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Comit Editor

Presidente: Gustavo Monti, M.V., Mg.Sc., Ph.D.


Jorge Toro Y., M.V., M.Sc., Ph.D.
Enrique Paredes H., M.V., Dr. med.vet.
Rubn Pulido F., M.V., Mg.Sc., Ph.D.
Asistente Editorial: Claudia Crdenas A., Ing. Agr.
ISSN 0301-732x
ISSN 0717-6201
Archivos de Medicina Veterinaria
VOL. 42, N 3, 2010
Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias Veterinarias
Casilla 567 - Valdivia, Chile
Comit Editor Asesor
Arturo Ferreira, M.V., Ph.D. - Universidad de Chile, Chile
Carmen Fuentealba, M.V., M.Sc., Ph.D. - University of Calgary, Canada
Carlos Hermosilla, M.V., Dr. med.vet., DipEVPC, Dr. habil. - University of London, UK
Oscar Illanes, M.V., Ph.D. - University of Calgary, Canada
Ral Mainar, M.V., M.Sc., Dr. Vet., DipECVPH - Centro de Invest. y Tec. Agroalimentaria, Espaa
Claudia Muoz-Zanzi, M.V., MPVM, Ph.D. - University of Minnesota, USA
Manuel Quezada, M.V., Dr. med.vet. - Universidad de Concepcin, Chile
Sergio Recabarren, Lic. Biologa, M.Sc. - Universidad de Concepcin, Chile
Gerhardt Schurig, M.V., Ph.D. - Virginia Tech, USA
Pedro Smith, M.V., M.Sc.- Universidad de Chile, Chile
Francisco Uzal, M.V., M.Sc., Ph.D., Dipl. ACVP - University of California Davis, USA
Gerdien van Schaik, M.Sc., Dipl Anim Sci, Ph.D. - Gezondheidsdienst voor Dieren, The Netherlands
VOLUMEN 42, N 3, 2010
CONTENIDOS
EDITORIAL
REVISIONES BIBLIOGRFICAS
Uso de lactonas macrocclicas para el control de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en el ganado
bovino.
RI Rodrguez-Vivas, RJ Arieta-Romn, LC Prez-Cogollo, JA Rosado-Aguilar, GT Ramrez-Cruz, G Basto-Estrella ...... 115
Rol de la mitocondria y el estrs oxidativo en el bloqueo del desarrollo de embriones bovinos producidos in vitro.
AM Tarazona, M Olivera-Angel, YY Lenis ........................................................................................................................... 125
Una actualizacin sobre el meteorismo espumoso bovino.
G Bretschneider ..................................................................................................................................................................... 135
ARTCULOS ORIGINALES
Crecimiento y caractersticas de canal en corderos Pelibuey puros y cruzados F1 con razas Dorper y Katahdin en
confnamiento.
U Macas-Cruz, FD lvarez-Valenzuela, J Rodrguez-Garca, A Correa-Caldern, NG Torrentera-Olivera, L Molina-
Ramrez, L Avendao-Reyes ................................................................................................................................................. 147
Efecto antihelmntico in vitro de extractos de plantas sobre larvas infectantes de nematodos gastrointestinales de
rumiantes.
FC Moreno, IJ Gordon, AD Wright, MA Benvenutti, CA Saumell ...................................................................................... 155
Adaptacin de Haemonchus contortus a los taninos condensados: puede ser posible?
JA Caldern-Quintal, JFJ Torres-Acosta, CA Sandoval-Castro, MA Alonso, H Hoste, A Aguilar-Caballero ..................... 165
Patrn electrofortico de protenas sricas en caballos con babesiosis.
R Barrera, MV Carapeto, MA Habela, C Zaragoza .............................................................................................................. 173
Almacenamiento en fro de espermatozoides de trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss): Efectos en la motilidad,
superxido intracelular, integridad de la membrana plasmtica y potencial de membrana mitocondrial.
O Berros, I Valdebenito, F Treuln, A Ubilla ....................................................................................................................... 179
Efecto del confnamiento sobre las variables sanguneas y calidad de carne de Salmn Atlntico (Salmo salar L.).
MC Gatica, GE Monti, TG Knowles, CB Gallo ................................................................................................................... 187
COMUNICACIONES
Estudio preliminar del comportamiento de potros raza Caballo Fino Chilote con acceso restringido a agua y espacio
durante el verano.
TA Tadich, RG Pulido ........................................................................................................................................................... 195
Caractersticas de manejo y conducta en caballos estabulados en el sur de Chile: Estudio preliminar.
C Mrquez, A Escobar, T Tadich .......................................................................................................................................... 203
Uso de concentrados autlogos de plaquetas como tratamiento de una fractura escapular y una lesin del plexo
braquial producidas por un disparo en un caballo.
C Lpez, JU Carmona, I Samudio ........................................................................................................................................ 209
Descripcin clnico-patolgica de fstulas perianales y dermatitis interdigital en un perro como posible diagnstico
de lupus eritematoso sistmico.
J Ojeda, M Moroni, E Paredes, MA Vidal, C Figueroa, M Concha ..................................................................................... 215
Hematologa y ttulo de aglutinacin despus de inmunizacin polivalente y desafo con Aeromonas hydrophila a
tilapias del Nilo (Oreochromis niloticus).
RL Bailone, ML Martins, JLP Mourio, FN Vieira, FS Pedrotti, GC Nunes, BC Silva .......................................................
221
VOLUME 42, N 3, 2010
CONTENTS
EDITORIAL
REVIEW ARTICLES
Use of macrocyclic lactones to control the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus.
RI Rodrguez-Vivas, RJ Arieta-Romn, LC Prez-Cogollo, JA Rosado-Aguilar, GT Ramrez-Cruz, G Basto-Estrella ..... 115
Mitochondrial rol and oxidative stress in the developmental blockade of in vitro produced bovine embryos.
AM Tarazona, M Olivera-Angel, YY Lenis ......................................................................................................................... 125
An update on frothy bloat in cattle.
G Bretschneider .................................................................................................................................................................... 135
ORIGINAL ARTICLES
Growth and carcass traits in pure Pelibuey lambs and crosses F1 with Dorper and Katahdin breeds in confnement.
U Macas-Cruz, FD lvarez-Valenzuela, J Rodrguez-Garca, A Correa-Caldern, NG Torrentera-Olivera, L Molina-
Ramrez, L Avendao-Reyes ................................................................................................................................................. 147
In vitro anthelmintic effect of plant extracts against infective larvae of ruminants gastrointestinal nematode parasites.
FC Moreno, IJ Gordon, AD Wright, MA Benvenutti, CA Saumell ...................................................................................... 155
Adaptation of Haemonchus contortus to condensed tannins: can it be possible?
JA Caldern-Quintal, JFJ Torres-Acosta, CA Sandoval-Castro, MA Alonso, H Hoste, A Aguilar-Caballero ..................... 165
Electrophoretic pattern of serum proteins in horses with babesiosis.
R Barrera, MV Carapeto, MA Habela, C Zaragoza .............................................................................................................. 173
Cold storage of sperm of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): Effect on motility, intracellular superoxide, plasma
membrane integrity and mitochondrial membrane potential.
O Berros, I Valdebenito, F Treuln, A Ubilla ....................................................................................................................... 179
Effects of crowding on blood constituents and fesh quality variables in Atlantic salmon (Salmo salar L.)
MC Gatica, GE Monti, TG Knowles, CB Gallo ................................................................................................................... 187
COMMUNICATIONS
Preliminary behavioural study of Caballo Fino Chilote stallions with restricted access to space and water during
summer.
TA Tadich, RG Pulido ........................................................................................................................................................... 195
Husbandry and behaviour characteristics in stabled horses in the south of Chile: A preliminary study.
C Mrquez, A Escobar, T Tadich .......................................................................................................................................... 203
Use of autologous platelet concentrates as treatment for a scapular fracture and brachial plexus nerve injury
produced by a gunshot in a horse.
C Lpez, JU Carmona, I Samudio ........................................................................................................................................ 209
Canine perianal furunculosis and interdigital lesions: Probable systemic lupus erythematosus.
J Ojeda, M Moroni, E Paredes, MA Vidal, C Figueroa, M Concha ...................................................................................... 215
Hematology and agglutination titer after polyvalent immunization and subsequent challenge with Aeromonas
hydrophila in Nile tilapia (Oreochromis niloticus).
RL Bailone, ML Martins, JLP Mourio, FN Vieira, FS Pedrotti, GC Nunes, BC Silva ...................................................... 221
Arch Med Vet 42, V (2010)
Editorial
La revista Archivos de Medicina Veterinaria, de septiembre a la fecha, ha implementado
la plataforma electrnica eQuipu, como una forma de agilizar y simplifcar los procesos
de edicin. Esta plataforma electrnica permite el envo de artculos on-line como
asimismo la realizacin del proceso editorial, incluyendo el seguimiento del estado de
los artculos por parte de los autores y el envo y recepcin de los arbitrajes. El Comit
Editorial ha establecido un perodo de marcha blanca de 6 meses, durante el cual se
continuarn recibiendo trabajos por las vas tradicionales (correo electrnico o postal).
Sin duda, esta plataforma es un gran avance que esperamos pueda ser bien recibido por
los autores, especialmente porque tendrn la posibilidad de revisar on-line el estado en
que se encuentra su trabajo. Sin embargo, como toda nueva informatizacin de procesos,
durante la marcha blanca se contempla ir realizando ajustes de acuerdo a los problemas
que se vayan suscitando.
Durante el mes de septiembre, fnaliz su perodo como editora y adems presidenta del
Comit Editor de la revista la Dra. Carmen Gallo. La Dra. Gallo estuvo en la presidencia
del Comit Editor durante los ltimos 3 aos, perodo que ha sido importante en relacin
a la modernizacin de la revista, que ha permitido implementar la plataforma electrnica
eQuipu. El Comit Editor agradece el esfuerzo y dedicacin para mejorar la calidad de
la revista. Como nuevo integrante del Comit Editor se incorpora el Dr. Rubn Pulido,
quien sin duda otorgar continuidad y fortalecer los procesos editoriales de Archivos de
Medicina Veterinaria.
115
Arch Med Vet 42, 115-123 (2010)
REVISIN BIBLIOGRFICA
Aceptado: 18.11.2009.
* km 15.5 carretera Mrida - Xmatkuil, CP 97 100, Mrida, Yucatn,
Mxico; rvivas@tunku.uady.mx
Uso de lactonas macrocclicas para el control de la garrapata
Rhipicephalus (Boophilus) microplus en el ganado bovino
Use of macrocyclic lactones to control the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus
RI Rodrguez-Vivas
*
, RJ Arieta-Romn, LC Prez-Cogollo,
JA Rosado-Aguilar, GT Ramrez-Cruz, G Basto-Estrella
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autnoma de Yucatn, Yucatn, Mxico.
SUMMARY
An overview of the macrocyclic lactones (ML), with recent results and their effect on the control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus, is presented
in this paper. This review describes in detail the chemistry, pharmacokinetics and dose presentation, security and time withdrawal and environmental
safety of the groups belonging to ML: avermectins (ivermectin, doramectin, eprinomectin, abamectin) and milbemycin (moxidectin). There is also
a discussion on their efficacy and the problem of resistance of R. (B.) microplus to ML. Finally, it is concluded that due to their high lipid solubility
ML are widely distributed in tissues, being effective in the control of R. (B.) microplus in cattle. The efficacy of short-acting ivermectin, doramectin,
eprinomectin, abamectin and moxidectin are similar (> 90% effective after four weeks post treatment, PT) to control adult stages of R. (B.) microplus,
however, in long-acting LM are available the market and present efficiency of > 95% with persistence up to 70 days PT.
Palabras clave: Rhipicephalus (Boophilus) microplus, lactonas macrocclicas, control, bovinos.
Key words: Rhipicephalus (Boophilus) microplus, macrocyclic lactones, control, cattle.
INTRODUCCIN
Uno de los principales problemas econmicos en la
ganadera bovina de las regiones tropicales y subtropi-
cales de Centro y Sudamrica, frica y Australia son
las garrapatas y las enfermedades que stas transmiten.
Por su importancia econmica y sanitaria la garrapata
Rhipicephalus (Boophilus) microplus es uno de los prin-
cipales ectoparsitos que causan graves problemas en la
ganadera de pastoreo. Su efecto directo est relacionado
con el dao a las pieles por accin de las picaduras, pr-
dida de sangre y el efecto de sus toxinas, lo cual incide
negativamente sobre la ganancia de peso y produccin de
leche de animales infestados, mientras que su efecto indi-
recto est dado por la transmisin de agentes patgenos:
Babesia bovis, Babesia bigemina y Anaplasma marginale,
los cuales a su vez producen baja en la condicin fsica,
mortalidades y altos costos para su control (Rodrguez-
Vivas y col 2005).
Los mtodos de control de garrapatas se clasifican
en qumicos (ixodicidas o garrapaticidas) y no qumicos
(vacunas y control biolgico). El mtodo ms utilizado
para el control de R. (B.) microplus es el uso de productos
qumicos tales como organofosforados, piretroides, amidi-
nas, fenilpirazolonas y lactonas macrocclicas (LM) (FAO
1987, Rodrguez-Vivas y col 2005). Sin embargo, a travs
del tiempo, el uso irracional de estos qumicos ha genera-
do el desarrollo de resistencia a los diferentes ixodicidas
(Fragoso y col 1999, Rodrguez-Vivas y col 2006
a,b
), lo
que ha propiciado la bsqueda de mtodos alternativos de
control de esta plaga en la industria bovina, tales como la
seleccin de razas resistentes, control biolgico (hongos
entomopatgenos, depredadores y plantas), uso de vacunas
(Jongejan y Uilenberg 1994, De la Fuente y col 1999,
Kaaya y Hassan 2000, Willadsen 2001, Tedonkeng y
col 2005) y el uso de lactonas macrocclicas (LM) (Lanusse
y col 1997). Las LM son endectocidas eficientes en el
control de endo y ectoparsitos (Lanusse y col 1997). Las
avermectinas (ejemplos: ivermectina, IVM; doramectina,
DRM; eprinomectina, EPM; abamectina, ABM) y milbe-
micinas (ejemplo: moxidectina, MXD) son activas para
el control de nematodos y artrpodos a dosis bajas en la
mayora de los animales domsticos (Sumano y Ocampo
2006). Se absorben por todas las vas debido a su alta
liposolubilidad y se distribuyen ampliamente en los teji-
dos, tales como la luz intestinal, grasa y piel (Entrocasso
y col 1996, Sumano y Ocampo 2006). Las LM producen
su efecto antiparasitario al incrementar la permeabilidad
de la membrana celular por los iones de cloro (Cl
-
), con la
consecuente hiperpolarizacin y parlisis de la musculatura
farngea y somtica de los parsitos (Mudd y Parker 1995,
Lifschitz y col 2002). El objetivo de la presente revisin
116
RI RODRGUEZ-VIVAS Y COL
es presentar informacin relevante de libros, tesis, con-
gresos, seminarios y revistas con comit editorial sobre
el uso de las principales LM (IVM, DRM, MXD, EPM,
ABM) para el control de la garrapata R. (B.) microplus
en el ganado bovino.
LACTONAS MACROCCLICAS
FAMILIAS Y MECANISMOS DE ACCIN
Las LM pertenecen a dos grandes familias segn sea el
actinomiceto de cuya fermentacin provienen: avermectinas
y milbemicinas (figura 1).
La compleja estructura qumica de estos frmacos
corresponde a una lactona macrocclica de 16 miembros
similar a la de los antibiticos macrlidos (pero sin efecto
bacteriano), unida a un grupo benzofurano (C
2
a C
8
) y a
un anillo espiroquetal (C
17
a C
25
). Son molculas de gran
tamao con peso molecular entre 600 kDa (milbemicinas)
y 800 kDa (avermectinas) (Lifschitz y col 2002).
Las LM comparten algunas propiedades fisicoqumicas
generales; pequeas diferencias en la estructura qumica
entre avermectinas y milbemicinas o aun dentro de las
avermectinas determinan cambios en el comportamiento
farmacocintico, lo cual repercute sobre la eficacia y la
persistencia antiparasitaria de las mismas (Lifschitz y
col 2002). En parsitos susceptibles, la IVM se une a un
receptor de alta afinidad, lo que provoca un incremento
en la permeabilidad de los iones Cl
-
, con el consiguiente
desprendimiento del parsito por una parlisis flcida.
La identificacin del receptor especfico al cual se unen
las LM ha sido objeto de controversia. Los primeros estudios
describieron que la IVM produca una liberacin de cido
gama-aminobutrico (GABA) desde los sinaptosomas del
cerebro de rata, as como una modulacin de los receptores
gabrgicos que aumentaba la afinidad por el neurotrans-
misor. Por otro lado, dependiendo de las concentraciones
de IVM a las que se exponen los parsitos, la entrada de
Cl
-
podra o no estar mediada por un mecanismo gabrgico.
Los datos actuales sugieren que la accin parasiticida de la
avermectinas y milbemicinas viene dada por la interaccin
de las mismas con los canales de Cl
-
ligados a un receptor
de glutamato en el parsito diana, lo cual dara lugar al
fenmeno de hiperpolarizacin descrito (Mudd y Parker
1995, Lifschitz y col 2002).
Utilizando el nematodo de vida libre Canorhabditis
elegans como modelo, se han podido caracterizar las
subunidades de este receptor, observndose que a bajas
concentraciones, las avermectinas potencian la accin del
glutamato y a elevadas concentraciones producen direc-
tamente la apertura del canal de Cl
-
. Este receptor se ha
localizado en la faringe de C. elegans y Ascaris suum y
la estimulacin del mismo inhibe la musculatura farngea
necesaria para la alimentacin del parsito (Lifschitz y
col 2002).
La informacin disponible hasta el momento sugiere
que las milbemicinas comparten mecanismo de accin
con las avermectinas, aunque no se descarta que existan
diferencias farmacodinmicas muy sutiles entre ambos
grupos (Lifschitz y col 2002).
La falta de actividad de las avermectinas y milbemi-
cinas sobre trematodos y cestodos se debe a la ausencia,
o al menos a una menor trascendencia, de la transmisin
mediada por ese tipo de canales de Cl
-
en la coordinacin
neuromuscular de estos parsitos en comparacin con
nematodos o artrpodos (Sumano y Ocampo 2006).
IVERMECTINA
Descripcin. La IVM es el resultado de la fermentacin
bacteriana del Streptomyces avermitilis, obtenido por pri-
mera vez en el ao 1979. Es un frmaco muy liposoluble
y poco hidrosoluble, por lo que se puede aplicar por todas
las vas, siendo las ms recomendadas la SC, intramuscular
(IM) y tpica (pour-on) (Lifschitz y col 2002).
Composicin qumica. Es un anlogo semisinttico de la
abamectina, conteniendo un 80% de 22,23-dihidroavermecti-
na B1a y no ms de un 20% de 22,23, dihidroavermectina
B1b (Lifschitz y col 2002).
Farmacocintica. La IVM es la LM de mayor difusin
y utilizacin en las diferentes especies de animales en
todo el mundo; por lo tanto, es la molcula que ms se ha
estudiado con respecto a sus caractersticas farmacodin-
micas y farmacocinticas. Las propiedades fisicoqumicas
de la IVM incluyen un alto peso molecular y una elevada
lipofilicidad, las que le confieren caractersticas farmaco-
cinticas de un alto volumen de distribucin, con una gran
afinidad por la grasa corporal y prolongada persistencia de
Abamectina
Ivermectina
Doramectina
Eprinomectina
Selamectina
Avermectinas
Streptomyces
avermitilis
Streptomyces
cyaneogriseus
Milbemicina
Nemadectina
Moxidectina
Milbemicina B41 D
Streptomyces
hygroscopicus
Milbemicina 5-Oxima
Figura 1. Origen y clasificacin de las lactonas macrocclicas:
avermectinas y milbemicinas (Tomado de Lifschitz y col 2002).
Origen and classification of macrocyclic lactones: avermectins
and milbemycins (From Lifschitz et al 2002).
117
RHIPICEPHALUS (BooPHILUS) MICRoPLUS, LACTONAS MACROCCLICAS, CONTROL, BOVINOS
sus concentraciones en el organismo (Sumano y Ocampo
2006).
El tiempo de liberacin de la IVM es de slo siete das
despus del tratamiento SC en bovinos. En un estudio se
encontr que la IVM-3,15% (0,63 mg/kg pv) inoculada
a bovinos permanece en concentraciones plasmticas
> 2 ng/ml
-1
a los 50 das PT (Lifschitz y col 2007).
Los parmetros farmacocinticos promedios de la IVM
obtenidos en plasma despus de ser administrados por
va SC a razn de 0,2 mg/kg pv en bovinos se presentan
en el cuadro 1.
Presentacin y dosificacin. Las presentaciones comerciales
que tiene la IVM son en solucin oral, tpica e inyectable
en el ganado bovino. La solucin oral e inyectable son
formulaciones acuosas, que contienen propilenglicol y
solubilizantes, mientras que la tpica tiene nicamente
el vehculo (McKellar y Benchaoui 1996). La dosis para
la va oral e inyectable es de 0,2 mg/kg pv. Sin embargo,
actualmente se dispone de IVM de larga accin al 3,15%,
que se aplica va SC a dosis de 0,63 mg/kg pv (Bridi y
col 2001).
Seguridad y tiempo de retiro en el ganado bovino. El uso
de IVM en el ganado bovino es seguro. Dosis de 4 mg/kg
pv producen ataxia que se atribuyen a acciones sobre el
sistema nervioso central. En general y con alguna variacin
segn los diferentes pases, la carne de animales tratados
no debe destinarse al consumo humano durante perodos
de 35-45 das (Lifschitz y col 2002).
Seguridad ambiental. Las elevadas concentraciones de
IVM que se eliminan por las heces mantienen su actividad
biolgica y ejercen su poder insecticida sobre un gran
nmero de especies de dpteros y colepteros que colonizan
la materia fecal de los bovinos. Nichols y col (2008) men-
cionan que la IVM produce la muerte de varias especies
de escarabajos coprfagos (paracpridos, telecpridos,
endocpridos) que utilizan las heces de los bovinos para
su anidacin, reproduccin y alimentacin. La principal
funcin de estos colepteros radica en la incorporacin de
las heces al suelo al brindar servicios ecolgicos de gran
valor en los ecosistemas de pastizales, ya que la produc-
cin forrajera depende estrechamente del reciclaje de la
materia orgnica producida y de la cantidad de elementos
minerales disponibles (Surez y col 2009).
La IVM se encuentra fuertemente unida a las partculas
de heces bovinas, y slo en una mnima proporcin es arras-
trada por el agua. La IVM tiene una vida media variable en
mezclas de materia fecal y suelo, que va desde los 14 das en
los meses de verano hasta los 240 das a 22 C en condiciones
de laboratorio (Lifschitz y col 2002). Wardhaugh y Mahon
(1998) reportan que los residuos de IVM en heces de bovinos
tratados previnieron el desarrollo de Musca vettustissima,
Musca domestica y Haematobia irritans durante 35 das en
el ambiente. Asimismo, Guglielmone y col (1998) reportaron
una eficacia de la IVM contra fases adultas de H. irritans
en aproximadamente dos semanas.
DORAMECTINA
Descripcin. La DRM se obtiene de Streptomyces avermitilis
y es una avermectina de estructura y espectro similares
a la IVM; sin embargo, tiene algunas diferencias que le
confieren disponibilidad plasmtica por un perodo ms
prolongado que la IVM (Sumano y Ocampo 2006).
Composicin qumica. Es una avermectina de estructura y
espectro similares a la ivermectina. Su nombre qumico es
25-ciclohexil-5-O-demetil-25-(1-metilpropil)-avermectina
A1a (Lifschitz y col 2002).
Farmacocintica. La DRM cuando se administra por va
SC tiene buena disponibilidad y eficacia contra nematodos
y ectoparsitos. Se concentra ms que otras ivermectinas
en la luz intestinal. Al administrar en bovinos una dosis
de 0,2 mg/kg pv por va IM, se logra una concentracin de
33,1 ng/ml, y por va SC se logran concentraciones varia-
bles que van de 27,8 a 37,5 ng/ml (Lanusse y col 1997).
Cuando se administra por va IM se requiere un tiempo de
cuatro das para alcanzar las concentraciones plasmticas
mximas y de seis das cuando se administra por va SC
(Lanusse y col 1997). La mayor parte del frmaco admi-
nistrado por va IM o SC no se metaboliza, y de tres a
21 das despus de la administracin se encuentra DRM
sin cambios en un 58-70% como residuo en tejidos, con
91% en grasa. Despus de 14 das de su administracin
Cuadro 1. Valores farmacocinticos promedios obtenidos para
la IVM, DRM y MXD en plasma despus de ser administradas
por va SC a razn de 0,2 mg/kg pv en bovinos (Tomado de
Lanusse y col 1997).
Mean pharmacokinetic values in plasma of IVM, DRM
and MXD after a SC injection at 0.2 mg/kg in bovines (From Lanusse
et al. 1997).
Parmetros
cinticos
Ivermectina Doramectina Moxidectina
T_ab (das) 39,20 56,40 1,32
C
max
(ng/mL) 42,80 37,50 39,40
T
max
(das) 4,00 6,00 0,32
ABC
total
(ng.d/mL) 459,00 627,00 217,00
TMR (das) 7,35 9,09 14,60
V
dss
/F (L/kg) 3,35 2,92 13,60
Cl
B
/F (mL/d/kg 457,00 322,00 938,00
T_ab: Tiempo medio de absorcin; C
max
: Mxima concentracin plasmtica;
T
max
: Tiempo en que se alcanza la C
max
: ABC
total
: rea bajo la curva de
concentracin frente a tiempo extrapolada al infinito; TMR: Tiempo medio
de residencia; V
dss
/F: Volumen de distribucin en el estado estacionario;
Cl
B
/F: Aclaramiento corporal total. V
dss
y Cl representan sus verdaderos
valores en relacin a la fraccin absorbida del frmaco.
118
RI RODRGUEZ-VIVAS Y COL
por va SC se encuentra 87% en heces y slo 1% en orina
(Lifschitz y col 2007). Los parmetros farmacocinticos
promedios de la DRM obtenidos en plasma despus de
ser administrados por va SC a razn de 0,2 mg/kg pv en
bovinos se presentan en el cuadro 1.
Presentacin y dosificacin. Las presentaciones comercia-
les que tiene la DRM en el ganado bovino son tpicas e
inyectables. La dosis para la va inyectable es de 0,2 mg/
kg pv (Lifschitz y col 2002).
Seguridad y tiempo de retiro en el ganado bovino. El
uso de DRM en el ganado bovino es seguro. La DRM se
tolera razonablemente; una dosis por va SC a razn de
0,6 mg/kg pv aplicada entre los das 12 y 55 de gestacin
no provoca efectos adversos en desarrollo embrionario,
mantenimiento de la gestacin, parto o supervivencia del
producto, y en los machos no afecta la calidad del semen.
Al igual que la IVM-1%, la carne de animales tratados no
debe destinarse al consumo humano durante perodos de
35-45 das (Lifschitz y col 2002).
Seguridad ambiental. En un estudio realizado por Surez
y col (2009) se aplicaron MXD (SC, pour-on) y DRM
(SC) a bovinos y se evalu el efecto de la excrecin de los
frmacos en heces sobre la sobrevivencia de artrpodos
benficos. En este estudio se concluy que la DRM tiene
mayor efecto adverso sobre artrpodos que la MXD.
Asimismo, Anziani y col (2001) evaluaron la actividad
de la DRM en bovinos tratados contra nes de campo de
H. irritans y observaron que en las heces no emergan
adultos durante 35 das despus del tratamiento.
MOXIDECTINA
Descripcin. La MXD es una LM sintetizada en 1990 en
Japn, es muy activa contra nematodos y artrpodos a dosis
bajas en la mayora de los animales domsticos (Sumano
y Ocampo 2006). Es un frmaco que puede usarse con
4 a 5 veces la dosis teraputica en ovinos sin observarse
reacciones negativas. En bovinos no se han observado
reacciones negativas incluso con dosis 10 veces mayores
a las recomendadas (Sumano y Ocampo 2006). Las dosis
teraputicas usadas son 0,2 a 1,0 mg/kg pv con resultados
satisfactorios. Su espectro abarca fases adultas e inmaduras,
asimismo reduce la capacidad reproductiva de las garrapatas
(Caracostantogolo y col 1993, Sibson 1994).
Composicin qumica. El nombre qumico es [6R,23E,25S(E)
5-0-desmetil-28-dioxi-25-(1-butenil)-6,28 epoxi-23-
(metoximino) milbemicina B; cuenta con un peso molecular
de 639,8 kDa y su frmula condensada es C
37
H
53
NO
8
.
Es un derivado semisinttico de la nemadectina, que es un
anillo lactona macrocclico producido por fermentacin de
Streptomyces cyanogriseus. La estructura qumica se relaciona
con las milbemicinas y avermectinas, con las que comparte
adems de la similitud de su molcula el tipo de absorcin y
la farmacocintica (Sumano y Ocampo 2006).
Farmacocintica. El frmaco se absorbe por todas las vas
debido a que es muy liposoluble; se considera ms lipoflica
e hidrofbica que la IVM, se distribuye ampliamente en
los tejidos, pero por su ciclo enteroheptico se acumula
sobre todo en la luz intestinal, grasa y piel, lo que permite
su uso como ixodicida con buenos resultados. La vida
media en bovinos es de 9 a 11 das en promedio, con un
efecto residual de tres meses, lo cual permite programar
con mayor intervalo el calendario de desparasitacin
(Entrocasso y col 1996).
Lifschitz y col (1999) utilizando MXD-1% a dosis de
0,2 mg/kg pv encontraron que la concentracin mxima
de MXD en plasma se alcanz al da 1 PT (84,2 ng/ ml
-1
)
y durante los primeros ocho das PT la concentracin de
la droga en plasma fue de 9 ng/g
-1
. La concentracin de
la MXD en la piel declin gradualmente con el paso del
tiempo, aunque en otros tejidos fue detectada hasta por 58
das (> 0,2 ng/ ml
-1
). Estas concentraciones altas de MXD
y su presencia prolongada en la piel la hacen ser una droga
eficaz contra diferentes ectoparsitos en rumiantes.
En un estudio realizado en Francia por Dupuy y
col (2007) utilizando MXD-10% a dosis de 1 mg/kg pv
en bovinos se detect por primera vez MXD en plasma
una hora PT (2,00 1,52 ng/ml
-1
) y dos das PT en pelo
a concentracin de (446,4 193,26 ng/g
-1
). El tiempo
en que se encontraron concentraciones en plasma y pelo
por encima de 2 ng/ml
-1
o 2 ng/g
-1
fue de 120 y 100
das, respectivamente. Los parmetros farmacocinticos
promedios de la MXD obtenidos en plasma despus de
ser administrados por va SC a razn de 0,2 mg/kg pv en
bovinos se presentan en el cuadro 1.
Presentacin y dosificacin. Las presentaciones comerciales
que tiene la MXD son en solucin oral, inyectable y epi-
cutnea. La solucin oral e inyectable son formulaciones
acuosas, que contienen propilenglicol y solubilizantes;
mientras que la forma epicutnea tiene nicamente un
vehculo (Aguilar-Tipacam y Rodrguez-Vivas 2002).
La dosis para la va oral e inyectable es de 0,2 mg/kg pv
y la presentacin tpica es utilizada a dosis de 0,5 mg/pv
(Geurden y col 2004). Sin embargo, actualmente se dispone
de una MXD de larga accin al 10%, que se aplica va SC
dosis de 1 mg/kg pv.
Seguridad y tiempo de retiro. No ocurre muerte de bovinos
cuando son inyectados por va SC hasta 10 veces la dosis
recomendada (2,0 mg/kg pv). Cuando fue aplicada tres veces
la dosis recomendada (0,6 mg/kg pv), no se observaron
efectos sobre la reproduccin de toros, vacas gestantes
y vaquillas cuando fue inyectada en cada trimestre de la
gestacin (Rae y col 1994). Cuando la MXD se administra
por va SC, es posible detectar el frmaco y siete de sus
metabolitos en diferentes tejidos, heces y bilis. Si se maneja
119
RHIPICEPHALUS (BooPHILUS) MICRoPLUS, LACTONAS MACROCCLICAS, CONTROL, BOVINOS
un tiempo de retiro de 30 das se pueden encontrar hasta 2
ppb en algunos tejidos (Sumano y Ocampo 2006).
Seguridad ambiental. El estircol de animales tratados
con MXD produce menor efecto adverso que la DRM e
IVM en contra de artrpodos benficos que se encuen-
tran en las heces de bovinos tales como los escarabajos
coprfagos (ejemplo: Sulcophanaeus, Digitonthophagus o
Canthidium) (Surez y col 2009). Aunque los residuos en
heces de bovinos tratados con MXD inyectable no tuvieron
efectos significativos sobre larvas de M. vettustissima y
M. domestica (Wardhaugh y col 1996), otros experimen-
tos muestran que la MXD en las heces de bovinos tiene
actividad contra las fases inmaduras de H. irritans (Surez
y col 2009).
EPRINOMECTINA
Descripcin. La EPM es una molcula que se obtiene
a partir de la fermentacin del Streptomyces avermitilis
(Blagburn y Lindsay 2001). La sustitucin de un grupo
epi-acetilamino en la posicin 4 es la diferencia con las
otras avermectinas B
1
(Lifschitz y col 2002).
Composicin qumica. Es un miembro del grupo de las
avermectinas biosintticas. Tambin se le conoce como
MK-397. Es un slido cristalino cuyo nombre qumico
es (4R)-4 -epi-(acetilamino)-4-desoxiavermectina B
1

(Blagburn y Lindsay 2001, Sumano y Ocampo 2006).
Farmacocintica. La EPM ha sido desarrollada para su ad-
ministracin en forma epicutnea, conservando su actividad
contra endo y ectoparsitos. Debido a que son compuestos
muy liposolubles su distribucin es muy buena, presentando
un elevado porcentaje de unin a protenas plasmticas, con-
centrndose principalmente en grasa e hgado. Su absorcin,
una vez colocada sobre el animal, comienza inmediatamente
y se mantiene en un buen nivel hasta 10 das despus de
la administracin. Es muy poco metabolizada y como las
otras avermectinas se elimina en forma activa por heces. Lo
ms interesante de este nuevo compuesto es que su uso en
vacas lecheras no requiere tiempo de retiro en leche (Dupuy
y col 2001). Esto se debe a una combinacin de factores:
por un lado, la EPM presenta un perfil residual bajo, por
otro, su lmite mximo de residuos es ms elevado que las
otras avermectinas. Su metabolizacin se lleva a cabo en el
hgado y se elimina principalmente en heces; menos del 1%
se elimina en la orina (Sumano y Ocampo 2006).
Presentacin y dosificacin. La presentacin comercial
que tiene la EPM es epicutnea en el ganado bovino. La
dosis por la va tpica es de 0,5 mg/kg pv (Lifschitz y
col 2002, Sumano y Ocampo 2006).
Seguridad y tiempo de retiro en el ganado bovino. Estudios
realizados en bovinos y cerdos, incluyendo hembras en
diversos estados de gestacin y machos reproductores,
han demostrado un amplio margen de seguridad cuando es
administrado a la dosis recomendada (Lifschitz y col 2002).
No debe administrarse por va oral o intravenosa. Los
bovinos toleran por va percutnea dosis hasta tres veces
mayores que la indicada. Una de las ventajas que tiene la
EPM comparada con otras LM es que al aplicarla (0,5 mg/
kg pv) en vacas lactantes los residuos de la droga en la
leche son bajos, por lo que se puede usar para el consumo
humano (Alvinerie y col 1999, Blagburn y Lindsay 2001,
Lifschitz y col 2002). Sin embargo, en Nueva Zelanda se
recomiendan hasta 14 das de retiro con las mismas indi-
caciones de aplicacin (Sumano y Ocampo 2006).
Seguridad ambiental. Las avermectinas incluyendo la EPM
tienen una semivida variable en mezclas de materia fecal
y suelo, que va desde los 14 das en los meses de verano
hasta los 240 das a 22 C en condiciones de laboratorio
(Lifschitz y col 2002). En la actualidad no existen estudios
del efecto de la EPM sobre poblaciones de artrpodos a
nivel de campo.
ABAMECTINA
Descripcin. Tambin se le denomina avermectina B
1

(Mrozik 1994). Se encuentra en forma de cristales blanco-
amarillentos y es inodora. Es un producto natural que se
obtiene tambin de la fermentacin de Streptomyces aver-
mitilis, del cual se forman dos homlogos, la avermectina
B
1
y la B
2
, que se diferencian por un grupo metilo. El
compuesto es similar a la ivermectina, de la que solamente
difiere por la presencia de una doble ligadura en los carbonos
22 y 23 (Mrozik 1994, Lifschitz y col 2002).
Composicin qumica. Su nombre qumico es
5-O-dimetilavermectina A1a y 5-O-dimetil-25-des
(1-metilpropil)-25-(1-metiletil) avermectina A
1a
(4:1);
avermectina B
1
a/b. Su frmula molecular es C
48
H
72
O
14
;
C
47
H
70
O
14
(Sumano y Ocampo 2006).
Farmacocintica. Los procesos de absorcin estn rela-
cionados con la va de administracin del frmaco. Su
distribucin es muy amplia; se acumula principalmente en
hgado y tejido adiposo, pero llega con facilidad a la piel.
Los procesos de metabolismo se sujetan a la hidroxilacin
del producto, y la excrecin se realiza principalmente por
las heces, la orina y una mnima proporcin en leche. Es
importante sealar que si se acelera el trnsito intestinal,
sta y otras avermectinas sern menos biodisponibles
(Sumano y Ocampo 2006).
Presentacin y dosificacin. En todos los casos se administra
una sola dosis y se pueden utilizar, segn la presentacin, las
vas oral, tpica y SC (Mrozik 1994, Lifschitz y col 2002);
en esta ltima se informa ligera inflamacin a los 10 das.
La ABM se ha utilizado con bastante xito en el control de
120
RI RODRGUEZ-VIVAS Y COL
las parasitosis con nematodos gastrointestinales del ganado
en dosis de 0,2 mg/kg pv por va subcutnea (Sumano y
Ocampo 2006).
Seguridad y tiempo de retiro en bovinos. No se recomienda
administrarla en bovinos menores de cuatro meses de edad.
La aplicacin parenteral ha causado lesiones spticas por
Clostridium sp y miositis, incluso fatales. Los ensayos en
animales de laboratorio muestran que la abamectina B
1a

