied with BA and GAs (GA3 and GA4+7), singly or in combination. When either BA or GA4+7 was contained in the medium, bud expansion occurred. Thereafter, summer dormant buds grew into shoots in the presence of BA, while winter dormant buds, although they swelled profusely, remained in a rosette. In the presence of BA, GA4+7 markedly stimulated shoot elongation of summer dormant buds, but GA3 did not. In winter dormant buds, GA4+7 not only failed to stimulate shoot elongation, but also interfered with the BA-induced swelling described above. The presence of bud scales delayed expansion of summer dormant buds, while it had little effect on winter dormant buds. The delaying effect of scales on expansion of summer buds was effectively removed by application of GA4+7 to the medium.( Teruhisa Yotsuya1 et al, Department of Agriculture, Kobe University, Kobe, Japan. 2.5.5. Absicis acid ABA thu c nhm cc ch t c ch sinh tr ng t nhin gy ra s ng ngh c a ch i, lm ch m s n y m m c a h t v s ra hoa, ng kh kh ng. ABA cn c tc d ng tng c ng kh nng ch ng ch u c a t bo th c v t i v i i u ki n ngo i c nh b t l i, v v y ABA c a vo mi tr ng nui c y v mang l i hi u qu nh t nh. Trong m t s nghin c u, khi b

sung ABA vo mi tr ng nui c y m v t bo, ng i ta nh n th y r ng ABA c tc d ng t o phi v tnh, kch thch s chn c a phi, kch thch s pht sinh ch i nhi u loi th c vt.

Abscisic acid (ABA) inhibits in vitro growth of cotton (Gossypium hirsutum L.) fiber and is effective only when applied during the first four days of culture started on the day of anthesis. Abscisic acid causes a small increase in potassium uptake by the ovules and also enhances leakage of potassium from them. During their period of rapid growth, fibers produced by ABA-treated ovules have a higher potassium content and a lower malate content as compared to fibers on untreated control ovules. Results are discussed in the light of earlier reports on the in vitro growth of cotton fiber and effects of abscisic acid on other plant tissues. It is suggested that ABA inhibits fiber growth, in part, by interfering with malate metabolism.( R. S. Dhindsa et al)
2.6. pH c a mi tr ng T bo v m th c v t i h i pH t i u cho sinh tr ng v pht tri n trong nui c y. Trong khi chu n b mi tr ng, pH c th thi t c a th nghi m. pH nh h ng ns c i u ch nh linh n gi tr c n

ng c a cc ion v nh

h ng tr c ti p t i qu trnh thu nh n cc ch t dinh d ng t mi tr ng vo t bo. i v i h u h t cc mi tr ng nui c y pH = 5,0-6,0 tr c khi kh trng pH cao hn s lm cho mi tr ng r t r n trong khi pH c c a agar. H u h t cc mi tr ng nui c y ngho ng gi tr pH, s dao ng ny c th gy b t l i cho

c xem l t i u.

th p l i gi m kh nng ng m, v th chng lm dao

th nghi m nui c y di ngy v s sinh tr ng c a cc t bo n ho c cc qu n th t bo m t th p. Nui c y callus c a nhi u loi cy, pH ban t c gi tr t 6,0-6,5. u th ng l

5,5-6,0 sau 4 tu n nui c y pH

c bi t khi s d ng cc nh

lo i ph gia c tnh ki m ho c tnh acid cao nh amino acid, vitamin th nh t ph i ph i dng NaOH ho c HCl long ch nh pH mi tr ng v t 5,5-6,5.

Nh ng th nghi m nui c y t bo n hay t bo tr n th vi c ch nh l b t bu c. 2.7. M t s lo i mi tr ng c b n

pH

Thnh ph n c b n c a m t s lo i mi tr ng nui c y m v t bo th c v t c trnh by trong b ng 2.1. Mi tr ng Murashige-Skoog (MS) l m t trong nh ng lo i mi tr ng c s d ng r ng ri nh t trong nui c y m v t bo th c v t. Mi tr ng MS thch h p cho c th c v t hai l m m v m t l m m. T i nay, c r t nhi u cng th c c i ti n mi tr ng MS trn c s cng th c g c do Murashige v Skoog cng b nm 1962. Mi tr ng B5 c thi t k u tin

cho nui c y callus ho c nui c y d ch huy n ph t bo, sau c c i ti n v tr thnh mi tr ng thch h p cho nui c y protoplast. Mi tr ng ny cng c s d ng ti sinh cy t protoplast. Mi tr ng Chu (N6) l lo i mi tr ng r t c bi t cho nui c y

hi u qu trong nui c y bao ph n c a la, c pht tri n

bao ph n cc loi ha th o, m c d trong cc th nghi m nui c y bao ph n mi tr ng c pht minh b i Nitsch (1969) v n c dng ph bi n hn. Mi tr ng Nitsch ngy cng thch h p v ph bi n trong nui c y cy u tng, c ba l