no se absorbe por va oral en mamferos y se elimina por
completo en las heces en dos das. Para bovinos el tiempo
de retiro es de 30-45 das, dependiendo de la presentacin
farmacutica que se haya aplicado, en cambio para ovinos
es de 14 a 21 das (Sumano y Ocampo 2006). Palma y
col (2006) realizaron un estudio para determinar los ni-
veles de residuos de ABM y triclobendazol (TCBZ) en
tejidos comestibles de bovinos tratados con la formulacin
comercial que contiene la asociacin de ambos frmacos
para administracin va oral en bovinos. Se utilizaron 16
bovinos con un peso promedio de 232 37,5 kg, los cuales
fueron tratados con la asociacin ABM-TCBZ a una dosis
de 0,2 mg de ABM/kg pv y 10 kg de TCBZ/kg pv. Los
animales fueron sacrificados en grupos de tres a cuatro
animales por semana desde el da siete hasta el da 42
posterior al tratamiento. No se registraron concentraciones
detectables de ABM en grasa, rin y msculo a los 14,
28 y 42 das postratamiento. Las mayores concentraciones
residuales de ABM fueron observadas en las muestras
de hgado (4,02 ng/g), las que persisten por un perodo
de 14 das. Estos hallazgos se pueden atribuir a la alta
lipofilicidad de ABM que le confiere mayor afinidad por
el tejido heptico.
Seguridad ambiental. La ABM se degrada rpidamente
en la superficie del suelo, donde sufre fotodegradacin,
y se han informado vidas medias desde 8 h hasta un da.
Cuando se aplica en la superficie del suelo y no se protege
del sol, la vida media en el suelo es de aproximadamente
una semana. Bajo la oscuridad y en condiciones aerbi-
cas, ese valor es de dos semanas a dos meses. La ABM se
degrada rpidamente en el agua. Su vida media en agua
superficial estancada es de cuatro das, y en sedimento
estancado, de dos a cuatro semanas. La ABM sufre una
rpida fotodegradacin y tiene vida media en el agua de
12 h. Las plantas no absorben la ABM a partir del suelo.
El frmaco se degrada rpidamente cuando est presente
en forma de una capa delgada (superficie de las hojas); en
un laboratorio bajo estas condiciones y en presencia de luz,
su vida media fue de 4 a 6 h (Sumano y Ocampo 2006).
La ABM es atxica para las aves, la DL50 en codorni-
ces es > 2000mg/kg. En organismos acuticos la ABM es
altamente txica para los peces y extremadamente txica
para invertebrados acuticos. Aunque la ABM es altamente
txica para los organismos acuticos, las concentraciones
encontradas en aguas superficiales adyacentes a reas
tratadas suelen ser bajas (Sumano y Ocampo 2006).
EFICACIA DE LAS LACTONAS
MACROCCLICAS PARA EL CONTROL
DE GARRAPATAS EN BOVINOS
En el cuadro 2 se presentan las eficacias, vas de
aplicacin y persistencia de IVM, DRM, MXD, EPM y
ABM a diferentes dosificaciones contra la garrapata R.
(B.) microplus.
Por un lado, en otros estudios se compararon IVM
contra MXD (0,2 mg/kg pv) por va SC, obteniendo una
eficacia del 99% la IVM y del 99,1% la MXD sobre la
reduccin de hembras que alcanzaron la replecin; y sobre
la reduccin de la oviposicin de hembras adultas que
alcanzaron la replecin. Por otra parte, tambin se evalu
la eficacia de ambas LM contra larvas de R. (B.) micro-
plus en bovinos infestados en condiciones controladas a
las semanas uno y cuatro PT, reportndose eficacias para
IVM del 82,4% (1 sem) a 0,0% (4 sem) y para MXD del
92,4% (1 sem) a 19,5% (4 sem) (McKellar y Benchaoui
1996, Davey y col 2005).
Bridi y col (1992) evaluaron la eficacia de la ABM
para el control de R. (B.) microplus en bovinos usando
0,1, 0,2 y 0,3 mg/kg pv va subcutnea y encontraron una
reduccin en el ndice de reproduccin de las garrapatas de
90, 94 y 96% respectivamente, no observndose diferencia
significativa en las distintas dosis evaluadas.
RESISTENCIA DE RHIPICEPHALUS (BooPHILUS)
MICRoPLUS A LAS LACTONAS MACROCCLICAS
La alta liposolubilidad de las LM le confiere caractersticas
farmacocinticas de alto volumen de distribucin, con una
gran afinidad por la grasa corporal. Debido a estas caracte-
rsticas y a la disponibilidad en el mercado de LM de larga
accin (IVM-3,15%, IVM-4%, MXD-10%), estos frmacos
al ser aplicados a los bovinos persisten en sangre, grasa y
piel por perodos prolongados, exponiendo a las garrapatas
a concentraciones letales o subletales que pudieran generar
en el futuro poblaciones de garrapatas resistentes.
La resistencia a LM ha sido mundialmente descrita
en algunas especies de nematodos. Casos de nematodos
gastrointestinales resistentes a la IVM han sido reportados
en Argentina, Brasil, Venezuela, Estados Unidos, Nigeria,
India, Bangladesh, Australia y Nueva Zelanda (Fashanu y
Fagbemi 2003, Soutello y col 2007). Sin embargo, slo se
han reportado garrapatas R. (B.) microplus resistentes a la
IVM en la ganadera bovina de Brasil (Martins y Furlong
2001, Klafke y col 2006). Debido al uso cada vez ms
frecuente de las LM en los ranchos bovinos para el control
de endo- y ectoparsitos en Mxico (Soberanes 2007) y
algunos reportes de ganaderos sobre la baja eficacia de las
LM cuando son aplicadas, es necesario realizar monitoreos
constantes de la susceptibilidad de R. (B.) microplus a las
LM para poder detectar tempranamente casos de resistencia
que permitan establecer oportunamente las medidas de
control pertinentes.
121
RHIPICEPHALUS (BooPHILUS) MICRoPLUS, LACTONAS MACROCCLICAS, CONTROL, BOVINOS
CONCLUSIONES
Se concluye que las LM por su alta liposolubilidad se
distribuyen ampliamente en los tejidos, siendo eficaces
para el control de R. (B.) microplus en el ganado bovino.
La eficacia de la IVM, DRM, MXD, EPM y ABM de corta
accin es similar (> 90% de eficacia a las cuatro semanas
PT) para el control de fases adultas de R. (B.) microplus;
sin embargo, existen en el mercado LM de larga accin
que presentan eficacia > 95% con persistencia hasta 70 das
PT. Los resultados de las investigaciones demuestran que
las LM son una buena alternativa de control de garrapatas
en el ganado bovino. Debido a la elevada persistencia de
las LM (en especial las de larga accin) en los tejidos de
bovinos tratados y al contacto constante de las garrapatas a
estos frmacos podran en el futuro promover la generacin
de poblaciones de garrapatas resistentes. Por tal motivo,
el monitoreo constante de la susceptibilidad de R. (B.)
microplus a las LM se hace necesario con la intencin de
detectar casos tempranos de resistencia y establecer los
programas de control pertinentes.
RESUMEN
En esta revisin se describe en detalle la composicin qumica,
farmacocintica, presentacin y dosis, seguridad y tiempo de retiro y la
seguridad ambiental de los grupos que componen a las LM: avemectinas
(ivermectina, doramectina, eprinomectina, abamectina) y milbemicinas
(moxidectina). Adems se presenta una discusin sobre su eficacia y el
problema de resistencia de Rhipicephalus (Boophilus) microplus a las
LM. Se concluye que las LM por su alta liposolubilidad se distribuyen
ampliamente en los tejidos, siendo eficaces para el control de R. (B.)
microplus en el ganado bovino. La eficacia de la ivermectina, doramectina,
eprinomectina, abamectina y moxidectina de corta accin es similar
(> 90% de eficacia a las cuatro semanas postratamiento, PT) para el
control de fases adultas de R. (B.) microplus; sin embargo, existen
en el mercado LM de larga accin que presentan eficacia > 95% con
persistencia hasta 70 das PT.
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Cuadro 2. Eficacia y persistencia de las lactonas macrocclicas sobre Rhipicephalus (Boophilus) microplus.
Efficacy and persistence of macrocyclic lactones on Rhipicephalus (Boophilus) microplus.
Principio activo
Dosis
(mg/kg/pv)
Va de aplicacin Eficacia (%)
Persistencia
(das PT)
Autor
Ivermectina 0,5% 0,5 Tpica 85 23 Davey and George 2002
Ivermectina 0,5% 0,2
0,5
1,0
Tpica
Tpica
Tpica
50
85
91
35
35
35
Cramer y col 1988
Ivermectina 1% 0,2 Subcutnea 99 28 McKellar y Benchaoui 1996, Davey y col 2005
Ivermectina 1% 0,2 Subcutnea 80 35 Cramer y col 1988
Ivermectina 3,15% 0,63 Subcutnea 87 63 Borges y col 2008
Ivermectina 3,15% 0,63 Subcutnea 95 56 Arieta-Romn 2008
Moxidectina 0,5% 0,5 Tpica 79 23 Davey y George 2002
Moxidectina 1% 0,2 Subcutnea 95-99 28 Aguilar-Tipacamu y Rodrguez-Vivas 2003,
Remington y col 1997, Coracostantogolo 1993
Moxidectina 10% 1,0 Subcutnea >95 70 CNACSA 2007, Arieta-Romn y col 2008
Doramectina 0,5% 0,5 Tpica 89 21 George y Davey 2004
Doramectina 1% 0,2 Subcutnea 94 21 George y Davey 2004
Doramectina 1% 0,2 Subcutnea 91-99 28 Muniz y col 1995
Eprinomectina 0,5% 0,5 Tpica 88 23 Davey y George 2002
Eprinomectina 0,5% 0,5
1,0
Tpica
Tpica
90
98
35
35
Aguirre y col 2005
Ivermectina 2,25%
+ Abamectina 1,25%
0,45 + 0,25 Subcutnea 91 63 Borges y col 2008
Abamectina 1% 0,2 Subcutnea 80 21 Pereira 2009
122
RI RODRGUEZ-VIVAS Y COL
Arieta-Romn RJ, RI Rodrguez-Vivas, JA Rosado-Aguilar, GT Ramrez-
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REVISIN BIBLIOGRFICA
Rol de la mitocondria y el estrs oxidativo en el bloqueo del desarrollo
de embriones bovinos producidos in vitro
Mitochondrial rol and oxidative stress in the developmental
blockade of in vitro produced bovine embryos
AM Tarazona
a*
, M Olivera-Angel
b
, YY Lenis
b
a
Grupo de Investigacin BIOGNESIS, Facultad de Ciencias Agropecuarias,
Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln, Colombia.
b
BIOGNESIS, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia, Medelln, Colombia.
SUMMARY
One of the biggest obstacles in the in vitro embryo production for basic research, commercial purposes, or conservation, is the blockade of the early
cleavage, which occurs on a species-specific manner in a particular stage of development. To explain this phenomenon some causative factors have
been postulated such as: disturbances in chromatin, cytoskeleton rearrangement, oxidative stress and mitochondrial damage. The latter has received
considerable attention because mitochondrion is a source of reactive oxygen species (ROS), and oxidative stress is a critical mediator of physiological
and pathological states. Over the past years it has been shown that hydrogen peroxide (H
2
O
2
) is a pivoting molecule able to trigger cell death by
different mechanisms that may or may not involve the transcription factors such as NFB-p53, and is executed by effector caspases. It is believed that
mitochondria may play an important role as a producer or as a target of H
2
O
2
, and as a mediator in apoptotic death of embryos. The purpose of this
review is to present the state of the art about apoptosis triggered by oxidative stress and mediated by mitochondria in in vitro produced bovine embryos,
as part of the explanation for the low efficiency in this process.
Palabras clave: apoptosis, NFB, potencial transmembranal mitocondrial, p53.
Key words: apoptosis, NFB, mitochondrial transmembranal potential, p53.
INTRODUCCIN
Un fenmeno comnmente observado durante la pro-
duccin de embriones in vitro es el bloqueo del desarrollo
temprano, el cual ocurre en una etapa concreta del clivaje
para cada especie. Se han postulado diferentes hiptesis
que explican este fenmeno, las cuales involucran desr-
denes en la cromatina, reorganizacin del citoesqueleto,
estrs oxidativo y daos mitocondriales (Meirelles y
col 2004).
En la ltima dcada se han desarrollado mltiples
trabajos en torno al papel de la mitocondria durante el
desarrollo temprano, especialmente su relacin con la pro-
duccin de especies reactivas de oxgeno (EROs) (Brookes
2005). Ya se ha demostrado que la cadena respiratoria
de la membrana interna mitocondrial produce perxido
de hidrgeno (H
2
O
2
), molcula capaz de desencadenar
muerte celular mediada principalmente por NFB y
p53 y ejecutada por caspasas efectoras; esta ruta se ha
estudiado en linfocitos como modelo de estrs oxidativo
en enfermedades neurodegenerativas como Alzheimer y
Parkinson (Jimnez Del Ro y col 2003) y en embriones
bovinos (Vlez y col 2007). Aunque el H
2
O
2
ha sido asociado
con el detenimiento del desarrollo embrionario temprano,
los mecanismos celulares y moleculares por los cuales
ocurre el detenimiento se desconocen. En este contexto, se
sabe que la mitocondria est jugando un papel importante
como productora o blanco del H
2
O
2
y como mediadora de
la muerte por apoptosis (Vlez y col 2007).
Durante el desarrollo temprano la apoptosis es un
mecanismo importante para el mantenimiento de un
nmero adecuado de clulas funcionales y sanas; sin
embargo, existen umbrales mnimos y mximos para la
presentacin de apoptosis asegurando la homeostasis. Si
el ndice apopttico es elevado la presencia masiva de
clulas muertas podra daar la homeostasis del embrin
y consecuentemente detener su desarrollo y morir (Fabian
y col 2005
b
). No obstante, el umbral de apoptosis que
es detrimental para el desarrollo temprano an no se ha
establecido en las diferentes especies. Se sabe que los
embriones no competentes no culminan el clivaje exi-
tosamente y se bloquea su desarrollo entes de alcanzar
el estado de blastocisto, mientras que los competentes
regulan la presentacin de apoptosis y alcanzan los es-
tados preimplantatorios.
Aceptado: 10.03.2010.
* Calle 59#63-20, Medelln, Bloque 50 oficina 316, Colombia;
arielmarcel@gmail.com
126
AM TARAZONA Y COL
BLOQUEO DEL DESARROLLO
EMBRIONARIO TEMPRANO
Los sistemas de produccin de embriones in vitro
simulan las condiciones del ambiente oviductal y uterino,
buscando igualar las tasas de desarrollo embrionario in vivo
hasta estados preimplantatorios (Meirelles y col 2004).
Se calcula que en promedio los laboratorios pierden entre
el 60 y el 70% de los oocitos madurados in vitro, debido
a que posterior a la fertilizacin el cigoto es incapaz de
sobrellevar el clivaje exitosamente y se bloquea antes de
alcanzar el estado de blastocisto (Lequarre y col 2003).
El detenimiento en el desarrollo que comnmente sufren
los embriones producidos in vitro ocurre en un estado
especfico segn la especie (quinto ciclo celular en conejo,
cuarto en gatos, tercero en humanos, segundo en ratn);
para el caso de los bovinos el detenimiento ocurre durante
el cuarto ciclo celular (Memili y First 2000), es decir,
en el paso del embrin de 8 a 16 clulas, momento que
coincide adems con la activacin completa del genoma
embrionario (De Sousa y col 1998).
Se plantea que el bloqueo de los embriones es conse-
cuencia de la incapacidad para activar genes importantes
para el desarrollo (p53, p21, Bax, Bcl-2) y del estrs pro-
ducido por el ambiente alterado al cual estn sometidos
(temperatura, humedad, pH, gases, etc.) (Greenwood y
Gautier 2005). Por otra parte, Meirelles y col (2004) su-
gieren que el bloqueo no es un fenmeno pasivo, sino que
requiere la participacin activa de rutas de sealizacin
que demandan la activacin del genoma embrionario. La
pregunta central de cul es la causa del bloqueo se man-
tiene sin una respuesta clara y el fenmeno an no est
bien entendido. Sin embargo, cabe cuestionarse si este
fenmeno podra estarse presentando bajo las condicio-
nes in vitro como un mecanismo biolgico para eliminar
aquellos embriones que no cumplan con ciertos criterios
de calidad embrionaria.
Una hiptesis es que las condiciones in vitro podran
estar afectando la dinmica de distribucin y funcin de las
mitocondrias y stas a su vez desencadenaran apoptosis y
generaran el bloqueo de los embriones bovinos (Serrano
y Olivera-Angel 2003).
PAPEL DE LA MITOCONDRIA
EN EL DESARROLLO TEMPRANO
Las mitocondrias son importantes para el funcionamiento
celular porque producen adenosintresfosfato (ATP), regulan
el ciclo de Krebs, el metabolismo de cidos grasos, urea
y ciertas hormonas, median procesos de muerte celular,
regulan el balance inico y almacenan cofactores impor-
tantes para la homeostasis (Tarazona y col 2006). En los
oocitos y los embriones, las mitocondrias son esenciales
para la realizacin de muchas de sus funciones. Acerca
del desarrollo temprano el papel de las mitocondrias ma-
ternas domina sobre las paternas, ya que las mitocondrias
espermticas son ubiquitinadas y eliminadas cuando el
espermatozoide ingresa al ooplasma (Jansen y col 2004).
Se sabe que durante el desarrollo del oocito el nmero de
mitocondrias vara desde unas pocas (aproximadamente
10) en las clulas germinales premigratorias alcanzando
200 en el estado de oogonia. Los oocitos primarios con-
tienen aproximadamente 6.000 mitocondrias y durante la
maduracin citoplsmica el nmero se incrementa hasta
ms de 100.0000 (Cummins 2004) con una o dos copias
de mtADN cada una, con pocas crestas y algunas vacuo-
las. Despus de la fertilizacin y durante el desarrollo
temprano, las mitocondrias maduran formando nuevas
crestas y adems pueden aparecer en diferentes estados
de maduracin (Bavister y Squirrell 2000), sugiriendo la
existencia de varias poblaciones con distintos niveles de
actividad y diferentes fases de maduracin (Tarazona y
col 2006).
En la actualidad se han descrito algunos patrones de
distribucin y actividad mitocondrial en diferentes esta-
dos del desarrollo embrionario, y se considera que este
es un importante parmetro para evaluar la competencia
potencial de los oocitos y los embriones. Segn Cummins
(2004), se deben considerar dos aspectos en la evaluacin,
mitocondrial: cualitativo y cuantitativo, aspectos que han
sido poco estudiados a travs del desarrollo temprano de
los embriones de diferentes especies como ratn (Van
Blerkom y col 2002), hamster (Barnett y col 1996), bovino
(Stojkovic y col 2001), primate (Bavister y Squirrell 2000)
y humano (Wilding y col 2001). Hasta el momento existe
solo un reporte sobre la dinmica mitocondrial completa
de la actividad a travs de todo el desarrollo temprano
desde el oocito hasta el blastocisto en el modelo bovino
in vitro (Tarazona y col 2006).
En el trabajo de Tarazona y col (2006) se evaluaron
1.816 embriones bovinos en diferentes estados, al igual
que oocitos inmaduros y maduros, demostrando que sola-
mente unos pocos oocitos inmaduros muestran actividad
mitocondrial, debido posiblemente a que la mayora de
mitocondrias estn todava inmaduras (Wilding y col 2001)
y la mayor parte de la energa es suplida pasivamente
por las clulas de granulosa. Tambin se encontr que des-
pus de la maduracin in vitro de los oocitos la actividad
mitocondrial aumenta y la distribucin se torna difusa en
el ooplasma. Aparentemente altos niveles de actividad
mitocondrial son necesarios para los eventos celulares
involucrados en la maduracin, los cuales son dependientes
de generacin de ATP, tal como la maduracin nuclear y la
competencia meitica, maduracin del citoplasma (Picton
y col 1998), rearreglo del citoesqueleto (Wang y Lessman
2002) y la acumulacin de ARNms necesarios para el
desarrollo temprano antes de la activacin completa del
genoma embrionario (Trounson y col 2001). La secuen-
cia correcta de estos eventos y sus mecanismos no son
claros an, pero esta actividad ha sido tambin reportada
previamente por Bavister y Squirrell (2000). Se sabe que,
aunque existen otras vas para la produccin de energa, el
127
APOPTOSIS, NFB, POTENCIAL TRANSMEMBRANAL MITOCONDRIAL, P53
ATP producido por fosforilacin oxidativa (OXPHOS) en
la mitocondria es esencial para la supervivencia, pero el
papel de las mitocondrias y los mecanismos de regulacin
de la actividad metablica mitocondrial no son claros an
(Turcotte 2003).
En los embriones la segregacin de mitocondrias en
todos los estados es asimtrica, excepto en el estado de
dos clulas (Tarazona y col 2006). Se sabe poco de la im-
portancia de la distribucin subcelular de las mitocondrias,
pero la literatura es controversial, ya que se han descrito
diferentes patrones: difuso y pericitoplsmico (Tarazona y
col 2006); esta descripcin es contraria a la descrita por Abe
y col (2002) quienes reportaron un patrn de distribucin
perinuclear en el desarrollo temprano, este ltimo patrn
tambin fue descrito por Tarazona y col (2006) pero sola-
mente en los blastocistos expandidos. Probablemente este
patrn se asocia con una actividad nuclear aumentada para
la produccin de ARNs, necesarios en la preparacin del
citoplasma para la posterior implantacin embrionaria en
los estados subsiguientes. Bowerman (2000) ha sugerido
que las blastmeras pueden especializarse o polarizarse
precozmente con diferentes demandas energticas y esto
explicara los diversos patrones de distribucin y segre-
gacin observados, posiblemente relacionados con los
ejes de clivaje embrionario y la posterior diferenciacin
celular (Sardet y col 2004).
Posterior a la eclosin la distribucin de las mitocon-
drias en las blastmeras del trofoectodermo cambia de
perinuclear a pericitoplsmico, mientras que en las clulas
de la masa interna la distribucin se mantiene sin cambio
(Tarazona y col 2006). Esta diferencia podra ser explicada
por el hecho de que las clulas trofoblsticas comienzan
la expresin de protenas de adhesin y otras molculas
importantes para el reconocimiento materno-embrionario
(Lu y col 2002). La reorganizacin citoplasmtica de las
blastmeras trofoectodrmicas para el reconocimiento
materno-embrionario y la adhesin consume grandes
cantidades de ATP y posiblemente esto contribuye a la
migracin de las mitocondrias cerca de la membrana plas-
mtica, demandando ms energa las clulas trofoblsticas
que las clulas de la masa interna.
Los patrones de actividad mitocondrial medidos como
el potencial de membrana interna estn muy relacionados
con la produccin de EROs. En el estudio de Tarazona y
col (2006) se encontr que los embriones hasta las 168
horas postinseminacin (hpi) mantienen un nivel medio
de actividad mitocondrial. Hasta las 50 hpi la mayora de
los embriones (~92%) tuvieron un nivel intermedio de
actividad y solamente unos pocos (~8%) tuvieron muy
poca actividad, pero a las 72 y 168 hpi hubo un cambio
dramtico hacia una mayor proporcin de embriones
exhibiendo muy bajos niveles de actividad (29% a 72
hpi, y 69%, a 168 hpi). No se encontraron embriones con
alto nivel de actividad y una posible explicacin ha sido
recientemente propuesta, en la cual los oocitos y embriones
necesitan un umbral de OXPHOS para sobrevivir y que
este umbral cambia durante el movimiento del embrin
hacia el tero, donde la tensin de oxgeno es menor que
en el oviducto (Cummins 2004). Adems Lane y Gardner
(1998) sugirieron que los embriones tempranos dependen
del ATP producido por la mitocondria va lactato piruvato,
pero que esta actividad disminuye despus de la activacin
del genoma embrionario (72 hpi); durante este periodo la
mayor ruta metablica usada es la gliclisis anaerbica
(Turcotte 2003), hiptesis sustentada en parte por los
hallazgos de Tarazona y col (2006) donde la actividad
mitocondrial se mantuvo en un nivel medio hasta la
activacin del genoma embrionario y posteriormente
disminuy. Las mitocondrias no se dividen durante los
estados tempranos del desarrollo embrionario, pero lo
hacen despus de la expansin del blastocisto, siendo
estas las que proveen la energa necesaria para el clivaje
temprano, manteniendo el umbral medio de actividad hasta
que nuevas rutas metablicas comiencen a operar.
Esta actividad intermedia encontrada en los embriones
competentes antes de la activacin del genoma posiblemente
est relacionada con un sistema de proteccin adaptativa
contra las EROs producidas por el metabolismo mitocondrial
(Nohl 2005). Estas molculas son controladas por enzimas
como el glutatin o peroxidasas que han sido producidas
y almacenadas durante la maduracin del oocito o por
transcripcin permisiva durante los estados tempranos
(Lonergan y col 2004). As si la actividad mitocondrial
fuera alta en los clivajes tempranos, el embrin morira
a causa de no poder controlar la excesiva produccin de
EROs.
Por lo tanto, una posible explicacin para la no
competencia de algunos embriones podra ser que son
deficientes en su capacidad para eliminar EROs, porque no
hubo acumulacin o transcripcin permisiva suficiente de
barredores. Se evidencia la necesidad de realizar estudios
de las relaciones causa-efecto por tcnicas no invasivas
que permitan seguir una misma muestra a travs de todos
los estados del desarrollo temprano.
Despus de la activacin del genoma al ingresar al
tero, el embrin encuentra una concentracin de oxgeno
ms baja, la ruta de gliclisis anaerbica es preferida
y la produccin de EROs es controlada (Thompson y
col 2000), lo cual es acorde con los reportes de activi-
dad mitocondrial despus de las 72 hpi cuando inicia
la transcripcin (Tarazona y col 2006). Otros autores
tambin han reportado que la gliclisis anaerbica es
la principal ruta usada en el desarrollo del blastocisto
(Turcotte 2003).
Estas investigaciones sugieren que durante los estados
iniciales de desarrollo la competencia de los embriones
depende de la produccin mitocondrial de ATP como fue
descrito por Lane y Gardner (1998), ya que los embriones
no competentes tienen baja actividad mitocondrial y su
clivaje es bloqueado antes de la activacin del genoma.
Esto evidencia un importante papel de la energa produ-
cida por la mitocondria en el proceso de activacin del
128
AM TARAZONA Y COL
genoma. La energa en los estados tempranos es produ-
cida va aminocidos, lactato y piruvato, mientras que el
exceso de produccin de energa por la ruta glucoltica
es nociva en estos estados; al parecer se requiere de un
umbral mnimo de actividad mitocondrial para suplir
las demandas de las blastmeras (Tarazona y col 2006).
Esto est aparentemente en desacuerdo con Van Blerkom
y col (2000), quienes sugirieron que los embriones no
dependen solamente del ATP mitocondrial; sin embargo,
estos autores no propusieron otras posibles fuentes de
energa y la duda permanece sin esclarecerse.
Los embriones no competentes son incapaces de superar
el bloqueo ya sea porque no logran el umbral mnimo de
actividad y sus mitocondrias son insuficientes al inicio
del desarrollo (Cummins 2001), o porque a pesar de que
sus mitocondrias son normales, sus niveles de barredores
son insuficientes para eliminar los EROs producidos por
la cadena respiratoria.
Ya que la mitocondria est involucrada en la produccin
de EROs por la cadena respiratoria para la produccin de
energa, est tambin asociada con el balance del estado
REDOX del citoplasma de las blastmeras embrionarias,
pudiendo de esta forma alterar la competencia para el
desarrollo temprano. Es posible que la regulacin de la
distribucin y segregacin pueda estar involucrada en
la complejidad de los ejes de segmentacin durante los
clivajes tempranos (Sardet y col 2004).
REGULACIN REDOX Y DESARROLLO
TEMPRANO
El uso de oxgeno como sustrato para la produccin
de energa en los sistemas aerbicos resulta tambin en la
produccin de EROs, particularmente el anin superxido y
el radical hidroxilo. Las EROs son aceptores de electrones
altamente activos y son capaces de capturar electrones de
otras molculas transformndolas en radicales libres. El
perxido de hidrgeno (H
2
O
2
) no es un radical per se,
pero es un producto de una reaccin de tipo catlisis por
in metlico del anin superxido; tanto el H
2
O
2
como
el anin superxido pueden formar el radical hidroxilo,
el cual es muy reactivo (Harvey 2002).
Las EROs son producidas principalmente a travs de la
cadena de transporte de electrones en la membrana interna
mitocondrial, pero tambin son producidas en el citoplasma
por la NADPH-oxidasa unida a membrana, por la enzima
citocromo p450 y por el sistema xantina-xantina oxidasa
(Mostefai y col 2008). Las clulas poseen diversos meca-
nismos para contrarrestar el efecto de las EROs, entre los
cuales se encuentran los sistemas de catalasas, peroxidasas
y superxido dismutasas dependientes de Cu, Zn y Mn,
algunas de las cuales presentan transcripcin permisiva
durante el desarrollo temprano previo a la activacin del
genoma (Harvey 1995).
Se sabe que tanto el estado de oxidorreduccin
celular como el metabolismo son cambiantes a lo largo
del desarrollo embrionario temprano y es diferente
entre las especies. Durante el paso hacia el estado de
blastocisto ocurre un cambio de fosforilacin oxidativa
a gliclisis anaerbica como fuente de ATP, indicando
que los estados preimplantatorios requieren un estado
ms oxidado que reducido, favoreciendo la adapta-
cin al medio uterino, el cual es ms hipxico que el
oviductal (Harvey 2002). Las altas tensiones de O
2

(aproximadamente 20%) en los cultivos in vitro podran
estar ocasionando una excesiva produccin de EROs y
la muerte embrionaria temprana. El papel de las EROs
durante el desarrollo temprano es controversial, debido
a que los resultados han sido diversos cuando se induce
la produccin de EROs o se aplican antioxidantes en los
medios (Thompson y col 1996).
Las mitocondrias generan EROs en la cadena respiratoria
pero el mecanismo exacto an no se ha dilucidado. Una
hiptesis sugiere que el primer sitio de produccin es el
complejo I, que puede generar el radical superxido va
reduccin del oxgeno por el centro hierro-azufre (N
2
) del
complejo y H
2
O
2
de una forma independiente del potencial
de membrana. Otro sitio de produccin sera el citocromo
oxidasa del complejo III, que puede generar radical super-
xido va ubisemiquinona y H
2
O
2
solamente si el potencial
de membrana es alto (Nohl y col 2005). Otra hiptesis es
que el flavinmononucletido (FMN) en el complejo I sera
la fuente de H
2
O
2
. El sitio exacto de generacin de EROs
por la mitocondria se mantiene an sin esclarecer, ya que
el superxido producido por la cadena transportadora de
electrones es transformado inmediatamente a H
2
O
2
por
la superoxidodismutasa Mn (Mn SOD), este ltimo es el
que se mide como indicador de la produccin de EROs
(Kowaltowski y col 2001). Las EROs cumplen funciones
como participar en rutas de sealizacin, pero tambin
pueden generar estados patolgicos o conducir a la muerte
celular (Liu y col 2002).
APOPTOSIS DURANTE EL DESARROLLO
TEMPRANO
El trmino apoptosis hace referencia a un proceso
de muerte celular programada que se reconoce por una
morfologa nuclear especfica que la diferencia de la ne-
crosis (Kerr y col 1972). La apoptosis se caracteriza por:
contraccin y aumento en la densidad celular, cromatina
picntica y empaquetada en fragmentos distribuidos en
la periferia nuclear, el ADN se hidroliza en fragmentos
de aproximadamente 185 pb debido al clivaje especfico
ejecutado entre los nucleosomas y es un proceso bajo
control gentico (Majno 1995).
La apoptosis en los embriones se ha convertido en
una temtica importante de investigacin, debido a que
se ha planteado su posible papel en la respuesta celular
al estrs ambiental y las condiciones subptimas para el
desarrollo in vitro (Betts y col 2001). Sin embargo, esta
ocurre de forma fisiolgica durante el desarrollo temprano
129
APOPTOSIS, NFB, POTENCIAL TRANSMEMBRANAL MITOCONDRIAL, P53
(Milligan y Schwartz 1997) y su principal funcin es la
de eliminar las clulas defectuosas y controlar la pobla-
cin celular (Jacobson y col 1997, Fabian y col 2005
a
).
Un conocimiento detallado de las caractersticas de la
apoptosis durante el desarrollo temprano es necesario para
implementar medidas que conduzcan al mejoramiento de
la calidad y supervivencia de los embriones producidos in
vitro, debido a que el aumento en el ndice apopttico es
un indicador de manejo inadecuado de las condiciones in
vitro (Rubio y col 2005).
Las posibles causas de apoptosis durante el desarrollo
temprano son: anormalidades cromosomales y nuclea-
res (Hardy 1999), inapropiado potencial de desarrollo
(incompetencia), desbalance hormonal y de factores de
crecimiento (Fabian y col 2005
a
) y exposicin a factores
nocivos como EROs (Yang y col 1998), irradiacin UV
(Zhou y Steller 2003) o choque trmico (Paula-Lopesa
y Hansen 2002).
El proceso apopttico puede desencadenarse por dos
vas: la extrnseca que involucra receptores de muerte
y la intrnseca mediada por la mitocondria. Durante la
apoptosis la permeabilidad de la membrana mitocondrial
se incrementa, permitiendo la salida del citocromo c para
la formacin del complejo apoptosoma que conllevan a
la cascada de activacin de caspasas 3, 9 y efectoras que
conducen a la muerte celular (Little y Mirkes 2002). Aparte
del papel pivotante de la mitocondria en la ejecucin de la
apoptosis, las EROs producidas por la cadena respiratoria
podran estar involucradas en la induccin de la misma
(Fleury 2002).
MODELO DE APOPTOSIS MEDIADO POR EROs
Debido a que el estrs oxidativo es un factor importante
en el bloqueo del desarrollo temprano in vitro y que el pe-
rxido es producido endgenamente por los embriones, la
ruta apopttica inducida por H
2
O
2
podra explicar en parte
el detenimiento del ciclo celular que sufren los embriones
bovinos (Tarazona y col 2006) (figura 1).
Se ha comprobado que el H
2
O
2
media la apoptosis
en linfocitos de sangre perifrica por un mecanismo
que puede estar mediado por factores de transcripcin
como NFB, p53 y c-Jun (Jimnez del Ro y col 2002).
Se sabe que hay una protena tirosina quinasa SyK que
activada por H
2
O
2
es la responsable de la fosforilacin
que provoca la inhibicin de IkB, a su vez responsable
de mantener inactivo a NFB en el citoplasma (Takada
2003) (figura 1). Sin embargo, este modelo no aplica para
los embriones bovinos, donde el H
2
O
2
media apoptosis
de forma independiente de estos factores de transcripcin
(Vlez y col 2007).
Tanto p53 como NFB son factores de transcripcin
importantes en la regulacin de la apoptosis. Al parecer
existe una comodulacin entre ambos factores de trans-
cripcin, pudiendo mutuamente aumentar o disminuir su
actividad.
FACTOR DE TRANSCRIPCIN P53
El factor p53 es una molcula ubicua que participa
en diversas funciones celulares como: regulacin del
ciclo celular, diferenciacin, reparacin del ADN,
envejecimiento, recombinacin y apoptosis (Favetta y
col 2004). Aunque es un factor de transcripcin cuenta
con una actividad propia para mediar rutas como la
apoptosis intrnseca (Jimnez del Ro y Vlez 2002).
Se sabe que es capaz de activar o represar por lo menos
100 genes estudiados, sin embargo, los anlisis de
bioinformtica sugieren que la cifra podra superar los
4.000 (Lu 2005). Esto indica la gran importancia de este
factor para el mantenimiento de una relacin mitosis/
apoptosis adecuada.
Para cumplir con sus mltiples funciones el p53 es
regulado a nivel de transcripcin y traduccin, tambin
sufre varias modificaciones postransduccionales como
fosforilacin, acetilacin, metilacin y glicosilacin.
Como mediador de la reparacin del ADN el p53 favorece
la transcripcin de GADD 45, p48, p53R2, APE1 y pol-,
influyendo as en la reparacin por excisin de bases
(Hofseth 2004).
Como regulador de la muerte celular programada puede
participar tanto en la va apopttica extrnseca (mediando
transcripcin de receptores de muerte) como en la va
apopttica intrnseca (mediando transcripcin de factores
pro y antiapoptticos o induciendo directamente la aper-
tura del poro de transicin mitocondrial) (Vousden 2002)
(figura 1). Por ser guardin del ciclo celular se considera
fundamental en los procesos de desarrollo temprano. Las
mutaciones sobre p53 lo pueden convertir en un oncogen,
favoreciendo la replicacin celular no controlada (Lu
2005), lo mismo ocurre cuando es bloqueado de forma
irreversible (Vlez y col 2007).
FACTOR DE TRANSCRIPCIN NFB
El NFB est presente en estado de reposo en el cito-
plasma de todas las clulas, consiste de una familia de
protenas que contienen el dominio Rel y a su vez estn
inhibidas por una familia de protenas que contienen un
dominio de anclaje, entre estas ltimas se encuentran
IB, IB, IB y IB (Shishodia 2004).
El NFB se considera un factor de transcripcin que
puede actuar en dos vas antagnicas, ya que la direccin
de sus efectos depender del momento en el ciclo celular,
el grado del estmulo y el ambiente intra y extracelular
(Shishodia 2004). Participa en la regulacin del ciclo celular
produciendo factores de proliferacin como citoquinas y
tambin en la muerte celular produciendo factores tanto
proapoptticos (c-myc, Fas) como antiapoptticos (IAP,
protenas de la familia Bcl-2) (figura 1).
La expresin de NFB durante el desarrollo temprano
indica que este se requiere para responder a estmulos
ambientales o estrs intracelular, se ha sugerido que la
130
AM TARAZONA Y COL
Figura 1. Ruta de sealizacin de apoptosis mediada por estrs oxidativo y mitocondria. (Adaptado y modificado de Parone y col 2002,
Fleury y col 2002, Susin y col 1996). Anti: factores antiapoptticos; C: citocromo c; EIM: espacio intermembranal; Fe: Hierro;
GPO: glutatin peroxidasa oxidado; GR: glutatin reducido; GSH: glutatin; GSSG: glutatin oxidado; H
2
O
2
: perxido de hidrgeno;
I, II, III, IV: complejos de la cadena respiratoria; MEM: membrana externa mitocondrial; MIM: membrana interna mitocondrial;
NFB: factor de transcripcin nuclear kappa B; P53: factor de transcripcin p53; Pro: factores proapoptticos; SOD: Superoxidodis-
mutasa; UQ: ubiquinona.
El perxido producido por la mitocondria puede desencadenar apoptosis por varios mecanismos que pueden involucrar o
no la activacin de factores de transcripcin, capaces de regular la viabilidad celular a travs de la expresin de genes tanto pro como
antiapoptticos. Sea cual sea la va, el citocromo c sale de la membrana externa mitocondrial y forma el complejo apoptosoma junto
con la procaspasas-9 y el Apaf-1, finalmente la apoptosis es desencadenada y ejecutada por caspasas efectoras.
Apoptosis signaling pathway mediated by oxidative stress and mitochondria. (Adapted from Parone y col 2002, Fleury y col 2002, Susin
y col 1996).
The peroxide produced by mitochondria can trigger apoptosis by several mechanisms that may or may not involve the activation of transcrip-
tion factors, they are able to regulate cell viability through gene expression of both pro, and antiapoptotic. Whatever the way, cytochrome c are released
from mitochondrial outer membrane and forms the apoptosome complex with procaspase-9 and Apaf-1, then apoptosis is triggered and executed by
effector caspases.
activacin de NFB en el estado de una clula en los
embriones de ratn es necesaria para el progreso en la
segmentacin y desarrollo de los estados subsiguientes.
En embriones bovinos el uso de bloqueadores de NFB
demostr que es esencial en la regulacin del clivaje (Vlez
y col 2007). La relacin de NFB con las EROs es incierta,
pero se sabe que el estrs oxidativo es capaz de mediar
su activacin como factor de transcripcin (Jimnez del
Ro y col 2002).
APOPTOSIS POR H
2
O
2
EN EMBRIONES BOVINOS
Existe asociacin entre la acumulacin de H
2
O
2
y la
presentacin de apoptosis en los embriones bovinos. Sin
embargo, los embriones no competentes muestran un
potencial transmembranal mitocondrial (PTM) muy bajo
como para producir el perxido va mitocondrial (Vlez y
col 2007). Con relacin a estos resultados, se han generado
dos hiptesis para explicar este fenmeno:
131
APOPTOSIS, NFB, POTENCIAL TRANSMEMBRANAL MITOCONDRIAL, P53
1) El H
2
O
2
es producido por el alto potencial mito-
condrial (Nohl y col 2005) durante la maduracin del
oocito, y aquellos embriones que son capaces de barrer el
H
2
O
2
progresan en el clivaje sincrnicamente (embriones
competentes), aquellos que no son capaces de barrerlo lo
acumulan y se bloquean en el cuarto ciclo celular (em-
briones no competentes); 2) Los altos ndices de H
2
O
2
que
presentan los embriones no competentes pueden produ-
cirse de una forma independiente del PTM por fallas en
la cadena respiratoria (Cadenas y Davies 2000). De esta
forma el H
2
O
2
acumulado por los embriones no compe-
tentes podra ser una de las causas del bloqueo temprano
y de la presentacin de apoptosis.
Los embriones no competentes acumulan H
2
O
2
y
muestran los ms bajos niveles de PTM, adems presentan
un elevado ndice de caspasas activas que conducen a la
apoptosis y al bloqueo del desarrollo (Tarazona y col 2006,
Vlez y col 2007). Esto sugiere que la apoptosis es me-
diada por el H
2
O
2
acumulado y es ejecutada por caspasas.
Contrariamente, los embriones competentes no presentan
acumulacin de H
2
O
2,
probablemente porque el H
2
O
2
pro-
ducido por los niveles intermedios de PTM es barrido por
los limpiadores producidos y de esta forma controlado, y
as, se presenta un ndice apopttico que se supone normal
para la formacin del blastocele y el control de calidad de
clulas defectuosas (Tarazona y col 2006, Vlez y col 2007).
Lo anterior demuestra una clara diferencia en la actividad
mitocondrial y produccin de H
2
O
2
entre los embriones
competentes y no competentes (Tarazona y col 2006).
Se ha comprobado que el H
2
O
2
es capaz de inducir
la activacin de NFB como factor de transcripcin
proapopttico (Takada y col 2003). Sin embargo, para el
caso de los embriones bovinos, se ha demostrado que el
bloqueo de este factor de trascripcin es detrimental para
el desarrollo embrionario, lo que sugiere que durante
el desarrollo temprano el NFB tiene otras funciones
diferentes al inicio de la muerte celular programada por
apoptosis (Vlez y col 2007). Esta hiptesis se sustenta
en los hallazgos realizados por Nishikimi y col 1999,
quienes reportaron que una de las subunidades del NFB,
el REL A, se expresa en los oocitos y embriones de ratn
durante todo el desarrollo temprano, pero su ubicacin
nuclear solo se demostr en el estado de cigoto. Las c-
lulas trofoblsticas expresan tanto p52/p100 como RelA
(subunidades del NFB), lo que indica una diferencia de
expresin dependiente del estado de desarrollo y del tipo
celular (Torchinsky y Toder 2004).
Los hallazgos de Vlez y col (2007) sugieren un papel
ms complejo del NFB durante el desarrollo temprano, ya
que al bloquearlo los embriones presentaron una segmen-
tacin asimtrica que difiere del patrn de segmentacin
de los mamferos que es simtrico rotacional, pero que
no correspondi con proliferacin ni con muerte celular
excesivas.
En el caso de p53 que tambin est involucrado en la
mediacin de apoptosis por H
2
O
2
, cuando este es bloqueado
en los embriones estos comprometen su viabilidad e inician
un proceso de divisin descontrolada (Vlez y col 2007).
Aunque uno de los papeles ms conocidos de p53 es su
funcin clave dentro de las rutas de respuesta a condiciones
de estrs celular, en los embriones bovinos parece no estar
involucrado en el proceso de detenimiento del ciclo celular.
En la hiptesis planteda por Vlez y col (2007), el H
2
O
2
generara apoptosis ejecutada por caspasas; sin embargo,
cuando se bloque la caspasa 3 de forma irreversible se
observ una segmentacin acelerada de los embriones.
Previos estudios han demostrado que la inhibicin ge-
neralizada de las caspasas es nociva para el desarrollo
embrionario temprano y recientemente se ha planteado
que las caspasas podran tener otras funciones diferentes
a su bien conocida funcin como ejecutoras de la muerte
celular por apoptosis; sin embargo, an no es claro cules
podran ser esas funciones (Zakeri y col 2005).
CONCLUSIN
A pesar de que la tcnica de produccin de embriones
bovinos in vitro lleva ms de dos dcadas, las tasas de
produccin y la calidad de los embriones an no son lo
suficientemente altas para cubrir las necesidades en los
campos de la investigacin y la reproduccin asistida. El
detenimiento del clivaje durante el desarrollo temprano
del embrin es la principal causa de esta baja eficiencia.
Esta revisin muestra que el estrs oxidativo es uno de los
mediadores del bloqueo y que la mitocondria es la organela
directamente implicada en este proceso. Un nivel mnimo
de actividad mitocondrial podra regular la competencia
embrionaria para alcanzar el estado de blastocisto, lo que
evidencia que la mitocondria es la principal organela para
la regulacin del balance REDOX y por ende fundamen-
tal en los procesos fisiolgicos que regulan el desarrollo
embrionario temprano. Las fallas en la funcionalidad
mitocondrial conllevan a que los embriones produzcan y
acumulen H
2
O
2
que desencadenara la muerte celular por
apoptosis y los hara no competentes para alcanzar el estado
de blastocisto. Esta apoptosis es ejecutada por caspasas de
una forma independiente de NFB y p53 a diferencia de
otros modelos celulares, lo que sugiere que los embriones
cuentan con mecanismos de regulacin alternativos para
la supervivencia o muerte celular. El estrs oxidativo por
H
2
O
2
es una de las causas del detenimiento y muerte de
los embriones bovinos producidos in vitro. Sin embargo,
se evidencian mltiples vacos en el conocimiento de las
rutas celulares y moleculares de regulacin del desarrollo
embrionario temprano y de muerte o supervivencia, por lo
cual se sugiere realizar nuevas investigaciones encaminadas
a dilucidar estos vacos y se permita una mayor comprensin
de la complejidad de estos fenmenos biolgicos.
A la luz de los resultados mostrados en la literatura, se
sugiere evaluar los protocolos de produccin de embriones y
modificarlos de tal manera que se favorezca la capacidad del
embrin para contrarrestar los efectos nocivos del ambiente
132
AM TARAZONA Y COL
oxidante, y les permita lograr la competencia morfolgica
y funcional necesarias para alcanzar los estados preim-
plantatorios. Aunque se han realizado estudios enfocados
a la resolucin de este problema, los resultados son con-
troversiales y poco satisfactorios, por lo que se evidencia
la necesidad de nuevas investigaciones en esta rea.
RESUMEN
Uno de los mayores obstculos en la produccin de embriones in
vitro con fines de investigacin bsica, comerciales, o de conservacin,
es el detenimiento temprano del clivaje que ocurre de forma especfica
en una etapa del desarrollo. Para explicar este fenmeno se han postulado
diferentes factores causales como: desrdenes en la cromatina, rearreglos
del citoesqueleto, estrs oxidativo y daos mitocondriales. Esta ltima
propuesta ha recibido gran atencin, debido a que la mitocondria es
fuente de especies reactivas de oxgeno (EROs) y el estrs oxidativo
es un mediador crtico de procesos fisiolgicos y estados patolgicos.
Durante los ltimos aos se ha demostrado que el perxido de hidrgeno
(H
2
O
2
) es una molcula pivotante capaz de desencadenar muerte celular
por diferentes mecanismos que pueden involucrar o no a los factores
de transcripcin: NFB - p53, y es ejecutado por caspasas efectoras.
Se cree que la mitocondria podra estar jugando un papel importante
como productora o como blanco del H
2
O
2,
y como mediadora en la
muerte por apoptosis de los embriones. El objetivo de esta revisin es
mostrar el estado del arte en cuanto a la apoptosis desencadenada por
estrs oxidativo y mediada por la mitocondria en los embriones bovinos
producidos in vitro, como parte de la explicacin del bloqueo del clivaje
y la baja eficiencia que an se tiene en este proceso.
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REVISIN BIBLIOGRFICA
Aceptado: 03.12.2009.
#

Sanfe03 Proyecto Lechero. Acciones para el desarrollo territorial
de la Provincia de Santa Fe, Argentina.
* rea de Investigacin en Produccin Animal, INTA EEA-Rafaela,
Santa Fe, C.C. 22 (2300), Argentina; gbretschneider@rafaela.inta.
gov.ar; bretschneider3@hotmail.com
Una actualizacin sobre el meteorismo espumoso bovino
#
An update on frothy bloat in cattle
G Bretschneider
*
Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria (INTA), Estacin Experimental
Agropecuaria (EEA)-Rafaela, Santa Fe, Argentina.
SUMMARY
Frothy bloat is a digestive disorder that limits productivity in dairy and beef cattle. Many factors are involved in the sudden onset of bloat, however, in
some cases, there is a lack of supporting evidence for their implication in the development of this disorder. To date, it is unknown what triggers the rapid
oncoming of frothy bloat and, as a result, there are no completely effective control measures. This article analyzes the factors that are best characterized
and that are most relevant for the development of frothy bloat. Current control measures available for cattle are also reviewed.
Palabras clave: Meteorismo espumoso, empaste, pH ruminal, protelisis ruminal.
Key words: frothy bloat, cattle management, ruminal pH, ruminal proteolysis.
INTRODUCCIN
Gran parte de los sistemas de produccin de carne y
leche basan su cadena forrajera en el uso de pasturas cul-
tivadas. Las leguminosas, puras o asociadas, representan
un componente importante de las mismas, tanto por su
calidad alimenticia como por su capacidad restauradora de
la fertilidad de los suelos; sin embargo, en algunas pocas
del ao su aprovechamiento se encuentra restringido a
causa de su efecto meteorizante sobre el ganado bovino
(Latimori y col 1992).
El meteorismo espumoso (ME) es una alteracin di-
gestiva caracterizada por la distensin del retculo-rumen
como consecuencia de la acumulacin de gas proveniente
de la fermentacin microbiana del alimento, el cual es
atrapado en pequeas burbujas de gran estabilidad. Esto
impide su normal eliminacin mediante la eructacin y
ocasiona alteraciones circulatorias y respiratorias que
pueden producir la muerte del animal (Howarth 1975).
Adems de las prdidas asociadas a mortandad de ani-
males, existen prdidas subclnicas que se manifiestan en la
disminucin de la produccin de carne y leche en los animales
afectados por un grado moderado del trastorno digestivo
(Laby 1991). La produccin de leche puede disminuir hasta
un 7% cuando los animales sufren un trastorno digestivo
leve, mientras que cuando el ME es severo, el descenso
en la produccin lctea puede alcanzar el 11% (Stockdale
1976). El ME tambin resulta una limitante en el proceso de
adopcin tecnolgica, como la utilizacin de variedades de
alfalfa sin latencia invernal y la implementacin de pastoreos
intensivos (Latimori y col 1992).
El ME ocurre principalmente cuando los animales
pastorean leguminosas como alfalfa (Medicago sativa L.),
trbol blanco (Trifolium repens L.) o trbol rojo (Trifolium
pratense L.) puras o asociadas con otras especies (Howarth
1975, Majak y Hall 1990). Se ha descrito tambin la presen-
tacin de ME en bovinos que pastorean trigo como verdeo
de invierno (Howarth y Horn 1984). Entre las forrajeras
no meteorizantes pueden citarse el trbol de cuernitos
(Lotus corniculatus L.), astrgalo (Astragalus cicer L.),
esparceta (onobrychis viciifolia Scop.) (Hall y col 1994)
y la mayora de las gramneas (Fay y col 1992).
La susceptibilidad al ME vara entre razas y entre
individuos de una misma raza (Howarth 1975). Factores
hereditarios influiran en la susceptibilidad al mismo
(Wilkins y Morris 1992). Probablemente, las diferencias
en susceptibilidad racial sean similares a las diferencias
observadas entre animales de una misma raza (Howarth
1975). Se ha demostrado que la mortalidad por ME puede
ser hasta tres veces menor en vacas lecheras adultas que
en vaquillonas (Carruthers y col 1987, Laby 1991). Las
vacas lecheras de mayor produccin seran ms propensas
a meteorizarse debido al mayor consumo diario de materia
seca (MS) (Colucci y Sienra 1982). La tasa de mortalidad
para la raza Jersey fue tres veces superior a la descrita para
la raza Holstein (Laby 1991). Segn Carruthers y col (1987)
la tasa de mortalidad por ME en vacas lecheras fue mayor
durante la primavera (0,68% promedio de tres aos) que
en los meses de otoo (0,23%, promedio de dos aos).
136
G BRETSCHNEIDER
Reid y col (1975) sostienen que no existen diferencias en
el consumo total de forraje entre un animal susceptible y
otro no susceptible al ME. Phillips y col (1996) registraron
una adaptacin de los animales al ME despus de un
perodo de pastoreo de dos semanas.
El ME ocurre tpicamente durante las primeras horas de
comenzado el pastoreo (Hall y Majak 1989). Este hecho se
asoci a la teora de la velocidad de digestin inicial, la
cual seala que las leguminosas meteorizantes presentan
mayor fragilidad en su pared celular que las leguminosas
no meteorizantes (Howarth y col 1978). Lees y col (1981)
indican que la resistencia de la pared celular determina la
velocidad de ruptura celular. Ante una menor resistencia,
el proceso de masticacin y el posterior ataque microbiano
al material vegetal (Howarth y Horn 1984) provocan una
rpida liberacin ruminal de los constituyentes intracelulares,
fundamentalmente hidratos de carbono solubles y protenas
solubles, que tienen un rol principal en el desarrollo del
ME. Dichos componentes se acumulan en cantidades que
resultan crticas para la formacin de espuma (Howarth
y col 1978). Posteriormente, Fay y col (1981) postularon
que las hojas de las leguminosas meteorizantes liberaban
sustancias solubles quimiotcticas (hidratos de carbono y
aminocidos) a travs de sus estomas, las cuales favoreceran
la atraccin microbiana hacia esos sitios. Esto se consider
como otro factor determinante de la mayor velocidad inicial
de digestin de las leguminosas meteorizantes.
El gas generado durante el ME proviene de la fermen-
tacin del alimento y de la acidificacin del bicarbonato
ruminal debido a la produccin de cidos grasos voltiles
(AGV) (Waghorn 1991
a
). Cangiano y Fay (1994) indican
que entre los componentes alimenticios, los hidratos de
carbono solubles son, inicialmente, la principal fuente
de produccin de gas debido a su rpida fermentacin a
nivel ruminal.
Leedle y col (1982) sugirieron que la solubilidad de
los hidratos de carbono del forraje y las vas de fermen-
tacin microbianas utilizadas despus de la alimentacin
determinan la velocidad de fermentacin de los diferentes
carbohidratos del alimento. En este sentido, los autores
indican que la tasa de fermentacin sera mxima para los
hidratos de carbono solubles, intermedia para el almidn
y mnima para la celulosa y hemicelulosa.
Las protenas solubles son los principales constituyen-
tes de la espuma y a su vez responsables de los cambios
en la viscosidad y tensin superficial del licor ruminal
(Walgenbach y Marten 1980). Las protenas solubles de
las hojas de alfalfa fueron clasificadas en dos fracciones:
la fraccin I (Ribulosa difosfato carboxilasa), de alto peso
molecular, y la fraccin II, compuesta por diferentes pro-
tenas de bajo peso molecular (Jones y Lyttleton 1969).
Ambas fracciones estn involucradas en el desarrollo del
ME (Howarth y col 1977). El 65% de las protenas solubles
del forraje se liberan durante el proceso de masticacin,
conduciendo a un aporte inmediato de componentes es-
tabilizadores de la espuma a nivel ruminal (McArthur y
Miltimore, 1969). Segn Majak y col (1995) la produccin
de espuma en los animales propensos a sufrir ME podra
ser atribuida a una menor tasa de pasaje de la fase lquida
del contenido ruminal a regiones posteriores del tracto
digestivo.
Waghorn (1991
a
) sostiene que la tasa de produccin de
gas puede afectar la formacin de espuma estable, aunque
la ocurrencia de ME dependera de la presencia de los
componentes capaces de estabilizar la espuma. El bajo
contenido de fibra y la elevada concentracin de protenas
solubles de las leguminosas inmaduras, asociados a un flujo
salivar reducido generan un contenido ruminal viscoso,
donde el gas queda retenido (Reid y col 1984, Majak y
col 1995). En cambio, Moate y col (1997) concluyeron
que el ME se originara por una alteracin en el proceso
de eructacin y sealaron que la produccin de gas y la
presencia de espuma persistente no seran factores des-
encadenantes del trastorno digestivo.
La disminucin en la frecuencia de las contracciones
del rumen no es un factor etiolgico del ME (Frost y
col 1978, Colvin y Backus 1988); por el contrario, las
contracciones ruminales incrementan su frecuencia durante
el comienzo del mismo, especialmente la onda B, la cual
est relacionada con la eructacin, y slo en el estado
final del trastorno digestivo la motilidad ruminal puede
cesar totalmente (Colvin y Horn 1984). Segn Waghorn
(1991
b
), un incremento en las contracciones del rumen
sera incapaz de facilitar la eructacin una vez que la
espuma est presente.
Hall y col (1988) sealaron que los animales reducen
el consumo de forraje entre un 18 y un 25% antes de ma-
nifestar el primer signo clnico de ME. Majak y col (1995)
sugirieron que los disturbios gstricos generados por la
espuma pueden ser los responsables de la disminucin en
el consumo, aun en ausencia de sintomatologa clnica.
Durante el ME clnico se produce un cese en el consumo
de forraje (Clarke y Reid 1974, McArthur y Miltimore
1969). Dougherty y col (1992) propusieron que el cese del
consumo y de la actividad de pastoreo estaran asociados
a la estimulacin de los receptores mecnicos de la pared
del retculo-rumen, por efecto de la espuma. El mecanismo
fsico generado por la distensin del tracto gastrointestinal
tambin puede estar involucrado en la disminucin del
consumo (Allen 1996). Colvin y Backus (1988) indicaron
que el intenso malestar que manifiesta el animal debido
a la distensin ruminorreticular puede ser el responsable
de muchas de las manifestaciones clnicas.
Las pectinas, saponinas y algunos minerales tambin se
mencionan como causales del ME (Clarke y Reid 1974).
Asimismo, diversos factores inherentes al animal, al clima
y al manejo jugaran roles importantes en su presentacin
(Howarth y col 1991).
En Argentina, si bien se reconoce la importancia del ME
principalmente en los sistemas de invernada y de produc-
cin lechera, an no se ha determinado la magnitud de las
prdidas totales originadas por este trastorno. Asimismo,
137
METEORISMO ESPUMOSO, EMPASTE, PH RUMINAL, PROTELISIS RUMINAL
a nivel mundial, no existen evaluaciones actualizadas de
las prdidas econmicas ocasionadas por el ME. Por otro
lado, debido a que nicamente se contabilizan las prdidas
asociadas a la muerte y el remplazo de los animales, las
mismas subestiman los efectos negativos del ME sobre
la rentabilidad de los sistemas ganaderos (Clarke y Reid
1974).
AMBIENTE RUMINAL
Majak y col (1982) establecieron que la susceptibilidad
de los animales al ME est relacionada con las condiciones
del rumen previo al pastoreo. Esta predisposicin estara
principalmente asociada a la actividad y composicin de
la comunidad microbiana ruminal. Entre otros factores,
el pH (Jones y Lyttleton 1972) y la actividad proteoltica
ruminal (Fay y col 1986) tambin se asociaron a la pre-
sentacin del ME.
POBLACIONES MICROBIANAS RUMINALES
La poblacin de microorganismos ruminales, depen-
diendo de su ubicacin en el rumen, se divide en tres grupos
(Cheng y col 1980): 1) microorganismos asociados a la
pared del rumen; 2) microorganismos libres en el fluido
ruminal y 3) microorganismos asociados a las partculas
de alimento. El grupo adherido al material particulado
puede clasificarse a su vez en dos subgrupos segn su
fuerza de unin a las partculas alimenticias (fuertemente
y dbilmente adheridas) (McAllister y col 1994); stas re-
presentaran el 70-80% de los microorganismos ruminales
(Craig y col 1987). Los grupos 2 y 3 interactan con las
partculas en digestin (McAllister y col 1994).
La cantidad de microorganismos asociados al material
particulado se incrementa en respuesta a la alimentacin,
alcanzando un pico mximo en las primeras horas post-
alimentacin para luego disminuir progresivamente (Craig
y col 1987). Como consecuencia de la colonizacin micro-
biana del alimento, Leedle y col (1982) demostraron que
se produce una reduccin del 40 al 60% en el nmero de
microorganismos viables asociados al fluido ruminal luego
del consumo. La unin de los microorganismos al forraje
ingerido ocurre generalmente dentro de los primeros cinco
minutos postingestin (McAllister y col 1994).
Bretschneider y col (2001) demostraron una menor
capacidad fermentativa de los licores ruminales de los
animales suplementados con ensilaje de maz previo al
pastoreo de alfalfa. Este hallazgo se interpret como una
consecuencia de la reduccin de los microorganismos
libres disponibles (grupo 2) para actuar sobre las legu-
minosas meteorizantes, inmediatamente despus de la
suplementacin con ensilaje de maz. Sin embargo, y en
contraposicin a esta primera interpretacin, Bretschneider
y col (2007) indicaron que la menor presentacin y seve-
ridad del ME observada con esta medida de manejo no
estara necesariamente asociada a la hiptesis anteriormente
planteada. No obstante, los mismos autores destacan que
la metodologa que se utiliz para medir los grupos de
microorganismos ruminales no era apropiada para evaluar
dicha hiptesis. En este sentido, los autores sostienen
que la medicin de la masa total de microorganismos
libres (vivos y muertos) no refleja el verdadero nmero
de microorganismos viables y disponibles para fermentar
la alfafa inmediatamente despus de la suplementacin
con ensilaje de maz.
PH RUMINAL
Hall y Majak (1989) determinaron que el pH ruminal
del ganado alimentado con alfalfa en estado vegetativo
vara de 5,5 a 6,0, mientras que en un animal con ME el
pH ruminal se encontrara en valores de entre 5,2 a 6,0.
La mxima estabilidad de la espuma se produce a valores
de pH prximos superiores al punto isoelctrico de las
protenas solubles (Jones y Lyttleton 1972) cuando las
cargas elctricas de las protenas se acercan a cero (no hay
repulsin) y tienden a una mxima cohesin entre ellas
(mayor viscosidad de la espuma) (Buckingham 1970). Este
ltimo autor as como Jones y Lyttleton (1972) indican
que la agregacin y precipitacin de las protenas solubles
ocurre cuando el pH de la solucin es igual o inferior a su
punto isoelctrico. Bajo condiciones de mxima fuerza de
unin entre las protenas solubles y mxima viscosidad de
la espuma, la agitacin del medio en el cual se encuentran
genera la agregacin de las protenas en solucin y con-
duce a su precipitacin debido a la prdida de solubilidad
(McArthur y Miltimore 1969).
El punto isoelctrico de la fraccin proteica I (18S) de
las hojas de alfalfa se alcanza a valores de pH de 5,4 a 5,6
(McArthur y Miltimore 1969), mientras que para la fraccin II
el pH que conduce a una mxima estabilidad es ms amplio
(4,5 a 6,0), lo cual demuestra que existen diferentes puntos
isoelctricos para los distintos constituyentes proteicos de
la fraccin II (Jones y Lyttleton 1972).
Bretschneider y col (2007) establecieron la existencia de
una asociacin positiva entre el pH ruminal y la severidad
del ME; sin embargo, aunque estadsticamente significativo
(P < 0,05), el coeficiente de correlacin fue muy bajo
(r = 0,31). Por lo tanto, al igual que lo indicado por Mendel
y Boda (1961), Moate y col (1997) y Bretschneider y
col (2001), los autores sugirieron que el pH ruminal podra
no ser un factor importante en el desarrollo del ME.
ACTIVIDAD PROTEOLTICA DE LA MICROBIOTA RUMINAL
La degradacin de las protenas en el medio ruminal
genera amonio y AGV como productos finales. Este pro-
ceso involucra diversas actividades microbianas como la
hidrlisis de la protena mediante proteasas, la degradacin
de pptidos por peptidasas y, finalmente, la desaminacin
y fermentacin de la cadena carbonada (Cotta y Hespell
1984).
138
G BRETSCHNEIDER
Segn Nolan (1993), un 30 a 50% de las especies
bacterianas ruminales comnmente aisladas presentan
actividad proteoltica. Los protozoarios e inclusive los
hongos (que constituyen una pequea proporcin de la
biomasa ruminal) tambin presentan una elevada actividad
proteoltica. La actividad proteoltica de las bacterias es
6 a 10 veces mayor que la de los protozoarios (Brock y
col 1982), siendo las bacterias Gram negativas las que
presentan mayor actividad (Kopecny y Wallace 1982). Sus
enzimas proteolticas estn asociadas principalmente a la
superficie celular, tanto sobre la cubierta celular como en
el espacio periplsmico (Cotta y Hespell 1984); mientras
que las bacterias Gram positivas liberan sus enzimas al
medio ruminal (Allison 1969).
La localizacin de las proteasas en la superficie celular
implica que la adsorcin rpida e irreversible de las protenas
solubles a la superficie bacteriana (Wallace y Cotta 1988)
sea el primer paso de su proceso degradativo (Broderick y
col 1991). Nolan (1993) sostiene que la mxima solubilidad
de las protenas no siempre conduce a una mayor degrada-
bilidad, debido a que la estructura proteica tambin juega
un rol importante en su susceptibilidad a la degradacin.
Por otro lado, las protenas insolubles no requieren de
la solubilizacin previa para ser degradadas ya que es la
bacteria la que se une a las mismas; esto determina que la
susceptibilidad de las diferentes protenas a la hidrlisis
microbiana est relacionada con su afinidad de adsorcin
(Broderick y col 1991).
La velocidad y extensin de la degradacin proteica
depende de diversos factores que finalmente van a deter-
minar el valor nutritivo de la protena (Wallace y Cotta
1988). Nugent y Mangan (1981) demostraron que la
degradacin de la fraccin proteica I (18S) de las hojas
de alfafa es catalizada principalmente por proteasas bac-
terianas y que la adsorcin de esa fraccin a la superficie
bacteriana para su posterior protelisis es inmediata.
Los autores concluyeron que la hidrlisis inicial es el
paso limitante en la protelisis de la fraccin I, ms que
la posterior degradacin de los pptidos a aminocidos
libres. En este sentido, Fay y col (1986) propusieron
que la reduccin de la actividad proteoltica ruminal
podra estar involucrada en el desarrollo del ME como
consecuencia de una mayor persistencia de las protenas
solubles en el fluido ruminal.
Baintner (1981) demostr que la actividad proteoltica
de los microorganismos ruminales es mxima con valores
de pH cercanos a 6,5 y declina rpidamente a medida que
el pH se reduce. Cotta y Hespell (1984) determinaron que
el pH ptimo para las proteasas bacterianas se encuentra
en el rango de 6 a 7. Tanto los pH cidos como alcalinos
extremos generan una completa inactivacin de las proteasas
ruminales (Baintner 1981). Esta inactivacin est relacio-
nada a un proceso de desnaturalizacin, donde se produce
la prdida de solubilidad y actividad cataltica (Lehninger
1991). Segn Erfle y col (1982) una disminucin del pH
por debajo de 6 conducira a una reduccin en el nmero de
los microorganismos proteolticos ruminales. En relacin
a esto, Bretschneider y col (2001, 2007) describieron una
disminucin en la actividad proteoltica y del pH ruminal
cuatro horas despus de iniciado el pastoreo. Los autores
sugirieron que la protelisis ruminal podra explicar por
qu las protenas solubles que atrapan el gas se acumulan
rpidamente y en gran cantidad en el fluido ruminal al
inicio del pastoreo.
Por otro lado, Ramrez y Mitchell (1960) y Chien y
Mitchell (1970) mencionan la presencia de inhibidores
de las proteasas (inhibidores de la tripsina) en harinas de
alfalfa y Walker-Simmons y Ryan (1977) en hojas de alfalfa.
Estos inhibidores tambin fueron identificados en el fluido
intracelular de las hojas de trigo (Segarra y col 1997).
Chang y col (1978) detectaron que la mayor concentracin
de los inhibidores de la tripsina se encuentra en las hojas
de alfafa fresca en comparacin con los tallos y la planta
entera, y observaron que su concentracin aumentaba a
medida que la planta avanzaba en su estado fenolgico.
Hazlewood y col (1983) identificaron dos inhibidores de
la tripsina asociados a la fraccin proteica I de las hojas
de alfalfa y propusieron que ambos podran interferir con
la protelisis ruminal. Tambin se identificaron enzimas
ruminales con actividad semejante a la tripsina (Brock
y col 1982). La posibilidad de que los inhibidores de la
tripsina tengan alguna implicancia en el desarrollo del
ME es sostenida por Hazlewood y col (1983).
MEDIDAS DE CONTROL
Se ha propuesto un conjunto de medidas para atenuar
el potencial meteorizante de las especies forrajeras invo-
lucradas en el desarrollo del ME, sin embargo, las mismas
no son extrapolables de una situacin a otra ni garantizan
un cien por ciento de eficacia.
Latimori y col (1997) recomiendan la utilizacin com-
binada de las diferentes alternativas disponibles con el fin
de aumentar la eficacia en el control del ME.
Entre las medidas de control ms reconocidas se
pueden citar:
UTILIZACIN DE LAS LEGUMINOSAS EN ESTADO
AVANZADO DE MADUREZ
La madurez de las leguminosas es uno de los facto-
res ms importantes a tener en cuenta en la prevencin
del ME (Howarth y col 1991). Segn Howarth y Horn
(1984), el incremento de la proporcin de fibra en el
forraje maduro y la mayor resistencia de la pared celular
a la ruptura durante los procesos de digestin, reduciran
el riesgo de ME.
La desventaja de esta medida de manejo es la menor
calidad de las leguminosas pastoreadas en estado fenolgico
avanzado. Los rebrotes a nivel de la corona pueden ser
un riesgo potencial a pesar de la madurez de las plantas
(Latimori y col 1997).
139
METEORISMO ESPUMOSO, EMPASTE, PH RUMINAL, PROTELISIS RUMINAL
UTILIZACIN DE PASTURAS ASOCIADAS
La inclusin de gramneas en una pastura de legumino-
sas permite reducir el riesgo de ME; sin embargo, se han
registrado casos de ME en pasturas con una proporcin
de leguminosas que no excede el 25-30% (Ferrari 1994).
Por lo tanto, a pesar de que las leguminosas representen un
bajo porcentaje de la composicin botnica de la pastura,
el riesgo de ME est presente, aunque probablemente con
una intensidad y frecuencia menor.
MARCHITAMIENTO Y DESECAMIENTO DE LAS PASTURAS
Marchitamiento por corte. Los cortes se realizan en cada
franja diaria a 5-7 cm del suelo, en estados del cultivo
que varan entre botn floral y 10% de floracin. Una vez
cortado, el forraje es oreado (aireado) por 36-48 horas en
otoo e invierno y por 12-24 horas en verano y primavera.
El forraje se ofrece en la andana (hilera de forraje cortado);
aunque tambin puede ofrecerse mediante el uso de un
carro forrajero, fuera del lugar de corte. Con esta medida
de control no solo se logr disminuir la presentacin de
ME, sino que tambin fue posible aumentar el consumo de
MS/animal/da en aproximadamente un 25% con respecto
al grupo de animales que consuman la pastura de alfalfa
en pie (Guaita y Gallardo 1997).
En comparacin con las hojas frescas, el oreado (du-
rante 48 horas) de las hojas de alfalfa (Davies y col 1993)
increment el porcentaje de MS en un 87% y disminuy
el porcentaje de protena bruta (% PB) en un 11%. No en-
contraron diferencias en los contenidos de materia orgnica
(MO), pared celular (PC), carbohidratos no estructurales
solubles (CNES) y digestibilidad in vitro de la MS (DIVMS)
y de la materia orgnica (DIVMO). Tambin observaron
una menor produccin de gas cuando las hojas oreadas se
expusieron al ataque microbiano ruminal.
Esta tcnica reducira la presentacin de ME debido a
una menor velocidad de digestin inicial de las hojas de
alfafa en el rumen y a una menor posibilidad de seleccin
de las plantas o partes de las plantas debido a la forma en
que el forraje es presentado al animal.
Desecamiento por herbicidas. Durante varios aos se
utiliz el paraquat (herbicida de contacto) a bajas dosis
como herramienta para el control de ME en los sistemas
de produccin de carne. La dosis utilizada es de 0,200 a
0,250 L/ha (Gramoxone Super - producto comercial) con
un volumen de agua de 80 litros y presin normal. Se debe
aplicar 36-48 horas antes del pastoreo de los animales
(Correa Luna y Damen 1997).
Los resultados en la prevencin del ME son satisfacto-
rios, aunque la respuesta productiva de los animales puede
resultar afectada. Latimori y col (1992) observaron una
reduccin del 15% en la ganancia diaria de peso (GDP) de
los animales que consuman forraje previamente tratado con
paraquat. Esta menor GDP se atribuy a una disminucin
en la calidad y cantidad del forraje tratado debido a la
cada de hojas que provoca el marchitamiento. A partir
de experiencias in vitro, Roig y col (1998) sugieren que
el paraquat a dosis de 10 a 1.000 ppm interferira con la
actividad digestiva de los microorganismos ruminales.
En los tejidos de novillos alimentados con alfalfa tra-
tada con paraquat no se detectaron residuos del herbicida
segn los lmites mximos establecidos por el Cdex
Alimentario Internacional (Latimori y col 1992, Correa
Luna y Damen 1997).
En experiencias realizadas durante tres aos en los meses
de primavera-verano el asperjado con paraquat no afect
los rebrotes ni la cantidad de plantas de alfalfa (Correa
Luna y Damen 1997). Davies y col (1994) indicaron que, en
comparacin con hojas frescas, el tratamiento de las hojas
de alfalfa con paraquat (48 horas de accin) incrementa el
% MS en un 52% y la pared celular en un 16%, disminuyen
la DIVMS y la DIVMO en un 7% y no afecta el contenido
de MO, PB y CNES; tambin observaron que las hojas
tratadas producan menos gas cuando eran atacadas por los
microorganismos del rumen. La menor incidencia de ME
podra ser consecuencia de una reduccin en la velocidad
inicial de digestin del forraje desecado.
Otros productos desecantes utilizados para prevenir el
ME son el 2,4-D (herbicida sistmico), el diquat (herbicida
de contacto) y el formol, aunque existe escasa informacin
en cuanto a sus efectos sobre los animales (residuos en
tejidos) y sobre las plantas (calidad, produccin y persis-
tencia) (Cangiano y Fay 1994).
AGENTES ANTIESPUMANTES
Entre los agentes antiespumantes ms conocidos se
pueden citar: siliconas (Ej. dimetilpolisiloxano), aceites
vegetales, grasas animales emulsionadas y vaselina lquida.
Los productos antiespumantes tienen una accin directa
sobre la espuma, impidiendo su formacin al mezclarse
con los constituyentes que la generan (principalmente
protenas solubles) y disminuyendo sus propiedades es-
pumantes (Fay y col 1992).
Estos productos pueden suministrarse en agua de bebida
o rociados sobre las pasturas. Otra forma de aplicacin
sencilla, aunque poco efectiva, es el pincelado del producto
en el flanco del animal. El xito de esta medida depende
de que el animal se lama el flanco antes de comenzar
el pastoreo y/o ante el primer signo de ME. Evidencias
empricas indicaran que los animales aprenden a asociar
el alivio del malestar con el acto de lamerse el flanco
(Stockdale 1991).
PRODUCTOS TENSIOACTIVOS SINTTICOS
Los productos ms conocidos son: los plurnicos (Ej.
poloxaleno) y los alcoholes etoxilados (Ej. Terics). Segn
Laby (1991), los eventos que preceden el comienzo del ME
incluyen la inactivacin que naturalmente ocurre de los
140
G BRETSCHNEIDER
lpidos antiespumantes en el rumen y la reduccin gradual
de la densidad del contenido ruminal; de esta manera, las
propiedades detergentes de los tensioactivos sintticos
permitiran la reactivacin de los lpidos antiespumantes a
travs de la humectacin de la superficie de los fragmentos
del forraje en digestin y la suspensin o emulsificacin
de los lpidos vegetales en el fluido ruminal.
Dougherty y col (1992) demostraron que el poloxa-
leno afecta el comportamiento ingestivo prolongando
el tiempo de pastoreo, lo cual podra deberse en parte
al alivio del ME. En este sentido, Laby (1991) indica
que la mejor respuesta productiva observada con el uso
de productos tensioactivos sintticos puede deberse a
un incremento en la densidad del contenido ruminal, lo
cual permite aumentar la tasa de pasaje y el consumo
de los animales.
A diferencia de los productos antiespumantes los agentes
tensioactivos sintticos poseen la ventaja de que con una
dosis baja se logra una mayor potencia y persistencia en
el rumen (Colucci y Sienra 1982). Entre los mtodos ms
conocidos para la administracin de los agentes tensioac-
tivos sintticos se pueden citar los siguientes:
Tomas individuales (drenching). Se considera el mtodo
ms efectivo y confiable para la prevencin del ME. Debido
al tiempo de accin en el rumen (aproximadamente 12
horas para el poloxaleno) se deben administrar dos dosi-
ficaciones al da. La administracin se realiza en la sala
de ordea mediante la utilizacin de pistola dosificadora
(Stockdale 1991).
Rociado sobre las pasturas. Es un mtodo muy confiable
si el proceso se realiza correctamente. Permite que los
animales consuman la dosis diaria requerida del agente
antimeteorizante durante el pastoreo. La principal limitante
de este mtodo est asociada a las condiciones climticas
que pueden afectar la distribucin uniforme del produc-
to. El viento y la lluvia son las variables climticas ms
influyentes. La lluvia lava el producto antimeteorizante
de la pastura y exige un nuevo rociado previo al ingreso
de los animales a la parcela. El pastoreo puede realizarse
inmediatamente despus de la aplicacin del producto
ya que ste ejerce su efecto sobre el animal y no sobre la
planta (Stockdale 1991).
Mezclado en la racin. Es un mtodo efectivo y tan confia-
ble como la administracin del producto antimeteorizante
mediante tomas indivuales (drenching), siempre que
se asegure el consumo total del suplemento (Stockdale
1991). Es un mtodo prctico para utilizar durante la
suplementacin en la sala de ordea. Si se logra un con-
sumo uniforme resultara un mtodo ms sencillo que
la administracin por tomas diarias. Es el mtodo ms
difundido en los establecimientos lecheros de Uruguay
(Colucci y Sienra 1982). Debido a su baja palatabilidad
se puede usar melaza para su administracin.
Diluido en el agua de bebida. Es un mtodo prctico pero
poco confiable ya que el consumo de agua puede variar
en cantidad (3 a 11% del peso vivo [PV]) y frecuencia
(Stockdale 1991). Adems, la elevada proporcin de agua
de las leguminosas potencialmente meteorizantes conduce
a una disminucin en el consumo de agua. Es necesario el
empleo de dosificadores en el agua de bebida de manera
que se respeten las concentraciones requeridas.
En bloques para lamer. Es un mtodo muy poco confiable
ya que no es posible asegurarse que todos los animales
accedan a lamer los bloques (Stockdale 1991).
En conclusin, las formas de administracin ms
confiables y seguras son aquellas en las cuales las dosis
preventivas llegan al rumen de todos los animales antes
que se presenten las condiciones que generan el ME. Tal
es el caso de las tomas individuales, el rociado sobre las
pasturas y el mezclado en la racin.
En los tambos de Nueva Zelanda y Australia el mtodo
ms utilizado es la administracin en tomas individuales
durante el ordee
1
. Waghorn y Shelton (1994) indican
que esta forma de prevencin no es efectiva en todos los
animales y que la variacin en la respuesta puede deberse
a diferencias en la estabilidad de la espuma y/o a una baja
dispersin del producto debido a un mezclado inadecuado
con el contenido ruminal, lo que implicara que el producto
se concentre en la zona craneal del retculo-rumen, pasando
rpidamente al abomaso.
El uso de detergentes domsticos es inefectivo en la
prevencin del ME (Majak y col 1995).
IONFOROS
Entre los ionforos ms utilizados en la prevencin del
ME se encuentran la monensina, cuyas propiedades estn
ampliamente descritas en la bibliografa, y la lasalocida.
La monensina es un antibitico comnmente utilizado en
las raciones del ganado de feedlot con el objetivo de
aumentar la eficiencia de conversin del alimento, reducir
el riesgo de acidosis y para la prevencin y control de la
coccidiosis (Vogel 1995). En condiciones de pastoreo,
el empleo de monensina mejor la GDP (Oliver 1975,
Bretschneider y col 2008) y redujo la presentacin de ME
(Branine y Galyean 1990, Majak y col 1995).
Lowe (1991) atribuye la reduccin en la incidencia de ME
al efecto de la monensina sobre el patrn de fermentacin
ruminal, al generar un incremento en la proporcin de cido
propinico a expensas de una reduccin en la proporcin
de cido actico, lo cual determina una disminucin en la
produccin de metano (CH
4
) y dixido de carbono (CO
2
).
Laby (1991) propone a la reduccin de la proporcin de
CH
4
en la mezcla de gases ruminales como la principal
causa por la cual disminuye la presentacin de ME debido
1
Ulyatt MJ, comunicacin personal.
141
METEORISMO ESPUMOSO, EMPASTE, PH RUMINAL, PROTELISIS RUMINAL
a que el CH
4
presenta mayor capacidad estabilizante de
la espuma que el CO
2
. La mayor solubilidad del CO
2
en
agua le permite atravesar ms fcilmente las paredes de
la burbuja, en cambio el CH
4
quedara retenido dentro de
sta. Por otro lado, Branine y Galyean (1990) atribuyen
la reduccin de la presentacin de ME al aumento del
pH ruminal que genera la monensina con respecto al
pH < 6,0 que sera necesario para una mxima estabilidad
de la espuma (McArthur y Miltimore 1969). Sin embargo,
Moate y col (1997) no encontraron diferencias significativas
(P > 0,05) en la composicin del gas de fermentacin ni
en el pH ruminal de vacas lecheras dosificadas con bolos
de liberacin lenta de monensina. En consecuencia, el
mecanismo por el cual la monensina reduce el ME es
an desconocido.
La eficacia de los ionforos en el control del ME
fue analizada por Majak y col (1995), quienes indicaron
una reduccin del 50% en la incidencia de ME. Estudios
realizados en Australia y Nueva Zelanda con bolos de libe-
racin lenta de monensina han demostrado una reduccin
de un 80% en la tasa de mortandad y en la incidencia de
casos clnicos de ME (Moate y col 1997). Experiencias en
Argentina han demostrado que mediante el uso de monensina
se logr disminuir la incidencia de ME en un 50-80%; sin
embargo, en condiciones de alto riesgo no se evitara la
aparicin de casos agudos (Latimori y col 1997).
La monensina puede administrarse con los suplementos
(por ejemplo, maz, sorgo, etc.), los cuales actuaran como
vehculo, o mediante el empleo de bolos de liberacin
lenta. Estos ltimos, una vez administrardos, liberan el
aditivo diariamente durante aproximadamente 100 das
(Bretschneider y col 2008). Sin embargo, cuando es ad-
ministrada mediante un vehculo, la monensina debe ser
cuidadosamente dosificada y mezclada con el suplemento
para prevenir sobredosis y toxicidad. Potter y col (1984)
recomiendan que la monensina se dosifique a razn de
100 mg/animal/da durante los primeros cinco das de
administracin y 200 mg/animal/da durante el resto de
la suplementacin. Para una dosificacin segura se reco-
mienda una concentracin mxima de monensina en el
suplemento de 440 ppm (mg/kg).
MEDIDAS DE MANEJO DEL PASTOREO
Momento de ingreso a la nueva parcela. Se demostr que
el pastoreo temprano en la maana aumenta el riesgo de
ME con respecto al pastoreo tarde en la maana (aproxi-
madamente a las 11:00-12:00 h) (Majak y col 1995). Esto
indica que es aconsejable el cambio de parcela despus
del medioda cuando el roco o las heladas ya desapare-
cieron (Hall y Majak 1995, Majak y col 1995). Ambos
factores provocan una mayor turgencia de las hojas, lo
cual determina una mayor fragilidad ante la masticacin
y la digestin por los microorganismos ruminales. Esto
implica una mayor velocidad inicial de digestin y un
ambiente ms propenso para el desarrollo del ME.
Tiempo de permanencia en la parcela. El pastoreo
continuo de alfalfa (24 h/da) redujo el riesgo de ME
con respecto al pastoreo de 6 horas diarias (Majak y
col 1995). Los sistemas de pastoreo que promueven un
vaciamiento ruminal rpido y continuo (ms bypass,
menos produccin de gas) reduciran el riesgo de ME
(Majak y col 1995).
Grado de ayuno previo al pastoreo. La produccin de gas
por s misma es irrelevante en la generacin de ME si los
agentes estabilizadores de la espuma no estn presentes
(Moate y col 1997). Waghorn (1991
b
) determin que el
ayuno previo al pastoreo genera un pH ruminal elevado
que contribuye a una mayor produccin de CO
2
durante
las primeras horas de pastoreo debido a la acidificacin
del bicarbonato ruminal. Por lo tanto, bajo esta situacin,
la presencia de los agentes estabilizadores de la espuma
contribuye a un mayor riesgo de ME. Por otro lado, Fay
y col (1986) sugieren que el ayuno prolongado (24 h)
reduce la actividad proteoltica ruminal, favoreciendo
el atrapamiento del gas en el rumen debido a una mayor
persistencia de las protenas solubles.
Despus de un perodo de ayuno, la mayora de los
animales presentan un mayor consumo en comparacin con
los animales alimentados ad libitum (Baile y McLaughlin
1987). Dougherty y col (1989) determinaron que los pero-
dos de ayuno en animales que pastorean alfalfa generan un
aumento en la tasa de consumo durante la siguiente sesin
de pastoreo. Adems, concluyeron que el comportamiento
ingestivo en respuesta al ayuno del ganado en pastoreo
estara determinado por el tiempo de retencin del forraje
en el tracto digestivo. Sin embargo, no se ha demostrado
que tanto la tasa de consumo (Clarke y Reid 1974, Majak y
col 1995) como el grado de ayuno al momento del pastoreo
sean de importancia en el desarrollo del ME (Walgenbach
y Marten 1980). En este sentido, Howarth (1975) indica
que la tasa de consumo determina la velocidad con que
un animal se meteoriza aunque no determina la frecuencia
del trastorno digestivo.
Suplementacin con heno. Cole y col (1945) determina-
ron que es necesario 4,5 y 7,7 kg de heno de pasto sudan
(Sorghum drummondii)/animal/da previo al pastoreo
para una proteccin parcial y completa contra el ME,
respectivamente. Por lo tanto, las elevadas cantidades a
suministrar determinan que sta sea una medida de preven-
cin poco prctica que, adems, reduce el aprovechamiento
de la pastura. Kitroser y Correa Luna (1993) indicaron
la presentacin de casos de ME en experiencias donde
se suministraron altos consumos de heno (1,7% del PV)
previo al pastoreo de leguminosas. Sin embargo, un trabajo
reciente (Majak y col 2008) mostr que la suplementa-
cin con heno de pasto Ovillo (Dactylis glomerata L.) en
cantidad de 2,5 kg MS/animal/da, previo al suministro
de alfalfa fresca, redujo la ocurrencia de ME (> 90%) en
novillos con fstula ruminal alimentados a corral. Es de
142
G BRETSCHNEIDER
destacar que en este mismo ensayo el heno de alfalfa no
fue efectivo para controlar el ME.
Suplementacin con concentrados energticos y proteicos.
Phillips y col (1996) sostienen que ante el riesgo de ME es
conveniente utilizar aquellos suplementos que se fermentan
lentamente en el rumen y que se consumen en suficiente
cantidad como para reducir los perodos de rpido consumo
del forraje. Por otro lado, los suplementos que contienen
un alto nivel de energa rpidamente fermentecible y un
elevado contenido proteico incrementaran la incidencia
de ME como consecuencia del sinergismo entre el aporte
de energa y nitrgeno, lo cual estimulara la fermentacin
ruminal.
La utilizacin de suplementos que reducen el pH ru-
minal genera condiciones que favorecen el desarrollo del
ME, por esta razn no sera aconsejable la utilizacin de
granos como suplemento para pasturas potencialmente
meteorizantes (McArthur y Miltimore 1969). Howarth y
Horn (1984) sostienen que existe una correlacin positiva
entre el contenido de almidn del forraje y la presentacin
de ME. En este sentido, Peralta y col (2002) mostraron
que la suplementacin con grano de maz entero (1%
PV de MS) previo al pastoreo de alfalfa no reduce la
ocurrencia de ME.
Tambin se han utilizado raciones que contienen un
elevado porcentaje de grasas o taninos para controlar el
ME, sin embargo los resultados no han sido concluyentes
(Colucci y Sienra 1982).
Suplementacin con ensilaje de maz. Pritchard y col (1989)
lograron controlar el ME en vacas lecheras mediante el uso
de ensilaje de maz en una proporcin no inferior al 40%
(5 kg MS/animal/da) de la dieta total. Asimismo, en los
sistemas intensificados de produccin de carne del Instituto
Nacional de Tecnologa Agropecuaria (INTA), Balcarce,
Argentina, se emple la suplementacin con ensilaje de
maz de novillos que pastorean alfalfa, sin que se hayan
registrado casos de ME clnico (Bretschneider 2000).
De Boever y col (1990) sostienen que la masticacin
de ingestin y rumiacin dependen de la naturaleza de la
dieta, y que el principal responsable de esta respuesta es
el nivel de fibra dietario. El proceso masticatorio estimula
la secrecin salival, la cual se requiere para humedecer
el alimento como requisito previo a la colonizacin
microbiana y para aportar sustancias buffer tendientes
a prevenir cambios bruscos del pH ruminal (McAllister
y col 1994). Elizalde y col (1993) indican que el alto
contenido de fibra del ensilaje de maz aumentara la
salivacin y, por lo tanto, provocara un aumento del pH
ruminal en animales alimentados con pasturas de calidad.
Es importante tener en cuenta que la longitud de la fibra
dietaria juega un rol muy importante en la respuesta
masticatoria y, en consecuencia, en el patrn de fermen-
tacin ruminal (Lu 1987, De Boever y col 1993). Por otro
lado, Howarth y Horn (1984) indican que el contenido
de fibra del forraje est negativamente relacionado con
la ocurrencia de ME.
Mediante la informacin obtenida a partir de ocho
ensayos (Stockdale 1994
b
, 1996,1997
a
, 1997
b
) de suple-
mentacin con ensilaje de maz en vacas lecheras realizados
en otoo y primavera sobre pasturas de trbol blanco
(Trifolium repens) y trbol persa (Trifolium resupinatum),
se obtuvo el valor medio y error estndar de los niveles de
sustitucin observados (kg MS de forraje no consumido/
kg MS de suplemento consumido), y de los niveles de
suplementacin (expresados como % PV) utilizados. Los
resultados de estos ensayos indican que para un nivel de
suplementacin de 0,98 0,09% PV en MS de ensilaje
de maz la respuesta sustitutiva fue de 0,20 0,05 kg/kg.
El mayor consumo de MS en los grupos suplementados
demuestra un efecto asociativo del ensilaje de maz con
las leguminosas. El elevado contenido de protenas y mi-
nerales de las leguminosas, asociado al aporte de energa
rpidamente fermentecible (almidn del grano) y el alto
aporte de fibra del ensilaje de maz, lo cual mantiene el
funcionamiento ruminal, determinan la complementarie-
dad de ambas fuentes alimenticias (Pritchard y col 1989,
Stockdale 1994
b
).
Segn Stockdale (1994
a
), el objetivo de la suplementacin
de los rumiantes en condiciones de pastoreo es aportar los
nutrientes que en la dieta base son deficitarios. Segn este
concepto, el ensilaje de maz complementara el desbalance
nutritivo ocasionado por el consumo de leguminosas, dado
que no slo permite obtener una mayor respuesta productiva
debido al consumo elevado de MS (baja tasa de sustitu-
cin), sino que tambin permite utilizar las pasturas en un
estado de mayor calidad al generarse un menor riesgo de
ME. En este sentido, Bretschneider y col (2001 y 2007)
indicaron que la suplementacin con ensilaje de maz
(0,5% PV de MS) previo al pastoreo de alfalfa redujo no
solo la ocurrencia (56 30%), sino tambin la severidad
(38 6,3%) del ME. Stockdale (1994
c
) y Bretschneider
y col (2007) sugirieron que una menor tasa de consumo
inicial sera una de las posibles causas por la cual el uso
del ensilaje de maz, previo al pastoreo de leguminosas
meteorizantes, reducira el riesgo de ME.
Cheng y col (1998) concluyeron que debido a las pre-
siones de los consumidores para reducir el uso de productos
qumicos (antibiticos, detergentes, etc.) en las dietas, y
dado que la aprobacin del uso de aditivos por parte de los
organismos reguladores de alimentos es econmicamente
prohibitiva, las medidas de manejo tendientes a controlar
el ME van a cobrar mayor importancia en el futuro.
PERSPECTIVAS PARA EL CONTROL
DEL METEORISMO ESPUMOSO BOVINO
Nuevas variedades de alfalfa con menor velocidad de
digestin inicial fueron evaluadas por Kudo y col (1985),
quienes demostraron que, durante las primeras horas de
consumo de un cultivar de alfalfa con una tasa de digestin
143
METEORISMO ESPUMOSO, EMPASTE, PH RUMINAL, PROTELISIS RUMINAL
inicial in situ (TDIS) 6% inferior a la TDIS del cultivar
testigo, se generaba una menor concentracin de protenas
y carbohidratos solubles, clorofila, AGV e iones hidrgenos
a nivel ruminal. As, la obtencin de nuevas variedades
de alfalfa con una menor TDIS podra resultar en una
reduccin de su potencial meteorizante.
Hall y col (1994) alimentaron a novillos en pastoreo
y a corral con un cultivar de alfalfa que presentaba una
TDIS 4 a 11% menor que la del cultivar testigo, pero no
observaron una reduccin significativa (P > 0,05) en la
ocurrencia de ME. Los autores sostienen que la falta de
xito se debi a que el cultivar de alfalfa con baja TDIS
estaba muy por debajo de lo recomendado (reducciones
en la TDIS del 20 al 30%) para prevenir el ME.
En Argentina, Basigalup y col (1999) estn trabajando
desde el ao 1991 en un programa de mejoramiento con
el objetivo de seleccionar cultivares de alfalfa con bajo
potencial meteorizante. Los resultados obtenidos hasta el
presente indican una reduccin promedio de 22,7% en la
TDIS (4 horas de incubacin) del tercio superior de la planta
de alfalfa (ProINTA Carmina) que la poblacin original.
Sin embargo, para el mismo cultivar de alfalfa la TDIS de
las hojas del tercio superior del forraje result slo un 4,5%
menor que la TDIS de las hojas del cultivar usado como
testigo (Brbara SP INTA) (Bernldez y col 2007).
Tanner y col (1995) demostraron mediante pruebas in
vitro que los taninos condensados reducen, a dosis depen-
diente, la fuerza compresiva de la espuma generada por las
protenas de las leguminosas. La mayora de las legumino-
sas meteorizantes carecen de taninos foliares (Fay y Dale
1993). En un futuro, la manipulacin gentica permitir la
incorporacin de taninos a las leguminosas meteorizantes
mediante la transferencia de genes de especies portadoras
(Familton 1990, Fay y Dale 1993), aunque ser necesario
determinar su concentracin ptima en el forraje, de modo
que se obtenga un equilibrio que no afecte la digestibilidad
ni la cantidad de protena protegida en las leguminosas
transferidas (Frame y col 1998).
Finalmente, la reduccin en la actividad proteoltica
ruminal en las primeras horas postpastoreo descrita por
Bretschneider y col (2001, 2007) destaca el rol potencial de
la protelisis en la persistencia de las protenas solubles en
el fluido ruminal, como fue sugerido por Fay y col (1986),
y reafirma la hiptesis de Hazlewood y col (1983), que
al conocimiento del autor no ha sido an evaluada, sobre
la implicancia de los inhibidores de las proteasas de la
alfalfa (Ramrez y Mitchell 1960, Chien y Mitchell 1970,
Walker-Simmons y Ryan 1977, Chang y col 1978) en el
desarrollo del ME bovino.
RESUMEN
El meteorismo espumoso bovino es un trastorno digestivo que limita
la produccin en los bovinos para carne y leche. Muchos factores han sido
involucrados como causales del mismo, sin conocerse a ciencia cierta su
influencia en el desarrollo de este trastorno. Actualmente no est claro
el origen etiolgico del meteorismo espumoso y, como consecuencia,
no contamos con una medida ciento por ciento segura para su control,
resultando la misma nicamente paliativa del problema. Este trabajo
resume los aspectos ms estudiados y relevantes sobre la etiologa del
meteorismo espumoso bovino, as como tambin las medidas de control
disponibles hasta la fecha.
AGRADECIMIENTOS
El autor agradece al Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas
y Tcnicas (CONICET), institucin de la cual el autor fue becario durante
el perodo en el que se realizaron los estudios experimentales que se
resumen en esta revisin. Un especial agradecimiento al Dr. Jos Patricio
Fay (INTA, EEA-Balcarce) quien fue mi mentor durante mis estudios de
postgrado en la Unidad Integrada INTA Balcarce/Facultad de Ciencias
Agrarias, Universidad Nacional de Mar del Plata. Se agradece tambin a
la Dra. Sandra. E. Prez (Facultad de Ciencias Veterinarias - Universidad
Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires -UNCPBA-Tandil)
por la lectura crtica del manuscrito.
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Arch Med Vet 42, 147-154 (2010)
ARTCULO ORIGINAL
Aceptado: 16.06.2010.
* Instituto de Ciencias Agrcolas, UABC, carretera Delta S/N, Ejido
Nuevo Len, CP. 21705, Mxico; lar62@hotmail.com
Crecimiento y caractersticas de canal en corderos Pelibuey puros y
cruzados F1 con razas Dorper y Katahdin en confinamiento
Growth and carcass traits in pure Pelibuey lambs and crosses F1 with Dorper
and Katahdin breeds in confinement
U Macas-Cruz
a
, FD lvarez-Valenzuela
a
, J Rodrguez-Garca
a
, A Correa-Caldern
a
,
NG Torrentera-Olivera
a
, L Molina-Ramrez
b
, L Avendao-Reyes
a*
a
Instituto de Ciencias Agrcolas, Universidad Autnoma de Baja California, Baja California, Mxico.
b
Bachillerato Tecnolgico Agropecuario No. 41, Baja California, Mxico.
SUMMARY
The aim of this study was to evaluate feedlot performance and carcass characteristics of 36 male and female lambs from the genotypes pure
Pelibuey, Dorper x Pelibuey, and Katahdin x Pelibuey under desert conditions in northwestern Mexico. Lambs were slaughtered for carcass evaluation
after 85 d of a productive performance test. Dorper x Pelibuey lambs had higher (P < 0.05) daily weight gain and feed intake than the other genotypes.
However, there were no differences (P > 0.05) among the three genotypes in carcass yield, Longissimus dorsi muscle area and back-fat thickness. Males
presented higher (P < 0.01) daily weight gain and lower (P < 0.01) feed conversion than females. Hot and cold carcasses were heavier (P < 0.05) in
males than in females, but carcass yield and back-fat thickness were similar (P > 0.05) between sexes. Yield and total weight of primary cuts were also
similar (P > 0.05) among genotypes and sexes. These findings suggest that the Dorper breed can be used in crossbreeding schemes to improve mutton
production in arid zones, like in northwestern Mexico.
Palabras clave: ovinos de pelo, cruzamientos, crecimiento, canales, estrs calrico.
Key words: sheep, crossbreeding, growth, carcasses, heat stress.
INTRODUCCIN
Las condiciones climticas extremas predominantes en
las zonas desrticas de todo el mundo han sido factores
que afectan el desarrollo de la actividad agropecuaria
en estas regiones debido al estrs que se presenta en el
animal. Pocas razas de las diferentes especies de ani-
males domesticados son capaces de sobrevivir y, ms
an, de producir eficientemente bajo estas condiciones.
Normalmente, este clima exige a las diferentes especies
un mximo de disponibilidad de energa para mantener
la homeostasis en su cuerpo, lo cual limita la produccin
(Marai y col 2007). Algunas razas de ovinos y cabras se
encuentran ampliamente distribuidas bajo diferentes climas
y han demostrado sobrevivir y producir en condiciones
ambientales donde para el ganado sera imposible (El
Khidir y col 1998).
En el noroeste de Mxico, donde las condiciones
climticas son tpicamente desrticas, los ovinos de pelo
de raza Pelibuey han sido adoptados por los productores
para la produccin de corderos en sus explotaciones. Bajo
estas condiciones, esta raza ha demostrado una gran capa-
cidad reproductiva, rusticidad y adaptacin, colaborando
en mejorar la eficiencia productiva de los rebaos debido
a su reducido manejo y menores costos de produccin
(Avendao y col 2004). Sin embargo, los corderos Pelibuey
al nacimiento presentan pesos bajos; a su vez, su crecimiento
y calidad de la canal son inferiores a las razas de lana o
crnicas al ser clasificada como una raza ligera (Gutirrez
y col 2005). Esta situacin ha provocado recientemente
que ovinocultores de la regin incorporen a sus rebaos
sementales de razas especializadas en produccin de carne
para realizar esquemas de cruzamientos, tales como Dorper
y Katahdin. Los ovinos Dorper bajo las condiciones del
desierto de Sudfrica han demostrado excelente adaptacin
basada en su nula estacionalidad a travs del ao y gran
velocidad de crecimiento (Cloete y col 2000). Por su parte,
la raza Katahdin desarrollada en el sur de Estados Unidos
se ha caracterizado como de buen desarrollo productivo
y reproductivo en condiciones tropicales y ridas (Burke
y Apple 2007). Se ha observado que los cruzamientos
entre hembras Pelibuey y sementales Dorper o Katahdin
producen corderos para el abasto que presentan tasas de
crecimiento superiores a los Pelibuey puros, as como buena
adaptacin en climas ridos (Avendao y col 2004). En
otros estudios realizados en climas templados (Gutirrez
y col 2005) o tropicales (Bores y col 2002, Canton y
148
U MACAS-CRUZ Y COL
col 2009
a
) tambin se ha observado una superioridad en
crecimiento de corderos Pelibuey cruzados con alguna
raza crnica, de lana o de pelo comparados a los puros,
lo cual es atribuido al efecto de heterosis y al ms rpido
grado de madurez que alcanzan los corderos cruzados. Sin
embargo, hace falta generar ms informacin del creci-
miento y caractersticas de la canal de corderos de pelo
cruzados con razas crnicas, bajo condiciones desrticas
del noroeste de Mxico, ya que el ambiente puede ser un
factor determinante en la utilizacin de la energa dispo-
nible en la racin y consecuentemente en el desarrollo del
animal. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar
el comportamiento productivo en corral y las caractersticas
de canal en corderos Pelibuey puros y sus cruzas F1 con
Dorper y Katahdin bajo un clima desrtico.
MATERIAL Y MTODOS
El estudio se realiz en la Unidad Experimental Ovina del
Instituto de Ciencias Agrcolas de la Universidad Autnoma
de Baja California (UABC), que se encuentra ubicada en el
Valle de Mexicali, Estado de Baja California, en el noroeste
de Mxico. Las condiciones climticas predominantes en
esta regin son clasificadas como Desierto de Sonora, que
se caracteriza por ser un clima extremadamente seco y
caliente, con temperaturas mximas en verano (50 C) y
mnimas durante invierno (0 C). La precipitacin media
anual es de 80 mm, siendo entre los meses de noviembre
y diciembre donde mayormente se concentra el perodo
de lluvias (Garca 1987).
ANIMALES Y MANEJO
Todos los procedimientos desarrollados sobre los ani-
males experimentales se realizaron en base a las normas
oficiales mexicanas
1
. Un total de 50 corderos nacidos en
noviembre del 2006 producto de un esquema de cruza-
mientos entre 60 hembras de raza Pelibuey y tres machos
Dorper, Katahdin y Pelibuey (uno de cada raza) fueron
destetados cuando alcanzaron una edad de 90 d. Al des-
tete, a estos animales se les aplicaron va intramuscular
vitaminas (A, D y E) y antiparasitario. Posteriormente se
seleccionaron 36 corderos, 12 de cada cruzamiento (seis
machos y seis hembras): Pelibuey puro (Pb), Dorper x
Pelibuey (DrX) y Katahdin x Pelibuey (KaX), para reali-
zar el experimento. Como los corderos presentaban una
edad variable entre los 129 y 136 d al momento de iniciar
la prueba, el peso vivo (PV) inicial se ajust a 133 d de
edad (Notter y col 1975). Las medias de los PV iniciales
1
Secretara de Economa de Mxico. 1997. Direccin General de
Normas: Catlogo de normas oficiales mexicanas. NOM-051-
ZOO-1995 (trato humanitario en la movilizacin de animales)
y NOM-033-ZOO-1995 (sacrificio humanitario de los animales
domsticos y salvajes en Mxico), http://www.economia-noms.gob.
mx/noms/inicio.do
fueron 18,1 0,73, 22,6 0,73 y 19,2 0,73 kg para Pb,
DrX y KaX, respectivamente. El PV inicial para todos
los machos y hembras fue 21,1 0,59 y 18,3 0,59 kg,
respectivamente. Los corderos se alojaron en parejas de
similar genotipo y sexo en corrales provistos de bebede-
ros, comederos y sombra. La prueba de comportamiento
productivo tuvo una duracin de 100 d, 15 d de adaptacin
y 85 d de perodo experimental. La alimentacin durante
este perodo consisti de dos dietas (cuadro 1): a) dieta de
iniciacin, ofrecida los primeros 32 d (19,6% PC y 2,65
Mcal/kg de EM) y b) dieta de finalizacin, ofrecida por
el resto del experimento (16,4% PC y 2,73 Mcal/kg de
EM). Todos los das se retir el alimento rechazado de un
da anterior para poder ofrecer alimento fresco a razn de
dos veces por da (8:00 y 16:00 h). Adems, los corderos
fueron pesados cada 18 d hasta finalizar el experimento
para ajustar el alimento ofrecido por da a 4,5% de su PV.
Diariamente, el alimento rechazado y ofrecido se pes
para estimar el consumo diario de alimento.
Una vez que se finaliz la prueba de comportamiento
productivo, los corderos de los tres genotipos fueron condu-
cidos a la planta faenadora universitaria y sacrificados por
el mtodo de degello sin previa insensibilizacin. Previo
al sacrificio (24 h), se les retir el agua y el alimento. La
piel, cabeza y rganos viscerales fueron retirados de cada
Cuadro 1. Ingredientes y composicin qumica de las dietas
utilizadas para la alimentacin de los corderos durante el perodo
de engorda.
Ingredients and chemical composition of diets used to feed
the lambs during the fattening period.
Ingredientes (g/kg de alimento)
Dietas
Iniciacin Finalizacin
Grano de trigo 417,7 533,7
Heno de alfalfa 313,3 266,9
Harina de soya 156,6 106,7
Paja de trigo 52,2 53,4
Melaza 52,2 31,9
Sal comn en grano 4,7 4,8
Piedra caliza 3,3 2,5
Composicin qumica (% en base fresca)
Materia seca 93,8 93,6
Materia orgnica 85,3 85,4
Protena cruda 19,6 16,4
Extracto etreo 1,4 1,1
Fibra cruda 14,8 13,2
Fibra detergente neutral 17,5 15,1
Cenizas 8,5 8,2
Energa metabolizable (Mcal/kg) 2,6 2,7
149
OVINOS DE PELO, CRUZAMIENTOS, CRECIMIENTO, CANALES, ESTRS CALRICO
canal y su peso fue registrado de forma separada. A su vez,
fue medido el peso de la canal caliente. Posteriormente, las
canales se refrigeraron durante 24 h a 4 C para determinar
el peso de la canal fra y la longitud de la canal, la cual
se estim midiendo la distancia desde la ltima vrtebra
cervical hasta la ltima vrtebra sacra. Las canales fueron
cortadas a lo largo de la lnea media dorsal con una sierra
elctrica. El lado derecho de cada canal fue trozado entre
la 12 y 13
va
costilla para medir espesor de grasa dorsal y
rea del msculo Longissimus dorsi usando una cuadrcula
de puntos (64 mm). Finalmente, se realiz un despiece
de cada canal para obtener el peso del cuello y cortes
primarios (lomo, costillares, paletas y piernas). La suma
de los pesos de los cortes primarios fue considerada como
peso total de cortes primarios (PTCP), el cual a su vez fue
expresado como porcentaje del peso de la canal fra para
determinar el rendimiento en cortes primarios (RCP). El
peso de piernas, paletas, lomo y costillas fue expresado
como porcentaje del peso de la canal fra, mientras que el
peso de la canal caliente fue expresado como porcentaje
del peso al sacrificio.
CONDICIONES CLIMTICAS
De la Estacin Climatolgica Experimental de la
UABC se colect la informacin referente a las condi-
ciones climticas (temperatura ambiental, T; y humedad
relativa, HR) registradas diariamente durante el desarrollo
del experimento. A partir de esta informacin, se calcul
el ndice de temperatura-humedad (ITH) con la ecuacin
propuesta para ovinos (Kelly y Bond 1971):
ITH = T - {[0,55*(1-HR)] * (T-14,4)}
El ITH sirve para determinar el grado de estrs calrico al cual
est sometido un animal bajo condiciones ambientales.
VARIABLES DE ESTUDIO
Las variables de estudio evaluadas fueron peso final
(peso registrado al finalizar la prueba de comportamiento
productivo), consumo diario de alimento, ganancia diaria
de peso, conversin alimenticia, longitud de la canal,
espesor de grasa dorsal y rea del msculo Longissimus
dorsi. Adems se analiz peso de canal caliente, de canal
fra, de cabeza, de piel, de rganos viscerales y del total de
cortes primarios y se calcul el porcentaje de cada corte
primario (en base al peso de canal fra), de rendimiento
en canal y del total de cortes primarios.
ANLISIS ESTADSTICO
Las variables fueron sometidas a un anlisis de varianza
utilizando un diseo completamente al azar con un arreglo
factorial 2 x 3, donde el modelo incluy el efecto fijo de
genotipo (Pb, DrX y KaX) y sexo (macho y hembra), as
como su posible interaccin. El peso ajustado a 133 d
se incluy como covariable en el modelo, mientras que
el peso final fue considerado como una covariable para
peso de canal caliente y canal fra. Las comparaciones de
medias fueron hechas con la prueba t a una = 0,05.
El anlisis estadstico fue desarrollado con el paquete es-
tadstico SAS versin 9,12 para Windows (SAS Institute,
Cary, NC, USA), utilizando el procedimiento PROC GLM
(SAS 2004). Los resultados para cada variable de estudio
se presentan como medias error estndar.
RESULTADOS
La temperatura ambiental e ITH variaron entre los
meses de estudio (cuadro 2), tendiendo a incrementarse
a medida que avanz el desarrollo del experimento.
En promedio (mximos y mnimos), la temperatura, la
humedad relativa y el ITH en el perodo experimental
fueron de 25,4 C (16,7 en abril a 36,0 C en junio),
30,7% (9,5 en mayo a 50,7% en abril) y 22,7 unidades
(15,7 en abril a 28,5 unidades en junio), respectivamente.
En general, durante los tres meses de estudio se regis-
traron das con ITH superior a las 23 unidades, siendo
en mayo y junio donde se observ mayor cantidad de
das con estos ndices de estrs calrico. Tanto en mayo
como en junio la temperatura e ITH presentaron valores
promedios de 28,5 y 33,0 C y de 23,0 y 25,8 unidades,
respectivamente.
Cuadro 2. Condiciones climticas e ndice de temperatura-humedad predominantes durante el desarrollo del experimento*.
Climatic conditions and temperature-humidity index during the experiment.
Mnimas Mximas Promedios
T H ITH T H ITH T H ITH
Abril 16,7 17,2 15,7 30,0 50,7 23,1 23,7 33,0 19,8
Mayo 22,4 9,5 18,9 33,1 49,9 24,1 28,5 28,1 22,5
Junio 25,4 17,2 20,4 36,0 39,9 28,5 33,0 31,1 25,8
*
T = Temperatura ambiental, HR = Humedad relativa, ITH = ndice de temperatura-humedad.
150
U MACAS-CRUZ Y COL
La interaccin genotipo x sexo fue estadsticamente
significativa (P < 0,05) slo para peso final. El peso final
entre hembras KaX (34,9 1,1 kg) y Pb (32,3 1,1 kg)
fue estadsticamente similar (P > 0,05), pero menor
(P < 0,05) al observado en los machos de los tres genotipos
(38,8 1,1, 39,3 1,1 y 37,2 1,1 kg para DrX, KaX y
Pb, respectivamente) y las hembras DrX (38,9 1,1 kg).
Adems, entre los machos y las hembras DrX tambin se
observaron pesos finales similares (P > 0,05).
Los animales estudiados presentaron en promedio
206 10 g de ganancia diaria de peso, 1,3 0,1 kg de
alimento consumido por da y una conversin alimenticia
de 6,6 0,3 kg (cuadro 3). Los corderos DrX ganaron
16 y 25% ms peso por da (P < 0,05) que los KaX y
Pb, respectivamente; asimismo, consumieron 16 y 18%
ms alimento por da (P < 0,05), respectivamente. Los
corderos de los tres genotipos consumieron cantidades
similares (P > 0,05) de alimento para incrementar un
kilogramo de su PV. Por otra parte, se observ que la
ganancia diaria de peso y el consumo diario de alimento
fue mayor (P < 0,01) en 32 y 14%, respectivamente, en
machos que en hembras. Adicionalmente, la conversin
alimenticia en machos (5,9 0,2) fue menor (P < 0,05)
que en hembras (7,3 0,2).
El genotipo no afect significativamente (P > 0,05) las
medias de rendimiento en canal, peso de la cabeza, peso
de los rganos viscerales, rea del msculo Longissimus
dorsi y espesor de grasa dorsal (cuadro 4). Sin embargo,
el peso de la canal caliente (20,1 0,6 vs 18,3 0,6 kg) y
canal fra (18,9 0,6 vs 16,6 0,6 kg) fue mayor (P < 0,01)
en corderos DrX que en Pb. Las canales de corderos KaX
presentaron pesos semejantes (P > 0,05) a los otros dos
genotipos estudiados. En relacin a la longitud de la
canal, las canales fueron ms cortas en el genotipo KaX
por 5 cm (P < 0,01) que las del genotipo DrX (63,0 1,3
vs 58,0 1,3), pero de tamao similar (P > 0,05) a las
del genotipo Pb. Las pieles de los corderos cruzados
pesaron en promedio 350 g ms (P < 0,01) que las de
corderos puros Pb. No obstante, el sexo result significa-
tivo (P < 0,05) sobre las caractersticas de canal medidas,
con excepcin de las variables (P > 0,05) rendimiento en
canal, rea del msculo Longissimus dorsi y espesor de
grasa dorsal. En los machos se observaron canales ms
largas (P < 0,01; 62,3 1,0 vs 58,7 1,0 cm) y pesadas
(P < 0,05; 20,0 0,5 vs 18,2 0,5 kg para canal caliente
y 18,81 0,5 vs 16,54 0,5 kg para canal fra), as como
valores superiores (P < 0,05) en el peso de cabeza, piel y
rganos viscerales en relacin a las hembras.
En cuanto a los resultados de cortes primarios (cuadro 5)
se observ que el genotipo slo influy (P < 0,01) en el
porcentaje del corte pierna y sexo sobre el porcentaje de
costilla y de paletas. El porcentaje de pierna fue mayor
(P < 0,05) en los genotipos DrX (25,4 3,2%) y KaX
(24,4 3,2%) comparado con el Pb (20,6 3,2%). Mientras
que el porcentaje del corte paleta fue ms alto (P < 0,05)
en machos (23,9 0,8 vs 19,3 0,8%) y el de costillas en
hembras (20,5 0,8 vs 16,4 0,8%), respectivamente.
DISCUSIN
Cuando las combinaciones entre temperatura y hume-
dad relativa producen un ITH 23 unidades se consideran
condiciones ambientales suficientes para producir un estrs
calrico sobre los ovinos (Kelly y Bond 1971). Por los ITH
registrados durante el desarrollo del experimento se consider
que los animales estuvieron bajo un estrs calrico de mo-
derado a severo, principalmente en mayo (entre 18,9 y 24,1
unidades) y junio (entre 20,4 y 28,5 unidades). En ovinos y
otras especies domsticas, las condiciones de estrs calrico
se relacionan con una disminucin en el consumo de alimento
como consecuencia de una reduccin en el funcionamiento
de la glndula tiroides (Marai y col 2007). En consecuencia,
esta reduccin en el consumo se refleja negativamente sobre
la tasa de crecimiento, peso al sacrificio y sobre la calidad
de la carne (Srikandakumar y col 2003). En este estudio,
el consumo diario de alimento, la ganancia diaria de peso
y el rendimiento en canal presentaron valores promedios
de 1,3 kg, 206 g y 53%, respectivamente. Estos resultados
son semejantes y en ocasiones superiores a otros reportados
en corderos Pelibuey puros y cruzados bajo condiciones
Cuadro 3. Medias errores estndar (E.E.) del comportamiento productivo en corderos machos y hembras del genotipo Pelibuey puro
y cruzados.
Means standard error of the productive performance in male and female lambs of the genotype Pure Pelibuey and their crosses.
Variables
Genotipo** Sexo
DrX KaX Pb E.E. Macho Hembra E.E.
Ganancia diaria de peso (g/d) 240,0
a
200,0
b
180,0
b
0,1 250,0
a
170,0
b
0,1
Consumo de alimento (kg/d) 1,5
a
1,3
b
1,2
b
0,0 1,4
a
1,2
b
0,0
Conversin alimenticia
*
6,3
a
6,3
a
6,9
a
0,3 5,9
a
7,3
b
0,2
Celdas dentro de genotipo y sexo con diferente superndice (
a, b, c
) significa diferencia a P < 0,05.
*