(red clover) v cc loi legume khc. Thnh ph n dinh d ng c a mi tr ng ny gip tng sinh tr ng c a t bo trong qu trnh pht sinh phi v nui c y protoplast. Thnh ph n ho h c c a mi tr ng ng vai tr quy t nh i v i thnh

cng c a nui c y t bo v m th c v t. M i loi cy, th m ch m i ki u gen, cc ki u nui c y khc nhau (nui c y m s o, huy n ph t bo, t bo tr n, bao ph n, h t ph n) c nh ng i h i khc nhau v thnh ph n mi tr ng. Khi b t nui c y m m t loi m i ho c m t gi ng m i, c n ph i l a ch n cho nghin c u m t lo i mi tr ng c b n ph h p. Cho u

i t ng

n nay, cc nh khoa h c i t ng v m c

t o ra m t s l ng r t l n cc mi tr ng thch h p v i t ng

tiu nghin c u.

thu n ti n cho vi c s d ng mi tr ng trong nui c y, cn c

trn ngu n g c khong dinh d ng ng i ta chia mi tr ng nui c y thnh 3 nhm: giu dinh dng, dinh d ng trung bnh v ngho dinh d ng. nui c y kh i u cho cc i v i cc

i t ng m i th l i khuyn c a ra l nn l a

ch n mi tr ng giu dinh d ng. B ng.: M t s mi tr ng c b n th ng c s d ng trong nui c y m v t bo th c v t.

Thnh ph n Murashige & Skoog (1962) White (1963) Gamborg (1968) Nitsch (1951) Heller (1953) Schenk & Hildeb (1972) (NH ) SO
4 2 4

Nitsch & Nitsch (1967) 125 125 500 125 27.85 37.25

Kohlenb ach (1975) 185 166 950 720 68 27.85 37.25 & Schmidt

Knop (1865)

370 -

720 200 65 80 300 16.5 -

134 500 150 3,000 150 27.8 37.3

250 1,500 25 2,000 250 -

250 750 75 600 125 _ -

400 200 2,500 300 15 20

250 250 1,000 250 -

MgSO4.7H2O Na SO
2 4

KC1 CaC1 2H O
2 2

440 1,900 1,650 170 27.8 1

NaNO KNO

Ca(NO ) .4H O
3 2 2

NH NO
4

NaH PO .1H O
2 4 2

NH H PO
4 2

KH PO
2

FeSO .7H 0)
4 2

Na EDTA
2

MnSO .4H O
4 2

22.3 8.6 0.025 0.025 0.83

7 3 2.5 0.75 1.5 -

10 (1 H O)
2

3 0.5 0.025 0.5 10 0.5 0.5 0.25

0.1 1 0.03 0.03 0.03 1 0.01 1 -

10 0.1 0.2 0.1 1.0 5 0.1

25 10 0.025 0.025 10 0.25

25 10 0.025 10 0.25

ZnSO 7H O
4 2

2 0.025 0.025 0.75 3 0.25

CuSO 5H O
4 2

H SO
2

Fe (SO )
2

4 3

NiC1 6H O
2 2

CoC1 6H O
2 2

A1C1

FeC1 6H O
3 2

FeC O H 5H O
6 5 7 2

K1 H BO
3 3

6.2 0.25

Na M O 2H O
2 0 4 2

TI LI U THAM KH O

1. Nguy n

c Thnh, 2000, Nui c y m t bo th c v t nghin c u v ng

d ng, Nh xu t b n nng nghi p H N i 2. L Vn Hong, 2005. Cng ngh nui c y m t bo th c v t, Nh xu t b n Khoa h c k thu t H N i

3. Hobbie L, Timpte C, Estelle M. 1994. Molecular Genetics of Auxin and Cytokinin. Plant Molecular Biology, 26: 1499- 1519. 4. Razan MK. 1994. An Introduction to Plant Tissue Culture. Oxford & IBH Publishing Co. Pvt. Ltd. New Delhi. 5. Trigiano RN and Gray DJ. 2000. Plant tissue culture concepts and laboratory exercises. CRC Press, New York. 6. T. Dennis Thomas,2008. The role of activated charcoal in plant tissue culture, Research Department of Botany, St. Thomas College, Pala, Arunapuram (P.O), PIN-686574, Kottayam (Dt), Kerala, India 7. Nguy n Th Kim Thanh v cs, 2005. Gio trnh Sinh l th c v t, NXB H N i

8. Blizzard, W. E., and Boyer, J. S.,1980. Comparative resistance of the soil and the plant to water transport. Plant Physiol. 9. Bohnert, H. J., Ostrem, J. A., and Schmitt, J. M., 1989. Changes in gene expression elicited by salt stress in Mesembryanthemum crystallinum. In Environmental Stress in Plants, J. H. Cherry, ed., Springer, Berlin.