Conversin alimenticia: Consumo de alimento/Ganancia diaria de peso (kg/kg).
** DrX: Dorper x Pelibuey, KaX: Katahdin x Pelibuey, y Pb: Pelibuey puro.
151
OVINOS DE PELO, CRUZAMIENTOS, CRECIMIENTO, CANALES, ESTRS CALRICO
de estabulacin y sin presencia de estrs calrico (Bores y
col 2002, Canton y col 2007, Canton y col 2009
a
, Partida de
la Pea y col 2009). Por ejemplo, en condiciones tropicales
(Canton y col 2007) reportaron valores promedios para con-
sumo de alimento, ganancia de peso y rendimiento en canal
de 1,2 kg/d, 232 g/d y 55%, respectivamente, en corderos
de genotipos similares a los usados en esta investigacin.
Mientras que bajo un clima templado Partida de la Pea y
col 2009 observaron que corderos Pb y cruzas de Pelibuey
con Suffolk y Dorset consumieron 1,1 kg/d de alimento,
incrementaron su peso 175 g/d y el promedio de rendimiento
en canal fue de 52%. El ITH 23 que seala como punto de
inicio de estrs calrico en ovinos fue estimado en base a
razas de lana (Kelly y Bond 1971), lo cual explica por qu
las condiciones ambientales en que se realiz este estudio
no afectaron negativamente el crecimiento de los corderos
estudiados. Hubiese sido apropiado haber usado un punto
de ITH referencial de estrs calrico para ovinos de pelo,
sin embargo, no se encontr ningn estudio donde ste se
haya estimado.
Cuadro 4. Medias errores estndar (E.E.) de caractersticas de canal en corderos machos y hembras del genotipo Pelibuey puro y
cruzados.
Means standard error of carcass characteristics in male and female lambs of the genotype Pure Pelibuey and their crosses.
Variables
Genotipos* Sexo
DrX KaX Pb E.E. Macho Hembra E.E.
Peso al sacrificio (kg) 39,9
a
36,6
b
34,2
c
0,8 39,4
a
34,4
b
0,6
Peso de canal caliente (kg) 20,1
a
18,9
ab
18,3
b
0,6 20,0
a
18,2
b
0,5
Peso de canal fra (kg) 18,9
a
17,5
ab
16,6
b
0,6 18,8
a
16,5
b
0,5
Rendimiento en canal (%) 52,6
a
52,4
a
54,5
a
1,1 53,1
a
54,1
a
0,9
Cabeza (kg) 1,4
a
1,4
a
1,3
a
0,1 1,6
a
1,2
b
0,1
Piel (kg) 2,7
a
2,6
a
2,3
b
0,1 2,7
a
2,3
b
0,1
rganos viscerales (kg) 1,5
a
1,6
a
1,3
a
0,1 1,7
a
1,2
b
0,6
Longitud de la canal (cm) 63,0
a
58,0
b
60,2
ab
1,3 62,3
a
58,7
b
1,0
rea del M.L.D. (cm
2
)** 16,2
a
16,8
a
16,3
a
0,9 17,0
a
15,9
a
0,7
Grasa dorsal (cm) 0,3
a
0,3
a
0,4
a
0,1 0,3
a
0,4
a
0,1
Celdas dentro de genotipo y sexo con diferente superndice (
a, b
) significa diferencia a P < 0,05.
* DrX: Dorper x Pelibuey, KaX: Katahdin x Pelibuey, y Pb: Pelibuey puro.
**

M.L.D. = Muscle Longissimus dorsi;
Cuadro 5. Medias errores estndar (E.E.) de los cortes primarios en corderos machos y hembras del genotipo Pelibuey puro y
cruzados.
Means standard error of wholesale cuts in male and female lambs of genotypes pure Pelibuey and their crosses.
Variables
Genotipos* Sexo
DrX KaX Pb E.E. Macho Hembra E.E.
Piernas (%) 25,4
a
24,4
a
20,6
b
3,2 24,2
a
22,8
a
1,0
Lomo (%) 21,9
a
19,3
a
18,1
a
4,7 18,7
a
20,9
a
1,7
Costillas (%) 16,5
a
19,3
a
19,6
a
3,4 16,4
a
20,5
b
0,8
Paletas (%) 21,9
a
21,3
a
21,5
a
3,2 23,9
a
19,3
b
0,8
Cuello (%) 5,1
a
6,1
a
5,5
a
1,3 5,4
a
5,7
a
0,5
PTCP (kg)** 16,4
a
16,0
a
15,3
a
1,7 15,9
a
15,9
a
0,4
RCP (%)
3
85,7
a
84,3
a
79,9
a
5,2 83,2
a
83,5
a
1,7
Celdas dentro de genotipo y sexo con diferente superndice (
a, b
) significa diferencia a P < 0,05.
* DrX: Dorper x Pelibuey, KaX: Katahdin x Pelibuey, y Pb: Pelibuey puro.
**

PTCP: Peso total de los cortes primarios,
3
RCP: Rendimiento en cortes primarios.
152
U MACAS-CRUZ Y COL
Los ovinos de pelo son razas que se desarrollaron en
climas tropicales donde las temperaturas y humedades
son altas; mientras que las razas de lana siempre se han
mantenido en climas fros. Debido a esto, los ovinos de
pelo muestran ser razas ms tolerantes al calor y adap-
tables a diferentes condiciones ambientales (Fitzhugh y
Bradford 1983). Esta situacin permite hipotetizar res-
pecto al potencial que tendran los ovinos de pelo (como
Pelibuey, Dorper y Katahdin), para sobrevivir y producir
en cualquier regin de Mxico, particularmente conside-
rando que el lugar donde se desarroll este estudio es una
de las regiones del pas con el registro de temperaturas
ms elevadas durante el verano.
Los resultados de efecto de genotipo y sexo sobre el
peso final coinciden con los encontrados en otro estudio
(Partida de la Pea y col 2009), en el cual reportaron pesos
finales similares entre machos de los genotipos Pb, Suffolk
x Pelibuey y Dorset x Pelibuey, asimismo, menor peso
en las corderas Pb que en las cruzadas. Tambin en otro
experimento Canton y col 2009
b
observaron que corderos
machos de genotipo Pb (30,3 kg), DrX (33,8 kg) y KaX
(34,8 kg) presentaron pesos similares despus de man-
tenerlos en corral por 75 d. Estos resultados sugieren un
crecimiento similar entre los machos de los tres genotipos,
lo cual posiblemente se deba al nivel de protena (19,6
y 16,4%) y energa (2,6 y 2,7 Mcal/kg) que contenan
la dietas ofrecidas. En un estudio realizado en el centro
de Mxico, Ruiz y col (2009) observaron que cuando
ofrecieron a corderos Dorper y Pb una dieta con 18% de
protena, despus de 70 d de consumo el peso vivo fue
similar (37,4 vs 36,8 kg); mientras que cuando ofrecieron
la dieta con 14% de protena, los corderos Dorper (37,2 kg)
pesaron 7% ms que los Pb (34,6 kg). Comparando tres
niveles de energa metablica (2,2, 2,5 y 2,8 Mcal/kg de
MS) sobre el comportamiento productivo de corderos Pb,
DrX y KaX, se observ un mayor crecimiento cuando se
alimentaron con la dieta que contena 2,8 Mcal/kg de MS,
en comparacin de cuando se alimentaron con la dieta que
contena 2,2 Mcal/kg de MS (Canton y col 2009
a
). Por
lo tanto, los machos de los tres genotipos de este estudio
pesaron estadsticamente igual porque los contenidos de
protena y energa metabolizable estuvieron muy cercanos
a los ptimos recomendados en la literatura, ya que segn
Sols y col (1991) para corderos de crecimiento moderado
stos corresponden a 2,6 Mcal/ kg de MS de EM y 14,7%
de PC. Adicionalmente, las corderas Pb y KaX presentaron
pesos finales inferiores a los corderos de los tres genotipos
y corderas DrX, lo cual est relacionado parcialmente
con la menor velocidad de crecimiento que presentan las
hembras debido a su sistema hormonal (Bores y col 2002).
Asimismo, dentro del grupo de hembras, el mayor incremento
de peso final en las DrX puede atribuirse parcialmente a
que las hembras de raza crnicas tienden fijar hasta 40%
mayor grasa corporal que las razas prolficas (Canton y
col 2009b). Tambin este resultado se puede deber a la
habilidad que tienen los ovinos de genotipo Dorper para
madurar a edad ms temprana y fijar entre la carne gran
cantidad de grasa, lo cual no ha sido observado en ninguna
otra raza de pelo, incluyendo Katahdin y Pelibuey (Cloete
y col 2007). Lo anterior explica la razn por la que tanto
machos como hembras de genotipo DrX presentaron ma-
yores pesos finales en comparacin a Pb y KaX.
En la literatura existe marcada discrepancia concer-
niente al comportamiento productivo que presentan los
corderos producto de esquemas de cruzamiento entre razas
de pelo prolficas y razas especializadas para produccin
de carne. Algunos estudios (Pineda y col 1998, Bunch y
col 2004, Partida de la Pea y col 2009) sealan que los
corderos hbridos presentan un mayor incremento en su
peso que los puros, mientras en otros no reportan dife-
rencias significativas, slo tendencias numricas (Canton
y col 2007, Canton y col 2009
a
). Los resultados de este
estudio coinciden en parte con aquellas investigaciones
donde han encontrado diferencias en la tasa de crecimien-
to entre genotipos a favor de las cruzas. Los corderos
DrX ganaron 25% ms de peso por da que los Pb, sin
embargo, los corderos KaX presentaron similar tasa de
crecimiento que los Pb. Posiblemente estos resultados
estn relacionados con el efecto de heterosis (Bunch y
col 2004), el cual se expresa en las cras al aparearse pro-
genitores de dos razas puras, aunque en esta investigacin
la falta de informacin sobre la ganancia diaria de peso
que alcanzan los corderos puros Dorper y Katahdin no
permite observar el nivel de heterosis adquirido por la
accin del cruzamiento practicado. Otra causa de estos
resultados es la diferencia en el peso adulto entre las
razas utilizadas (Notter y col 2004). El ovino Pelibuey
se caracteriza por ser una raza ligera en relacin a la raza
Dorper y Katahdin, asimismo, en general a las razas de
lana (Bradford 2002).
En el consumo diario de alimento, los corderos DrX
consumieron 16 y 18% ms que los KaX y Pb, respec-
tivamente. En un estudio realizado en Estados Unidos
tambin encontraron que los corderos St. Croix puros
consumieron 8 y 16% menos alimento que las cruzas de
cordero Callipyge wool x St. Croix y Dorper x St. Croix,
respectivamente (Bunch y col 2004). Igualmente en
Mxico han reportado diferencias en el consumo entre
corderos Pb, DrX y KaX de 8% en promedio a favor
de las cruzas (Canton y col 2009
a
). En este estudio, los
corderos DrX consumieron mayor cantidad de alimento, por
lo cual ganaron tambin mayor PV por da. Se encuentra
documentado que los animales cambian su consumo para
ajustar sus requerimientos nutricionales (Forbes 1986). As,
el consumo de alimento se relaciona con los cambios en
el peso vivo. Cabe mencionar que esta relacin positiva
entre consumo y ganancia conllev a que no se observaran
diferencias en la conversin alimenticia (6,3 para corderos
hbridos y 6,9 para Pb). El comportamiento observado
entre los genotipos estudiados sobre conversin alimen-
ticia est acorde a lo reportado previamente al comparar
corderos de raza de pelo puros y sus cruzas (Canton y
153
OVINOS DE PELO, CRUZAMIENTOS, CRECIMIENTO, CANALES, ESTRS CALRICO
col 2009
a
, y Bunch y col 2004). Se puede inferir que los
genotipos utilizados presentan similar eficiencia en el uso
del alimento consumido al nivel de protena y energa que
contenan las dietas.
Los resultados concernientes al efecto del sexo son
consistentes con los reportados en otros estudios (Pineda y
col 1998, Bores y col 2002, Partida de la Pea y col 2009)
donde mencionan que los machos tienden a presentar tasas
de crecimiento ms altas y a utilizar ms eficientemente el
alimento consumido que las hembras. Esto es atribuido al
efecto anablico de los andrgenos presentes en los machos
(Bradford 2002). Por otra parte, el mayor consumo de
alimento que registraron los machos se relaciona tambin
con el mayor incremento de peso (Bores y col 2002).
En corderos Pb, Suffolk x Pelibuey y Rambouillet x
Pelibuey sacrificados a los 35 kg de PV, no se encontraron
diferencias entre las medias del peso de la canal caliente y
fra por efecto de genotipo (Gutirrez y col 2005). Canton
y col (2009
b
) tampoco encontraron diferencias para estas
variables al comparar canales del genotipo Pb, DrX y
KaX. Ambos resultados son contrarios a los observados
en este estudio. Esto posiblemente se deba a que en este
trabajo hubo diferencias entre los PV al sacrificio de
los corderos (de 10 a 14% ms pesados al sacrificio los
DrX y KaX) debido a que fueron sacrificados a la misma
edad, mientras que en los resultados reportados en la
literatura, los genotipos usados se sacrificaron a pesos
similares. Adems, canales de DrX fueron ms pesadas
y largas comparadas a las de Pb debido a diferencias en
el tamao corporal en relacin al peso maduro (Bradford
2002). Sin embargo, estas diferencias entre genotipos no
fueron detectadas en la evaluacin de rendimiento de
canal, lo que es coincidente con lo reportado por otros
autores (Bores y col 2002, Gutirrez y col 2005, Partida
de la Pea y col 2009). La ausencia de diferencias en
rendimiento de canal entre los genotipos estudiados se
atribuye a que no se observaron variaciones significa-
tivas sobre el espesor de grasa dorsal (Bradford 2002).
Aunque existen otros factores que tambin pueden ayudar
a explicar este resultado, tal como el bajo contenido
gastrointestinal al sacrificio, grado de finalizacin y los
pesos similares registrados para los componentes corpo-
rales no considerados en el peso de la canal (Gutirrez
y col 2005). Por otra parte, el peso de la piel vari entre
los genotipos siendo ms pesadas las de corderos DrX
(2,7 kg) y KaX (2,6 kg). Esto se debe al mayor tamao
corporal que presentaban dichos genotipos. Caractersticas
como peso de la cabeza, peso de los rganos viscerales,
rea del msculo Longissimus dorsi y el espesor de
grasa dorsal no mostraron variaciones en sus medias por
efecto de genotipo. Igualmente, otros autores tampoco
reportaron diferencias para estas caractersticas de canal
entre corderos Pb y sus cruzas con razas crnicas (Bores
y col 2002, Bunch y col 2004).
En la literatura se menciona que entre corderos de
genotipos de razas puras o sus cruzas no hay diferencias
en cortes primarios cuando son expresados como por-
centaje del peso de la canal (Snowder y Dunckett 2003,
Gutirrez y col 2005, Espinoza y col 2009). Esto debido
a que a medida que se expresa el peso como porcentaje,
la variabilidad entre pesos de la canal y de cada corte
tiende a disminuir. Los resultados para cortes primarios
por efecto de genotipo del presente estudio son consis-
tentes con la literatura a excepcin de porcentaje del
corte pierna, el cual fue 4,2% mayor en las cruzas. El
incremento del peso de las piernas como porcentaje de
canal fra posiblemente est relacionado con una madu-
rez ms tarda en la raza Pelibuey en comparacin con
los otros genotipos (Espinoza y col 2009), y adems,
con una mayor cantidad de grasa intramuscular en las
piernas de los corderos hbridos, ya que en otro estudio
se encontr que la grasa se distribuye ms rpidamente
en los cuartos anteriores comparado con las otras partes
de la canal (Gallo 2002).
Los resultados de efecto de sexo sobre caractersticas de
la canal se debieron en gran medida a diferencias entre los
pesos al sacrificio. Los machos presentaron en promedio,
un peso al sacrificio de 39,4 kg, mientras que las hembras
de 34,4 kg. As, variables relacionadas con la longitud y
el peso de los componentes de la canal (canal caliente,
canal fra, cabeza, piel y rganos viscerales) presentaron
valores ms altos en machos que en hembras. En un estudio
(Gutirrez y col 2005) donde sacrificaron corderos y cor-
deras a los 35 kg de los genotipos Pb, Suffolk x Pelibuey
y Rambouillet x Pelibuey, no se observaron diferencias en
peso (15,9 kg para machos y 16,5 kg para hembras) ni en
longitud (60,3 cm para machos y 60,4 cm para hembras)
de la canal. Tambin se considera que estos resultados
estuvieron influenciados por el efecto hormonal, el cual
en los machos favorece que haya un mayor desarrollo
muscular y en las hembras una mayor fijacin de grasa
(Bradford 2002). Anteriormente, en animales Pelibuey
y sus cruzas con Suffolk y Dorset se detect una mejor
relacin msculo/grasa en machos (5,8) que en hembras
(3,5) (Partida de la Pea y col 2009). Por otra parte, otros
estudios (Notter y col 2004, Gutirrez y col 2005) tam-
bin han reportado que no existen diferencias importantes
entre sexos para rendimiento en canal, rea del msculo
Longissimus dorsi y espesor de grasa dorsal.
Actualmente no existe una tendencia bien definida del
efecto de sexo sobre el porcentaje de cortes primarios.
Factores como peso al sacrificio, edad, concentraciones
hormonales, ambiente y alimentacin se han relacionado
con las variaciones en los resultados. En este estudio se
observ que el sexo solamente influy sobre el porcentaje
de los cortes paleta y de costillares. No obstante, otro es-
tudio (Gutirrez y col 2005) encontr que el sexo afect
solamente porcentaje de cuello y lomo.
En las condiciones en que se realiz el presente estu-
dio, los corderos de genotipo DrX presentaron tasas de
crecimiento y consumos de alimento ms altos que los
genotipos Pb y KaX. Adems, a pesar de que los corderos
154
U MACAS-CRUZ Y COL
Pb no son de raza crnica, mostraron rendimientos en canal
tan satisfactorios como las cruzas con razas especializadas
en produccin de carne (Dorper y Katahdin). Por otra parte,
los resultados sugieren que sera recomendable engordar
machos en lugar de hembras debido a su mayor tasa de
crecimiento, eficiencia para aprovechar los nutrientes del
alimento para incrementar su peso y por la produccin
de canales ms pesadas. Los registros de ganancia diaria
de peso y peso al sacrificio de los corderos, sugieren
buena capacidad de adaptacin de las razas de pelo utili-
zadas al clima rido y seco, al menos en condiciones de
confinamiento.
RESUMEN
El objetivo del presente estudio fue evaluar el comportamiento
productivo en corral y las caractersticas de canal de 36 corderos (machos
y hembras) de los genotipos Pelibuey puro, Dorper x Pelibuey y Katahdin
x Pelibuey bajo condiciones desrticas del noroeste de Mxico. Despus
de 85 d de prueba de comportamiento en corral, se sacrificaron todos
los corderos para la evaluacin de sus canales. Los corderos Dorper
x Pelibuey presentaron mayor (P < 0,05) ganancia diaria de peso y
consumo diario de alimento que los otros dos genotipos. Sin embargo,
entre los tres genotipos no se observaron diferencias (P > 0,05) para
rendimiento en canal, rea del msculo Longissimus dorsi y espesor de
grasa dorsal. Los machos presentaron mayor ganancia diaria de peso
(P < 0,01) y menor conversin alimenticia que las hembras. Los pesos
de la canal caliente y fra fueron mayores (P < 0,05) en machos que en
hembras, pero el rendimiento en canal y el espesor de grasa dorsal fueron
similares (P > 0,05) entre ambos sexos. El peso total y el rendimiento
de cortes primarios fueron similares (P > 0,05) entre los genotipos y los
sexos. Estos resultados sugieren que la raza Dorper puede ser usada en
esquemas de cruzamiento para mejorar la produccin de carne ovina en
zonas ridas como las del noroeste de Mxico.
AGRADECIMIENTOS
A la Coordinacin de Posgrado e Investigacin de la Universidad
Autnoma de Baja California, en Mexicali, Mxico, por el financiamiento
de este proyecto de investigacin.
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155
Arch Med Vet 42, 155-163 (2010)
ARTCULO ORIGINAL
Aceptado: 24.03.2010.
# Fuente financiamiento: INTA-Instituto Nacional de Tecnologa Agro-
pecuaria, Argentina, CSIRO - Sustainable Ecosystem, Townsville,
Australia.
* Pinto 399 (7000) Tandil, Argentina; fmoreno@balcarce.inta.gov.ar.
Efecto antihelmntico in vitro de extractos de plantas sobre larvas
infectantes de nematodos gastrointestinales de rumiantes
#
In vitro anthelmintic effect of plant extracts against infective larvae
of ruminants gastrointestinal nematode parasites
FC Moreno
a,b,d*
, IJ Gordon
a
, AD Wright
c
, MA Benvenutti
a,d
, CA Saumell
b
a
CSIRO Davies Laboratory, University Drive, Townsville, Queensland, Australia.
b
Facultad de Ciencias Veterinarias, U.N.C.P.B.A. Campus Pje., Arroyo Seco s/n, Tandil, Argentina.
c
AIMS Australian Institute of Marine Science, Townsville, Queensland, Australia.
d
INTA EEA Cerro Azul, Cerro Azul, Misiones, Argentina.
SUMMARY
With the purpose of studying the anthelmintic efficacy of some plant species presents in Queensland State, Australia, we tested in vitro the effect
of plant extracts on infective larvae (L3) migration of Haemonchus placei, Cooperia sp., Haemonchus contortus and Trichostrongylus colubriformis. In
general, plant extracts reduced the larval migration of Haemonchus placei and Cooperia sp. The most effective plants against Haemonchus placei and
Cooperia sp. (P < 0.0001) were Allocasuarina torulosa, Neolitsea dealbata, Acacia holosericea, Acacia salicina, Callitris endlicheri and Casuarina
cunninghamiana. Plants extracts were less effective on L3 migration of Haemonchus contortus and Trichostrongylus colubriformis. Callitris endlicheri,
Casuarina cunninghamiana, Acacia farnesiana, Acacia holosericea and Acacia nilotica were the plant extracts that shown an important larval migration
inhibition against H. contortus and Trichostrongylus colubriformis (P < 0.0001). Callitris endlicheri was the plant that consistently inhibited the larval
migration of every nematode species under study. These in vitro results suggest anthelmintic properties associate with some of the plant species we
studied.
Palabras clave: evaluacin in vitro, nematodos gastrointestinales, plantas, propiedades antihelmnticas.
Key words: in vitro test, gastrointestinal nematodes, plants species, anthelmintic properties.
INTRODUCCIN
Los parsitos nematodos gastrointestinales de rumiantes
representan un serio problema a nivel mundial ya que afectan
la productividad del hospedador causando reducciones en
las tasas de crecimiento, fecundidad e incremento en la
mortalidad. La parasitosis gastrointestinal es una de las
enfermedades que mayor impacto econmico ocasiona
en los sistemas de produccin de carne (Mcleod 1995,
Fiel y Steffan 1994).
Hasta el presente, el principal modo de control de los
parsitos del tracto digestivo ha estado basado en el trata-
miento qumico con antiparasitarios. Debido al creciente
desarrollo de resistencia a los antiparasitarios por parte de
los nematodos gastrointestinales (Jackson y Coop 2000)
es necesario investigar estrategias alternativas al control
farmacolgico de las helmintiasis. A esto se suma la
creciente demanda de limitar el uso de sustancias qumi-
cas en la produccin animal para reducir los residuos de
drogas en los productos animales (McKellar 1997, Waller
y Thamsborg 2004).
La necesidad de encontrar alternativas para el control de
los nematodos que puedan reducir el uso de antihelmnticos
es reconocida internacionalmente. Varias opciones estn
siendo investigadas, dentro de las cuales se pueden citar el
control biolgico, usando hongos nematfagos (Larsen 1999,
Larsen 2000), la produccin de vacunas contra helmintos
(Smith 1999, Vercruysse y col 2007), inmunonutricin
(Houdijk y Athanasiadou 2003) y estudios genticos ten-
dientes a producir animales resistentes a helmintos (Gray
1997, Gasbarre y Miller 2000). Tambin se han iniciado
experimentos sobre la influencia de la suplementacin
proteica en la dieta, que podra mejorar la respuesta a la
vacunacin y en el desarrollo de animales inmunorresis-
tentes (Coop y Holmes 1996). Otra estrategia alternativa
para el control de parsitos gastrointestinales la constituye
el uso de metabolitos secundarios de las plantas (MSP)
(Athanasiadou y Kyriazakis 2004), con el objetivo no solo
de encontrar nuevos compuestos qumicos eficaces contra
helmintos, sino que tambin por su aplicabilidad desde el
punto de vista orgnico, ya que ellos podran reemplazar el
156
F MORENO Y COL
uso de qumicos sintticos corrientemente usados, lo cual
puede proveer mtodos ecolgicos para el tratamiento de
parsitos usando plantas con propiedades antihelmnticas.
Los test in vitro son un medio apropiado para evaluar
especies de plantas debido a que son rpidos de realizar y
econmicos, comparados a los test in vivo. Aunque se ha
encontrado que existe una correlacin significativa entre
los test in vitro e in vivo en estudios de eficacia de los
antihelmnticos y resistencia de los parsitos a las drogas
sintticas (Geary y col 1999, Athanasiadou y Kyriazakis
2004), no es claro an si una relacin similar existe para
los MSP (Athanasiadou y Kyriazakis 2004). Por ello,
es importante que los resultados de los test in vitro sean
siempre validados in vivo antes de hacer generalizaciones
respecto a las propiedades antiparasitarias de los MSP
(Athanasiadou y Kyriazakis 2004).
Debido a que el parsito adulto es el blanco prin-
cipal de los MSP, sera deseable poder utilizarlos para
determinar el potencial antiparasitario de los MSP. Sin
embargo, los parsitos adultos no pueden ser mantenidos
vivos fuera del hospedador por ms de 24 horas, lo cual
es inadecuado para los test in vitro. Por ello, los test in
vitro se realizan usualmente con los estadios infectantes
(L3) en lugar de adultos (Geary y col 1999, Athanasiadou
y Kyriazakis 2004).
El test in vitro de inhibicin de la migracin larval con
L3 ha sido ampliamente usado para estudiar la eficacia
antiparasitaria de los MSP en Nueva Zelanda (Molan y
col 2004, Molan y col 2000
c
) y Francia (Hounzangbe-
Adote y col 2005, Paolini y col 2004). El test de inhibicin
de la movilidad larval fue desarrollado por Wagland y
col (1992) y modificado por Rabel y col (1994) y Paolini
y col (2004). El uso de L3 para el test de migracin parece
ser apropiado para el estudio de la eficacia antiparasitaria
de los MSP debido a que el primer contacto de los MSP
con los parsitos se da cuando las L3 son consumidas
junto con el forraje. A su vez, el test de inhibicin de la
migracin de L3 tiene la ventaja sobre los test basados
en la eclosin de huevos o en el desarrollo larval en que
las L3 son fcilmente disponibles y almacenables y son
relativamente simples de usar (Rabel y col 1994).
El objetivo del presente trabajo fue utilizar el test in
vitro de inhibicin de la migracin larval para estudiar el
efecto antihelmntico de 24 extractos de plantas autctonas
de Australia con potenciales propiedades antiparasitarias,
a tres concentraciones diferentes (5, 15 y 30 mg/ml), en la
migracin de L3 de nematodos que afectan al ganado bovino
(Haemonchus placei y Cooperia sp.) y caprino (Haemonchus
contortus y Trichostrongylus colubriformis).
MATERIALES Y MTODOS
DISEO EXPERIMENTAL
El trabajo experimental se llev a cabo en el CSIRO
Davies Laboratory, Townsville, Australia. Se realiz un
experimento in vitro para evaluar el efecto de extractos
de plantas australianas en la migracin de L3 de nema-
todos que afectan al ganado bovino (Haemonchus placei
y Cooperia sp.) y caprino (Haemonchus contortus y
Trichostrongylus colubriformis).
PLANTAS
Para decidir las especies de plantas a evaluar, libros
de etnobotnica en medicina tradicional humana o vete-
rinaria y otras fuentes de informacin fueron consultados
(Lassak y McCarthy 1983, Seigler 2002, Anderson 1993,
WHO 1999
1
, Chittendon 1956
2
, Cribb y Cribb 1981
3
,
Bennet-Jenkins y Bryant 1996, Moore 2005 comunicacin
personal, Grieve 1984
2
, Satrija y col 1994
4
, Athanasiadou
y col 2000
a, b
, Athanasiadou y col 2001).
Como resultado, 24 especies de plantas con potencial
antihelmntico fueron identificadas: Acacia farnesiana,
Acacia melanoxylon, Acacia salicina, Acacia holosericea,
Acacia flavescens, Acacia leptostachya, Acacia nilotica,
Eucalyptus tessellaris, Eucalyptus tereticornis, Eucalyptus
platyphylla, Eucalyptus corymbia, Eucalyptus drepano-
phylla, Eucalyptus citriodora, Eucalyptus moluccana,
Eucalyptus crebra, Casuarina cunninghamiana, Callitris
endlicheri, Melaleuca leucodendra, Alphitonia excelsa,
Erythrina variegata, Neolitsea dealbata, Allocasuarina
torulosa, Euphorbia hirta y Panicum minutiflora. De las 24
especies seleccionadas, 19 fueron evaluadas en bovinos y
14 en caprinos. La seleccin de las plantas se bas en tres
criterios: a) plantas conocidas previamente como activas
en el control de parsitos internos en animales o humanos,
b) plantas con alto contenido de MSP, no mencionadas
como antiparasitarias pero con potencial antihelmntico,
c) especies que sean abundantes ya que las especies raras
podran ser irrelevantes para los animales en pastoreo.
PREPARACIN DE LOS EXTRACTOS DE PLANTAS
Hojas frescas de las especies de plantas a evaluar fueron
colectadas en el estado de Queensland, Australia, durante
los meses de septiembre y octubre y mantenidas en freezer
(-20 C) hasta su procesamiento. Aproximadamente 50 g
de material correspondiente a cada una de las especies
fue secado en liofilizador (freeze drier) y posteriormente
molido a un milmetro de tamao de partcula. Setenta y
cinco mililitros de metanol fueron adicionados a tres gramos
del material ya molido y dejado en agitacin durante toda
una noche para favorecer la extraccin de los compuestos.
Las muestras extradas fueron filtradas en filtro de papel
1
http://www.genhealth.com/garlic.htm. fecha consulta: 08/08/2005
2 http://www.ibiblio.org/pfaf/cgi-bin/arr_ht ml?Melaleuca+hyperici-
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4
http://www.ansci.cornell.edu/plants/medicinal/papaya.html. fecha
consulta: 08/08/2005.
157
EVALUACIN IN VITRo, NEMATODOS GASTROINTESTINALES, PLANTAS, PROPIEDADES ANTIHELMNTICAS
Whatmann N 40. El filtrado fue luego liofilizado para
obtener los polvos de extracto.
El polvo de los extractos de las plantas fue disuelto en
buffer fosfato (0,1 M fosfato, 0,05 M NaCl; pH 7,2) y diluido
en serie previo a la incubacin. Las diluciones evaluadas fueron
5, 15 y 30 mg/ml . Dichas diluciones fueron elegidas debido a
que son comparables con las concentraciones usadas in vivo.
Asumiendo que el contenido gastrointestinal de bovinos de
destete de aproximadamente 200 kg de peso vivo es de aproxi-
madamente 30 litros y sabiendo que el consumo de alimento
es de aproximadamente 4 kg de materia seca por da, y que el
mximo rendimiento de extracto es de aproximadamente 15%
(Van Soest 1982), la mxima concentracin de extracto de
planta en el tracto gastrointestinal sera de aproximadamente
20 mg/ml (4 kg/da x 0,15/30 lts) cuando el animal consume
solamente plantas ricas en MSP.
PARSITOS
Las L3 provenientes de cultivos puros de H. placei
fueron suministradas por el Dr. Malcolm Knox, del CSIRO
Livestock Industries FD McMaster Laboratory, Armidale,
Australia; y las L3 provenientes de Cooperia sp. fueron
suministradas por Novartis Animal Health, New South
Wales, Australia, para realizar la primoinfeccin de los
bovinos donadores de L3.
Dos terneros de destete libres de parsitos fueron
infectados con una dosis nica de 10.000 L
3
H. placei
y otros dos animales con una dosis nica de 15.000 L
3

Cooperia sp. Los cuatro animales se mantuvieron en corrales
individuales en las instalaciones del CSIROs Lansdown
Research Station, Townsville, Australia. L3 de H. placei
y Cooperia sp. se obtuvieron de cultivos fecales despus
de 28 das postinfeccin siguiendo el procedimiento de
Lyndall-Murphy (1993). Aproximadamente 30 g de heces
y un volumen similar de vermiculita fueron puestos en
botellas de cultivo. Las heces fueron cultivadas para pro-
ducir L3 solamente si el recuento de huevos de parsitos
excedi los 200 huevos por gramo.
L3 provenientes de cultivos puros de H. contortus y T. co-
lubriformis fueron suministradas en su totalidad para realizar
el test in vitro por el Dr. Malcolm Knox, del CSIRO Livestock
Industries FD McMaster Laboratory, Armidale, Australia, por
lo que no se necesit contar con animales dadores.
TEST DE INHIBICIN DE LA MIGRACIN LARVAL
Para determinar la eficacia antihelmntica de los
extractos de plantas se utiliz el test in vitro de inhibi-
cin de la migracin larval desarrollado por Wagland
y col (1992) y modificado por Rabel y col (1994). Se
construyeron filtros con tubos de acrlico transparente
de 20 mm de largo y 7 mm de dimetro interno a los que
se les adhiri una malla de nylon de 20 m en uno de
sus extremos. Se utilizaron tubos plsticos de 2 ml a los
cuales se le agreg 0,4 ml de extracto diluido (dilucin
final 5, 15 y 30 mg/ml) y 150 a 200 L3 suspendidas en
0,1 ml de solucin acuosa. Se realizaron tres repeticio-
nes para cada una de las distintas concentraciones de
los extractos de plantas y un control negativo (L3 en
buffer fosfato) se corri en paralelo. Los tubos fueron
incubados a 37 C por 16 horas. El contenido total de
los tubos (0,5 ml) fue luego transferido a los filtros
localizados dentro de cmaras de acrlico de 1,9 cm de
dimetro interno. Dichas cmaras con los filtros fueron
incubadas a temperatura ambiente por 18 horas para
permitir a las larvas migrar a travs de los filtros dentro
de la cmara. Luego, los filtros fueron removidos de
las cmaras y el nmero total de larvas en las cmaras
y en los filtros fueron contados.
ANLISIS ESTADSTICO
La inhibicin de la migracin larval (IML) se determin
usando la siguiente frmula:
IML = A- Bx100
A
Donde A = proporcin de larvas migradas en el control y
B = proporcin de larvas migradas en los tratamientos
Para la variable porcentaje de migracin larval fue
realizado un anlisis de variancia con un arreglo factorial
de planta por concentracin utilizando el procedimiento
PROC GLM de SAS V.9.1.3 (SAS, Institute Inc., Cary, NC,
USA). Para obtener el cumplimiento de los supuestos, la
variable fue transformada con la funcin arcoseno. Como
la interaccin result significativa fue estudiado el com-
portamiento de las plantas dentro de cada concentracin.
Con el objeto de detectar las mejores combinaciones de
planta y concentracin fueron realizadas comparaciones
mltiples con la media ms pequea (CMM) (Kuehl 2001).
Esta metodologa estadstica permiti detectar subconjun-
tos conformados por extractos de plantas con porcentajes
de inhibicin larvaria similares dentro de cada una de las
concentraciones evaluadas. Cuando se compararon todas las
combinaciones de extractos de plantas y concentraciones,
la CMM detect un subgrupo combinacin extracto-
concentracin con los mejores porcentajes de inhibicin
larvaria para cada especie parasitaria.
RESULTADOS
La interaccin entre extractos de plantas y concen-
traciones fue significativa en cada uno de los gneros
parasitarios evaluados (P < 0,0001).
El porcentaje de migracin de larvas de Haemonchus
placei en el tratamiento control con solo buffer fue de
89,66%. A la concentracin de 5 mg/ml fue detectado
efecto significativo entre plantas (P < 0,0001). En el
cuadro 1 puede observarse que la CMM detect un
158
F MORENO Y COL
subconjunto de extractos que afectaron la migracin
larval, conformado por las plantas Eucalyptus tereticornis,
Eucalyptus tessellaris, Eucalyptus crebra, Eucalyptus
moluccana, Eucalyptus platyphylla, Acacia flavescens,
Acacia holosericea, Acacia leptostachya, Acacia salicina,
Allocasuarina torulosa, Casuarina cunninghamiana y
Neolitsea dealbata, con porcentajes de migracin menores
al 81,6%. A la concentracin de 15 mg/ml el efecto de
los extractos tambin fue estadsticamente significativo
(P < 0,0001) y la CMM detect un subconjunto confor-
mado solamente por la planta Allocasuarina torulosa con
un porcentaje de migracin de 4,19%. A la concentracin
de 30 mg/ml fue detectado efecto significativo entre
plantas (P < 0,0001) y la CMM detect un subconjunto
de extractos conformado por las plantas Acacia holose-
ricea, Acacia salicina, Allocasuarina torulosa, Callitris
endlicheri, Casuarina cunninghamiana y Neolitsea
dealbata, con porcentajes de migracin menores al
20,5%. Cuando se compararon todas las combinaciones
de plantas y concentraciones, la CMM detect un grupo
conformado por las plantas Acacia holosericea, Acacia
salicina, Allocasuarina torulosa, Callitris endlicheri,
Casuarina cunninghamiana y Neolitsea dealbata, a la
concentracin de 30 mg/ml, y la planta Allocasuarina
torulosa a la concentracin de 15 mg/ml con porcentajes
de migracin menores al 21%.
Para Cooperia sp., el porcentaje de migracin larval en
el tratamiento control con solo buffer fue de 93,78%. En el
cuadro 2 se observa que a la concentracin de 5 mg/ml fue
detectado efecto significativo entre plantas (P = 0,0002)
y la CMM detect un subconjunto de extractos confor-
mado por las plantas Acacia farnesiana, Acacia salicina,
Allocasuarina torulosa, Casuarina cunninghamiana y
Neolitsea dealbata, con porcentajes de migracin menores
al 73%. A la concentracin de 15 mg/ml el efecto de las
plantas fue estadsticamente significativo (P < 0,0001) y la
CMM detect un subconjunto de extractos que afectaron
la migracin larval, conformado por las plantas Acacia
salicina, Allocasuarina torulosa y Neolitsea dealbata,
con porcentajes de migracin menores al 16%. A la
concentracin de 30 mg/ml tambin fue detectado efecto
significativo entre plantas (P < 0,0001) y la CMM detect
un subconjunto de extractos, conformado por las plantas
Acacia holosericea, Acacia melanoxylon, Acacia salicina,
Cuadro 1. Porcentaje de migracin de larvas infectivas de Haemonchus placei despus de la incubacin con extractos de plantas
a 5, 15 y 30 mg/ml (n = 3).
Percentage migration of infective larvae of Haemonchus placei after incubation with plant extracts at 5, 15 y 30 mg/ml (n = 3).
Concentracin
Extracto
de plantas
[5 mg/ml] [15 mg/ml] [30 mg/ml]
Media EE Media EE Media EE
Eucalyptus citriodora 81,92 1,49 79,95 1,99 79,88 0,93
Eucalyptus tereticornis 77,04* 2,48 72,12 3,95 58,72 4,03
Eucalyptus tessellaris 81,64* 3,13 79,11 2,17 68,95 5,06
Eucalyptus crebra 72,43* 4,61 68,37 1,68 66,55 5,56
Eucalyptus moluccana 81,09* 1,51 84,47 1,79 74,01 5,33
Eucalyptus platyphylla 73,45* 2,28 63,89 4,42 65,16 4,43
Acacia farnesiana 91,49 1,18 82,85 0,44 80,48 7,52
Acacia flavescens 77,09* 4,33 71,21 6,31 68,03 6,45
Acacia holosericea 62,87* 4,29 54,77 3,36 11,80*
#
8,98
Acacia leptostachya 80,18* 1,48 45,96 7,48 34,83 5,78
Acacia melanoxylon 83,89 2,14 64,79 5,83 51,30 7,56
Acacia salicina 74,24* 2,60 42,79 8,81 17,32*
#
4,69
Allocasuarina torulosa 61,28* 10,28 4,19*
#
2,09 1,07*
#
0,45
Alphitonia excelsa 90,17 1,90 74,18 3,47 67,61 9,35
Callitris endlicheri 83,64 1,45 47,90 1,26 9,62*
#
4,82
Casuarina cunninghamiana 78,08* 10,69 59,39 7,14 7,36*
#
5,24
Erythrina variegata 92,24 3,27 49,97 8,32 49,43 6,36
Melaleuca leucodendra 86,95 2,79 78,00 2,66 80,54 1,48
Neolitsea dealbata 68,09* 4,81 34,93 6,60 20,41*
#
4,67
* Subconjuntos de extractos con menor porcentaje de migracin, detectados por la CMM en cada una de las concentraciones.
#
Subconjunto de combinacin extractos/concentracin con menor porcentaje de migracin, detectados por la CMM.
159
EVALUACIN IN VITRo, NEMATODOS GASTROINTESTINALES, PLANTAS, PROPIEDADES ANTIHELMNTICAS
Cuadro 2. Porcentaje de migracin de larvas infectivas de Cooperia sp. despus de la incubacin con extractos de plantas a 5, 15 y
30 mg/ml (n = 3).
Percentage migration of infective larvae of Cooperia sp. after incubation with plant extracts at 5, 15 y 30 mg/ml (n = 3).
Concentracin
Extracto
de plantas
[5 mg/ml] [15 mg/ml] [30 mg/ml]
Media EE Media EE Media EE
Eucalyptus citriodora 82,92 1,46 74,11 2,29 85,75 1,87
Eucalyptus tereticornis 90,20 1,83 73,47 9,39 69,19 4,09
Eucalyptus tessellaris 91,78 2,17 86,06 2,30 56,16 1,90
Eucalyptus crebra 89,59 1,63 84,92 3,24 79,32 5,10
Eucalyptus moluccana 92,06 1,73 87,34 1,06 50,71 2,59
Eucalyptus platyphylla 77,44 1,60 53,59 8,02 47,55 8,66
Acacia farnesiana 72,71* 8,70 83,17 6,28 90,32 0,48
Acacia flavescens 81,01 6,54 72,52 5,43 66,54 9,51
Acacia holosericea 86,60 2,42 40,46 6,37 15,46*
#
8,88
Acacia leptostachya 88,06 4,26 84,71 8,09 58,60 12,97
Acacia melanoxylon 84,71 3,51 75,94 12,27 29,74*
#
11,51
Acacia salicina 68,27* 7,96 13,52*
#
1,35 0,41*
#
0,21
Allocasuarina torulosa 38,93* 16,31 5,55*
#
1,52 2,30*
#
1,16
Alphitonia excelsa 84,75 1,26 81,69 4,82 72,85 9,90
Callitris endlicheri 78,53 3,30 42,47 6,27 0,39*
#
0,20
Casuarina cunninghamiana 72,14* 9,54 55,74 5,64 20,49
#
11,83
Erythrina variegata 85,88 4,52 86,16 2,22 70,98 3,21
Melaleuca leucodendra 92,77 0,51 87,84 3,59 88,32 1,03
Neolitsea dealbata 66,64* 13,71 15,69*
#
2,00 2,07*
#
0,82
* Subconjuntos de extractos con menor porcentaje de migracin, detectados por la CMM en cada una de las concentraciones.
#
Subconjunto de combinacin extractos/concentracin con menor porcentaje de migracin, detectados por la CMM.
Allocasuarina torulosa, Callitris endlicheri y Neolitsea
dealbata, con porcentajes de migracin menores al 30%.
Cuando se compararon todas las combinaciones de plantas
y concentraciones, la CMM detect un grupo conformado
por las plantas Acacia holosericea, Acacia melanoxylon,
Acacia salicina, Allocasuarina torulosa, Callitris endli-
cheri, Casuarina cunninghamiana y Neolitsea dealbata,
a la concentracin de 30 mg/ml, y las plantas Acacia
salicina, Allocasuarina torulosa y Neolitsea dealbata a la
concentracin de 15 mg/ml con porcentajes de migracin
menores al 30%.
El porcentaje de migracin de larvas de Haemonchus
contortus en el tratamiento control con solo buffer fue de
99,3%. A las concentraciones de 5 mg/ml y 15 mg/ml no fue
detectado efecto significativo entre plantas (P = 0,3777) y
(P = 0,0529) respectivamente. Sin embargo, a la concentracin
de 30 mg/ml (cuadro 3) fue detectado efecto significativo
entre plantas (P = 0,0053) y la CMM detect un subconjunto
de extractos que afectaron la migracin larval, conformado
por las plantas Acacia holosericea, Acacia nilotica, Acacia
farnesiana, Callitris endlicheri y Casuarina cunninghamiana,
con porcentajes de migracin menores al 88%. Cuando se
compararon todas las combinaciones de plantas y concentra-
ciones, la CMM detect un grupo conformado por las plantas
Acacia holosericea, Acacia nilotica, Acacia farnesiana, Callitris
endlicheri y Casuarina cunninghamiana a la concentracin
de 30 mg/ml y la planta Casuarina cunninghamiana a la
concentracin de 15 mg/ml con porcentajes de migracin
entre 64,14 y 89,83%.
Para Trichostrongylus colubriformis el porcentaje de
migracin larval en el tratamiento control con solo buffer
fue de 99,5%. A la concentracin de 5 mg/ml no fue
detectado efecto significativo entre plantas (P = 0,4129).
En el cuadro 4 puede observarse que a la concentracin
de 15 mg/ml fue detectado efecto significativo entre
plantas (P = 0,0006) y la CMM detect un subconjunto
160
F MORENO Y COL
Cuadro 3. Porcentaje de migracin de larvas infectivas de Haemonchus contortus despus de la incubacin con extractos de plantas
a 5, 15 y 30 mg/ml (n = 3).
Percentage migration of infective larvae of Haemonchus contortus after incubation with plant extracts at 5, 15 y 30 mg/ml (n = 3).
Concentracin
Extracto
de plantas
[5 mg/ml] [15 mg/ml] [30 mg/ml]
Media EE Media EE Media EE
Acacia holosericea 97,41 2,59 98,28 0,84 83,49*
#
1,47
Acacia melanoxylon 96,34 1,54 93,07 0,41 98,87 0,05
Acacia nilotica 100 0 96,60 0,05 77,12*
#
5,41
Acacia salicina 98,90 0,65 99,78 0,23 97,29 0,98
Acacia farnesiana 98,78 0,67 98,42 0,58 87,79*
#
0,45
Callitris endlicheri 98,32 0,25 96,87 2,20 64,14*
#
23,57
Casuarina cunninghamiana 96,98 0,01 89,83
#
8,13 77,89*
#
16,70
Eucalyptus drepanophylla 98,01 1,11 97,75 0,72 96,63 0,97
Eucalyptus platyphylla 99,02 0,39 99,76 0,25 98,57 0,01
Eucalyptus tereticornis 98,03 1,98 99,34 0,67 98,64 0,40
Eucalyptus tessellaris 99,57 0 99,27 0,25 99,34 0,17
Eucalyptus corymbia 97,09 1,23 99,78 0,23 99,77 0,23
Euphorbia hirta 98,90 0,62 99,44 0,04 98,54 0,15
Panicum minutiflora 95,91 1,36 96,41 2,11 98,44 0,57
* Subconjuntos de extractos con menor porcentaje de migracin, detectados por la CMM en cada una de las concentraciones.
#
Subconjunto de combinacin extractos/concentracin con menor porcentaje de migracin, detectados por la CMM.
Cuadro 4. Porcentaje de migracin de larvas infectivas de Trichostrongylus colubriformis despus de la incubacin con extractos de
plantas a 5, 15 y 30 mg/ml (n = 3).
Percentage migration of infective larvae of Trichostrongylus colubriformis after incubation with plant extracts at 5, 15 y 30 mg/ml
(n = 3).
Concentracin
Extracto
de plantas
[5 mg/ml] [15 mg/ml] [30 mg/ml]
Media EE Media EE Media EE
Acacia holosericea 99,14 0,05 99,40 0,16 98,51 1,49
Acacia melanoxylon 99,16 0,45 99,22 0,02 98,27 0,49
Acacia nilotica 99,09 0,91 97,22* 0,89 87,12 0,65
Acacia salicina 100 0 100 0 97,65 1,51
Acacia farnesiana 99,79 0,21 99,39 0,62 100 0
Callitris endlicheri 99,17 0,04 92,96* 2,72 21,55*
#
14,96
Casuarina cunninghamiana 97,55 1,06 100 0 86,86 8,58
Eucalyptus drepanophylla 98,81 0,24 98,34 1,23 97,71 0,97
Eucalyptus platyphylla 99,41 0,59 99,60 0,02 97,79 1,74
Eucalyptus tereticornis 97,90 0,15 98,49 0,27 98,12 0,56
Eucalyptus tessellaris 99,14 0,01 99,45 0,15 99,37 0,28
Eucalyptus corymbia 99,57 0 100 0 100 0
Euphorbia hirta 98,15 1,85 98,54 0,61 97,85 1,70
Panicum minutiflora 99,50 0,08 98,13 0,61 97,03 1,68
* Subconjuntos de extractos con menor porcentaje de migracin, detectados por la CMM en cada una de las concentraciones.
#
Subconjunto de combinacin extractos/concentracin con menor porcentaje de migracin, detectados por la CMM.
161
EVALUACIN IN VITRo, NEMATODOS GASTROINTESTINALES, PLANTAS, PROPIEDADES ANTIHELMNTICAS
de extractos conformado por las plantas Acacia nilotica
y Callitris endlicheri, con porcentajes de migracin de
97,22% y 92,96%, respectivamente. A la concentracin de
30 mg/ml fue detectado efecto significativo entre plantas
(P < 0,0001) y la CMM detect un subconjunto confor-
mado solamente por la planta Callitris endlicheri con un
porcentaje de migracin de 21,55%. Cuando se compararon
todas las combinaciones de plantas y concentraciones,
la CMM detect solo la planta Callitris endlicheri a la
concentracin de 30 mg/ml como diferente del resto de
los extractos.
DISCUSIN
Las especies de plantas estudiadas en el presente
trabajo se eligieron debido a que fueron previamente
nombradas en fuentes de etnobotnica como activas en el
control de parsitos en animales o humanos e identificadas
previamente por su alto contenido en MSP con potencial
antiparasitario.
Para H. placei la CMM nos permiti detectar subconjun-
tos de extractos de plantas que causaron bajos porcentajes
de migracin dentro de cada una de las concentraciones
evaluadas. La mayora de las extractos analizados afectaron
significativamente (P < 0,0001) la migracin de larvas a la
concentracin de 5 mg/ml, pero los niveles de inhibicin
de la migracin larval (IML) de entre 8 y 28% no fueron
relevantes, mientras que a la concentracin de 15 mg/ml
el extracto de Allocasuarina torulosa logr una reduccin
importante de la migracin con niveles de IML mayores a
85%. Los extractos de Acacia holosericea, Acacia salicina,
Allocasuarina torulosa, Callitris endlicheri, Casuarina
cunninghamiana y Neolitsea dealbata, a la concentracin
de 30 mg/ml causaron una reduccin de la migracin con
niveles de IML de 69%.
Para Cooperia sp. la CMM detect subconjuntos de
extractos de plantas que causaron porcentajes de migracin
variables. A la concentracin de 5 mg/ml los extractos
lograron IML en un 22%, mientras que a la concentracin
de 15 mg/ml y 30 mg/ml los niveles de IML llegaron a
78 y 64% respectivamente. Las especies de plantas que
resultaron ms efectivas en reducir significativamente la
migracin de larvas de H. placei y Cooperia sp. con por-
centajes menores a 21% y 30% respectivamente fueron:
Acacia holosericea, Acacia salicina, Allocasuarina torulosa,
Callitris endlicheri, Casuarina cunninghamiana y Neolitsea
dealbata (cuadro 1). Allocasuarina torulosa fue una de
las especies que redujo la migracin de larvas en ambas
especies de parsitos a las diferentes concentraciones eva-
luadas. Acacia salicina, Allocasuarina torulosa y Neolitsea
dealbata fueron las especies de plantas detectadas por el
mtodo CMM que demostraron una significativa capacidad
de inhibicin de la migracin en L3 de Cooperia sp. a las
tres concentraciones estudiadas.
Para el caso de las L3 de H. contortus y T. colubri-
formis, pudo observarse un menor efecto de los extractos
vegetales evaluados, lo que se vio reflejado en los altos
porcentajes de migracin larval. Para H. contortus,
solo a la concentracin de 30 mg/ml pudieron detec-
tarse extractos de plantas que redujeron la migracin
larval con bajos ndices de IML (11%), mientras que a
la concentracin de 15 mg/ml un solo extracto redujo
escasamente la migracin larval con un IML de 3%.
Estos valores demuestran una baja efectividad de los
extractos, lo que se traduce en una reducida capacidad
de inhibicin de la migracin de L3 de H. contortus a
las tres concentraciones estudiadas
En el caso de T. colubriformis, si bien a la concentra-
cin de 15 mg/ml los niveles de IML (2,5%) no fueron
relevantes, a la concentracin de 30 mg/ml el extracto de
Callitris endlicheri logr una reduccin importante de la
migracin con niveles de IML mayores a 78%. Callitris
endlicheri fue la nica especie de planta detectada por el
mtodo CMM que mostr una significativa capacidad de
inhibicin de la migracin larval.
Callitris endlicheri es una de las especies de plantas
que redujo la migracin de larvas en todas las especies de
nematodos evaluadas en el presente estudio. Estos resul-
tados concuerdan con los antecedentes que muestran que
esta especie de planta fue previamente identificada por su
alto contenido en taninos y por su efecto antihelmntico
en equinos (Lassak y McCarthy 1983, Chittendon 1956
5
,
Cribb y Cribb 1981
3
).
Por su parte, Eucalyptus grandis es conocido por su
efecto antihelmntico en caprinos (Bennet-Jenkins y Bryant
1996). Sin embargo, en el presente estudio las especies de
Eucalyptus evaluadas tuvieron un efecto leve en larvas de
H. placei y Cooperia sp. y no afectaron la migracin de
larvas de H. contortus y T. colubriformis.
En general, las especies de Acacia (Seigler 2002,
Anderson 1993) y Eucalyptus
6
son conocidas por su alto
contenido en MSP siendo particularmente ricas en taninos.
En el presente estudio las especies de Acacia presentaron
una mayor actividad antihelmntica que las especies de
Eucalyptus. Por ejemplo, Acacia holosericea y Acacia
salicina estuvieron dentro de las especies que mostraron
tener actividad para H. placei y Cooperia sp., mientras que
ningn Eucalyptus se encontr dentro de este grupo. Algo
similar ocurri en H. contortus y T. colubriformis donde
Acacia holosericea, Acacia nilotica, Acacia farnesiana
fueron las especies ms activas, pero ningn Eucalyptus
se encontr dentro de este grupo.
Existe muy poca informacin acerca de la actividad
antiparasitaria de las especies de plantas evaluadas en el
presente estudio. A su vez, la poca informacin disponible
en general no es clara. Es necesario que estos resultados
generados in vitro sean validados con estudios in vivo. De
5
http://www.ibiblio.org/pfaf/cgi-bin/arr_ht ml?Callitris+endlicheri
&CAN=LATIND. fecha consulta: 08/08/2005.
6
Moore B. 2005. Senior Research Associate. School of Tropical
Biology. James Cook University (comunicacin personal).
162
F MORENO Y COL
hecho, algunos estudios encontraron una buena relacin
entre los resultados in vitro e in vivo, por ejemplo Molan
y col (2000
a, b
) encontraron que los taninos condensados
purificados de varias especies vegetales redujeron la mo-
vilidad y migracin de L3 de nematodos y estos resultados
estuvieron de acuerdo con los obtenidos en estudios in
vivo en rumiantes (Athanasiadou y col 2000
, b
, Paolini
y col 2003
, b
). Sin embargo, se requiere prudencia en la
extrapolacin de los resultados in vitro a condiciones in
vivo debido a que los componentes qumicos de las plan-
tas pueden ser modificados luego de pasar por el tracto
digestivo. Esto es particularmente cierto en el ambiente
ruminal que afecta a los taninos por degradacin bacteriana
(Makkar 2003). Sumado a ello deben tenerse presente los
mecanismos adaptativos especiales desarrollados por los
animales. La presencia de Streptococcus caprinus en el
rumen de caprinos y la secrecin de saliva rica en prolina
son las principales adaptaciones experimentadas por los
caprinos, en los cuales plantas ricas en taninos son parte de
su dieta (Landau 2000). Por otra parte, la toxicidad de los
taninos para los animales no puede ser evaluada in vitro.
Es ampliamente conocido que bajas a moderadas concen-
traciones de taninos (3-6% MS) mayoritariamente tuvieron
efectos positivos en la fisiologa del hospedador, crecimiento
y produccin de lana y leche (Min y col 2003), mientras
que altas concentraciones (7-8% MS) reducen la ganancia
de peso y productividad de los animales e incluso pueden
causarle la muerte (Waghorn y McNabb 2003). Por ello, una
vez identificadas las especies de plantas con mayor potencial
antihelmntico a travs de estudios in vitro, es necesario
validar dichos resultados con estudios in vivo.
Se concluye que, en general, los extractos de plantas
evaluados redujeron la migracin de larvas de H. placei
y Cooperia sp. Las plantas que mostraron una mayor
inhibicin de la migracin larval contra estas especies
de nematodos fueron Allocasuarina torulosa, Neolitsea
dealbata, Acacia holosericea, Acacia salicina, Callitris
endlicheri y Casuarina cunninghamiana.
Los extractos fueron menos efectivos en inhibir la
migracin de larvas de H. contortus y T. colubriformis.
Las plantas que mostraron una mayor inhibicin de la
migracin larval contra esta especies de nematodos fueron
Callitris endlicheri, Casuarina cunninghamiana, Acacia
farnesiana, Acacia holosericea y Acacia nilotica.
Callitris endlicheri fue la especie que inhibi la migra-
cin de todas las especies de nematodos estudiadas.
Estos resultados in vitro sugieren la existencia de
propiedades antihelmnticas asociadas con algunas de
las especies de plantas evaluadas. Para confirmar estos
resultados in vitro es necesario conducir estudios in vivo
con dichas plantas.
RESUMEN
Con el objeto de estudiar la capacidad antihelmntica de algunas
especies de plantas presentes en el Estado de Queensland, Australia, se
evalu el efecto in vitro de extractos de hojas de plantas en la migracin de
larvas infectantes (L3) de Haemonchus placei, Cooperia sp., Haemonchus
contortus y Trichostrongylus colubriformis. En general, los extractos
de plantas redujeron la migracin de larvas de H. placei y Cooperia sp.
Las plantas con mayor actividad antihelmntica contra estas especies
de nematodos fueron Allocasuarina torulosa, Neolitsea dealbata,
Acacia holosericea, Acacia salicina, Callitris endlicheri y Casuarina
cunninghamiana (P < 0,0001). Los extractos fueron menos efectivos
en inhibir la migracin de larvas de H. contortus y T. colubriformis.
Las plantas que mostraron una mayor inhibicin de la migracin larval
contra estas especies de nematodos fueron Callitris endlicheri, Casuarina
cunninghamiana, Acacia farnesiana, Acacia holosericea y Acacia nilotica
(P < 0,0001). Callitris endlicheri fue la especie que ms consistentemente
inhibi la migracin de todas las especies de nematodos estudiadas. Estos
resultados in vitro sugieren la existencia de propiedades antihelmnticas
asociadas con algunas de las especies de plantas evaluadas.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el apoyo tcnico y econmico del CSIRO
Sustainable Ecosystem, Townsville, Australia, y del INTA, Argentina,
para la realizacin de este trabajo. Un especial agradecimiento a Edgardo
Rodrguez y Juan Passucci de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la
UNCPBA, por su ayuda en el anlisis estadstico de los datos.
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ORIGINAL ARTICLE
Accepted: 09.06.2010.
# This work was supported by CONACYT-SAGARPA (project No.
12441).
* Apdo. Postal. 4-116, Itzimn, 97000, Mrida, Yucatn, Mxico;
ccastro@uady.mx
Adaptation of Haemonchus contortus to condensed tannins: can it be possible?
#
Adaptacin de Haemonchus contortus a los taninos condensados: puede ser posible?
JA Caldern-Quintal
a
, JFJ Torres-Acosta
a
, CA Sandoval-Castro
a*
,
MA Alonso
b
, H Hoste
c
, A Aguilar-Caballero
a
a
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autnoma de Yucatn, Yucatn, Mxico.
b
Centro de Enseanza, Investigacin y Extensin en Ganadera Tropical,
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autnoma de Mxico.
c
UMR1225 INRA/DGER IHAP, ENVT, Toulouse, France.
RESUMEN
El efecto antihelmntico (AH) in vitro de los extractos ricos en taninos de Acacia pennatula, Lysiloma latisiliquum, Piscidia piscipula y Leucaena leucocephala
sobre larvas L
3
de tres cepas mexicanas de Haemonchus contortus fue evaluado. Extractos acetona/agua fueron obtenidos del follaje de A. pennatula, L. latisiliquum,
P. piscipula y L. leucocephala proveniente de la vegetacin de Yucatn, Mxico. Concentraciones crecientes de extractos liofilizados (300, 600, 1.200, 1.800 and
2.400 mg/ml PBS) fueron empleados para evaluar el efecto AH utilizando la prueba de inhibicin de la migracin larvaria (LMI). Se utilizaron tres cepas
mexicanas no relacionadas de H. contortus (CENID-INIFAP, UADY y UNAM). El papel de los taninos sobre el efecto AH fue confirmado mediante el
uso de polivinil polipirrolidona (PVPP), un inhibidor de taninos. Las cepas de H. contortus mostraron diferente respuesta a los extractos. Unicamente
un extracto de planta (L. latisiliquum) mostr efecto sobre la migracin larvaria en la cepa de Yucatn (UADY). Dos extractos de plantas (A. pennatula
y L. latisiliquum) inhibieron la migracin larvaria en la cepa CENID-INIFAP. Mientras que tres extractos tuvieron efecto sobre la cepa UNAM (A.
pennatula, L. latisiliquum y P. piscipula). Adicionalmente, la cepa UNAM fue afectada con dosis menores de los extractos en comparacin con las cepas
CENID-INIFAP y UADY. Los resultados indican que las larvas obtenidas de Yucatn, Mxico, son menos sensibles a los extractos de PRT obtenidos
de la misma regin sugiriendo una posible adaptacin a los taninos.
Key words: larval migration inhibition test, tropical tannin rich fodder, Haemonchus contortus.
Palabras clave: inhibicin de la migracin larvaria, forraje tropical rico en taninos, Haemonchus contortus.
INTRODUCTION
The direct anthelmintic (AH) activity, attributed to
phenolic compounds and specifically to condensed tan-
nins, is present in certain forages (Niezen et al 1995, Hoste
et al 2006). The nematocidal activity of tannin extracts
against L
3
larvae of gastrointestinal nematode (GIN), such
as Haemonchus contortus and Trichostrongylus colubri-
formis, has been tested in vitro using legume forages or
woody plants grown under temperate (Molan et al 2003,
Paolini et al 2004) and tropical conditions (Alonso-Daz
et al 2008
a
, 2008
b
). The AH effects have also been tested
in vivo (Brunet et al 2008, Martinez-Ortiz-de-Montellano
et al 2009, 2010).
The tropical and subtropical regions have a large vari-
ety of tropical tannin rich plants (TRP) within the native
vegetation of Yucatan (Flores-Guido 2001). These are an
important component of the diet of goats and sheep (Rios
and Riley 1985). In a previous study, we reported that Acacia
pennatula, Piscidia piscipula and Lysiloma latisiliquum
are consumed by goats (Alonso-Daz et al 2008
c
) and
sheep (Alonso-Daz et al 2009). Therefore, ruminants have
evolved and developed adaptation mechanisms that allow
them to consume tannins contained in TRP while satisfying
their nutrient requirements from this type of vegetation.
Furthermore, animals infected with H. contortus ate more
TRP fodder than non infected animals when offered the
same diet (Martinez-Ortiz de Montellano et al 2010).
Tannins from the fodder of TRP have a direct AH effect
upon the exsheatment of infective parasitic larvae (Brunet
et al 2008). The AH effect on adult stages is recently being
explored and preliminary results indicated lesions on the cu-
ticle, buccal cavity and vulva (Martinez-Ortiz-de-Montellano
et al 2009). However, sheep and goats consuming TRP, can
have GIN burden in their gastrointestinal tract which can
severely affect their health status. Therefore, it is possible to
hypothesize that GINs from animals with a history of TRP
intake might have also developed adaptation mechanisms
to survive tannins. This hypothesis is not unexpected since
both host and parasites co-evolve to adapt to prevailing
environmental conditions (Cordero-del-Campillo and Rojo-
Vzquez 1999). Parasites evolving to develop some kind
of adaptation mechanisms would be a logical result of the
166
JA CALDERN-QUINTAL ET AL
direct response against the ruminants TRP intake. Whether
the animals intake of TRP is linked to controlling their
GIN burden or just a nutrient search, parasites would need
to adapt to such hostile environment. This phenomenon
has not being studied yet in ruminants. However, recent
evidence from plant studies has suggested that phenolic
compounds appear to be the reciprocal cause and effect of
plant defense mechanisms and larval adaptation to such
mechanisms (Ibanez et al 2009). Hence, the objective of
the present study was to determine the sensitivity to TRP
in three H. contortus strains obtained from three zones in
Mexico, based on the assumption that the contact with
TRP was divergent depending on the area.
MATERIAL AND METHODS
SAMPLING AREA
The plant material was collected in the deciduous tropi-
cal forest of the north of Yucatan, Mexico (2048' N and
8942' W), in an area nearby the Faculty of Veterinary
Medicine of the Universidad Autonoma de Yucatan
(UADY), between June and November 2006 (wet season).
The climate of the area is hot sub-humid with summer
rainfalls. The average temperature ranged from 26 to
27.8 C. Annual rainfall ranges from 940 to 1100 mm
(Garca 1988). Prior to the beginning of the trial, samples
of the different plants were collected and identified at the
FMVZ-UADY herbarium.
PREPARATION OF PLANT EXTRACTS
The extracts used in this trial were the same used by
Alonso-Daz et al (2008
a
, 2008
b
). These were obtained
from fresh leaves of L. latisiliquum, A. pennatula, P. pi-
scipula and Leucaena leucocephala harvested from the
low deciduous forest nearby the premises of UADY, in
Merida, Yucatan, Mexico (2052 N, 8937 W). These
plant species were chosen because of their high content of
CT (Bobadilla-Hernndez et al 2007, Monforte-Briceo
et al 2005, Alonso-Daz et al 2008
c
). Fresh leaves of each
plant species (500 g) were chopped to obtain the extracts.
The chopped material was then placed in a mixer containing
one liter (l) of acetone: water (70:30) containing ascorbic
acid (1 g 1-1) to avoid oxidation. The mixture was then
sonicated for 20 min in a water bath (Branson 5510).
The extract was obtained from the filtered material using
a filter paper. Acetone was evaporated from the extract at
58 C using a roto-vapor (Buchii R-114). The aqueous
solution was washed four times with 500 ml methylene
chloride to remove chlorophyll and lipids. A separation
funnel was used for discarding the methylene chloride
fraction. The remaining fractions were lyophilized and
kept refrigerated at 4 C in air-tight containers until their
use for biochemical and biological assays.
POLY-PHENOLIC COMPOUND COMPOSITION OF THE PLANT
EXTRACTS
The extracts were analyzed to quantify the content of
polyphenolic compounds by Alonso-Daz et al (2008
a
).
This included total phenols (TP with FolinCiocalteu), total
tannins (TT with FolinCiocalteu + PVPP), condensed tan-
nins (CT with the Vanillin method) and biological activity
(BA units measured as relative precipitation per gram of
extract using resorcinol as standard). The highest level of
CT and BA was found in A. pennatula extract (95.98 g/100
and 11.54 units respectively). Lysiloma latisiliquum and L.
leucocephala extracts followed with 46.91 g/100 and 7.00
units and 45.71 g/100 and 5.80 units respectively. Finally,
the lowest values were found in P. piscipula extract (26.07
g/100 and 5.00 units).
PREPARATION OF GASTROINTESTINAL NEMATODE LARVAE
Larvae were harvested from faecal cultures of sheep
faeces with mono-specific H. contortus infection. Three
sheep were used as egg donors for the faecal cultures. Each
donor sheep was infected with one of the three different
H. contortus strains used. The strains originated from
three different parasitology laboratories: UADY (Merida,
Mexico), UNAM (Cuatitlan, Mexico) and CENID-INIFAP
(Cuernavaca, Mexico). The first strain (UADY) was ob-
tained from a donor sheep which was artificially infected
with a local H. contortus strain isolated from a browsing
animal with daily access to the area where the plants were
collected. The UNAM strain was obtained from grazing
sheep from the highlands of the centre of Mexico (grass
fed). The third strain (CENID-INIFAP) was obtained from
sheep herded in a subhumid tropical area in Hueytamalco,
Puebla in the centre of Mexico.
Faeces were collected from the respective donor sheep
every morning using plastic containers. Faeces were ho-
mogenized and moistened to achieve a crumbly (doughy)
consistency in a plastic container with an aluminum lid.
The faeces were incubated at room temperature (27-30 C)
for 7 to 8 days. This allowed the eggs of H. contortus
to hatch and develop to the infective L
3
larvae. At the
end of the incubation period, the mixture was placed in
respective Baermans apparatus overnight to harvest the
L
3
larvae. The larvae were sieved (250 mm) to remove
faecal debris. Then, larvae were stored at 4 C for later
use. The larvae from the three strains were used between
two and six weeks of age.
LARVAL MIGRATION INHIBITION BIOASSAY (LMI)
The inhibitory activity of the native tanniniferous plants
extracts was evaluated with an in vitro larval migration
inhibition (LMI) assay (Rabel et al 1994). This assay
measures the percentage of L
3
larvae of H. contortus that
fails to pass through a sieve relative to the larvae in the
167
LARVAL MIGRATION INHIBITION TEST, TROPICAL TANNIN RICH FODDER, HAEMoNCHUS CoNToRTUS
control wells containing phosphate-buffer solution (PBS).
A range of plant extract concentrations (600, 1,200, 1,800
and 2,400 g/ml diluted on PBS) were used as described by
Alonso-Daz et al (2008
a
, 2008
b
). Briefly, four ml of larval
solution concentrated at ~1000 L
3
/ml were added to tubes
containing four ml of either PBS, an anthelmintic control
(levamisole 0.4%) or a range of plant extract concentrations
for each plant species. All incubations were carried out for
three hours at 24 C. Thereafter, the L
3
were added with
4 ml of PBS and centrifuged (3,500 rpm during 5 min).
The supernatant was removed (4 ml). This procedure was
repeated three times. Then, 800 l of this solution were
added to inserts equipped with a 20 m mesh, positioned
in a conical tube with the mesh just above PBS. Four repli-
cates were run for each plant concentration as well as for its
PBS and anthelmintic controls. As in other studies, the 20
m mesh was selected in order to ensure that migration of
larvae through the sieves was an active phenomenon. After
three hours at room temperature, the inserts were retrieved
and L
3
which had actively migrated through the mesh into
the PBS below, were counted under a stereomicroscope at
magnification 20x, based on a 10% aliquot.
In order to confirm the role of tannins in the AH effect,
another series of incubations were made using polyvinyl
polypirrolidone (PVPP) as a tanning blocking agent (Makkar
et al 1995). The procedure was similar to that described
above including three treatments: i) the negative control
(PBS), ii) the solution to be tested with PVPP (50 mg
PVPP/ml) and iii) the same test solution without PVPP.
Four replicates were run for each treatment.
DATA CALCULATION AND STATISTICAL ANALYSES
The larval migration (%) was determined according
to the following equation:
%LM = B/A * 100
Where: A is the number of larvae deposited in the
sieves in the wells, and B is the number of larvae migrating
through sieves in wells.
The significance of differences (P < 0.05) of larval
migration among different treatments (extract doses)
and their respective PBS control in the different assays
was performed by means of Mann-Whitney tests using
Minitab 15 (Minitab 2007). No statistical comparison
was performed between strains. Also, PBS values were
not compared statistically as they were used as reference
control values.
Larval migration inhibition was determined according
to the equation reported by Rabel et al (1994):% LMI =
((A-B)/A) * 100
Where: A is the number of larvae migrating through
the sieves in negative control wells (PBS), and B is the
number of larvae migrating through sieves in the respec-
tive treatment wells (containing extracts). No statistical
analysis was performed for these values.
RESULTS
LARVAL MIGRATION INHIBITION BIOASSAYS
UNAM strain. The migration obtained with the PBS
control ranged from 50.71 to 66.70% and the levamisol
migration ranged from 0 to 1.31%. Significant differences
(P < 0.05) to control values were found at low doses (600
g/ml) for the larvae after contact with A. pennatula and
even lower for L. latisiliquum (300 g/ml) (table 1).
Meanwhile, a high concentration (1,200 g of extract/
ml) of P. piscipula extract was needed to cause inhibition
of larval migration for this strain of H. contortus (57%
relative to the PBS control). The L. leucocephala extract
did not cause a reduction in the larval migration at any
concentrations used in this trial (P > 0.05).
CENID-INIFAP strain. The migration obtained with the PBS
control ranged from 83.04 to 100.00% and the levamisol
migration ranged from 0 to 1.95%. A consistent AH effect
was found with the A. pennatula extract from 600 g/ml
causing a significant reduction (49.18%) on the larval
migration compared to the PBS control (P < 0.05). The
L. latisiliquum extract showed an effect only at the highest
concentration with 2,400 g/ml (35.06%; P < 0.008).
The L. leucocephala and P. piscipula extracts did not
cause a reduction in the larval migration of H. contortus
at any concentrations used (P > 0.05).
UADY strain. The migration obtained with the PBS control
ranged from 50.63 to 68.90% and the levamisol migration
ranged from 0 to 2.15%. Significant differences to control
values were found for the larvae after contact with 300,
600, 1,200, 1,800, 2,400 g/ml of the L. latisiliquum
extract (P < 0.05) and the larval migration inhibition
showed to be 27.8%, 22%, 28%, 35% and 51.7%
respectively. The A. pennatula, L. leucocephala and
P. piscipula extracts did not cause reduction in the larval
migration of H. contortus at any concentrations used
(P > 0.05).
A second series of LMI assays, with and without
PVPP, showed significant differences (P < 0.05) compared
to control values for the three larvae strains. The level
used for the UNAM strain was 1,200 g/ml meanwhile
the UADY and the CENID-PAVET strains were tested at
2,400 g/ml because some extracts were not showing AH
effect at 1,200 g/ml. Migration was restored to control
values in A. pennatula, L. latisiliquum, and P. piscipula
when PVPP was added.
DISCUSSION
Although the AH effect of tannins on GIN has been
demonstrated consistently, the efficacy has been variable.
Alonso-Diaz et al (2008
a
, 2008
b
) reported that tannin-
containing extracts obtained from different TRP have a
168
JA CALDERN-QUINTAL ET AL
Table 1. Percentage of migration of Haemonchus contortus infective larvae (UNAM strain) exposed to different concentrations of
tannin rich plant extracts (Mean+/SE).
Migracin (%) de larvas infectantes de Haemonchus contortus (cepa UNAM) expuestas a diferentes concentracions de extractos vegetales
ricos en taninos (Media +/SE).
Treatments 2,400 g/ml 1,800 g/ml 1,200 g/ml 600 g/ml 300 g/ml
Acacia pennatula 48.03 1.23* 47.83 3.73* 45.05 7.31
Leucaena leucocephala 43.45 3.65 49.06 4.10 46.78 3.44 56.59 4.21 43.84 3.46
Piscidia piscipula 28.53 4.49* 62.81 4.01
Lysiloma latisiliquum 42.05 8.52* 35.49 5.51* 40.10 4.73*
* Values in the respective rows are statistically different to those of the PBS values.
using the larval migration inhibition (LMI) assay.
No reduction in larval migration compared to PBS control.
Table 2. Percentage of migration of Haemonchus contortus infective larvae (CENID-INIFAP strain) exposed to different concentrations
of tannin rich plant extracts(Mean+/SE).
Migracin (%) de larvas infectantes de Haemonchus contortus (cepa CENID-INIFAP) expuestas a diferentes concentracions de extractos
vegetales ricos en taninos (Media +/SE).
Treatments 2,400 g/ml 1,800 g/ml 1,200 g/ml 600 g/ml 300 g/ml
Acacia pennatula 34.5 6.89* 40.33 6.01* 55.09 12.41* 58.52 9.93*
Leucaena leucocephala 73.44 6.0
Piscidia piscipula 98.41 4.71 97.26 7.69 92.13 2.73
Lysiloma latisiliquum 31.60 1.07*** 72.04 6.55 77.36 5.74 75.77 3.09
* Values in the respective rows are statistically different to those of the PBS values.
using the larval migration inhibition (LMI) assay.
No reduction in larval migration compared to PBS control.
Table 3. Migration (%) of Haemonchus contortus infective larvae (UADY strain) exposed to different concentrations of tannin rich
plant extracts (Mean+/-SE).
Migracin (%) de larvas infectantes de Haemonchus contortus (cepa UADY) expuestas a diferentes concentracions de extractos vegetales
ricos en taninos (Media +/SE).
Treatments 2,400 g/ml 1,800 g/ml 1,200 g/ml 600 g/ml 300 g/ml
Acacia pennatula 48.37 2.91 48.58 6.94 40.01 4.82 40.38 5.31
Leucaena leucocephala 58.16 4.31 66.93 4.16 47.35 3.07
Piscidia piscipula 48.22 4.01 50.28 3.78
Lysiloma latisiliquum 29.60 3.16* 39.84 3.63* 44.04 1.22* 42.27 2.62* 39.14 2.24
* Values in the respective rows are statistically different to those of the PBS values.
using the larval migration inhibition (LMI) assay.
No reduction in larval migration compared to PBS control.
variable AH effect measured with in vitro tools such as
the LMI or larval exsheathment assays. Moreover, some
extracts did not show AH effect when using the LMI test
but when using the exsheathment assay they did. The results
of the present trial illustrate such phenomenon and explain
part of the reason for such variability: our hypothesis
was that worm strains originating from geographic areas
where they are exposed to TRP would be less sensitive
to the extracts obtained from the same TRP than those
worm strains from other geographic areas. For example,
the UADY strain was obtained in an area where TRP are
an important part of the host diet. Those same TRPs were
used to obtain the tannin rich extracts used in the pres-
ent trial. As a result, only one of the four TRP extracts
(L. latisiliquum) showed a clear AH effect with this strain.
It is possible that the extract of this plant was the only one
169
LARVAL MIGRATION INHIBITION TEST, TROPICAL TANNIN RICH FODDER, HAEMoNCHUS CoNToRTUS
showing in vitro AH effect because the fodder of this tree
is less accessible to browsing animals due to its higher
branches (compared to other TRP evaluated in the trial).
Meanwhile, the UNAM strain was originated from grazing
sheep of the highlands of central Mexico with no recent
history of browsing. This strain was sensitive to three differ-
ent extracts (A. pennatula, L. latisilquum and P. piscipula)
and at lower doses than UADY or CENID-INIFAP strains.
Finally, the CENID-INIFAP strain was sensitive to two
plant extracts A. pennatula and L. latisiliquum. The latter
strain originated from a tropical region in the highlands of
Mexico. Due to the higher altitude of the region of origin
(compared to central Yucatan) the plant species in contact
with the strain may have differed from those where the
extracts were obtained.
It is noticeable that the L. latisiliquum extract was
effective against the three H. contortus strains tested. The
AH effect found for this extract is consistent with earlier
results with H. contortus and T. colubriformis strains obtained
in France (Alonso-Daz et al 2008
a
, 2008
b
). Moreover, in
both French strains the AH effect of the extracts was dose
dependent and the AH effect was found at lower doses than
those found in some Mexican strains used in the present
trial (UADY and CENID-INIFAP). This plant has already
demonstrated its AH effect under in vivo conditions using
sheep fed with cut and carry fresh fodder and infected
with the H. contortus strain from CENID-PAVET (Brunet
et al 2008, Martinez-Ortiz-de-Montellano et al 2010).
It is possible that the lack of AH effect of the A. pen-
natula extract in the UADY strain could be explained by the
frequent exposure of UADY strain to the tannins contained
in this plant. The A. pennatula fodder is commonly browsed
in the Yucatan tropical forest due to the low height of the
plant fodder. The lack of AH effect was observed in spite
of the high CT content and high BA of the extract used.
Such features might explain why this extract was effective
against the UNAM and CENID-INIFAP strains.
The AH effect of L. leucocephala was not evident in
any of the strains of the present trial. For the UADY and
CENID-INIFAP strains this result could be expected as the
fodder of this type of plant is commonly used for browsing
and/or cut and carry feeding systems. However, it is not
possible to explain the lack of effect on the UNAM strain
as this plant is not common in the grazing systems of the
highlands of Mexico. Furthermore, this same extract has
shown to be efficacious against an H. contortus strain
from France.
An inhibitor of tannins (PVPP) confirmed the role
of tannins on the in vitro AH effect of the different ex-
tracts, as it has been performed elsewhere (Alonso-Daz
et al 2008
a
, 2008
b
).
The development of adaptive mechanisms to avoid
negative effects of different plant secondary compounds
(PSC) is not new and has been reported for different or-
ganisms exposed to the PSC. The plant produces tannins
as a defense mechanism against herbivores (Levin 1976,
Robbins et al 1987
a
, 1987
b
). As a result, the organisms
attacked by tannins adapt to these substances in order to
be able to continue using such resource in their diet or
survive in an environment rich in this type of compounds.
The nematode can develop morphological adaptations
like changes in esophageal glands, the mount and gut,
and the cuticula surface (Jasmer et al 2003). In animals,
an example of adaptation is the proline rich saliva of
ruminants that has been reported in deer and rhinoceros
(Clauss et al 2005). This type of adaptation was recently
found in sheep and goats from Yucatan
1
. Thus, it is not
unthinkable that parasitic nematodes present in the GIT
of ruminants might also develop adaptive mechanisms to
cope with the tannin rich environment.
Using TRP fodder as a nutraceutical option to control
GIN is feasible for some farmers in tropical areas. Sheep
and goats may consume large enough quantities of fodder
from TRP to cause AH effect without any evidence of
toxicity (Alonso-Daz et al 2008
c
, 2009, Martinez-Ortiz-
de-Montellano et al 2010, Aregheore and Perera 2004,
Hernndez-Orduo et al 2008, Mendez-Ortiz et al 2009).
Also, the in vitro and in vivo AH effects have been con-
firmed (Niezen et al 1995, 1998, Molan et al 2000, Paolini
et al 2003
a
, 2003
b
, Hoste et al 2008, Hoste et al 2006,
Brunet et al 2008, Martinez-Ortiz de Montellano et al 2010).
However, sheep and goats browsing TRP keep worm parasite
populations in their gastrointestinal tract. Therefore, it is
difficult to conceal a clear AH effect with the TRP intake
from browsing. Recent browsing and pen studies with sheep
and goats suggested that animals might use TRP intake to
affect the worm biology (reducing worm fecundity, worm
size and/or quantity of eggs in faeces) rather than eliminating
their actual worm burden (Martinez-Ortiz de Montellano
et al 2010). Similar results were suggested by Ibanez
et al (2009) where adonivernith (a phenolic compound
contained in a flower) acted as a growth inhibitor or a feed
deterrent rather than a lethal compound for Chiastocheta
spp. larvae feeding on globeflower seeds.
Hence, it is possible that parasitized small ruminants
will eat more TRP fodder which will increase the quantity
of tannins in the diet affecting the worm biology (less larval
establishment, reduced worm female fecundity and worm
size) leading to reduced parasite challenge. As a result, the
parasites will need to develop adaptation mechanisms for
survival. Controlling worms rather than eliminating them
is a better strategy for the host as the surviving worms can
help the host to maintain premunity against parasites. In
this case animals are using the direct AH mechanism and
the animal immune system to tackle worm infection. This
warrants further research.
Although results obtained from LMI are not directly ap-
plicable in vivo, they provide supporting evidence to previous
in vivo trials by Brunet et al 2008 and Martinez-Ortiz de
1
Alonso-Daz et al unpublished data.
170
JA CALDERN-QUINTAL ET AL
Montellano et al (2009, 2010) and suggest that Mexican H.
contortus strains could be controlled by tannins from TRP
normally present in the host diets. However, the current results
also suggest that the diet of the host (browsing or grazing)
and the nature of the polyphenolic compounds contained
in the diet should be considered in order to understand/
avoid low sensitivity of the parasites leading to failure of
tannins in modifying the biology of those same parasites.
This leads to the opportunity to investigate other sources of
tannins which would not be normally present in the hosts
diet such as agroindustrial by products or plants not used
for feeding ruminants. Promising results have been recently
obtained in our lab using cocoa beans, extracted coffee and
mangrove leaves (Nieves-Guerrero et al 2009).
In conclusion, this experiment suggested that different
H. contortus strains showed different sensitivities to tannin
rich extracts. The strains that have been in contact with
TRP normally present in the host diet were less sensitive
to the extracts and those strains from grazing animals were
more sensitive. Further studies are needed to confirm this
result in vivo.
SUMMARY
The in vitro anthelmintic (AH) effect of Acacia pennatula, Lysiloma
latisiliquum, Piscidia piscipula and Leucaena leucocephala tannin rich
extracts on three Mexican strains of Haemonchus contortus L
3
larvae was eval-
uated. Water/acetone extracts were obtained from the fodder of A. pennatula,
L. latisiliquum, P. piscipula and L. leucocephala collected in the vegetation
of Yucatan, Mexico. Increasing concentrations of lyophilized extracts (300,
600, 1,200, 1,800 and 2,400 g/ml PBS) were screened for their in vitro AH
effect using the larval migration inhibition (LMI) assay. Three unrelated
H. contortus Mexican strains were used (CENID-INIFAP, UADY and
UNAM). The role of tannins on the AH effect was confirmed by means
of polyvinyl polypyrrolidone (PVPP), an inhibitor of tannins. The differ-
ent H. contortus strains showed different responses to the extracts. Only
one plant extract (L. latisiliquum) affected the larval migration of the
H. contortus strain obtained from Yucatan (UADY). Two plants extracts
(A. pennatula and L. latisiliquum) inhibited the larval migration of the
CENID-INIFAP strain. Meanwhile, three plant extracts affected larval
migration of UNAM strain (A. pennatula, L. latisiliquum, P. piscipula).
Furthermore, UNAM strain was affected by extracts at lower doses than
CENID-INIFAP and UADY strains. These results indicated that the
larvae obtained from Yucatan, Mexico, were less sensitive to extracts of
TRP from the same region suggesting a possible adaptation to tannins.
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was performed by J.A. Caldern-Quintal to obtain a MSc
degree at the Universidad Autnoma de Yucatn, Mexico. This work was
financially supported by CONACYT-SAGARPA (project No. 12441).
Infective larvae were kindly provided by M.C. Alfredo Cuellar-Ordz
(UNAM strain) and Enrique Liebano Hernandez and Pedro Mendoza
de Gives (CENID-INIFAP strain).
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173
Arch Med Vet 42, 173-178 (2010)
ORIGINAL ARTICLE
Accepted: 14.07.2010.
* Avda. Universidad s/n 10071, Cceres, Spain; zaragoza@unex.es
Electrophoretic pattern of serum proteins in horses with babesiosis
Patrn electrofortico de protenas sricas en caballos con babesiosis
R Barrera, MV Carapeto, MA Habela, C Zaragoza
*
Department of Medicine and Health Animal, Faculty of Veterinary Sciences, University of Extremadura, Spain.
RESUMEN
La electroforesis srica en hojas de acetato de celulosa es una tcnica que se usa frecuentemente para separar las distintas fracciones proteicas. Esta
tcnica permite detectar cambios cualitativos y cuantitativos en las protenas sricas relacionados con distintas enfermedades. El propsito de este estudio
fue caracterizar los cambios que se producen en las distintas fracciones proteicas en caballos con babesiosis con el fin de evaluar su aplicacin en el
diagnstico de la enfermedad. En este trabajo se han calculado las concentraciones de protenas totales de 53 caballos y se ha realizado electroforesis
srica de estos animales. Los caballos fueron divididos en dos grupos: Grupo I (19 caballos sanos) y Grupo II (34 caballos con babesiosis clnica). La
enfermedad fue diagnosticada por inmunofluorescencia indirecta. Los resultados obtenidos en el grupo de caballos enfermos se compararon con los
mostrados por los caballos sanos. Las medianas estadsticas para la concentracin de protenas totales y la fraccin de -globulinas fueron estadsticamente
ms altas (P < 0,01) que las observadas en el grupo control. Adems, la subfraccin de
2
-globulina en los caballos enfermos mostr tambin un aumento
estadsticamente significativo (P < 0,05) con respecto a los caballos sanos. Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que la alteracin
ms significativa observada en el patrn srico de protenas en caballos con babesiosis es el aumento de las
2
-y las -globulinas.
Key words: electrophoresis, serum, babesiosis, horse.
Palabras clave: electroforesis, suero, babesiosis, caballo.
INTRODUCTION
Serum electrophoresis is a common technique of
laboratory diagnosis in human medicine, as well as in
small animal medicine. There are different techniques of
electrophoresis but the most common method in clinical
medicine is zone electrophoresis (Batamuzi et al 1996,
Thomas 2000). It is characterized because the serum is
placed on a supporting medium such as cellulose acetate.
Serum proteins have a negative charge, so they migrate in
an electric field and can be separated from each other in
different bands (zones). Each band is made up of a group of
individual proteins which can be identified by this technique
(Barta and Pourciau 1984). Although this technique provides
very useful information about the quantitative alterations
of the serum protein fractions related to the disease, it is
not commonly used in equine medicine.
Serum electrophoresis from healthy horses is
characterized by the absence of prealbumin region and
by six different bands: albumin,
1
-globulins,
2
-globulins,

1
-globulins,
2
-globulins and -globulins (Kohn 1997).
However, in the disease such as in equine babesiosis, the
serum concentration of the proteins can change significantly
(Kumar et al 2002).
Equine babesiosis is a tick-borne protozoal disease caused
by Babesia caballi and Babesia equi. Although it has been
reported that horses are most susceptible to infection, the
disease can affect horses, donkeys, their hybrids and wild
equidae (Okamura et al 2005, 2007). The disease may take
on an acute or chronic form (Radostits et al 1999). Clinical
signs of the acute form include weakness, anorexia, fever
of up to 42 C, which usually becomes irregular after the
second day (Malikides et al 2000). Animals that have the
chronic form of the illness usually survive for months without
any apparent signs of the disease. Symptoms may include
steady weight loss and slight anaemia usually following
exercise or stress situations (Hailat et al 1997).
Babesiosis is an important disease from both economic
and animal health point of view, because it involves
substantial losses by death and by decrease in animal
production. In addition, the equestrian legislation of some
countries do not allow seropositive symptomatic and non-
symptomatic animals (Asenzo et al 2008).
Horses with babesiosis often display an increase in the
concentration of total proteins usually caused by dehydration
and by the increase in the -globulin concentration (Kumar
et al 2002). However, until now zone-electrophoresis
to evaluate changes in protein fractions has not been
applied to the serum in equine babesiosis, although it is
very useful from a clinical point of view because it is less
time consuming.
The aim of the present work was characterize the
serum electrophoretic pattern in horses suffering from
babesiosis and to evaluate its application in the diagnosis
by the study of the quantitative alterations in the serum
proteins associated to this disease.
174
R BARRERA ET AL
MATERIALS AND METHODS
ANIMALS
Fifty three adult horses of different breed, sex, and
age were studied and classified in two groups. Group I
included 19 healthy horses all seronegative to babesiosis.
Animals from Group II were presented to the Veterinary
Teaching Hospital at Extremadura University (Spain)
showing clinical symptoms consistent with the disease
(table 1). This group included 34 horses suffering from
naturally acquired babesiosis: 7 horses (20.59%) showed
positive antibody titre against Babesia caballi, 9 horses
(26.47%) against Babesia equi and 18 horses (52.94%)
showed positive titre against both Babesia species (Table2).
Disease was always diagnosed or ruled out by indirect
immunofluorescence antibody assay.
SEROLOGICAL TESTS
Serological tests were performed according with
Callow et al (1979), Donnelly et al (1980
a, b
), Soule
et al (1984), and Habela et al (1989). Antigen of Babesia
equi was prepared after esplenectomized carrier horse
(titre 1/320) from Andaluca (local strain), and the antigen
of Babesia caballi after infection with USDA strain of
seronegative horse, which was kindly provided for Professor
G. Uilenberg (Veterinary Faculty, Utrecht, Netherlands).
Commercial fluorescein conjugated rabbit anti-horse
immunoglobulin (Nordic, Tilburg, Netherlands) was used
at a dilution of 1:60 in phosphate-buffered saline. A titre
of 1:80 was considered positive. Positive and negative
control sera were kindly supplied by Professor G. Uilenberg
(Veterinary Faculty, Utrecht, Netherlands).
SERUM TOTAL PROTEIN
Blood samples were obtained under non-stress conditions
by jugular venipuncture using vacutainer tubes. Serum was
obtained by centrifugation for 10 minutes at 600 g using
serum-separator tubes. Serum was used instead of plasma in
order to avoid interference from fibrinogen. Serum protein
concentration was calculated by Biurets method (Gornall
et al 1949). Freeze-dried bovine serum albumin (Qumica
Clnica Aplicada, Spain) was used as a control.
SERUM ELECTROPHORESIS
To characterize the serum electrophoretic pattern in
the animals studied, serum electrophoresis was performed.
Zone electrophoresis (Kohn 1957) on a supporting medium
of cellulose acetate strips (2.5 17 cm) (Cellogel

, Atom
Biosystems, Spain) was performed. Serum proteins
migrated in an electric field of 200 volts for 65 minutes.
The buffering solution used was sodium veronal 0.04 M
and sodium-dietilbarbiturate 0.82 g/dl. Amido-Black
Table 1. More significant clinical manifestations noted in the
Group II (horses with babesiosis).
Manifestaciones clnicas ms significativas observadas en el
Grupo II (caballos con babesiosis).
Horse
N
Weakness Anorexia Fever*
Steady
weight
loss
Pale
mucous
mem-
branes
Jaundice Oedemas
1 +
2 + + + +
3 + + + + +
4 + + + +
5 +
6 +
7 + + + + +
8 + + + + +
9 +
10 + +
11 + + + +
12
13 + +
14 +
15 + + + + + + +
16 + + + + +
17 +
18 + + + + +
19 + + +
20 +
21 + + +
22 +
23 + + + + +
24
25 + + + +
26 + + + +
27 + + +
28 + +
29 + + + + +
30 + + + + + +
31 + + + +
32 + + + + +
33 + + + +
34 + + + + +
* Body temperature up to 39 C.
(Atom Biosystems, Spain) staining was used, and a
solution of methanol, acetic acid, and water (40:10:50) was
applied as a destaining solution. Finally, the strips were
analyzed in a scanner densitometer using the Ultroscan
GSX software (Pharmacia LKB Biotechnology, San
Francisco, CA, USA).
STATISTICAL ANALYSIS
Statistical analysis of the results was performed using
the non-parametric of Mann-Whitney U test. The used
software was SPSS 14 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).
175
ELECTROPHORESIS, SERUM, BABESIOSIS, HORSE
Table 2. Antibody titers for Babesia equi and Babesia caballi obtained by indirect immunofluorescence test (IFI) in the Group II
(horses with babesiosis).
Ttulos de anticuerpos frente a Babesia equi y Babesia caballi obtenidos mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) en el Grupo II (caballos
con babesiosis).
Horse N B. equi B. caballi Horse N B. equi B. caballi
1 1/160 1/160 18 1/1280 Negative
2 1/640 1/320 19 1/160 1/160
3 1/160 1/320 20 1/320 Negative
4 1/80 1/320 21 1/320 Negative
5 1/160 1/160 22 Negative 1/640
6 Negative 1/640 23 1/160 Negative
7 1/320 1/1280 24 1/80 Negative
8 Negative 1/640 25 1/160 1/320
9 Negative 1/160 26 1/160 Negative
10 1/640 1/160 27 1/80 1/640
11 Negative 1/320 28 1/640 Negative
12 1/80 1/80 29 1/1280 1/640
13 1/640 Negative 30 1/80 1/640
14 Negative 1/320 31 1/160 1/320
15 1/320 1/320 32 1/1280 1/160
16 Negative 1/1280 33 1/160 1/80
17 1/160 Negative 34 1/320 1/160
RESULTS
GROUP I
Serum electrophoresis from Group I showed a normal
electrophoretic pattern, characterized by six different
bands: albumin,
1
-globulin,
2
-globulin,
1
-globulin,

2
-globulin and -globulin fractions (figure 1). Statistical
analysis results of serum protein fractions from Group I
are shown in table 3.
GROUP II
In our study, the median obtained for the serum total
proteins in the Group II was 7.18 g/L (interquartile range
(IQR) 5.80-9.03 g/L), showing a statistically significant
difference (P < 0,001) with the Group I (table 3). Although,
the range of values obtained was very wide (minimum
value = 36g/L; maximum value = 142.7 g/L), hyperproteinemia
was observed in 14 horses. Conversely, six animals showed
hypoproteinemia with a serum total protein concentration
lower than 55 g/L.
Although the median albumin concentration was
3.96 g/L, 13 horses with babesiosis displayed high values
of the albumin concentration. Statistical data obtained
for the concentration albumin in Group II are shown in
table 3.
In this group, the -globulin fraction was also resolved
into two subfractions:
1
-globulin and
2
-globulin,
respectively. The
1
-globulin values from sick horses were
similar to the results obtained in healthy horses for the same
subfraction. Conversely, a statistically significant increase
(P < 0,005) in the median
2
-globulin sub-fraction was
observed in Group II (table 3). Fourteen of the 34 horses
studied, showed high values of
2
-globulin sub-fraction,
mainly 5 of them (figure 2).
The -globulin fraction in horses with babesiosis
was also resolved into two subfractions:
1
-globulin and

2
-globulin, respectively. Statistical results are shown in
table 3. The
1
and
2
-globulin median from sick horses
was similar to the results obtained in healthy horses for the
same subfraction. Although 3 horses in particular, had an
increase in the
2
-globulin and a decrease in
1
-globulin,
2 animals presented an increase in both sub-fractions and
9 horses showed a decrease in both sub-fractions.
The median value of the -globulins fraction obtained
in the sick horses (1.36 g/L) was significantly higher
(P < 0.01) than that obtained in Group I (table 3).
Finally, 12 of the sick animals displayed a ratio lower
than 1 and a low albumin concentration was observed in
the majority of them. The statistical results obtained for the
albumin/globulin ratio in Group II are shown in table 3.
DISCUSSION
Hyperproteinemia in babesiosis is usually caused by
dehydration, whose main cause is the letargy associated to
the disease (Divers 1998). In addition, the increase in the
-globulin concentration also contributes to the increase
in the total proteins concentration (Radostits et al 1999).
In our study, the median value obtained for the serum
total proteins in the Group II was significantly higher
(P < 0.01) than that obtained in the Group I (table 3).
Hypoproteinemia observed in six animals may be related
to the severe anorexia that characterizes the disease in its
acute form, as well as the feverish symptoms displayed
(table 1). In some cases, hypoproteinemia can be so severe
176
R BARRERA ET AL
proteins are usually evaluated together and reference is
made to the -globulin fraction without indicating the
sub-fraction (Sevelius and Andersson 1995, Kaneko
1997). The
1
-globulin median from the sick horses was
similar to the results obtained in the healthy horses for the
same subfraction (table 3). Changes of the
1
-globulin
concentration do not appear to be important from a
diagnostic point of view. However, the median value for
the
2
-globulin subfraction in Group II was significantly
higher (P < 0.05) when compared with that obtained in
Group I (table 3). The increase of the -globulin fraction
occurs frequently in equidae suffering from different
pathologies (Carapeto et al 2006). Although its increase has
not been described in equine babesiosis, a clear increase
in the
2
-globulin sub-fraction was observed in five of the
horses studied (figure 2). Although this increase is due to
tissue damage and inflammatory processes, elevation of
the -globulin fraction may be observed in diseases that
are not linked to inflammation, such as occurs in cases of
hepatic or renal damage (Kaneko 1997). This fact may
explain the results observed in some of the horses studied
because when a hepatopathy is developed, an increase in
the
1
-glycoprotein-acid,
1
-antitrypsin, haptoglobin and

2
-macroglobulin can be observed (Sevelius and Andersson
1995). In addition, animals with babesiosis frequently
develop renal disease resulting from dehydration and
haemoglobinuria by intra-vascular haemolysis produced
by the parasite (Navarrete y Serrano 1999). Finally, the
increase of -globulin fraction may be cut off by the
decrease in the concentration of the haptoglobin, usually
observed in animals with haemolytic anaemia, which
characterizes the disease (Jain 1993).
1
2
3
4
5
7
Figure 1. Densitometer scan of the serum electrophoresis of
a healthy horse. 1: albumin; 2:
1
-globulin; 3:
2
-globulin;
4:
1
-globulin; 5:
2
-globulin; 6: -globulins.
Lectura densitomtrica de la electroforesis srica de un ca-
ballo sano. 1: albmina; 2:
1
-globulina; 3:
2
-globulina; 4:
1
-globulina;
5:
2
-globulina; 6: -globulinas.
1
2
3
4 5
6
Figure 2. Densitometer scan of the serum electrophoresis of
a horse with babesiosis showing an increase of the
2
-globulin
subfraction. 1: albumin; 2:
1
-globulin; 3:
2
-globulin; 4:
1
-
globulin; 5:
2
-globulin; 6: -globulins.
Lectura densitomtrica de la electroforesis srica de un caballo
con babesiosis mostrando un aumento en la fraccin de
2
-globulinas.
1: albmina; 2:
1
-globulina; 3:
2
-globulina; 4:
1
-globulina; 5:
2
-
globulina; 6: -globulinas.
that oedema in the limbs of 3 horses was observed in our
study (table 1).
The median concentration of albumin in Group II
was higher than that obtained in Group I, although non-
statistically significant difference was observed (table 3).
The increase in the albumin concentration may be explained
as a consequence of dehydration because no pathological
processes with increase in the production of albumin have
been described (Kaneko 1997). In order to produce clinical
signs, it is considered that the serum albumin level must
decrease until some values below 15.0 g/L. The presence
of oedema was verified in the 3 horses that presented
such values. The decrease of the albumin concentration
in horses with babesiosis is related to the hepatopathy
that may develop during the disease (Colville 2002) and
to the symptomatic anorexic state (Stockham and Scott
2002) observed in 23 horses (table 1). Hypoalbuminemia
is usually related to chronic cases and a prolonged course.
Furthermore, the albumin concentration variation is usually
associated to that of serum total proteins since it is the most
abundant protein in the blood, as usually observed in the
animals studied. However, in 5 of the 14 horses that showed
an increase in serum total proteins, hyperalbuminemia
was not the main cause of the increase, it was a severe
hypergammaglobulinemia that had contributed noticeably
to that increase.
The -globulin fraction are known as acute stage
proteins because their concentration increases immediately
after an inflammation or a wound (Stockham and Scott
2002). In horses, the concentration of
1
-globulin is
lower than
2
-globulin (Kohn 1997), although functional
differences between them have not been reported. These
177
ELECTROPHORESIS, SERUM, BABESIOSIS, HORSE
When the results of -globulin sub-fractions in horses
with babesiosis were compared with those obtained in the
control group, no significant differences were observed
(table 3). Changes in this fraction depend on different factors,
such as the progress of the disease (acute or chronic) and
the course or severity of the haemolytic anaemia caused.
In addition, an increase in its concentration related to acute
hepatic damage has been described (Kaneko 1997) as a
consequence of the increase in the transferrin concentration.
This protein also contributes to the -globulin decrease
if the hepatic disease is chronic (Barta and Pourciau
1984). Conversely, horses suffering from babesiosis are
characterized by haemolytic anaemia. Although this has not
been confirmed in natural clinical processes, the -globulin
increase is a consequence of in vitro haemolysis caused by
the presence of free haemoglobin. In addition, a decrease
in the -globulin concentration as a result of a decrease
in the pepsin concentration in cases of clinical haemolysis
has been described (Barta and Pourciau 1984). Horses with
babesisosis occasionally show disseminated intra-vascular
coagulation (Radostits et al 1999) that causes an increase
in the plasminogen concentration, which is included in the
-globulin fraction. Finally, -globulin fraction concentration
may be related to the albumin fraction in cases of extra-
vascular liquid exudation. This fact was observed in two
of the horses that presented lower -globulin values and
hypoalbuminemia.
In babesiosis, the immunity mechanisms are mainly
of humoral nature (Morris et al 2002), although the
protozoa can activate a cellular-type immune response
(Tizard 1996). In this study, the median value obtained
for the -globulin fraction in sick horses was significantly
higher (P < 0.01) than the one obtained in healthy horses
(table 3). This increase observed in the serum -globulin
concentration (figure 3) is related to the humoral
immunity activated by the parasitation of the animals
studied. This occurs mainly in horses with a more severe
hypergammaglobulinemia and hepatic damage, although
the immune response in some animals may produce an
increase of immunoglobulin too small to be detected
through routine electrophoresis techniques (Jain 1993,
Stockham and Scott 2002).
Finally, although one third of the sick animals
displayed a albumin/globulin ratio lower than 1, the
absence of statistically significant difference against
healthy horses (table 3) may be due to the increase in
the albumin concentration observed in a high number
of animals (14 horses), as well as to the increase in the
Table 3. Median and interquartile range of the total protein concentration (g/L), serum protein fractions (g/L) and albumin/globulin
ratio (A/G) from Group I (healthy horses) and Group II (horses suffering from babesiosis). Statistical differences between both groups
are shown.
Mediana y rango intercuartlico de la concentracin de protenas totales (g/L), fracciones de protenas (g/L) y cociente albmina/globulina
(A/G) del Grupo I (caballos sanos) y del Grupo II (caballos con babesiosis). Se muestran las diferencias estadsticas obtenidas entre ambos grupos.
Total
protein
Albumin

1
-
globulin

2
-
globulin

1
-
globulin

2
-
globulin
-
globulin
A/G
GROUP I
(N = 19)
Median 6.00 3.21 0.12 0.53 0.65 0.41 0.94 1.05
IQR 0.60 0.44 0.05 0.23 0.25 0.42 0.29 0.35
GROUP II
(N = 34)
Median 7.18 3.63 0.12 0.68 0.69 0.36 1.36 1.22
IQR 3.23 1.65 0.08 0.33 0.35 0.42 1.22 0.76
Significance level P < 0.01 NS NS P < 0.05 NS NS P < 0.01 NS
IQR = interquartile range.
NS = non-statistically significant.
NS = no estadsticamente significativo.
1
2
3
4
5
6
Figure 3. Densitometer scan of the serum electrophoresis of
a horse with babesiosis showing an increase of the -globulin
fraction. 1: albumin; 2:
1
-globulin; 3:
2
-globulin; 4:
1
-globulin;
5:
2
-globulin; 6: -globulins.
Lectura densitomtrica de la electroforesis srica de
un caballo con babesiosis mostrando un aumento en la fraccin de
-globulinas. 1: albmina; 2:
1
-globulina; 3:
2
-globulina; 4:
1
-globulina;
5:
2
-globulina; 6: -globulinas.
178
R BARRERA ET AL
concentrations of
2
-globulin and -globulin fractions
discussed previously.
Results obtained in this study allow to conclude that
the increase of the -globulin fraction, associated in
some cases to the increase of the
2
-globulin fraction,
is a common finding in the serum electrophoresis of the
horses suffering from babesiosis and it can be very useful
for the diagnosis of the disease.
SUMMARY
Serum electrophoresis in cellulose acetate strips is a technique
commonly used to separate the protein fractions. This technique allows
detecting quantitative and qualitative changes in the serum proteins
associated with different diseases. The aim of this study was to characterize
the changes of the serum protein fractions produced in horses suffering
from babesiosis and to evaluate its application in its diagnosis. Serum
total proteins were calculated and the serum electrophoresis from 53
horses was performed. Animals were classified in two groups: Group I
(19 healthy horses) and Group II (34 horses suffering from babesiosis).
Babesiosis was diagnosed by indirect immunofluorescence antibody
assay. Data obtained in the group of sick horses were compared with
those from the healthy horses. Median values from total proteins and
-globulins fraction were significantly higher (P < 0.01) than that observed
for the control group. In addition, a statistically significant increase was
observed (P < 0.05) in the values of
2
-globulin subfraction in the sick
horses. Results obtained in this study allow concluding that the most
significant alteration observed in the serum electrophoretic pattern of
horses suffering from babesiosis is the increase of
2
-globulin and
-globulin fractions.
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179
Arch Med Vet 42, 179-186 (2010)
ARTCULO ORIGINAL
Aceptado: 03.03.2010.
# Proyecto FONDEF DO6I1020. Casilla 15-D Temuco, Chile;
oberrios@uct.cl
Almacenamiento en fro de espermatozoides de trucha arcoiris
(Oncorhynchus mykiss): Efectos en la motilidad, superxido intracelular, integridad
de la membrana plasmtica y potencial de membrana mitocondrial
#
Cold storage of sperm of rainbow trout (oncorhynchus mykiss): Effect on motility, intracellular
superoxide, plasma membrane integrity and mitochondrial membrane potential
O Berros
*
, I Valdebenito, F Treuln, A Ubilla
Escuela de Acuicultura, Universidad Catlica de Temuco, Temuco, Chile.
SUMMARY
In teleostei, as opposed to what happens in mammals, most of the studies that evaluate the quality storages of semen are oriented toward the exposure
of spermatozoa to some reactive oxygen species (ROS), the utilization of antioxidants in the diet, or the incorporation of these in seminal plasma. There
is no available the literature covering the presence of superoxide ions (O
2
._
), or the function of these on the interior of the spermatozoa that have been
stored. In this study, we evaluated the effect of storage on intracellular O
2
._
, motility, plasmatic membrane integrity, and mitochondrial membrane potential
(
Mit
) of spermatozoa of rainbow trout (oncorhynchus mykiss). Semen was extracted and put into storage for 12 days at 4 C. Spermatozoa motility,
(
Mit
), plasmatic membrane integrity were evaluated every 4 days, and intracellular O
2
._
was detected. It was found that 82.59% of the cells were positive
for the staining of O
2
._
on the day of sample extraction, while sperm motility,
Mit
and plasmatic membrane integrity only showed deterioration after
the eighth day of storage. Only
Mit
is correlated negatively with O
2
._
starting from the eighth day of storage (r = 0.56 P < 0.05). Regarding motility
and plasmatic membrane integrity, these were not affected by intracellular O
2
._
, although the deterioration observed in these last two indicators, could
have been caused by the prolonged contact of the spermatozoa with contaminating agents that were not evaluated in this study.
Palabras clave: almacenamiento, superxido intracelular, trucha arcoiris, espermatozoides.
Key words: storage, intracellular superoxide, rainbow trout, spermatozoa.
INTRODUCCIN
Es habitual en especies de cultivo utilizar el almace-
namiento de semen fuera del ambiente testicular, en caso
de diagnstico ictiosanitario o por ubicacin de los repro-
ductores a grandes distancias del sitio en que se realiza la
incubacin. Generalmente, este procedimiento es fcil de
ejecutar y no requiere de implementacin costosa ni de
conocimientos avanzados, por lo que frecuentemente se
practica en centros de cultivo.
Una forma de evitar el deterioro de los espermatozoi-
des almacenados es diluir el semen en soluciones salinas
isotnicas o diluyentes que imitan el medio en que se
encuentran dentro del testculo. Los beneficios de estas
soluciones estn centrados principalmente en mantener las
condiciones de humedad y control bacteriano del semen,
permitiendo conservar las potencialidades fecundantes
de los espermatozoides por largos periodos de tiempo
(Babiak y col 2006).
En atencin a lo anterior, se han identificado algunos
agentes que perjudican la viabilidad y motilidad de los
espermatozoides almacenados in vitro, entre estos se
cuentan las condiciones propias de los reproductores como
la edad de maduracin, o factores relacionados con el
medio de almacenamiento como temperatura, exposicin
a CO
2
, pH, concentracin de oxgeno o contaminacin
con orina (Billard y col 1993, Billard y col 1997, Ohta y
Izawa 1996, Bencic y col 2001, Ingermann y col 2002,
Liley y col 2002, Valdebenito y col 2009).
Los estudios relacionados con calidad del semen
de telesteos almacenado in vitro en su mayora estn
orientados a evaluar algunas caractersticas como color,
consistencia (Estay y Tllez 1994), densidad espermtica,
motilidad (Billard 1988, Aas y col 1991, Estay y Tllez
1994) o composicin del plasma seminal (Lahnsteiner y
col 1998) y, a diferencia de lo que ocurre con mamferos,
poco se ha estudiado el deterioro estructural o produccin
de especies reactivas de oxgeno (ROS) en espermatozoides
mantenidos fuera del testculo.
En relacin a lo anterior, en mamferos se ha observado
un evidente incremento en la concentracin de especies
reactivas del oxgeno (ROS), como resultado de patolo-
gas o por criopreservacin de las clulas espermticas
(Chatterjee y col

2001, Agarwal 2004).
180
O BERROS Y COL
Las ROS son una serie de radicales con carga negativa,
y por ser altamente inestables tienden a reaccionar con otras
molculas dentro de la clula, las ms frecuentes son el anin
superxido (O
2
.
), radical peroxilo (ROO

) y anin hidroxilo
(OH

). Adems, existen otras ROS que no son radicales,


como por ejemplo el perxido de hidrgeno (H
2
O
2
). En
mamferos, estos elementos se producen naturalmente en
bajas concentraciones dentro de la clula, interviniendo en
procesos como capacitacin, hiperactivacin espermtica,
reaccin acrosmica y en la unin del espermatozoide a
la zona pelcida (Sharma y Agarwal 1996, de Lamirande
y col 1997, Cuquerella y col 2003).
La produccin en exceso de ROS por la clula recibe
el nombre de estrs oxidativo, fenmeno que origina dao
a la membrana plasmtica causando peroxidacin lipdica,
alteraciones de fluidez, fragmentacin en el ADN, apoptosis
vinculada a la activacin de algunas caspasas y tambin se
asocia a disminucin de la motilidad por descenso en la
fosforilacin de protenas del axonema (Connell y col 2002,
Paasch y col 2004, Martin y col 2004) y aun cuando el plasma
seminal cuenta con sistemas enzimticos y no enzimticos
para reducir el efecto, en caso de estrs estos mecanismos no
son suficientes (de Lamirande 1997, Peeker y col 1997).
Al respecto, se ha encontrado que concentraciones
de ROS sobre las normales coinciden con deterioro de la
membrana plasmtica, disminucin del potencial de mem-
brana mitocondrial y motilidad de los espermatozoides.
Para disminuir experimentalmente los niveles de ROS
con frecuencia se han utilizado antioxidantes similares
a aquellos presentes en el semen natural. Esta tcnica ha
mostrado mejorar los parmetros de calidad espermtica,
logrando a veces buenos resultados (Baumber y col 2000,
Michael y col 2007).
En peces se desconoce si existe presencia de O
2
._
intra-
celular cuando el semen se encuentra almacenado in vitro,
o como consecuencia de contaminacin con desechos al
momento de su extraccin; adems tampoco se encuentra
literatura sobre el efecto del almacenamiento del semen
en la integridad de la membrana plasmtica y potencial de
membrana mitocondrial, no obstante, los escasos trabajos
publicados sobre el tema en su mayora estn orientados
principalmente a la evaluacin indirecta de ROS o a la
inclusin de antioxidantes en la dieta (Mansour y col 2006,
Mirzoyan y col 2006, Zhou y col 2006).
El propsito de este estudio fue evaluar el efecto
del almacenamiento refrigerado en la permanencia de
motilidad, O
2
._
intracelular, integridad de la membrana
plasmtica y
Mit
de espermatozoides de trucha arcoiris
(oncorhynchus mykiss).
MATERIAL Y MTODO
OBTENCIN DE SEMEN
Se extrajo semen de veinte machos maduros de trucha
arcoiris (oncorhynchus mykiss) de dos aos de edad
provenientes de la Piscicultura Los Laureles perteneciente
a la Universidad Catlica de Temuco. Antes de la extrac-
cin, los peces fueron anestesiados con BZ-20 al 0,015%,
procediendo posteriormente a vaciar la vejiga urinaria.
Luego, mediante masaje abdominal o stripping se extrajo
la muestra de semen, la cual fue oxigenada y depositada
en contenedores plsticos hermticamente cerrados.
En el laboratorio, el semen fue diluido en una pro-
porcin 1:2 (semen: diluyente espermtico), este ltimo
compuesto de NaCl 18,8 g/L, CaCl
2
* 3H
2
O 2 g/L, KCl
72 gr/L, NaH
2
PO
4
* H
2
O 4,1 g/L, NaHCO
3
1 g/L, MgSO
4

* 7 H
2
O 2,3 g/L y glucosa 1g/L.
Todos los procedimientos fueron realizados a 4 C.
Diariamente los tiestos con las muestras se agitaron y se
airearon inyectndoles oxgeno comprimido.
ANLISIS CITOMTRICO
Las lecturas de fluorescencia fueron realizadas en
un citmetro de flujo FACscalibur (Becton-Dickinson)
controlado por el software Cell-Quest pro. Las clulas
pasaron a travs del instrumento a aproximadamente
600-1.000 cel/s y se registraron datos de 10.000 clulas.
La excitacin de las clulas fue a 488 nm usando un lser
de argn. La coloracin fluorescente del SYBR-14 fue
detectada utilizando un filtro con banda de 520 nm (FL1);
la fluorescencia del ioduro de propidio (IP) y dihydroethi-
dium (DHE) fue detectada con filtro de 610 nm de banda
(FL3); todos sobre escalas logartmicas.
EVALUACIN DE MOTILIDAD
En un portaobjeto dispuesto sobre hielo se depositaron
10 l de semen de trucha arcoiris; el portaobjeto con la
muestra rpidamente fue montado sobre un microscopio
de contraste de fase Olimpus BX 41. Una vez enfocada la
muestra, se aplicaron sobre sta 20 l de agua de pozo, la
cual activa el movimiento de los espermatozoides. Luego
se procedi a evaluar el tiempo desde que comenz el
movimiento espermtico, hasta que la totalidad de las
clulas del campo visual dejaron de moverse.
DETERMINACIN DE SUPERXIDO INTRACELULAR
Para medir el anin superxido se utiliz la tcnica
propuesta por De Iuliis y col (2006) modificada, la cual
utiliza el colorante fluorescente dihydroethidium (DHE)
(Molecular Probe). Este compuesto tiene la particularidad
de aceptar radicales superxido (O
2
._
) transformndose en
2-hydroxyethidium. La tcnica consisti en centrifugar a
470 g por 5 min una suspensin espermtica conteniendo
3 x 10
6
espermatozoides en diluyente espermtico. Se retir
el sobrenadante y el pellet fue disuelto en 400 l de dilu-
yente conteniendo una concentracin final de DHE 2 M.
Las clulas fueron incubadas en oscuridad durante 15 min
a 4 C, y nuevamente centrifugadas a 470 g por 5 min; se
181
ALMACENAMIENTO, SUPERXIDO INTRACELULAR, TRUCHA ARCOIRIS, ESPERMATOZOIDES
retir el sobrenadante y el pellet fue diluido en 400 l de
diluyente espermtico, para evaluacin citomtrica.
DETERMINACIN DE POTENCIAL DE MEMBRANA
MITOCONDRIAL
Para la deteccin de la disminucin del potencial de
membrana mitocondrial (
Mit
) de los espermatozoides
se utiliz el kit comercial (Biomol

Research Laboratories,
AK-116), cuyo colorante activo es 5,5,6,6-tetrachloro-
1,1,3,3-tetraethyl-benzamidazolocarbocyanin iodide (JC-1).
ste posee una estructura de carga positiva y lipoflica que
le permite ingresar fcilmente a las clulas y mitocondrias.
La carga negativa de la membrana mitocondrial interna pro-
duce agregacin del colorante JC-1, el cual forma dmeros
que emiten fluorescencia de color rojo cuando existe un
alto potencial mitocondrial. Cuando en la clula el
Mit

disminuye, el reactivo ingresado asume una forma monom-
rica que emite fluorescencia verde (Marchetti y col 2004).
Ambos colores son detectados por citometra.
Para la experimentacin se adicionaron 3 x 10
6
esperma-
tozoides a 1 ml de diluyente, la suspensin se centrifug a
470 g por 5 minutos y se elimin el sobrenadante. Luego, el
pellet fue disuelto en una concentracin final de 10 g JC-1/
ml diluyente. Para que actuara el colorante la suspensin se
incub 15 minutos a 4 C protegido de la luz, y se centrifug
nuevamente a 470 g por 5 minutos. Se elimin el sobrenadante
y los espermatozoides contenidos en el pellet fueron disueltos
en 400 l de diluyente para ser evaluados al citmetro.
EVALUACIN DE INTEGRIDAD DE MEMBRANA PLASMTICA
La integridad de la membrana plasmtica se evalu
con el kit Live/Dead

Sperm Viability Kit (L-7011)


(Molecular Probes), el cual est compuesto por dos colo-
rantes fluorescentes, uno para la tincin de cidos nucleicos
(SYBR 14 dye) y otro para viabilidad celular (ioduro de
propidio (IP)). Esta tincin permite la identificacin de
clulas con la membrana ntegra (color verde) y aquellas
muertas (color rojo).
Para la experimentacin se adicionaron 3 x 10
6
esper-
matozoides a 1 ml de diluyente espermtico, se centrifug
a 470 g por 5 minutos y se elimin el sobrenadante. El
pellet fue diluido en 1 ml de solucin compuesta por
SYBR14-IP a una concentracin final de 1 M y 5 M
respectivamente, e incubado por 15 minutos a 4 C protegido
de la luz. Posteriormente, la suspensin compuesta por
espermatozoides, diluyente y colorante fue centrifugada
a 470 g por 5 minutos, eliminando luego el sobrenadante.
Por ltimo, el pellet resultante fue diluido en 400 l de
diluyente para ser evaluado al citmetro.
ANLISIS ESTADSTICO
La normalidad de los datos se verific con la prueba
de Kolmogorov-Smirnov y la homocedasticidad con la
prueba de Levene. Se aplic anlisis de varianza ANDEVA
con respecto a los das de almacenamiento. Cuando ste
result significativo se utiliz la prueba de Tukey para la
separacin de medias con P < 0,05. Para ver si los das
de almacenamiento con los parmetros evaluados se
correlacionaban, se utiliz la correlacin de Pearson con
P < 0,05. Tambin se utiliz esta prueba para ver la exis-
tencia de correlacin entre la produccin de superxido
con potencial de membrana mitocondrial e integridad de
membrana plasmtica. Todos los datos fueron analizados
con el programa estadstico XLSTAT versin 7.5.2.
RESULTADOS
MOTILIDAD
El tiempo que permanecieron en movimiento los
espermatozoides el primer da de almacenamiento fue de
1,7 0,2 min. Sin embargo, a partir del octavo da la mo-
tilidad disminuye a menos de un minuto (0,53 0,3 min),
encontrando que el movimiento espermtico es de solo
0,47 0,5 min el ltimo da de encontrarse los esperma-
tozoides almacenados (figura 1).
SUPERXIDO INTRACELULAR
La tincin con DHE para detectar O
2
._
intracelular
revel un alto porcentaje de espermatozoides que son
teidos con DHE, desde el primer da de almacenamiento
82,59 26,57% del semen, aumentando hacia el ltimo
da de evaluacin, donde se detecta O
2
._
a un 96,7 3,4%
0
1
2
1.8
1.6
0.8
0.6
0.8
0.2
1.4
1.2
M
a
n
t
e
n
c
i

n

d
e

l
a

m
o
t
i
l
i
d
a
d

(
m
i
n
)

1 4 8 2
(Das)
Figura 1. Mantencin de la motilidad de espermatozoides de
trucha arcoiris (o. mykiss) almacenados in vitro. Valores pro-
medio DE.
Maintenance of motility of spermatozoa of rainbow trout
(o. mykiss) stored in vitro. Mean values SD.
182
O BERROS Y COL
de los espermatozoides (figura 2). El anlisis de varianza
ANDEVA mostr diferencias significativas en el porcentaje
de espermatozoides que presentaron O
2
._
solo el ltimo
da de evaluacin (P < 0,05), no obstante, se encontr alta
correlacin entre los das de almacenamiento del semen
y el porcentaje de espermatozoides que presentaba O
2
._

(r = 0,8 P < 0,05).
Los grficos de dispersin de la figura 3 muestran
en la regin superior izquierda la poblacin de aquellos
espermatozoides que se tieron positivamente con DHE.
Se observa que este grupo de clulas se mantuvo ms o
menos constante a partir del primer da de evaluacin.
INTEGRIDAD DE MEMBRANA CITOPLASMTICA
La integridad de la membrana plasmtica tambin se vio
afectada con el almacenamiento del semen; al respecto, se
encontr que el 88,6 9,3% de los espermatozoides regis-
trados en el citmetro presenta la membrana ntegra el da
de extraccin (figura 2). Este porcentaje se ve disminuido
a la mitad, 50,3 14,9%, el octavo da de almacenamiento;
y despus de doce das de encontrarse los espermatozoi-
des fuera del testculo se observa el 47,0 13,7% de los
espermatozoides con la membrana intacta, caracterizada
por la fluorescencia de color verde. Al igual que el
Mit
,
el anlisis de varianza ANDEVA muestra diferencias
significativas de la integridad, a partir del octavo da de
almacenamiento (P < 0,05). Correlacionando los das
de almacenamiento con la integridad de la membrana, se
encontr que la permanencia de los espermatozoides fuera
del testculo la afecta negativamente (r = 0,8 P < 0,05).
Al correlacionar el O
2
._
con la integridad, para observar
algn grado de relacin, no se encuentra correlacin entre
ambos (P > 0,05).
El grfico de dispersin muestra el desplazamiento de
la poblacin celular desde el cuadrante inferior derecho de
clulas con la membrana ntegra hacia el cuadrante superior
derecho, donde se detectan las clulas con la membrana
deteriorada o muertas, teidas con IP (figura 4).
POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCONDRIAL
Se observ gran porcentaje de espermatozoides con
alto
Mit
el primer da de evaluacin (80,8 11,6%), dis-
minuyendo a la mitad los espermatozoides con alto
Mit

el octavo da (53,8 20,3%). Finalmente la evaluacin
correspondiente al duodcimo da revel un 44,9 26,1%
de espermatozoides con alto
Mit
(figura 2). Por otro
lado, el test de comparaciones mltiples (T-Tukey) muestra
diferencias significativas del
Mit
entre los das 1 y 4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
E
s
p
e
r
m
a
t
o
z
o
i
d
e
s

(
%
)

Mit
Integr. membrana plasmtica
O
2
.
r = 0.6 r = 0.8 r = 0.8
a
a
a
a
a
a
a
b
b
b
b
b
Da 1 Da 4 Da 8 Da 12
Figura 2. Porcentaje de espermatozoides de trucha arcoiris (o. mykiss) con
Mit
alto, membrana citoplasmtica ntegra y con superxido
intracelular. En la parte superior se exhibe el coeficiente de correlacin con respecto a los das de almacenamiento y la significancia,
aqu letras diferentes muestran diferencias estadsticamente significativas (p < 0,05). Los resultados se dan en promedio DE. El
recuadro muestra los das de las evaluaciones.
Percentage of spermatozoa of rainbow trout (o. mykiss) with high
Mit
, cytoplasmic integral membrane and with intracellular superoxide.
At the top is displayed the correlation coefficient with respect to days of storage, and the significance, here different letters show statistically significant
differences (p < 0.05). The results are average SD. The box shows the days of the evaluations.
183
ALMACENAMIENTO, SUPERXIDO INTRACELULAR, TRUCHA ARCOIRIS, ESPERMATOZOIDES
humanos y equino sometidos a criopreservacin (De Iuliis
y col 2006, Burnaugh y col 2007).
En espermatozoides de mamferos, el O
2
._
intracelular
es consecuencia de los procesos metablicos que habi-
tualmente ocurren en la mitocondria (de Lamirande 1997,
Sanocka y Kurpisz 2004); aqu este radical es generado y
liberado al citoplasma donde es transformado a H
2
O
2
, el
cual finalmente difunde hacia el espacio extracelular (de
Lamirande 1997, Koppers y col 2008).
En humanos, habitualmente es baja la concentracin
de O
2
._
disponible al interior de la clula, el cual formara
parte de una cascada de eventos que finalizara con la
capacitacin espermtica (de Lamirande 1998).
No se encuentran trabajos disponibles que traten la
produccin de superxido intracelular y la funcin que
ste cumple al interior del espermatozoide de peces.
Los escritos publicados estn orientados a la utilizacin
de antioxidantes en la dieta, su aplicacin en el plasma
seminal o la exposicin de los espermatozoides a otros
tipos de ROS, donde se pone nfasis en la evaluacin
de la motilidad, capacidad fecundante, lipoperoxidacin
y dao del ADN de los espermatozoides por efecto de
antioxidantes (Ciereszko y Dabrowski 1995, Kiron y
col 2004, Mansour y col 2006, Zhou y col 2006, Canyurt
y Akhan 2008).
D
D
H
E
A B
C
Figura 3. Comportamiento de los espermatozoides de trucha
arcoiris (o. mykiss) respecto de la tincin de DHE para supe-
rxido. Se observa a la mayora de los espermatozoides ubicados
en el cuadro superior izquierdo, que corresponde a las clulas
con O
2
._
intracelular, durante todos los das que permanecieron
almacenadas. A = da 1, B = da 4, C = da 8 y D = da 12.
Behavior of spermatozoa of rainbow trout (o. mykiss) after
DHE staining for superoxide. Note the majority of sperm located in the
upper left box, which corresponds to the cells with intracellular O
2
._
,
every day they remained in storage. A = 1st, B = 4 days, C8 days and
D = 12 days.
I
P
SYBR-14
A B
C D
Figura 4. Tincin de SYB14 - IP para integridad de membrana
plasmtica de trucha arcoiris. Se observa el desplazamiento
de los espermatozoides desde el cuadro inferior derecho, que
corresponde a la membrana ntegra, hacia el cuadro superior
derecho correspondiente a la tincin de ioduro de Propidio, este
ltimo ti las clulas muertas. A = da 1, B = da 4, C = da 8
y D = da 12.
Staining SYB14 - IP for plasma membrane integrity of
rainbow trout. It shows the movement of sperm from the lower right
square that corresponds to the integral membrane, towards right upper
square for the propidium iodide staining, the latter stained dead cells.
A = 1st, B = 4 days, C8 days and D = 12 days.
con los das 8 y 9 (P < 0,05). Al correlacionar los das de
almacenamiento versus el porcentaje de espermatozoides
con alto
Mit
se encuentra correlacin negativa entre
ambos (r = 0,6 P < 0,05), al igual que al correlacionar
el porcentaje de clulas con tincin positiva para O
2
._
y

Mit
, donde tambin se obtiene un ndice de correlacin
negativo r = 0,56 P < 0,05.
El test de comparaciones mltiples entre el porcentaje
de espermatozoides con tincin positiva para O
2
._
y el
porcentaje de espermatozoides con alto
Mit
nuevamente
muestra diferencias significativas entre los das 1 y 4 con
los das 8 y 12.
En el grfico de dispersin de la figura 5 se aprecia un
desplazamiento evidente de las clulas desde el cuadrante
inferior derecho, donde se encuentran los espermatozoides
con alto
Mit
, hacia el cuadrante superior derecho donde
se encuentran las clulas con bajo
Mit
, este ltimo grupo
aumenta notoriamente los das 8 y 12.
DISCUSIN
El tiempo que permanece almacenado el semen fuera
del ambiente testicular produce efectos perjudiciales en
los espermatozoides. La presencia del anin superxido
(O
2
._
) intracelular, una especie reactiva de oxgeno (ROS),
anteriormente haba sido detectado en espermatozoides
184
O BERROS Y COL
peces (Alavi y col 2004, Alavi y Cosson 2005, Alavi y
col 2007). Una particularidad que tienen los espermato-
zoides de salmnidos, entre los que se encuentra la trucha
arcoiris, es la carencia de movimiento cuando se hallan
dentro del testculo o en el lquido seminal, caracterstica
que permite mantenerlos inactivos in vitro, recurriendo a
soluciones isoosmticas con una concentracin de potasio
similar a la del semen, puesto que este ion es el principal
responsable de inhibir el movimiento dentro del testculo
(Morisawa y Morisawa 1986). Inversamente, cuando se
requiere evaluar motilidad, los espermatozoides deben
ser activados depositndolos en agua o medios salinos
isoosmticos, con una concentracin de potasio inferior
al lquido seminal, donde, al igual que en la naturaleza,
el movimiento finalizar 15 a 30 s despus que la clula
haya sido activada (Christen y col 1987).
En este estudio, el movimiento espermtico present
un evidente descenso a partir del octavo da, observndose
solo la mitad de los espermatozoides con movimiento en
esta evaluacin. Considerando el largo periodo de tiempo
transcurrido antes de que la motilidad fuera afectada, al
parecer sta no estuvo influenciada negativamente por los
radicales O
2
._
intracelulares, y el perjuicio podra deberse
a otros factores externos que no fueron evaluados en este
trabajo, como puede ser la contaminacin con orina o mi-
croorganismos (Dreanno y col 1998, Ochsendorf 1999).
Los espermatozoides obtienen la energa para el
movimiento del flagelo a partir del adenosin-trifosfato
(ATP) (Christen y col 1987). La forma como adquieren
esta molcula puede variar entre las diferentes especies,
as en Cyprinus carpio o carpa comn, por ejemplo,
los espermatozoides obtienen parte de la energa para
el movimiento por va glicoltica, en trucha arcoiris, en
cambio, obtiene prcticamente la totalidad de la energa
a partir de respiracin aerbica, con participacin de las
mitocondrias, las cuales generan ms O
2
._
a medida que
aumenta el movimiento flagelar (Zietara y col 2009).
En este aspecto, llama la atencin el alto porcentaje de
clulas que presentaron tincin positiva para O
2
._
, aun
cuando durante los ensayos los espermatozoides perma-
necieron en soluciones que no activaron su motilidad, lo
cual debera disminuir considerablemente la generacin
de este radical en las mitocondrias. Lo anterior hace
presumir que los O
2
._
observados en gran porcentaje de
espermatozoides podran provenir de otro compartimento
distinto a las mitocondrias (De Iuliis y col 2006) o tener
un origen extracelular como se ha observado en algunos
mamferos (Marklund 1984).
La importancia de la membrana plasmtica radica
principalmente en funciones de transporte, reconocimiento
de seales, balance hdrico y capacidad fecundante de
la clula espermtica (Boitano y Omoto 1991, Cabrita
y col 2001). En este estudio, se entregan los primeros
antecedentes sobre integridad de membrana en esperma-
tozoides de trucha arcoiris almacenados. No obstante, en
espermatozoides de mamferos sometidos a criopreservacin
ha sido ampliamente estudiada (De Baulny y col 1997,
Rasul y Anzar 2001).
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
Intensidad
Alto
MIT
(uorescencia roja)
Bajo
MIT
(uorescencia roja)
A B
C D
Figura 5. Comportamiento del
Mit
durante el almacenamien-
to. Se observa la mayora de los espermatozoides en el cuadro
inferior derecho, indicando un alto
Mit
los primeros das de
evaluacin, mientras que en las dos ltimas evaluaciones se
produjo desplazamiento de la mancha hacia la parte superior
derecha donde se encuentran los espermatozoides con bajo
Mit
,
caracterizados por una mezcla de ambos colores. Las flechas de
los ejes indican intensidad de la fluorescencia. A = da 1, B = da
4, C = da 8 y D = da 12.

Mit
behavior during storage, observed the majority of
sperm in the lower right square indicating a high
Mit
first days of
evaluation, while in the last two assessments were moving toward the part
upper right in which are spermatozoa with low
Mit
, characterized by a
mixture of both colors. The arrows indicate the axes of the fluorescence
intensity. A = day 1, B = day 4, C = day 8 and D = day 12.
A diferencia de lo observado en espermatozoides de
humanos y jabal (Guthrie y Welch 2006), en el presente
estudio se detect O
2
._
intracelular en gran porcentaje de
los espermatozoides desde el da de extraccin del semen.
Sin embargo, no se advirti que este radical afectara la
motilidad, integridad de la membrana plasmtica o el
Mit

los primeros siete das de almacenamiento. Lo anterior
podra indicar la inocuidad de los radicales superxido
cuando se encuentran al interior celular, al igual que lo
observado en espermatozoides incubados en medios con
xantina-xantina oxidasa (XA-XO), donde el dao a la
motilidad y estructuras celulares es producido principal-
mente por el exceso de H
2
O
2
liberado del metabolismo de
los O
2
._
y no directamente por la presencia de este radical
(Aitken y col 1993, Baumber y col 2000, Guthrie y Welch
2006, Martnez-Pastor y col 2009).
La motilidad espermtica es un indicador que habi-
tualmente se evala en los experimentos con semen de
185
ALMACENAMIENTO, SUPERXIDO INTRACELULAR, TRUCHA ARCOIRIS, ESPERMATOZOIDES
Una caracterstica de la membrana plasmtica de
trucha arcoiris es su alto contenido en colesterol (Pustowka
2000), lo cual permite a la clula regular funciones como
la fluidez y permeabilidad (Sanocka y Kurpisz 2004). En
este trabajo no se observ relacin entre la integridad de
la membrana y O
2
._
presente en el interior celular, ya que
al correlacionar ambos no hubo asociacin. Sin embargo,
cuando se correlacion integridad con das de almacena-
miento s se encontr elevada correlacin negativa, r = 0,8,
lo que podra indicar perjuicio del almacenamiento, tal vez
debido a otros radicales generadores de oxgeno, como
por ejemplo, perxido de hidrgeno generado a partir de
O
2
._
al transcurrir los das de almacenamiento o por otros
agentes contaminantes, ya por un tema de proteccin
al medio ambiente; la solucin salina isoosmtica que
se utiliz para la conservacin de los espermatozoides
careca de cualquier tipo de antibitico, razn por la cual
es muy probable que la muestra de semen haya contado
con una gran carga de microorganismos, algunos de los
cuales podran haber producido perxido de hidrgeno
(Ochsendorf 1999), daando la membrana y alterando la
motilidad espermtica durante el almacenamiento.
Otro agente que frecuentemente se puede encontrar en
la extraccin del semen es la orina, y aunque se tomaron
algunas precauciones para evitar su extraccin junto con la
muestra de semen, probablemente stas no fueron suficientes.
La orina en el semen altera la molaridad y concentracin
de potasio, adems influye en la concentracin de ATP y
motilidad espermtica (Dreanno y col 1998).
El
Mit
es el nico indicador que fue afectado por
O
2
._
intracelular, lo cual se demuestra en la correlacin
negativa obtenida (r = 0,56) al asociar ambos indicadores.
De acuerdo a los resultados, los espermatozoides tambin
fueron afectados por los das de almacenamiento, presentan-
do una disminucin en el potencial a partir del octavo da.
Esto ltimo probablemente debido a la interaccin directa
y prolongada entre O
2
._
y algunas molculas que son pro-
ductos de la cadena respiratoria en la mitocondria (Koppers
y col 2008), ya que, a diferencia del ROS intracelular, el
extracelular (principalmente perxido de hidrgeno) no
produce dao peroxidativo a corto plazo en la membrana,
ni afecta el
Mit
(Baumber y col 2000), inversamente a lo
encontrado en espermatozoides de jabal, donde el exceso
de O
2
._
s provoca disminucin del potencial mitocondrial y
motilidad, a pesar de encontrarse este radical en un escaso
nmero de espermatozoides (Guthrie y Welch 2006).
En conclusin, en nuestro estudio se observ un alto por-
centaje de espermatozoides que presentaron O
2
._
intracelular.
De acuerdo a los anlisis estadsticos, este anin no afect
la motilidad ni la integridad de la membrana plasmtica.
Sin embargo, el potencial de membrana mitocondrial s es
afectado, lo cual podra deberse a la exposicin directa y
prolongada de O
2
._
con molculas generadas como producto
de la respiracin dentro de la mitocondria.
Por otro lado, teniendo en cuenta los das de almacena-
miento, se observ deterioro en todos los indicadores aqu
evaluados, no obstante, dos de ellos (motilidad e integridad
de la membrana citoplasmtica) no son efecto directo de los
O
2
._
, sino que al parecer de otros factores no evaluados en
esta investigacin, como puede ser el perxido de hidrge-
no generado a partir de la contaminacin bacteriana o por
efecto de la contaminacin involuntaria con orina.
Finalmente, considerando la importancia que tiene la
reproduccin de peces en cautiverio y silvestres, resulta
conveniente profundizar la investigacin en aspectos
celulares y as proporcionar informacin til para la ela-
boracin de medios de cultivos y otros insumos utilizados
en el manejo de gametos.
RESUMEN
A diferencia de lo que ocurre en mamferos, en telesteos la mayora de
los estudios que evalan la calidad del semen almacenado estn orientados a
la exposicin de los espermatozoides a algunas especies reactivas de oxgeno
(ROS), a la incorporacin de antioxidantes en la dieta o a la aplicacin de
stos en el plasma seminal. No se encuentran trabajos disponibles que traten
la presencia del radical superxido (O
2
._
), ni la funcin que ste cumple
al interior del espermatozoide cuando se encuentran almacenados. En la
presente investigacin se evalu el efecto del almacenamiento en el O
2
._
,
motilidad, integridad de la membrana plasmtica y potencial de membrana
mitocondrial (
Mit
) en espermatozoides de trucha arcoiris (oncorhynchus
mykiss). Para ello se extrajo el semen, el cual fue almacenado durante
12 das a 4 C. Cada 4 das se evalu motilidad,
Mit
, integridad de la
membrana plasmtica y se detect O
2
._
intracelular en los espermatozoides.
Se encontr un 82,59% de clulas con tincin positiva para O
2
._
el da de
extraccin de la muestra, mientras que la motilidad,
Mit
y la integridad
de la membrana plasmtica, solo mostraron deterioro despus del octavo da
de almacenamiento. nicamente el
Mit
se correlaciona negativamente
con O
2
._
a partir del octavo da de almacenamiento (r = 0,56 P < 0,05).
Respecto a la motilidad e integridad de la membrana plasmtica no fueron
afectadas por el O
2
._
intracelular, no obstante el deterioro observado en
estos dos ltimos indicadores podra deberse al contacto prolongado
de los espermatozoides con agentes contaminantes no evaluados en el
presente trabajo.
AGRADECIMIENTOS
A la Direccin General de Investigacin de la Universidad Catlica
de Temuco, por su colaboracin.
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187
Arch Med Vet 42, 187-193 (2010)
ORIGINAL ARTICLE
Accepted: 06.08.2010.
* cristinagatica@gmail.com
Effects of crowding on blood constituents and flesh quality
variables in Atlantic salmon (Salmo salar L.)
Efecto del confinamiento sobre las variables sanguneas y
calidad de carne de Salmn Atlntico (Salmo salar L.)
MC Gatica
a*
, GE Monti
b
, TG Knowles
c
, CB Gallo
a
a
Instituto de Ciencia Animal y Tecnologa de Carnes, Facultad de Ciencias Veterinarias,
Universidad Austral de Chile, Campus Isla Teja, Valdivia, Chile.
b
Instituto de Medicina Preventiva Veterinaria, Facultad de Ciencias Veterinarias,
Universidad Austral de Chile, Campus Isla Teja, Valdivia, Chile.
c
School of Clinical Veterinary Science, University of Bristol, Langford, Bristol, UK.
RESUMEN
Se compararon en los das 0, 1, 4, 7 y 10 post mortem, en trminos de variables de la calidad de la carne y constituyentes sanguneos, los efectos
de la anestesia (como tratamiento del control) y el confinamiento controlado con disminucin del nivel de oxgeno en salmones tamao cosecha (Salmo
salar). Los peces fueron mantenidos en triplicado en estanques y muestreados despus de anestesiar con AQUI-S

y despus de confinar por un perodo


de una hora. Dieciocho peces de cada tratamiento fueron insensibilizados mediante un golpe en la cabeza, se les extrajo sangre mediante la puncin
de la vena caudal para luego ser sangrados mediante el corte de branquias y posteriormente procesados para obtener los filetes. Todas las variables
sanguneas a excepcin del cortisol fueron significativamente ms altas (P < 0,05) en los peces confinados comparados con los peces anestesiados. El
pH muscular inicial fue ms bajo en los pescados confinados nicamente en los das 0, 1 y 4 post mortem. El color muscular obtuvo una puntuacin
significativamente ms baja (P < 0,05) en los peces confinados que en aquellos anestesiados en los das 0 y 1 post mortem. La prdida del peso fue mayor
(P < 0,05) en los peces confinados, aumentando en ambos tratamientos en los siguientes das post mortem. La concentracin de astaxantina muscular
no mostr ninguna diferencia estadstica entre los tratamientos ni en los das post mortem. Se puede concluir que el confinamiento y el bajo nivel de
oxgeno tienen un efecto negativo en las variables sanguneas y en parmetros de calidad de carne, disminuyendo la puntuacin de color, bajando el pH
muscular inicial y aumentando la prdida del peso de los filetes.
Key words: stress, quality, blood, pH, cortisol.
Palabras clave: stress, calidad, sangre, pH, cortisol.
INTRODUCTION
Animal welfare has become a subject of great importance
in farm animals and is also an important topic to consider in
farmed fish (Kestin et al 1995, Hstein 2004). Intensively
produced fish are exposed to management practices such as
handling, transportation or confinement which elicit stress
responses. There is an extensive literature that has examined
the response of fish to typical stressors in aquaculture
practices (Barton 2002, Acerete et al 2004). Stressors
can be multiple and of diverse origin: deficient feeding,
high stocking densities, low water oxygen, inappropriate
water conditions (physical-chemical), pH, inappropriate
temperature, high carbon dioxide levels, ammonium, nitrites,
sulphydric acid, organic matter in the water, salinity, photo
and/or thermo period, vibrations and noises, injuries from
handling (harvests, transport) (Rottmann et al 1992, Ruiz
et al 2003), high metal concentrations in water, as well
as pollution (Iwama et al 2004). Kestin (1994), identified
handling and confinement as the major stressing agents
in commercial salmon aquaculture.
Increasing stocking density is one method of increasing
productivity at the growing farm, however, high densities
have been shown to produce aggressive behaviour, reduce
feed conversion and growth rate, decrease water quality and
increase the presence of physical injuries (Wall 2001).
High stocking densities were identified as one of the
main causes of problems related to flesh quality as well
as animal welfare (Wall 2001). High stocking densities
are often associated with lowered water quality (excess
ammonium and low oxygen tension). The increased
proximity between fish contributes to the dissemination of
disease, an increase in stress and a consequent reduction in
the immune response (Kestin 1994). Bell et al (2002) did
not find a correlation between high stocking densities and
various measures of animal welfare until a break point of
20 to 24 kg/m
3
, however, densities above this point were
thought to jeopardize the welfare of the fish.
188
MC GATICA ET AL
Harvesting is an inevitable part of farmed fish production
and places fish in an acute stress situation by reducing
surrounding water volume and causing increased activity
as fish attempt to escape (Thomas et al 1999). Further
live transport in wellboats and high stocking densities
in the resting cages before slaughtering are all stressful
procedures (Skjervold et al 2001, Foucat et al 2004). The
harvesting is under-represented in investigations into fish
welfare, probably due to the endpoint (for the biologist)
being the death of the fish (Erikson et al 1997
b
, Thomas
et al 1999, Skjervold et al 2001).
In Chile, live transportation of harvest size salmon to
slaughter is common and carried out mainly in wellboats.
The fish are loaded by means of pumps into the wellboats
chambers, where they are kept during the whole journey
at high stocking densities (approximately 120 kg/m
3
).
Once the wellboat arrives at the processing plants pier,
unloading is either into the resting cages, where fish are
kept at stocking densities between 25 and 30 kg/m
3
, usually
for a period of up to 24 hours, or directly to the processing
plant to slaughter.
Disturbance during harvest and antemortem handling
can be detected through physiological changes that can
be used as indicators of the degree of stress experienced
by the fish (Barton 2000). Fish respond in different
ways to maintain homeostasis during stress and many
physiological changes are involved in the stress response,
including changes in osmolality, hormone release, and
energetic metabolism (Barton and Iwama 1991, Wendelaar
Bonga 1997).
Of great commercial importance is the influence that
these changes have on various characteristics of flesh quality:
firmness (Skjervold et al 2001), onset and duration of rigor
mortis, muscle pH, water holding capacity, texture, gaping
and shelf life (Huss 1995, Thomas et al 1999, Skjervold
et al 2001, Roth et al 2002, Foucat et al 2004, Jittinandana
et al 2005). From a commercial, as well as from an animal
welfare point of view, it is important to understand the
nature of the physiological and metabolic changes in
order to implement appropriate measures to reduce any
deleterious effects (Kestin 1994, Pottinger 2001).
The aim of the present study was to evaluate the effect
of crowding and low oxygen on blood levels of glucose,
lactate, cortisol, sodium, chlorides and osmolality, and
on flesh quality parameters of weight loss, asthaxantin
content, colour and muscle pH in harvest size salmon
(Salmo salar).
MATERIAL AND METHODS
EXPERIMENTAL DESIGN
Thirty six fish from a total of 75.4, to 5 kg harvest
size Atlantic salmon, that had been brought from cages
to tanks and allowed to acclimatise for a period of 86
days before the trial, were used for the experiment. The
fish were held in three 3000 L. tanks, each holding 25
fish (aprox. 33 kg/m
3
) at the biggining of the study. The
tanks had an open flux of water with a total rechange of
the water in 1 hour. The three tanks were considered as
replicates. On the first day of the experiment, 30 mg/L of
AQUI-S were used as an anaesthetic in all three tanks,
dissolved directly into the water and left to act for a
period of 30 minutes at the time that the flux of water was
closed; then 6 fish at random were sampled individually
from each tank by means of a ketch (Anaesthetized fish,
n = 18). Each fish was stunned by a blow to the head,
and a blood sample was obtained with a syringe from the
posterior aorta. The blood was divided in two tubes, one
with NaF, to obtain plasma by means of centrifugation
for glucose and lactate concentrate determination, and
another without anticoagulant, to obtain serum for cortisol,
osmolality, Na and Cl concentrate determination. Both
plasma and serum were frozen (-20 C) for later analysis.
After blood sampling, the fish were killed by gill cut, hung
by the peduncle and left to bleed out of the water for a
period of one hour. After bleeding each fish was filleted
and the Norwegian Quality Cut (NQC) from the left and
right fillets were used to determine quality characteristics.
Once the 18 anaesthetized fish were blood sampled from
the three tanks, the flux of water was restored in each of
them and the anaesthetic was eliminated.
The next day, the remaining fish were crowded, by
means of a mesh inside the tanks and the escape of water,
to a maximum density of 200 kg/m
3
over the period of
one hour. Fifty per cent of the water was released from the
tanks, and oxygen saturation level reduced from an average
of 90% to 23%. Fish from the 3 tanks (replicates) were
crowded at 1 hour intervals to allow enough time to sample
each tank before starting the next one. After one hour of
crowding, six fish from each tank were taken individually
out of the water in the same way the anaesthetized fish
were sampled on day one (Crowded fish, n = 18). Then
the holding mesh was removed and the water level in the
tank returned to its original level.
BLOOD VARIABLE ANALYSIS
Glucose concentration was determined spectro-
photometrically using the GOD-PAP method without
deproteinization. The lactate concentration was also
determined spectrophotometrically by means of an
enzymatic-colorimetric method. Serum sodium concentration
was determined with a Perkin-Elmer 238 atomic absorption
spectrophotometer. Both urea and chlorides were determined
colorimetrically using the GLDH enzymatic method
and the tripyriditiazine (TPTZ) method respectively.
Glucose, lactate, urea and chlorides were determined in
an autoanalyzer (Cobas Mira Plus spectrophotometer
(Roche

)) by means of the colorimetric technique. Urea


Nitrogen was determined in order to calculate osmolality
using the formula:
189
STRESS, QUALITY, BLOOD, PH, CORTISOL
(1) UreaNitrogen
urea
=
2 14 .
.
Serum osmolality was then obtained using the
formula:
(2)
mosmol kg Na
Glu e UreaN
/ .
cos

1
]
+

_
,

+ 1 86
18 2..8

_
,


(Holmes 1962)
Cortisol concentration was determined by a RIA
technique (Radio Immune Assay). The samples were
measured on a radioimmunoassay using marked cortisol
with iodine 125 and this marked hormone is made to
compete with cold hormone, which is in the samples.
As the antibody is attached to the tube, this test is
called coat-to-count. The antibody is highly specific
for cortisol and has very low reaction crossed with
other steroids such as cortisone and corticosterone. At
FISENLAB laboratory all RIAs have been validated
for use in animals.
MUSCLE PH, COLOUR, ASTHAXANTIN CONTENT
AND PERCENTAGE WEIGHT LOSS
Muscle pH and colour scores were determined at 0
(1 hour post-mortem), 1, 4, 7 and 10 days post-mortem.
Muscle pH was measured by directly inserting a pH probe
(Checker 200) in the left NQC fillet of each fish; probe
insertion was always performed at the same position
and by the same person. At the same time, visual colour
scores were obtained using the DSM SalmoFan (DSM
Nutritional Products, Chile), which uses a scale ranging
from 21 (light red) to 34 (dark red), under standardised
illumination in a Salmon Colour Box and by the same
person every time. Asthaxantin content was determined
by HPLC on days 1, 4, 7 and 10 postmortem, also in the
left NQC fillet. Between measurements the fillets were
kept refrigerated (0-4 C) in individually labelled plastic
bags. The right NQC fillets were weighed and also kept
individually labelled in refrigeration (0-4 C); any liquid
exudate present in the bag was wiped off before each
weighing. Weight loss was determined as the difference
between day 1 and days 4, 7, 10, and then calculated as a
percentage of the initial weight on day 1. All flesh quality
analysis were performed at TraceLab Analytical Services,
Puerto Montt, Chile.
STATISTICAL ANALYSIS
The normality of the distribution of the blood variables
was determined by visual inspection of a histogram and by
means of the Shapiro-Wilks Normality Test. A two sample
t-test was used to test variables with a normal distribution
and the Wilcoxon Rank Sum Test for those not normally
distributed. Flesh quality data were repeated measures
and were analysed with a model that allowed a varying
intercept (Singer and Willett 2003), expressed as:
Y
ij
= b
0ij
+
1
Days post mortem0
j
+
3
Days post
mortem10
j
+
4
Treatment
j
b
0ij
=
0i
+
0j
+
0ij
Where i = days postmortem and j = individual
This model assumes that
0j
takes a particular variance
structure (simple, compound symmetry first-order
autoregressive and unstructured (more details in the next
paragraph) for the repeated measures within-individuals
and the error term
0ij
is a Gaussian random variable that
are uncorrelated and have expectations 0 and and variances


(N (0,

) (Singer 1998).
With typical repeated measures, as here, two measure-
ments that are taken at adjacent time are more correlated
than those measurements taken several time points apart
(Little et al 1996). Therefore, it is important to account
for these correlations in estimating the effects of time and
of treatment.
Several error structures were evaluated including
simple (no correlation), compound symmetry, first-order
autoregressive and unstructured (estimating a correlation
for each separate correlation). The different correlation
structures were evaluated using Akaikes Information
Criterion (AIC). AIC can be used to compare models
with the same fixed effects but that differ in the variance
structure (Little et al 1996). We found the first-order
autoregressive (AR(1)) correlation structure to provide
the best fit to these data. For the first-order autoregressive
model, the correlations decrease exponentially with the
distance between measurements. Therefore, we illustrate
below a correlation sub-matrix for the ith individual:
1
1 2
2 1
3 2 1




2 3

Analysis were performed in SAS V.9.1 and statistical


significance was defined at P < 0.05.
RESULTS
The results from the analysis of blood constituents for
each group are shown in table 1. All of the blood variables
analyzed, (glucose, lactate, Na, Cl and osmolarity) with the
exception of cortisol, increased (P < 0.05) in the salmon
which were crowded.
The results from the flesh quality measurements are shown
in table 2. Flesh colour was significantly lower (P < 0.05) in
crowded salmon, both at death and on day 1, post mortem.
190
MC GATICA ET AL
Table 1. Anaesthetized and crowded salmons blood variables. Mean and SD.
Variables sanguneas para salmn anestesiado y en confinamiento. Promedio y DS.
Treatment
Glucose
mmol/L (SD)
Lactate
mmol/L
(SD)
Cortisol
ng/ml (SD)
Na
mmol/L (SD)
Cl
mmol/L
(SD)
Osmolality
mosm/kg
(SD)
Anesthetised 4.26* (1.1) 3.40* (3.2) 242.79 (78.9) 149.82* (22.7) 126.37* (31.8) 263.77* (77.4)
Crowded 7.52 (1.9) 14.0 (4.3) 284.53 (60.6) 161.33 (10.8) 139.35 (3.0) 300.87 (20.1)
* For a variable, it indicates statistical differences between treatment groups (P < 0.05).
Table 2. Mean and SD of anaesthetized (Anaest) and crowded salmons muscle colour, muscle pH, asthaxantine content and weight
loss percentage on days 0, 1, 4, 7 and 10 post-mortem.
Promedio y DS para salmn anestesiado (Anaest) y en confinamiento para color muscular, pH muscular, contenido de astaxantina y
porcentaje de prdida de peso en los das 0, 1, 4, 7 y 10 post-mortem.

Colour
Salmofan (SD)

Muscle pH
pH (SD)

Asthaxantine
ppm (SD)

Weight loss
% (SD)
Treatment
Day P-M
Anaest. Crowded* Anaest. Crowded* Anaest. Crowded Anaest. Crowded*
0 28.00
(0.63)
27.00
(6.39)
7.31 (0.11) 6.39
(0.23)
Nd Nd Nd Nd
1 26.00
(0.42)
25.00
(0.76)
6.34 (0.28) 5.98
(0.07)
6.97 (1.44) 6.98 (2.08) Nd Nd
4 25.00
(0.57)
25.00
(0.50)
5.96 (0.07) 5.87
(0.08)
6.83 (1.20) 6.66 (1.88) 1.73 (0.82) 2.72 (0.95)
7 25.00
(0.42)
25.00
(0.46)
5.94 (0.07) 5.99
(0.10)
6.18 (1.24) 6.57 (1.88) 3.07 (1.12) 4.35 (1.07)
10 (Ref.) 25.00
(0.48)
25.00
(0.46)
5.92 (0.08) 5.72
(0.86)
6.07 (1.34) 6.65 (1.76) 5.10 (1.10) 5.59 (1.37)
* different superscripts in the same line within a variable indicate statistical differences between treatment group P < 0.05).
different superscripts in middle columns of the same variable indicate statistical differences between days post-mortem (P < 0.05) in reference to
10 days post-mortem.
Nd = not determined.
Muscle pH was also significantly lower (P < 0.05) in
crowded fish until day 1 postmortem. There was no statistical
difference (P > 0.05) in asthaxantin content, neither between
treatments, nor over time, postmortem. Weight loss was
statistically greater (P < 0.05) in crowded fish at days 4 and
7 postmortem. Within groups, the weight loss increased
significantly (P < 0.05) between days 4, 7 and 10.
DISCUSSION
This study was carried out to compare the effects of
crowding and low oxygen on blood constituents and flesh
quality parameters under controlled experimental conditions,
but simulating those conditions used during harvest.
A primary response to stress is an increase in plasma
cortisol levels (Barton and Iwama 1991, Barton 2002,
Acerete et al 2004), and it is widely used to index a
stressful stimulus (Skjervold et al 1999). The 242.79 ng/
ml of cortisol obtained in the anaesthetized fish (table 1)
was higher than the 100.4 ng/ml observed in previous
work in low density and uncrowded Atlantic salmon
(Skjervold et al 1999, Skjervold et al 2001). Other
studies have found even lower values in the order of 20.9
ng/ml for unstressed salmon (Erikson et al 1999). In
our study there was no significant difference in cortisol
concentration between anaesthetized and crowded fish.
This could have been due to the fact that the cortisol
level was already high, at over twofold the value found
by others (Skjervold et al 2001). To accommodate the
sampling protocol during this study, the daily schedule
of handling and feeding of the fish was modified, which
could have contributed to the elevated cortisol levels
191
STRESS, QUALITY, BLOOD, PH, CORTISOL
observed in the anaesthetized fish. These fish were
sampled 30 minutes after the anaesthetic was poured
in the water and not one hour after handling, as in the
case of the crowded fish.
Osmotic changes during stress are affected directly by
changes in branchial permeability to water and electrolytes
(Redding and Schreck 1983). Changes seen in the levels
of blood Na
+
, Cl
-
and osmolality in the crowded fish were
consistent with this mechanism and the high levels of
cortisol found in this study.
In the present work, after crowding, the blood monovalent
ion Cl
-
increased over 10% (table 1). In previous studies
(Iversen et al 1998) it has also been observed to increase in
seawater adapted fish in response to handling or confinement.
Additionally, a difference increase of 7% was observed in
Na
+
concentration after crowding. This can be explained
by the net transepithelial fluxes of Na
+
and C1
-
in these
euryhaline fish during stress (Redding and Schreck 1983).
A major driver of these ionic imbalances is increased gill
permeability, which in turn promotes the exchange rate
of Na
+
and Cl
-
and water along concentration gradients
(Urbinati et al 2004).
A short-term intensive stress generally leads to a large
increase in cortisol concentration followed, after a set
delay, by a concomitant change in glucose (Svobodov
et al 1999). The mobilization of glucose in response to
stress is generally accepted as being a means of providing
extra energy resources, enabling the animal to overcome
the disturbance (Acerete et al 2004), making increase
of the glucose plasmatic concentration one of the most
common indicators of the metabolic changes following
stress (Iwama 1998, Reddy and Leatherland 1998). In this
study, plasma glucose levels (table 1) in the anesthetized
fish were within the range observed previously for harvest
size Salmo salar (Erikson et al 1999, Skjervold et al
2001). Glucose concentration was increased by 76% in
the crowded group. This is similar to values found in a
previous study (Skjervold et al 2001) where an increase
of 70% was seen in crowded fish.
With increased physical activity, pre-mortem, the greater
is the depletion of glycogen and the formation of lactic acid
(Roth et al 2002). Lactate concentration has been shown to
increase significantly in several species following severe
exercise or as a result of hypoxia (Acerete et al 2004).
In our study, blood lactate in the crowded fish increased
by over 300%, significantly higher than in anesthetized
fish (table 1), and indicative of a high level of anaerobic
muscle activity (Thomas et al 1999). Skjervold et al (2001)
showed similar results when comparing lactate levels
in crowded and uncrowded Atlantic salmon. Fish white
muscle mainly generates energy by means of anaerobic
metabolism which results in an accumulation of lactic acid
that must be transported to the liver for metabolization
(Huss 1995). Our results for lactate agree with those of
Thomas et al (1999), who found a significant increase
in plasma lactate in two species of salmonids following
lowering the water level, to simulate handling during
harvest and forced exercise.
High stocking densities can be very stressful for fish
(Erikson et al 1997
a
, Thomas et al 1999, Skjervold et al 2001,
Bahuaud et al 2010). At slaughter, the cessation of blood
circulation results in a decrease in oxygen concentration in
the cell and a progressive reduction of the redox potential,
leading to anaerobiosis (Toldr 2003) and a reduction in
muscle pH, due to lactic acid accumulation (Einen and
Thomassen 1998, Skjervold et al 2001). The more the fish
struggle before and during harvesting and slaughtering
procedures, the greater is the stress and the faster will be
the post-mortem drop in muscle pH (Thomas et al 1999).
The fall in post mortem muscle pH has an effect on the
physical properties of the fillet, lowering the net charge of
muscle proteins and causing a partial denaturation, which
results in a diminished water holding capacity (Kristoffersen
et al 2006). In our study, initial pH was significantly lower
(P < 0.05) in crowded than in anaesthetized fish (table 2).
This is in accordance with a previous study where muscle pH
was lower at slaughter in fish exposed to exercise, activity or
stress before death (Gatica et al 2008, Bahuaud et al 2010).
A lower initial pH, post mortem, is associated with more
rapid and detrimental quality changes in muscle properties
(Huss 1995, Einen and Thomassen 1998, Skjervold et al
2001, Toldr 2003). In the anaesthetized fish, initial pH
was significantly higher (table 2) than in the crowded fish,
probably indicative of a better quality, a longer pre rigor
period, and therefore, also allowing a longer time to process
the fish before rigor sets in. This is of great importance to
the industry as a fish in rigor cannot be easily manually
or mechanically processed: a rapid onset of rigor leaves a
limited time in which to gut and process the fillets. There
was no difference in pH between both treatments from the
fourth day postmortem, as seen in table 2. In the case of
the anaesthetized fish, the decrease in pH was faster than in
the crowded fish. This is in agreement with (Robb 2001),
who stated that there is no difference in final pH between
stressed and unstressed fish of the same species in spite of
presenting differences in initial post-mortem pH (Skjervold
et al 2001, Bahuaud et al 2010).
As a consequence of pH drop, water binding decreases
rapidly as the charge on proteins moves towards neutrality,
causing a loss of water from the flesh (Toldr 2003). In
our study, one hour after death, both muscle pH and colour
were significantly lower (P < 0.05) in those fish subjected to
crowding (table 1). This is in accordance with our previous
work (Gatica et al 2008) in which fish subjected to the stress
of transport had lower initial muscle pH. These findings
are supported by other authors (Robb et al 2000; Robb
2001), who stated that with a more rapid decrease in pH,
generally observed in fish which show higher muscle activity
prior to slaughter, there are also significant changes in the
colour of the salmon fillets. These same authors affirmed to
that these changes in colour are a result of changes in the
reflection of light from the surface of the fillet, due to the
192
MC GATICA ET AL
water loss from the flesh. As in this study it was possible
to observe differences in colour between anaesthetized
and crowded fish but there was no significant difference
in the content of asthaxantin between both groups. This
result suggests that the difference in colour is likely to
be due to water loss due to protein denaturation, and this
water loss also the cause of the significantly higher weight
loss on days 4 and 7, post-mortem, in the fillets from the
crowded fish (table 2). This change in colour, without a
loss in pigment (asthaxantin) content, is very similar to
an effect that occurs in pigs that are acutely stressed at
slaughter, which results in paler flesh known as pale, soft
and exudative (PSE) (Robb 2001).
It can be concluded that crowding increases blood
concentrations of glucose, lactate, Na, Cl and osmolarity.
Effects were also seen within the muscle, where pH was
lowered compared with anaesthetized fish until day four,
postmortem. Low muscle pH lowers the water holding
capacity of the proteins. This resulted in a greater weight
loss in fillets from the crowded fish. The difference in
colour observed between the crowded and anaesthetized
fillets during the first two days, could not be attributed to
a decrease in the content of the pigment asthaxantin under
the conditions of this study but rather to a change in the
relectance of the surface of the fillet of the crowded fish,
due to greater loss of water content.
SUMMARY
The effects of anaesthesia (as a control treatment) and controlled
crowding, with its concomitant low oxygen level, on harvest size salmon
(Salmo salar) were compared in terms of blood constituents and flesh
quality variables, at 0, 1, 4, 7 and 10 days post-mortem. Fish were held
in tanks in triplicate and were sampled after anaesthetizing with AQUI-
S and after crowding for one hour. Eighteen fish from each treatment
were stunned, blood sampled from the posterior aorta and the fish bled
by gill cut and filleted. All blood variables with the exception of cortisol
were higher (P < 0.05) in crowded fish compared with anaesthetized
fish. Initial muscle pH was lower in the crowded fish and only between
days 0; 1 and 4. Colour was significantly lighter in crowded than in
anaesthetized fish on days 0 and 1. Weight loss was higher (P < 0.05)
in the crowded fish and also increased in both treatments with time post
mortem. Muscle asthaxantin concentration showed no statistical difference
between treatments nor post mortem. It can be concluded that crowding
and reduced oxygen level had a negative effect on blood variables and
on flesh quality, lowering colour score, lowering initial muscle pH, and
increasing the weight loss of fillets.
ACKNOWLEDGMENTS
We are most grateful to DSM Nutritional Products Chile S.A.,
EWOS Innovation Chile S.A. and Universidad Austral de Chile, through
its Project MECESUP AUS 0005, who financially supported this work.
Also, we would like to thank Fundacin Chile at Quillaipe Experimental
Centre who provided facilities for the experiment.
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195
Arch Med Vet 42, 195-201 (2010)
COMMUNICATION
Accepted: 17.03.2010.
* Casilla 567, Valdivia, Chile; tamaratadich@uach.cl
Preliminary behavioural study of Caballo Fino Chilote stallions
with restricted access to space and water during summer
Estudio preliminar del comportamiento de potros raza Caballo Fino Chilote
con acceso restringido a espacio y agua durante el verano
TA Tadich
a b*
, RG Pulido
b
a
Becario CONICYT, Programa Doctorado en Ciencias Veterinarias,
Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
b
Instituto de Ciencia Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias,
Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
RESUMEN
El Caballo Fino Chilote (CFCh) es la nica raza de pony chileno y un recurso gentico nico. Un grupo de 7 potros CFCh fue observado por 60
horas, durante el verano, en la estacin experimental del INIA-Butalcura, Isla de Chilo, bajo condiciones de restriccin de espacio y agua. El mtodo
de muestreo por escaneo se utiliz cada 5 minutos para evaluar estados conductuales y focal continuo para los eventos. Se registraron 5 estados y 19
eventos conductuales. Las interacciones entre potros tuvieron una frecuencia de presentacin baja, siendo la ms comn evasin con un promedio de
1,2 eventos por potro por da. Los equinos utilizaron un 55,89% ( 4,3%) del tiempo en forrajear, 2,5% ( 0,82%) en locomocin, 7,26% ( 0,82%) de
pie alerta, 32,24% ( 2,7%) descansando y 1,86% ( 0,64) en otras actividades. Forrajeo fue la principal actividad, siendo significativamente ms baja
(P < 0,05) durante el medioda, periodo donde el descanso fue significativamente mayor (P < 0,05) comparado con los periodos de maana y tarde. Se
encontr una correlacin positiva significativa entre temperatura y descanso y una correlacin negativa significativa entre temperatura y forrajeo. Este
estudio es la primera descripcin conductual de potros de raza CFCh; la distribucin de sus actividades es comparable a la de otras razas mantenidas en
sistemas de pastoreo. Se enfatiza que la restriccin de acceso a agua a la cual estaban sujetos estos animales es preocupante desde el punto de vista tico
poniendo en riesgo su bienestar. Se requieren ms estudios conductuales de esta raza para clasificarla de acuerdo a su temperamento y posibles usos.
Key words: Caballo Fino Chilote, horse, stallion, behaviour, Chile.
Palabras clave: Caballo Fino Chilote, potros, conducta, Chile.
INTRODUCTION
In Chile the most popular horse breed is the Caballo
Criollo Chileno for which pedigree information can be
traced back to 1893 (Pinochet 1980). There is a second
Chilean horse breed; the Caballo Fino Chilote (CFCh).
This breed is related to the Archipilago of Chilo located
between 41 and 43 of south latitude. The island has an
oceanic temperate rainy climate, with medium annual
temperatures of 11 C (Snchez and Morales 2000).
The CFCh is a unique equine resource; morphological
characteristics (Voeltz 1996, Escobar and Tadich 2006) and
a genetic analysis (Barrera 1998) confirm that its origins
comes from those equines from the Pennsula Ibrica brought
by the Spaniard conquerors between the XVI and XVII
centuries (Escobar et al 1998, Mujica et al 2005) with a
close relationship with the Garrano horse from Portugal
(Mujica et al 2005). The main importance of the CFCh is
that it is considered the only pony with Spanish origins
subsisting in South America (Cothran et al 1993). Records
for the CFCh can be found since 1999 when the stud book
was opened as a result of a conservation program (FIA
2000). It has an average height to the withers of 120 cm
(Voeltz 1996) and an average weight of 218 kg for stallions
and 247 kg for mares (Mujica et al 2005).
The breed is known for being alert with excellent
temperament (Escobar et al 1998). It has also been described
as a rustic, strong and tame horse (Mujica et al 2005), and
with biokinematic characteristics, such as stride and step
length, and conformational parameters, suitable for its use
in hipotherapy (Escobar and Tadich 2006), although there
are no studies about the breeds behaviour.
Animals in natural conditions are regarded as showing
the normal behaviour of that species (Christensen et al
2002). Time budgets assess objectively important aspects
of behaviour (Fraser 1992) such as amount of time involved
in them and their distribution according to time of day or
season. Diurnal studies of the time budgets of domestic
horses on pasture, and of free-ranging feral horses, have
been conducted by Schoen et al (1976), Salter and Hudson
(1979), Crowel-Davis (1983), Kaseda (1983) and Sweeting
et al (1985). Behavioural information about Chilean breeds
196
TA TADICH, RG PULIDO
is scarce, for this reason the objective of this study was to
perform a preliminary study of some behavioural aspects
of CFCh stallions kept on pasture in their natural habitat
(Chilo Island) during summer, under typical management
conditions used for this breed.
MATERIAL AND METHODS
A group of seven CFCh stallions, kept at the National
Institute of Agricultural Research (INIA) located in
Butalcura, Chilo Island was studied. Stallions at INIA are
kept together on pasture, in a reduced area of 1 hectare.
No handling is done with them since they are kept only
as a genetic resource.
The group was observed between 08:00 h and 20:00 h
between the 27
th
of February and 2
nd
of March of 2008
(summer season). During this period, except for the presence
of the observer, no human contact occurred. Stallions were
kept with no ad libitum access to water (not recommended)
and with no mares in the vicinity of the enclosure. They
were taken to a water source once daily after observation
hours, being this the normal management routine used at
the station. They had been kept in this area prior to the
beginning of the study.
Stallions were identified by natural marks. Observations
were conducted by one observer from a distance between
15-20 m to avoid influencing the horses behaviour. Average
temperatures and relative humidity were registered through
the meteorological unit located at the research station.
Five mutually exclusive behavioural states were recorded
by scan sampling every five minutes. These behavioural
states were foraging, resting, standing alert, locomotion, and
other behaviours and are defined in table 1 (1-5). Foraging
was categorized into grazing and browsing while resting
was categorized into rest standing and rest recumbent.
To assess male related and inter-male interactions, 19
behavioural events were registered (table 1, 6-24) using
continuous focal sampling.
The twelve hour observation period was subdivided
into three periods: 08:00-12:00; 12:00-16:00 and 16:00-
20:00 h. These intervals divided the day into a morning,
midday and afternoon periods.
The body condition score (BCS) of each horse was
recorded once at the beginning of the study using the body
condition scoring index for horses from 0 (very poor) to
5 (very fat), based on the Carroll and Huntington (1988)
method. The age of stallions was provided by INIA.
Data analysis: Differences in percentage of time
dedicated to each behavioural state, between and within
stallions and between different periods of the day, among
the 5 days of observation, were analyzed by One-Way
Analysis of Variance. In cases where data was not normally
distributed, according to the Shapiro Wilk test, a Kruskal
Wallis test was applied. For assessing correlations between
temperature and each of the five behavioural states studied, a
Pearsons correlation was coefficient obtained. Behavioural
events are presented in terms of total occurrence, average
frequency per day and standard deviation. All calculations
were made in the computer software STATISTIX 8. A
significance level of P < 0.05 was applied.
RESULTS AND DISCUSSION
The geographical location where the study took place
(Butalcura, Chilo Island) corresponds to the original
conditions in which this breed has developed, since it
was first introduced by the Spanish conquerors (Cabrera
1945, Escobar et al 1998, Mujica et al 2005). The average
temperatures of 18.7 C (4.5 C min and 29.4 C max) and
average relative humidity (57.9%) registered during the
period of observation were normal for the period (Snchez
and Morales 2000).
Social status and nutritional condition have been
described as linked to the biological rhythm of an
individual (Souris et al 2007). The 7 stallions observed
ranged between 4 and 14 years of age (average 9 years),
6 of them had a BCS of 3 (good) and only one had a
score 2 (moderate).
For horses living in natural social units, interactions
among stallions comprise a prominent feature of social
behaviour, ranging from peaceful and cooperative to
sparring (McDonnell 2003). Some male related and
inter-male interactions observed in the CFCh stallions are
summarised in table 2. Avoidance behaviour was more
frequent (1.20 events per day per stallion) than aggressive
interactions such as biting, boxing or lunging (0.03,
0.37 and 0.03 events per stallion per day respectively)
(figure 1). Positive interactions such as allogroom and
play were also observed (table 2). Christensen et al
(2002) registered a higher number of social interactions
in naturally reared and mixed age group of Przewalski
stallions than in a domestically reared and of similar age
group of stallions. Although the restricted space (1ha) a
low number of interactions was found in the present study
(table 2). This could be a result of the small size of the
group of stallions, of similar ages and the fact that it has
been conformed over a long period of time, since according
to Boyd and Houpt (1994) the dominance relationship in
a group depend on these characteristics; or the fact that
they had enough resources to supply their biological needs
and that there were no mares present, since aggression
may be induced by competition for limited resources
(Christensen et al 2002). Another reason for the low
frequencies of interactions found could be some intrinsic
characteristics of the breed, which has been described as
having good temperament (Escobar et al 1998), but this
would need further studies to assure.
Over the period monitored, the group of stallions
studied spent 55.89% ( 4.3) of the time foraging, 32.4%
( 2.7) resting, 7.26% ( 2.04) standing alert, 2.54%
( 0.82) in locomotion and for 1.86% ( 0.64) of their
time they were involved in other activities (table 3). This
197
CABALLO FINO CHILOTE, HORSE, STALLION, BEHAVIOUR, CHILE
Table 1. Ethogram of the behaviours recorded based on Christensen et al (2002), McDonnell (2003) and Souris et al (2007).
Etograma de las conductas observadas, basado en Christensen et al (2002), McDonnell (2003) y Souris et al (2007).
Behaviour Description
1. Foraging Grazing: Ingest grassy vegetation. With the lips and tongue, vegetation is gathered into the mouth, broken off
usually in clumps by jerking the jaw while chewing, and swallowed.
Browsing: Ingest woody plants.
2. Resting Rest Standing: Standing inactive in a relaxed posture, usually with head slightly lowered, eyes partly or nearly
closed, and often bearing weight on three legs (one hind leg slightly flexed). With deeper drowsiness (transition
between wakefulness and sleep), the lips relax and the ears rotate laterally.
Rest recumbent: Rest or sleep while lying down with head up or legs and head outstretched.
3. Standing alert Rigid stance with the neck elevated and the head oriented toward the object or animal of focus. The ears are held
stiffly upright and forward, and the nostrils may be slightly dilated.
4. Locomotion Walk trot or gallop with a minimum duration of 10s. The horse is not involved in grazing.
5. Other behaviours All other behaviours, e.g. social behaviours, urination, defecation, inter-male interactions, etc.
6. Roll Dropping from standing to sternal recumbency, then rotating one or more times from sternal to dorsal recumbency,
tucking the legs against the body. Typically occurs on dusty or sandy areas.
7. Autogroom Nibbling, biting, licking, or rubbing a part of the body.
8. Allogroom Reciprocal coat care in which the partners stand beside one another, usually head to shoulder or head to tail,
grooming each others neck, mane, rump or tail by gently nipping, nuzzling, or rubbing.
9. Stomp Raising and lowering of a foreleg to strike the ground sharply, usually repeatedly.
10. Avoidance Movement that maintains or increases an individuals distance from an approaching stallion. The head is usually
held low and ears turned back. The retreat can be at any gait but usually occurs at trot.
11. Posturing Pre-fight head-bowing, prancing, stomping, olfactory investigation, as well as stiffening of the entire body, including
forelegs. The arched neck threat is also a major component, being held through out most of the interaction.
12. Lunge Swift forward thrust of the body from the rear position or charge from close range toward another stallion (usually
toward his fore body), most often displayed concurrently with a bite threat, with ears pinned.
13. Push Pressing of the head, neck, shoulder, chest, or body against another horse, causing it to move one or more legs
to regain balance.
14. Bite threat Bite intention movement with ears back and neck extended, with no actual contact.
15. Bite Opening and rapid closing of the jaws with actual contact to another horses body.
16. Strike threat A strike motion that appears abbreviated or gestured so as to miss contacting the opponent, often a part of
ritualized interactions between stallions.
17. Boxing Two stallions in close proximity simultaneously rearing and striking out toward one another with alternate
forelegs.
18. Chase Pursuit of another stallion, usually at a gallop in an apparent attempt to overtake, direct the movement of, or
catch up with the pursued stallion. The pursuing stallion usually pins the ears, exposes the teeth, and bites at the
pursued stallions rump and tail.
19. Herding Combination of head threat and ears laid back with forward locomotion, apparently directing the movement of
another stallion(s).
20. Defecate over Defecation on faecal piles in a characteristic sequence: sniff faeces, step forward. Defecate, pivot or back up,
and sniff faeces again.
21. Flehmen Head elevated and neck extended, with the eyes rolled back, the ears rotated to the side, and the upper lip everted
exposing the upper incisors and adjacent gums while drawing air and fluids through the teeth.
22. Play Play directed at another individual, which may or may not reciprocate; includes low intensity play movements
such as nipping, nuzzling, or rubbing.
23. Body sniff Olfactory investigation. A horse sniffs the neck, withers, flank, or tail of another horse, which may or not
reciprocate.
24. Displacement Approach of one horse with ears back causes another to move away so that distance is maintained or increased,
without overt aggression.
198
TA TADICH, RG PULIDO
Table 2. Total occurrence by stallion, average and standard deviation by stallion and daily frequency by stallion for the behavioural
events observed.
Presentacin total por potro, promedio por potro y desviacin estndar y frecuencia de ocurrencia diaria por potro de eventos
conductuales.
Behavioural event
total occurrence by stallion
average by
stallion
frequency
by day
1 2 3 4 5 6 7 total
roll 4 3 7 1 2 0 3 20 2.86 2.27 0.57
autogroom 9 2 8 8 9 5 2 43 6.14 3.13 1.23
allogroom 5 1 5 3 3 0 0 17 2.43 2.15 0.49
stomp 0 0 0 0 0 4 3 7 1.00 1.73 0.20
avoidance 0 4 1 15 5 7 10 42 6.00 5.23 1.20
posturing 0 0 0 0 0 1 1 2 0.29 0.48 0.06
lunge 0 0 0 0 0 0 1 1 0.14 0.38 0.03
push 1 0 2 0 0 0 0 3 0.43 0.79 0.09
bite threat 2 1 7 0 1 0 0 11 1.57 2.51 0.31
bite 0 0 1 0 0 0 0 1 0.14 0.38 0.03
strike threat 0 0 2 0 0 1 3 6 0.86 1.21 0.17
boxing 0 0 4 0 1 3 5 13 1.86 2.12 0.37
chase 0 0 9 0 0 0 0 9 1.29 3.4 0.26
herding 0 0 0 0 12 0 0 12 1.71 4.54 0.34
defecate over 2 2 4 0 1 5 5 19 2.71 1.98 0.54
flehmen 5 1 2 2 2 0 0 12 1.71 1.7 0.34
play 2 2 1 0 0 0 0 5 0.71 0.95 0.14
body sniff 2 2 2 0 0 2 1 9 1.29 0.95 0.26
displacement 1 0 13 0 2 0 0 16 2.29 4.79 0.46
Figure 1. Caballo Fino Chilote stallion lunging against another
stallion.
Potro Caballo Fino Chilote embistiendo a otro potro.
preliminary overall time budget for the CFCh stallions
studied (table 3) can be compared with those described
for other breeds as Camargue horses (Kiley-Worthington
1989), draft and light mares (Flannigan and Stookey 2002)
and Przewalski horses (Souris et al 2007). There were
no significant differences among the days included in
the study in relation to the distribution of the behaviours
within stallions, and no significant differences (P > 0.05)
between the stallions observed.
From the time spent foraging, 54.4% ( 4.97) was done
by grazing and 1.6% ( 1.15) by browsing. Foraging is
known to be the main activity of horses, occupying most
of their time budgets, and its is characterized by being
controlled by a highly regulated motivational system
(Fraser 1992). The CFCh stallions spent most of their time
in this activity (56%), percentage similar to that reported
by Duncan (1980, 1985) for Camargue horses and higher
than the 25.83% 26.8% found for densely housed Arab
breeding mares by Benhajali et al (2008). The CFCh, being
a rustic breed, is capable of adapting to adverse foraging
conditions (Escobar et al 1998, Mujica et al 2005), this
199
CABALLO FINO CHILOTE, HORSE, STALLION, BEHAVIOUR, CHILE
is why time spent browsing was also calculated (1.6%).
The main species available for grazing were Blechnum
pennamarina, a common fern in this island, and for
browsing Drimys winteri (tree) and Berberis microphylla
(bush). Because of the characteristics of these species, it
becomes highly important the adjustability of the ingestive
behaviour of the CFCh horse, important feature of equines
that has been described by many authors (Hintz 1977,
Frape 1980).
Resting time was also divided into rest standing
(29% 3.92) and rest recumbent (3% 2.35). This
behaviour was the second main activity (32%, table 3) in
which stallions were involved after foraging, although it
tended to follow an opposite trend (figure 2). Percentages
reported by Boyd et al (1988) were slightly higher for rest
recumbent (5.3%) and lower for rest standing (16%). This
could be due to the fact that their study was done over a 24
hour period. Deep sleep occurs in a recumbent position only
(McDonnell 2003) which is lower during day time (Boyd
et al 1988). According to Boyd et al (1988) a certain amount
of recumbency is critical for well being; horses depend on
vigilance and speed, and are especially vulnerable while in
recumbent rest. Most predators of horses are crepuscular or
diurnal, so minimizing recumbency during day time avoids
leaving them in a vulnerable position (Boyd 1998).
The mutually exclusive behaviours studied were not
equally distributes during the study period. Foraging and
resting showed the largest variation during the day. Foraging
was significantly lower (P < 0.001) during midday, time
at which resting was significantly higher (P < 0.001)
compared to the morning and afternoon period. There
was a significant higher amount of time spent resting at
midday compared to the other periods, the exact opposite
occurred for foraging (P < 0.001).
The percentage of time spent in each behaviour, during
the 12 hours studied was associated to average temperature
(figure 2). Average temperature showed a statistically
significant positive correlation with the amount of time spent
resting (r = 0.65, P = 0.025) and a statistically significant
negative correlation with the amount of time spent foraging
(r = 0.67, P = 0.016). There were no statistically significant
correlations (P > 0.05) between average temperature
and the remaining behaviours. Similar correlations were
described by Boyd (1998). Horses conserve energy by
resting during the hottest hours of the day until it becomes
cool enough for them to become active and graze without
incurring in thermal stress (Berger 1986) probably this is
the reason why stallions used the midday period, when
temperatures were higher, for resting. This midday decrease
in foraging activity has been observed to disappear during
winter (Rubenstein 1981), when energy requirements of
horses are probably higher, because of a higher metabolic
rate needed to maintain core body temperature, requiring
more time engaged in this behaviour (Boyd et al 1988).
Even though resting was the main activity during midday,
short bouts of foraging also occurred within this period
(figure 2). Equines salivate as a response to chewing,
while production of gastric acids are continues (Harris
and Arkell 2005), there fore avoiding long periods of time
without feeding enables horses to maintain an adequate
gastrointestinal environment and avoid discomfort as a
result of excessive acidity.
Locomotion was also found to be constant over the whole
observation period, a pattern that was also described by
Souris et al (2007). Locomotion is considered an integral
part of foraging, since horses are able to keep their heads
down ingesting food while taking a step or two (Fraser
1992, McGreevy 2004). In the present study, locomotion
was only considered when performed separately from
foraging behaviour, otherwise the 2.54% reported for this
activity would be higher.
Even though stallions were enclosed in a reduced
area (1ha) the percentage of time involved in standing
alert (7.23%) was consistent with percentages reported
by Griffitts (1985) and the Boyd et al (1988) and close to
the 11% reported by Souris et al (2007). A low percentage
of the stallions time was occupied in standing alert and
other activities (table 3) compared to other studies (Boyd
et al 1988, Boyd 1998, Flannigan and Stookey 2002,
Benhajali et al 2008). This could be due to differences in
the conditions in which horses were kept and the overall
observation hours included in the studies. Because of the
range of ages between the stallions in this study (4-13) we
expected them to be, more alert and vigilant because of
possible agonistic interactions in such a reduced space.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
8
:
0
0
9
:
0
0
1
0
:
0
0
1
1
:
0
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0
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1
3
:
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0
1
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:
0
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:
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1
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:
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1
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:
0
0
1
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:
0
0
2
0
:
0
0
Day hours
0
5
10
15
20
25
%

T
i
m
e
Foraging
Average T C
Other behaviours
Standing alert
Locomotion
Resting
Figure 2. Day time distribution of the five behaviours observed
and temperature, averaged by hour and day and subsequently
over all five days.
Distribucin diaria de los 5 estados conductuales observados y
temperatura, datos promediados por hora por el total de das registrados.
200
TA TADICH, RG PULIDO
Drinking was not included in the behaviours observed
in this study because stallions had no ad libitum access
to water. Horses daily water requirements range between
20-70 litres, depending on body weight, air temperature
and humidity, level of activity and health (NEWC 2005);
Porte (1992) indicates that water requirements can vary
between 2.5 and 5 litres for every kilogram of feedstuff
or 5-6% of live body weight. The presence of dew on
the grass during early morning and water included in the
species foraged were probably an important extra source
of water for these stallions. Heat stress is probably not
a problem because of the temperate climate of Chilo
Island, compared to the situation of horses kept in arid or
tropical areas where average temperatures are higher during
summer, as in the case of working horses in Afghanistan,
Egypt, India, Jordan and Pakistan (Pritchard et al 2005).
According to the NEWC (2005) every horse must have
free access to a supply of fresh, clean drinking water to
meet its individual maintenance and activity requirements
and wellbeing.
Even though the present study has limitations in relation
to management conditions and period of observation it
gives a first description of some behavioural characteristics
of CFCh stallions kept under restricted space and access
to water. The distribution of their activities during day
time is comparable to those of other free ranging horses,
spending the highest amount of time foraging at mornings
and afternoons when temperatures are lower. Although
agonistic interactions occurred with low frequencies,
further studies regarding specific behaviours are needed
to be able to classify this breed according to temperament
and possible uses, especially in relation to therapeutic
work with children.
SUMMARY
The Caballo Fino Chilote (CFCh) is the only Chilean pony breed
and a unique genetic resource. A group of seven CFCh stallions were
observed for 60 hours, during summer, at INIA- Butalcura research
station, Chilo Island, under restricted space and access to water
conditions. Scan sampling every five minutes was used to register 5
behavioural states and continuous focal sampling for 19 behavioural
events. Inter-male interactions had a low frequency of presentation being
avoidance (1.2 average events per stallion per day) the most common.
Overall stallions spent 55.89% ( 4.3%) of their time foraging, 2.5%
( 0.82%) in locomotion, 7.26% ( 0.82%) standing alert, 32.24%
( 2.7%) resting and 1.86% ( 0.64) in other behaviours. Foraging was
the main activity, its occurrence was significantly lower (P < 0.05) during
midday, time when resting was significantly higher (P < 0.05) compared
to the morning and afternoon periods. Locomotion, standing alert and
other behaviours had a constant distribution during the day. A significant
positive correlation between temperature and resting was found while
there was a significant negative correlation between temperature and
foraging. The present study is a first attempt in describing behavioural
characteristics of CFCh stallions. Distribution of their activities during
day time is comparable to those of other free ranging horses. Emphasis
is made on the fact that the restricted access to water, that these horses
were subjected to, is of ethical concern and a risk for their wellbeing.
More studies in relation to behaviour are needed in order to classify this
breed according to temperament and possible uses.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors would like to acknowledge INIA-Butalcura for allowing
us to undertake this study at their facilities, and CONICYT for the funding
of the Doctor in Veterinary Science degree.
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Table 3. Overall day-time time budget for the seven Caballo Fino Chilote stallions observed over 12 hours for 5 days.
Presupuesto de actividad diurno total para los 7 potros Caballo Fino Chilote observados 12 horas diarias por 5 das.
Foraging Locomotion Standing alert Resting Other behaviours
Percentage of time 55.89 2.54 7.26 32.40 1.86
S.D. 4.30 0.82 2.04 2.70 0.64
Time in minutes 402.19 18.29 52.27 233.28 13.39
201
CABALLO FINO CHILOTE, HORSE, STALLION, BEHAVIOUR, CHILE
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en el sur de Chile: Estudio preliminar
Husbandry and behaviour characteristics in stabled horses in
the south of Chile: A preliminary study
C Mrquez
a
, A Escobar
ab
, TA Tadich
ab*
a
Instituto de Ciencia Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
b
Programa Bienestar Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
SUMMARY
The use of stables for horses has become a routine practice, especially for those used in equestrian sports, affecting some behaviours due to the
changes in their natural environment which can have a detrimental effect on their welfare. In Chile the conditions under which horses are kept in stables in
relation to welfare have not been described. This is why the main objective of this study was to describe the housing systems for horses used in the south
of Chile and determine if they have the conditions required to maintain an adequate welfare status. Fourteen stud farms, including 283 horses of different
breeds located in Valdivia, Ranco, Osorno and Chilo provinces were visited. Direct and indirect methods were used for the evaluation; these included
aspects of health, behaviour, handling of the horses and training of the personnel. According to our results most horses had a good body condition score
(88%), 2.5% presented lesions and only 0.7% were lame. All stud farms had deworming schedules and the majority a vaccination programme. The main
problems were related with the presence of behavioural disorders (18.4%), low number of food rations per day, size of the stables and lack of training
of the personnel, especially in relation to animal welfare concepts. All stud farms had a high level of concern about the care of their horses. However,
the lack of knowledge in some aspects related to horse management need to be addressed through training in order to improve horses welfare.
Palabras clave: equinos, bienestar, manejo, estabulacin.
Key words: equines, welfare, management practices, stables.
INTRODUCCIN
La estabulacin del equino es una prctica que se ha
ido masificando en los criaderos a travs del tiempo; entre
las razones de esto estn la necesidad de ahorrar pasturas,
eliminar la competencia durante la alimentacin y facilitar
a los dueos un mayor control sobre el valor nutritivo del
alimento entregado y sobre la ingesta de agua (McGreevy
2004). Sin embargo, la estabulacin puede tener un efecto
negativo sobre el bienestar equino, principalmente debido
a las modificaciones conductuales que sufren al reempla-
zar su ambiente natural por establos (McGreevy 2004).
La conducta de forrajeo se ve altamente alterada en un
sistema de estabulacin. Los equinos en su ambiente
natural pueden ocupar hasta 16 horas diarias forrajeando,
mientras que en estabulacin esta conducta se ve reducida
a aproximadamente tres horas del da (Kiley-Worthington
1987), produciendo frustracin alimenticia durante el
encierro; la estabulacin es tambin un factor de riesgo
para la presentacin de conductas anormales o no deseadas
(Christie y col 2006, Tadich y Araya 2010).
La evaluacin del bienestar animal se basa princi-
palmente en la recoleccin de dos tipos de informacin:
los mtodos indirectos, que evalan lo adecuado de los
insumos y las prcticas de manejo que el animal recibe
e indican el riesgo de un problema de bienestar (Wood y
col 1998), y los mtodos directos, que usan parmetros
basados en el animal proporcionando una medida del estado
de bienestar de ste (Pritchard y col 2005). Dentro de los
aspectos a evaluar se deben incluir aquellos relacionados
con el comportamiento, mantencin, alimentacin y cui-
dado veterinario, elementos bsicos para la mantencin de
equinos en condiciones adecuadas (Endenburg 1999).
Las condiciones en que se mantienen los equinos es-
tabulados en relacin a su bienestar no han sido descritas
en Chile, por ello se plante como objetivo describir los
sistemas de estabulacin en relacin a la presencia de con-
diciones apropiadas para mantener un estado de bienestar
adecuado de los equinos.
MATERIAL Y MTODOS
ANIMALES
Se utilizaron 283 equinos, en su mayora destinados a
deporte, de diversas razas, pertenecientes a 14 criaderos
de la zona sur del pas, ubicados en las Provincias de
204
C MRQUEZ Y COL
Valdivia y Ranco, Regin de Los Ros, y en las Provincias
de Osorno y Chilo, Regin de Los Lagos.
EVALUACIN DE BIENESTAR ANIMAL
Se aplic el protocolo de evaluacin de bienestar
animal aplicado por Mrquez (2009), el cual contempla
indicadores directos e indirectos.
Indicadores directos: fueron utilizados el estado de salud
de los animales, incluyendo la condicin corporal, segn
la tabla de condicin corporal desarrollada por Henneke
(1985) y modificada por Naour (2003), clasificando la
condicin corporal en buena, regular o mala; presencia de
heridas y cicatrices, presencia de claudicaciones y lesiones
de cascos observables a la inspeccin del animal, tales
como: fisuras, desprendimiento de muralla e infecciones.
Adems, se observ la presencia de conductas anormales
como lignofagia, aerofagia con o sin fijacin, mal del oso,
sacudir la cabeza, patear la pesebrera y caminar estereo-
tipado, segn las descripciones entregadas por Tadich y
Araya (2010). Estos indicadores se evaluaron por inspec-
cin directa de los equinos dentro de sus pesebreras. En el
caso de los indicadores conductuales, estos se registraron
mediante el mtodo de escaneo focal, por el tiempo que
dur la visita al criadero, en promedio 4 horas, y se con-
trast con lo indicado por los respectivos cuidadores por
medio de encuesta.
Indicadores indirectos: fueron utilizados los programas de
manejo sanitario (vacunas y desparasitaciones), infraestruc-
tura de los establos (tamao, iluminacin y ventilacin),
manejo nutricional y alimenticio, tiempo de estabulacin
(horas por da), presencia y tipo de herraje, mtodo de
amansa utilizado (tradicional o racional) y capacitacin
del personal en manejo equino. Estos indicadores fueron
evaluados mediante observacin del establo y la aplicacin
de una encuesta en relacin a manejo, confeccionada para
los trabajadores de los criaderos que estaban en contacto
permanente con los equinos estabulados.
ANLISIS ESTADSTICO
Se utiliz estadstica descriptiva. Los resultados para las
distintas observaciones se expresaron en base a nmeros
totales y porcentajes.
RESULTADOS Y DISCUSIN
De la evaluacin de los 283 equinos incluidos en
este estudio se evidenci que un 88% de ellos obtuvo
una calificacin de condicin corporal buena; un 12%
una condicin corporal regular y no se observ ningn
animal con una calificacin de condicin corporal mala.
Esto contrasta con lo reportado por Naour (2003) y
Tadich y col (2008) quienes utilizaron la misma escala
de evaluacin de condicin corporal en equinos de tiro
liviano (carretoneros) encontrando 36% y 59% de los
equinos en condicin corporal buena y un 9% y 8% en
condicin corporal mala respectivamente. Las diferencias
con los estudios mencionados podran deberse a que los
dueos de caballos carretoneros son en general personas
de clase socioeconmica baja (Mac-Leod 1999), lo que
dificulta la mantencin de una buena condicin corporal
de los animales producto de la falta de recursos para
comprar alimentos de buena calidad para satisfacer sus
requerimientos nutricionales, los cuales probablemente se
pueden solventar en los equinos de deporte involucrados
en este estudio.
En cuanto a la presencia de heridas y cicatrices, se
observ un bajo porcentaje de lesiones, siendo stas de un
2,5% y un 8,8% respectivamente. Estos porcentajes son
inferiores al 27% de heridas y 50% de cicatrices encontra-
dos en equinos carretoneros por Tadich y col (2008). En
dicho estudio la mayora de las lesiones fueron provocadas
por los aperos, los cuales, tal como seala Hovell (1998),
causan lesiones producto de una pobre mantencin o uso
inapropiado; en cambio, los aperos utilizados en equinos
de deporte presentan mejores caractersticas de calidad y
ajuste de acuerdo a la funcin y necesidades particulares
del equino (Del Campo 2004).
La prevalencia de problemas de comportamiento en
este estudio fue de un 18,4%, teniendo en cuenta que al-
gunos equinos presentaban ms de un problema conductual
(cuadro 1). Este porcentaje es mayor al 10% reportado
en Chile para caballos chilenos por Muoz y col (2009)
y a resultados en otros pases, donde se han encontrado
prevalencias que van desde un 2,5% en Italia (Vecchiotti
y Galanti 1986) hasta un 15% en Canad (Luescher y
col 1991). La alta prevalencia de problemas de compor-
tamiento en el presente estudio se puede deber a que se
consider un mayor nmero de desrdenes conductuales
Cuadro 1. Distribucin de los problemas de comportamien-
to observados en los equinos estabulados de los criaderos
evaluados.
Distribution of the behavioural disorders observed in stabled
horses.
Problema conductual
Nmero
de equinos
Porcentaje
(%)
Masticar madera (lignofagia) 16 5,7
Patear la pesebrera 10 3,5
Aerofagia con o sin fijacin 8 2,8
Sacudir la cabeza 6 2,1
Mal del oso 9 3,2
Caminar estereotipado 1 0,4
Otro* 2 0,7
Ninguno 233 82,3
* Otro corresponde a morderse el labio continuamente y levantar la
cola continuamente.
205
EQUINOS, BIENESTAR, MANEJO, ESTABULACIN
que en los estudios mencionados, donde slo tomaron
en cuenta problemas como el mal del oso, aerofagia con
fijacin, caminar estereotipado y otros desrdenes como
lignofagia. La mayor presencia de problemas de com-
portamiento podra atribuirse a la cantidad de horas de
estabulacin continua a la que eran sometidos los equinos
en el presente estudio (cuadro 2), siendo ste un factor
de riesgo para la presentacin de conductas anormales
(Christie y col 2006).
El mal del oso, la aerofagia con fijacin y el ca-
minar estereotipado se presentaron en un porcentaje
levemente menor a los encontrados en otros estudios
(cuadro 1). Waters y col (2002) reportaron un 4,6%
de equinos con el mal del oso, un 2,3% con caminar
estereotipado y 10,5% aerofagia con fijacin. En tanto,
Christie y col (2004) registraron prevalencia para estos
comportamientos de un 4,8, 3,8 y 3,8% respectivamente.
Esto podra deberse a que, a pesar de su estabulacin
continua, todos los equinos tenan contacto entre ellos,
siendo principalmente este contacto de tipo visual y en
menor medida visual y tctil (cuadro 2), lo cual podra
disminuir la presentacin de problemas como el mal del
oso (McGreevy y col 1995).
En cuanto al manejo sanitario, los equinos de los
14 criaderos evaluados (100%) contaban con asistencia
veterinaria peridica, siendo esto superior a lo sealado
por Iturriaga (1998) en el pas, quien encontr que slo un
64,5% de los centros equinos en Chile contaba con asis-
tencia veterinaria peridica. La totalidad de los criaderos
realizaba tratamientos antiparasitarios a sus equinos en
forma peridica, con fechas predeterminadas sin basarse
en exmenes coprolgicos, en donde la mayor parte de
stos la realizaban cada tres meses (78,6%). Esta forma de
manejo puede afectar el bienestar animal de los equinos
debido a que produce resistencia de los parsitos hacia
los frmacos antihelmnticos, como se ha reportado en
el caso de los ciatostomas a los bencimidazoles (Herd y
Coles 1995), lo cual se ha reportado en equinos del sur
de Chile (von Witzendorff y col 2003).
La mayora de los criaderos utilizaban vacunas para
prevenir algunas enfermedades infecciosas (influenza
equina, rinoneumonitis y gurma); slo se encontr un
14,3% de criaderos que no aplicaban este mtodo pre-
ventivo. Esto se debe a que los dueos de los criaderos
en cuestin no han tenido problemas de esta naturaleza,
por lo cual no consideran necesario este manejo; aun as,
este porcentaje es menor al 22,6% reportado hace ya una
dcada por Iturriaga (1998).
En cuanto a la infraestructura, el 100% de los establos
contaba con ventilacin, dada principalmente por aperturas
en el techo y por ventanas, tal como recomienda Ensminger
(1973). Todos los criaderos tenan en sus establos luz
natural y luz artificial lo que, segn Retamales (1989),
es importante para evitar la sensacin de encierro en los
animales. Las caractersticas que presentaban las pesebreras
diferan entre los criaderos principalmente en tamao y
en algunos casos en el uso que se les daba, en relacin al
almacenamiento de alimento (cuadro 2).
Ms del 50% de los criaderos evaluados presentaba
pesebreras con dimensiones iguales o menores a 3 x 3
metros, siendo que esas son las dimensiones mnimas
recomendadas para equinos de alzadas menores a 1,42 m
(Webster y col 1987). A pesar de no haberse realizado una
clasificacin de los equinos segn su alzada, se estima
que la mayora de los animales involucrados en el estudio
era de una alzada mayor. La utilizacin de pesebreras de
tamaos menores a los recomendados limita el movimiento
y actividad de los equinos al interior de stas, provocan-
do as distrs en el animal, impidiendo que exhiban un
repertorio conductual adecuado y repercutiendo en la
posible aparicin de conductas estereotipadas (Broom y
Kennedy 1993).
La utilizacin de las pesebreras como lugar de almace-
namiento de alimento (cuadro 2) no es aconsejable, ya que
ste puede atraer roedores que transmiten enfermedades,
adems el heno en mal estado favorece la presentacin de
problemas respiratorios como la obstruccin recurrente de
las vas areas (Clarke 1987, Morn y col 2006).
En cuanto a la alimentacin y estabulacin, en el
cuadro 2 se observan algunos aspectos importantes que
se pueden relacionar con el bienestar de estos equinos.
En la mayora (57,1%) de los criaderos evaluados la
frecuencia de alimentacin ms usada era de dos veces/
da. Esta frecuencia resulta insuficiente y provoca una
reduccin importante de la conducta de forrajeo (Kiley-
Worthington 1987). Un bajo nmero de raciones repercute
negativamente en el sistema digestivo ya que facilita la
Cuadro 2. Caractersticas de la infraestructura y del manejo
equino durante la estabulacin.
Characteristics of the stables and husbandry practices used.
Caractersticas de
la estabulacin
Nmero Porcentaje
(%)
Tamao de
pesebreras (m)
2x5v3 2 14,2
3x3 6 42,9
3,5x3,5 6 42,9
Lugar de
almacenamiento
del alimento
Pesebreras 1 7,1
Bodega y pesebrera 3 21,4
Galpn o bodega 10 71,4
Frecuencia de
alimentacin
2 veces/da 8 57,1
3 veces/da 5 35,6
4 veces/da 1 7,1
Tiempo de estabu-
lacin
continua en el da
< 2 horas 1 7,1
2 - 4 horas 5 35,7
4 - 8 horas 6 42,9
> 8 horas 2 14,3
Contacto entre
equinos estabulados
Visual 11 78,6
Visual y tctil 3 21,4
206
C MRQUEZ Y COL
presentacin de lceras gstricas; stas como consecuencia
de una disminucin del pH gstrico, provocada por la
secrecin continua de cido clorhdrico que realizan los
equinos (Andrews y col 2005) y que, en estos casos, no
es amortiguado correctamente por la secrecin salival,
debido a los largos periodos de ayuno a los que son so-
metidos. Adems un reducido tiempo dedicado al forrajeo
podra causar frustracin alimenticia causando cambios
conductuales. Una frecuencia de alimentacin recomen-
dable es de cuatro veces al da, ya que un aumento en la
frecuencia previene la aparicin de conductas anormales
(Ninomiya y col 2004) y al mismo tiempo disminuyen la
probabilidad de aparicin de lceras gstricas, ya que la
entrega, cada seis horas, de forrajes ricos en fibras ayuda
a regular el pH estomacal (Andrews y col 2005) a travs
de una adecuada produccin de saliva.
En cuanto al tiempo de estabulacin, sobre el 50%
de los criaderos mantena a sus animales estabulados por
ms de cuatro horas continuas (cuadro 2), factor de riesgo
importante en la presentacin de problemas de comporta-
miento (Mills y col 2005).
La capacitacin del personal en diferentes mbitos
relacionados a los equinos se muestra en el cuadro 3. En
el caso de los herrajes la mayora de los criaderos contaba
con una persona capacitada para realizar este manejo. La
prctica del herraje es una actividad fundamental que requiere
conocimientos adecuados para realizarlo sin provocar daos
en el pie del equino y es indispensable que el herrador est
formado acadmicamente (Funtanillas 2004).
El 0,7% de los equinos presentaba algn tipo de claudi-
cacin y un 9,9% problemas a nivel de cascos, porcentajes
inferiores a lo reportado por Mac-Leod (1999) y Naour
(2003) en equinos carretoneros, quienes encontraron
13,5% y 10% de prevalencia de claudicaciones y 90,4%
y 93% de problemas en los cascos, respectivamente. Los
bajos porcentajes encontrados podran ser producto de
que la mayora de los criaderos (85,7%) contaba con
gente capacitada en herraje y el 100% de los criaderos
evaluados efectuaban despalme y cambio de herraje con
intervalos de cuatro a seis semanas, coincidiendo con lo
recomendado por la World Society for the Protection of
Animals (WSPA 2003).
La amansa de los caballos la efectuaba mayoritaria-
mente personal sin capacitacin en el tema (60%), lo que
podra afectar el bienestar de los equinos, ya que en general
stos utilizan la amansa tradicional (80%), la cual se basa
principalmente en el uso de castigos (Porte 1979), mientras
que slo un 20% practicaba amansa racional (cuadro 3),
basada en el comportamiento y refuerzo positivo del ca-
ballo (Muoz 2004).
La capacitacin del personal en el manejo equino y
bienestar animal demostr ser un aspecto que todava no
es considerado como elemento importante. Mejorar los
porcentajes de capacitacin, especialmente en el tema de
bienestar animal, podra mejorar las condiciones de los
equinos. Altamirano (2004) demostr cmo la capacitacin
de trabajadores con respecto a temas de manejo animal
result en mejoras en los indicadores de bienestar animal
en plantas faenadoras.
En general, la buena condicin corporal en que se
encontraban los equinos denota que existe preocupacin
por el cuidado de ellos. Sin embargo, la presencia de
problemas de comportamiento es un aspecto preocu-
pante. Una manera de enfrentar este aspecto es dar a
conocer los factores de riesgo y consecuencias de estos
desrdenes conductuales sobre la salud de los equinos.
Otros problemas que se encontraron se relacionan con
desconocimiento de las necesidades referentes a espacio,
conducta normal y frecuencia de alimentacin requerida
por los equinos, aspectos que pueden ser solucionados a
travs de capacitacin del personal que maneja de forma
directa a los equinos en los criaderos.
RESUMEN
La estabulacin de los equinos es una forma de manejo cotidiana,
principalmente en aquellos destinados a deporte, provocando modificaciones
conductuales debido al cambio desde un ambiente natural a uno
artificial, pudiendo afectar su bienestar. En Chile, las condiciones en
que se mantienen los equinos estabulados en relacin a su bienestar
no han sido descritas. El objetivo de este estudio fue describir algunas
de las condiciones de estabulacin de equinos y determinar si stas
son las requeridas para mantener un estado de bienestar adecuado. Se
evaluaron 283 equinos, de distintas razas, pertenecientes a 14 criaderos
del sur de Chile (Provincias de Valdivia, Ranco, Osorno y Chilo). Se
utilizaron mtodos directos e indirectos; stos consideraron aspectos de
Cuadro 3. Capacitacin del personal en distintos aspectos asociados al manejo equino.
Training of handlers in different aspects associated with equine management.
Capacitacin
Herraje Amansa* Manejo general Bienestar animal
N % N % N % N %
S 12 85,7 4 40 7 50 1 7,1
No 2 14,2 6 60 7 50 13 92,9
* Slo 10 de los criaderos evaluados realizaban la amansa.
207
EQUINOS, BIENESTAR, MANEJO, ESTABULACIN
salud, comportamiento, prcticas de manejo y capacitacin del personal.
El 88% de los equinos present buena condicin corporal, mientras
que pocos presentaron heridas (2,5%) y claudicaciones (0,7%). Todos
los criaderos se preocupaban de realizar manejo antiparasitario y la
mayora de vacunar contra enfermedades infecciosas. Las principales
falencias fueron la presencia de problemas conductuales (18,4%); la baja
frecuencia de la alimentacin de los equinos, tamao de las pesebreras
y la capacitacin del personal en el manejo equino, particularmente la
capacitacin en relacin al bienestar animal. En todos los criaderos existe
preocupacin por el cuidado de sus animales, sin embargo, la falta de
conocimiento en relacin a los problemas presentados es una situacin
que debera ser solucionada. La capacitacin del personal encargado del
manejo equino, en cuanto a comportamiento normal, sera un aporte para
mejorar el bienestar de estos animales.
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209
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COMUNICACIN
Aceptado: 12.05.2010.
* Calle 65 N 26-10, Manizales, Caldas, Colombia; carmona@ucaldas.
edu.co
Uso de concentrados autlogos de plaquetas como tratamiento de una fractura
escapular y una lesin del plexo braquial producidas por un disparo en un caballo
Use of autologous platelet concentrates as treatment for a scapular fracture
and brachial plexus nerve injury produced by a gunshot in a horse
C Lpez
a
, JU Carmona
a
, I Samudio
b
a
Grupo de Investigacin Terapia Regenerativa, Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, Caldas, Colombia.
b
Departamento de Nutricin y Bioqumica, Pontificia Universidad Javeriana, Bogot, Colombia.
SUMMARY
Gunshot injuries have been scarcely reported in horses. Close-range gunshots usually produce extensive soft tissue damage and comminute fractures.
A case of a comminute fracture of the neck of the scapula with acute injury of the brachial plexus produced by a 9 mm gunshot in a six year-old stallion
is described. The patient was successfully treated by combining surgical debridement of the affected region and local injection of several doses of
autologous platelet concentrates (APCs) and physiotherapy. Although scapular fractures and peripheral nerve damage take at least 18-24 months for
full recovery, this patient reached full recuperation of the affected limb in 9 months. These results suggest that injections of APCs in combination with
physiotherapy could provide a therapeutic benefit in the treatment of soft tissue acute injuries and bone fractures in horses.
Key words: equine, autologous platelet concentrate, wound treatment.
Palabras clave: equinos, concentrado autlogo de plaquetas, tratamiento heridas.
INTRODUCCIN
Las fracturas escapulares son poco frecuentes en
caballos, ya que este hueso est bien protegido por ms-
culos circundantes y situaciones traumticas inusuales
son necesarias para producir dao seo (Dyson 1986).
Las fracturas escapulares ms frecuentes son las de la
tuberosidad supraglenoidea (Pankowski y col 1986). Las
fracturas del cuello de la escpula representan un desafo
quirrgico puesto que los extremos fracturados estn des-
plazados y su aposicin completa es tcnicamente difcil,
por lo que en algunas circunstancias se han empleado
placas de compresin dinmica para tratar esta clase de
fracturas (Shamis y col 1989).
Usualmente, caballos con fracturas escapulares
tratadas de manera conservadora (administracin de
antiinflamatorios no esteroidales combinada con 3-4
meses de descanso en cuadra, seguido por un periodo
de 9-12 meses en pastura) o con ciruga requieren de un
tiempo de recuperacin entre 6-13 meses (Dyson 1986,
Shamis y col 1989, Vallance y col 2007). Las fracturas
escapulares, en especial del cuello, pueden estar acom-
paadas de lesin del nervio supraescapular (NSE) y
subsecuentemente producir atrofia por denervacin
de los msculos supra e infraespinoso (Dyson 1986,
Dutton y col 1999). Este sndrome clnico es llamado en
ingls sweeney (Schneider y col 1985). Normalmente,
las lesiones del NSE requieren entre 16-18 meses para
una completa recuperacin. Reportes tempranos han
indicado pronsticos favorables en caballos tratados de
manera conservadora (Dutton y col 1999) o por ciruga
(Schneider y col 1985).
Los concentrados autlogos de plaquetas (APCs)
se obtienen por centrifugacin de la sangre del mismo
paciente. Se define como el contenido en plaquetas en
forma de sobrenadante tras la centrifugacin de sangre
anticoagulada (Dugrillon y col 2002). Las plaquetas des-
empean un papel muy importante dentro de los APCs, ya
que constituyen la principal fuente de actividad mitgena
en el plasma sanguneo y funcionan como vehculo por-
tador de factores de crecimiento (GFs), principalmente
factor de crecimiento transformante (TGF-), factor
de crecimiento insulnico (IGF), factor de crecimiento
derivado de las plaquetas (PDGF) y de otras protenas
que modulan la inflamacin y la cicatrizacin (Carmona
y Prades 2009).
En este artculo se presenta un caso de fractura con-
minuta del cuello de la escpula acompaada de lesin
del NSE y compromiso moderado del plexo braquial
producido por un balazo 9 mm (M882 NATO) a un caba-
llo, el cual fue tratado exitosamente con APCs obtenidos
mediante el mtodo del tubo (Argelles y col 2006) y
fisioterapia.
210
C LPEZ Y COL
MATERIAL Y MTODOS
DESCRIPCIN DEL CASO CLNICO
Un caballo criollo colombiano, intacto, con seis aos de
edad y 330 kg fue referido para evaluacin de una herida
de bala producida accidentalmente por su propietario en el
miembro anterior derecho (MAD), mientras era montado.
El accidente haba ocurrido tres horas antes con una pistola
automtica (Jericho 941, IMI, Israel) que disparaba cartuchos
9 mm NATO. Durante el ingreso el paciente presentaba tem-
peratura, pulso y frecuencia respiratoria dentro de los lmites
normales. Sin embargo, el caballo presentaba cojera grado
5/5 del MAD mientras caminaba. Durante el examen fsico
se detect tumefaccin dolorosa sobre la regin escapulo-
humeral derecha con una pequea herida (puntura) en la
parte proximodorsal al nivel del borde dorsal de la escpula.
En ese momento, la manipulacin del miembro afectado no
revel la presencia de crepitacin o inestabilidad.
RESULTADOS Y DISCUSIN
EVALUACIN ECOGRFICA
Se realiz evaluacin ecogrfica (Falcovet, Esoate,
Genova, Italia) con un transductor convexo a una frecuencia
Figura 1. Ecografas de las porciones proximal (A) y central (B) del msculo infraespinoso derecho del paciente. A) La sonda ecogr-
fica est ubicada sobre la entrada de la bala. Observe el edema subcutneo y la trayectoria de la bala (flechas) con disrupcin muscular
mnima. B) La sonda ecogrfica se encuentra 3 cm distal a la herida de entrada. Note la ecogenicidad anormal con maceracin, disrup-
cin y hematoma muscular.
Ultrasonographies of the proximal (A) and central (B) portions of the infraspinatus muscle of the patients report. A) The ultrasound probe
is just over the entry of the gunshot. Note the oedema of the subcutaneous tissue and the initial trajectory of the missile (arrows) with minimal disruption
of the muscle. B) The ultrasound probe is just 3 cm distal to the entry wound. Note the abnormal echogenicity with fibre disruption and maceration and
hematoma of the muscle.
de 3,5-5 mHz, para seguir la direccin de la bala y de-
terminar la severidad y compromiso de las estructuras
lesionadas por el disparo. Se not edema subcutneo y
disrupcin de las fibras del msculo infraespinoso derecho.
La regin central del msculo presentaba ecogenicidad
anormal con dao de fibras, maceracin y hematoma
(figura 1A y B). La trayectoria del disparo segua una
direccin de lateral hacia medial. Inicialmente, no fue
posible encontrar el proyectil debido a la gran tumefac-
cin que limitaba la capacidad tcnica de la sonda de
ultrasonido.
EVALUACIN RADIOGRFICA Y CIRUGA
El caballo fue sedado con xilacina (0,5 mg/kg, IV) y
morfina (0,1 mg/kg, IV). La anestesia fue inducida con
guayacolato de glicerilo al 5% (dosis efecto) y ketamina
(2,2 mg/kg, IV) y mantenida con isofluorano al 2,5%,
para estudio radiogrfico y desbridamiento quirrgico de
los tejidos comprometidos. Se tomaron radiografas del
hombro derecho para determinar la posicin exacta del
proyectil y la extensin del dao seo. La inflamacin
del hombro y brazo era tan severa que afect la obtencin
de radiografas de buena calidad y limit la colocacin
adecuada de los casetes, para poder analizar la regin
inmediatamente superior a la articulacin escapulohumeral
211
EQUINOS, CONCENTRADO AUTLOGO DE PLAQUETAS, TRATAMIENTO HERIDAS
derecha. Sin embargo, las radiografas evidenciaron inte-
gridad del hmero sin compromiso de la articulacin del
hombro, aunque no se pudo detectar la silueta radiopaca
del proyectil en esa regin.
Se realiz una incisin de 20 cm sobre la espina de la
escpula que segua la direccin del disparo. Se eliminaron
las fibras musculares necrticas y el hematoma del ms-
culo infraespinoso. Sin embargo, la trayectoria de la bala
era difcil de seguir y se opt por realizar lavado copioso
(a presin) del tracto restante de la herida y as evitar un
posible dao iatrognico. No se tom muestra para cultivo
y sensibilidad bacteriana. Se dej un drenaje de Penrose
durante 72 horas, el cual emerga de la regin ms distal
de la incisin y estaba ubicado dentro de la zona de espacio
muerto ocasionada por la ciruga en el msculo infraespi-
noso. El caballo fue asistido por varios operarios durante
la recuperacin anestsica y recibi penicilina G cristalina
(22.000 IU/kg/IV/q.u.i.d), sulfato de gentamicina (6,6 mg/
kg/IV/s.id.) y fenilbutazona (2,2 mg/kg/IV/b.i.d) durante 10
das. Al tercer da postoperatorio, se apreci disminucin
de la tumefaccin del hombro con atrofia progresiva de los
msculos supra e infraespinoso, trceps, deltoides, pectoral
y extensor lateral, acompaada con desplazamiento lateral
(abduccin) del MAD. Sin embargo, el paciente poda
apoyar levemente la extremidad contra el piso. En esa oca-
sin, la manipulacin del MAD evidenci crepitacin en
la regin del hombro. La ecografa mostr que el proyectil
haba producido intenso dao muscular de la porcin distal
del msculo infraespinoso y del deltoides. El cuello de la
escpula mostr interrupcin de la lnea hiperecoica de su
superficie y mltiples fragmentos seos con hematoma pe-
rilesional (figura 2A). Un artefacto hiperecoico con silueta
de bala fue detectado cerca al foco de fractura (figura 2B).
La bala no fue extrada para no producir ms dao muscular.
Con base en la historia, los hallazgos del examen clnico,
ciruga y pruebas complementarias se diagnostic fractura
conminuta del cuello de la escpula con lesin del nervio
SEC y afectacin moderada del plexo braquial secundarios
a impacto de bala.
TRATAMIENTO CON CONCENTRADOS
AUTLOGOS DE PLAQUETAS
El foco de fractura (cuello de la escpula) y los tejidos
blandos comprometidos por el balazo (msculos supra
e infraespinoso, trceps y deltoides) fueron tratados con
inyecciones de APCs obtenidos mediante el mtodo del
tubo por doble centrifugacin (Argelles y col 2006,
Carmona y col 2009, Carmona y Prades 2009). Se realiz
una inyeccin ecoguiada con una aguja espinal N 18G
y se depositaron 30 mL de APC activados con 3 mL de
gluconato de calcio al 10%. Este protocolo se realiz
tres veces, con un intervalo de dos semanas entre aplica-
cin. Adicionalmente, se realiz estimulacin elctrica
Figura 2. Ecografas del hombro derecho del paciente tres das despus de la herida de bala. A) Note que el cuello de la escpula pre-
senta interrupcin de la lnea hiperecoica del hueso con esquirlas seas y hematoma perilesional. B) Observe un artefacto hiperecoico
con forma de bala cercano al foco de fractura (flechas).
Shoulder ultrasonographies of the patients report at the third postoperative day. A). Note that the neck of the scapula presented interruption
of the hyperechoic line of the bone with multiple bone fragments and perilesional hematoma. B) Note a hyperechoic like-bullet shaped artefact near to
fracture foci (arrows).
212
C LPEZ Y COL
transcutnea nerviosa (TENS) a cada msculo atrofiado a
una frecuencia de 60 mHz y una duracin de 300 s/pulso
durante 15-30 min. Esta terapia fue realizada cinco veces/
semana, durante dos meses.
RESULTADOS Y DISCUSIN
EVOLUCIN CLNICA
Un mes despus, el caballo present reduccin de su
grado de cojera (3/5) y desaparicin de la crepitacin. La
ecografa revel mejora de la apariencia de la arquitectura
de las estructuras seas y musculares comprometidas. Sin
embargo, el paciente presentaba un acortamiento aparente
(~5 mm) del MAD respecto al miembro contralateral.
El caballo fue dado de alta un mes y medio despus del
balazo y permaneci bajo confinamiento en cuadra durante
un mes, seguido por descanso en un pequeo corral por
dos meses. El siguiente mes comenz a recibir paseos
de la mano de 15 min, dos veces al da. En ese momento
presentaba disminucin de su grado de cojera a 2/5, pero
an presentaba atrofia de los msculos de la regin del
hombro del MAD, aunque el grado de abduccin haba
disminuido notablemente. El caballo fue manejado con un
programa gradual de ejercicio controlado y se recuper
completamente a los nueve meses postlesin (figura 3).
Para ese tiempo, el paciente presentaba un grado de cojera
de 0,5/5, quizs asociada a un componente mecnico como
consecuencia del acortamiento del MAD. Para mejorar esa
situacin se realiz un herraje correctivo con una plantilla
de cuero de un espesor 5 mm entre la herradura y el casco
comprometido. Actualmente, el caballo entrena dos horas,
cuatro veces por semana y realiza paseos al trote de seis
horas, dos veces por mes, y no ha manifestado complica-
ciones adicionales.
Desafortunadamente, el uso indiscriminado de poderosas
armas de fuego por parte de civiles ha producido muerte
o lesiones severas a personas (Richmond y col 2005) y
animales (Mellish y Andreani 2008), tal como es reportado
en este caso. En caballos, se han documentado lesiones
producidas por disparos, bien sean inducidas accidentalmente
o producidas por violencia (Vatistas y col 1995, Mellish
y Andreani 2008). Vatistas y col (1995) documentaron un
disparo accidental que afect la regin del hombro en un
caballo. El paciente de ese reporte haba sido herido con
un cartucho calibre 22 de baja velocidad (< 305 m/s (Farjo
y Miclau 1997)) mientras era montado por su propietario.
El caballo de este reporte sufri el accidente de la misma
manera, aunque fue producido por un proyectil 9 mm de
velocidad intermedia (330-610 m/s (Farjo y Miclau 1997))
con alto poder destructivo.
Frecuentemente, los disparos efectuados a corta dis-
tancia (a quemarropa) producen dao extenso de tejidos
blandos y fracturas conminutas (Farjo y Miclau 1997, Oku
y Aktug lu 2005). En personas, lesiones de las extremidades
superiores producidas por disparos a corta distancia estn
asociadas con inestabilidad esqueltica y dao de tejidos
blandos y resultan en morbilidad significativa, prolongados
periodos de incapacidad funcional y hospitalizacin (Oku
y Aktuglu 2005). El caso presentado en este reporte fue
Figura 3. Evolucin clnica comparativa del grado de atrofia muscular del miembro anterior derecho (afectado) al tercer (A), quinto
(B) y noveno (C) meses postlesin. Note la completa resolucin de la atrofia muscular en este caballo.
Comparative clinical evolution of the degree of muscular atrophy of the right (affected) forelimb at the third (A), ninth (B) and eleventh
(C) postinjury months. Note the complete resolution of the muscular atrophy in this horse.
213
EQUINOS, CONCENTRADO AUTLOGO DE PLAQUETAS, TRATAMIENTO HERIDAS
producido por un disparo a quemarropa con un proyectil
9 mm. La complejidad de las lesiones producidas por este
disparo hace de este caso nico en la literatura, ya que
normalmente caballos con fracturas de huesos largos oca-
sionados por disparos tienen mal pronstico y normalmente
son sometidos a eutanasia (Vatistas y col 1995).
La extensin del dao producido por el proyectil en el
caballo de este reporte fue ms severa que el caso reportado
por Mellish y Andreani (2008), quienes documentaron
en una yegua una lesin de bala con dao de la muscula-
tura del trceps derecho, posiblemente producida por un
proyectil de alta velocidad (> 610 m/s (Farjo y Miclau
1997)). En contraste, el caballo de este reporte sufri dao
muscular grave, dao nervioso parcial del plexo braquial
con afectacin de los nervios supraescapular, axilar, radial
y torcicos (Levine y col 2007) y fractura conminuta del
cuello de la escpula.
Las lesiones del plexo braquial son poco comunes en
caballos, aunque se han descrito lesiones del NSE y del
nervio radial (Reed 2008). No existen reportes previos
sobre lesiones del plexo braquial producidas por heridas de
bala en caballos. En personas se ha visto que las heridas de
bala pueden ser la causa del 12-18% de lesiones del plexo
braquial (Kim y col 2004). Normalmente, el 40% de esta
clase de lesiones se recupera de manera espontnea sin
necesidad de ciruga, sobre todo cuando son producidas
por proyectiles de baja velocidad (Kim y col 2004). Sin
embargo, cuando las lesiones nerviosas son producidas
por proyectiles de alta velocidad o por disparos a corta
distancia son ms graves, ya que los nervios son daados
no slo por el impacto directo, sino tambin por la onda del
impacto y los efectos de cavitacin (Farjo y Miclau 1997,
Kim y col 2004). Los nervios lesionados por disparos de
alta velocidad o a quemarropa tienen poca probabilidad de
recuperar su funcin. Pacientes que no presentan signos de
recuperacin dentro de los primeros 2-4 meses siguientes
a la lesin deberan ser tratados quirrgicamente (Kim y
col 2004). Es posible que el paciente de este reporte nica-
mente haya sufrido de neuropraxia de algunas estructuras
del plexo braquial (Levine y col 2007), aunque no se sabe
cmo pudo haber evolucionado sin el uso de los APCs.
La herida de bala de este reporte fue inicialmente ma-
nejada con desbridaje muscular agresivo, lavado copioso
y con terapia antiinflamatoria y antibitica, tal como ha
sido previamente recomendado para seres humanos (Rhee
y Martin 1997, Oku y Aktug lu 2005) y caballos (Vatistas
y col 1995, Mellish y Andreani 2008). Adems, las inyec-
ciones de APCs y la fisioterapia (TENS y el programa de
ejercicio controlado) fueron empleadas con la meta de
mejorar el pronstico general de este paciente.
El tratamiento con los APCs fue realizado para acelerar
la regeneracin (Carmona y col 2009, Carmona y Prades
2009) de los tejidos afectados: msculo, hueso y nervio
(Mariconda y col 2008, Simman y col 2008, Mishra y
col 2009). Se ha demostrado que los APCs son tiles para el
tratamiento de afecciones crnicas del aparato locomotor en
caballos (Carmona y col 2009, Carmona y Prades 2009) y
existe informacin bsica (Mariconda y col 2008, Simman
y col 2008) y clnica (Mishra y col 2009) que valida el
empleo de APCs en lesiones agudas de tejidos blandos
y en fracturas seas (Mariconda y col 2008, Simman y
col 2008, Elgazzar y col 2008).
Otro importante efecto benfico del APC es su poderoso
efecto antibacteriano (Bielecki y col 2008). Normalmente,
un proyectil no es esterilizado por el fuego del disparo y
puede transportar bacterias viables dentro de la herida. La
flora bacteriana de una herida de bala cambia con el tiempo,
pero las especies que inicialmente causan infeccin son
por lo regular biota de la piel (Bowyer y Rossiter 1997).
Bielecki y col (2007) encontraron que el gel de plaquetas
humano presentaba efecto antibacteriano in vitro contra
Staphylococcus aureus y Escherichia coli. De esta manera
los APCs podran ser usados como una terapia adjunta
para manejar heridas de bala infectas en combinacin con
antibiticos. Aunque la TENS y los programas de ejercicio
controlado son ampliamente usados en clnica equina,
no existen estudios clnicos controlados que soporten
de manera contundente su uso en caballos (Buchner y
Schildboeck 2006). En el paciente de este reporte se ob-
serv que la utilizacin de APCs combinados con TENS
disminuyeron el grado de dolor y permitieron una rpida
introduccin del paciente a programa de rehabilitacin con
ejercicio teraputico. Tambin los resultados de este reporte
sugieren que el tratamiento con APCs puede facilitar el
proceso regenerativo en hueso, msculo y nervio y que
la TENS podra tener un efecto teraputico sinrgico en
combinacin con los APCs.
Los resultados clnicos observados en este paciente
fueron espectaculares y esperanzadores. Los registros
clnicos asociados con cada uno de los problemas del
paciente de este reporte, tales como fractura escapular,
trauma muscular y dao del NSE, toman al menos 18-24
meses para alcanzar la recuperacin completa en la mayora
de los casos en cada lesin (Schneider y col 1985, Dyson
1986, Pankowski y col 1986, Shamis y col 1989, Dutton y
col 1999, Vallance y col 2007). El paciente de este reporte
alcanz recuperacin completa de la extremidad afectada
en tan slo nueve meses. Estos resultados soportan el uso
de inyecciones APCs y TENS (cuando es posible) para
mejorar la cicatrizacin de lesiones agudas de tejidos
blandos y fracturas seas en caballos.
RESUMEN
Las heridas de bala han sido escasamente descritas en caballos. Los
disparos a corta distancia suelen producir daos en tejidos blandos y
fracturas conminutas. Un caso de una fractura conminuta del cuello de
la escpula con lesin aguda del plexo braquial producida por una bala
de 9 mm en un semental de seis aos de edad es descrito. El paciente fue
tratado con xito mediante la combinacin de desbridamiento quirrgico
de la regin afectada e inyeccin local de varias dosis de concentrados
autlogos de plaquetas (APC) y fisioterapia. A pesar de la fractura de
la escpula y del dao en los nervios perifricos que toman al menos
18-24 meses para una recuperacin completa, este paciente se recuper
214
C LPEZ Y COL
satisfactoriamente en nueve meses. Estos resultados sugieren que las
inyecciones de APC en combinacin con fisioterapia pueden proporcionar
un beneficio teraputico en el tratamiento de lesiones agudas de tejidos
blandos y fracturas seas en caballos.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a Dairo E. Gmez, MVZ, Alejandro Lpez
y a su caballo Consentido.
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215
Arch Med Vet 42, 215-219 (2010)
COMMUNICATION
Accepted: 16.06.2010.
* *Casilla 567, Valdivia, Chile; javierojeda@uach.cl
Canine perianal furunculosis and interdigital lesions:
Probable systemic lupus erythematosus
Descripcin clnico-patolgica de fstulas perianales y dermatitis interdigital
en un perro como posible diagnstico de lupus eritematoso sistmico
J Ojeda
a*
, M Moroni
b
, E Paredes
b
, MA Vidal
c
, CD Figueroa
c
, M Concha
c
a
Instituto de Ciencias Clnicas Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Chile.
b
Instituto de Patologa Animal, Universidad Austral de Chile, Chile.
c
Instituto de Anatoma, Histologa y Patologa, Universidad Austral de Chile, Chile.
RESUMEN
La clasificacin de los signos clnicos del lupus eritematoso sistmico de acuerdo a su importancia en mayor o menor grado ha permitido orientar
hacia un diagnstico definitivo confirmado con la utilizacin de tcnicas serolgicas e inmunohistoqumicas. Un perro de raza Pastor alemn de cinco
aos de edad se present en el Hospital Veterinario de la Universidad Austral con una historia clnica de fstulas perianales y lesiones interdigitales
en sus cuatro miembros, persistentes durante tres meses, que fue tratado con antibiticos. Los signos clnicos observados fueron alopecia, eritema,
despigmentacin, ulceracin, excesiva presencia de tejido de granulacin y dolor en la zona perianal e interdigital de los cuatro miembros. Adems,
present aumento de volumen en las articulaciones carpales y tarsales manifestando dolor en movimientos de flexin y extensin. Por medio de biopsias
de zonas interdigitales y perianales tanto de reas lesionadas como sanas, se realiz un anlisis histopatolgico. El examen mostr una separacin
parcial de la unin dermoepidrmica, presencia de detritus celulares, vacuolizacin de las clulas epidrmicas basales, abundante infiltrado histioctico y
linfoplasmoctico en la dermis con acumulo de eosinfilos en los vasos sanguneos. Con tincin PAS se pudo observar una membrana basal discontinua
y engrosada tanto en la piel sana como daada. Adems, los anlisis inmunohistoqumicos mostraron reaccin en la unin dermoepidrmica a IgM,
IgA y C
3
, pero no hubo reaccin para IgG. Analizando los antecedentes clnicos, histopatolgicos e inmunohistoqumicos se sugiere que el presente
reporte es un caso de lupus eritematoso sistmico.
Key words: systemic lupus erythematosus, perianal furunculosis, autoimmune diseases.
Palabras clave: lupus eritematoso sistmico, furunculosis perianal, enfermedades autoinmunes.
INTRODUCTION
Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoim-
mune disease characterized by the production of a variety
of autoantibodies (antinuclear antibodies, rheumatoid
factor, antiphospholipid antibodies) which react against
their own cellular antigens and also form immune com-
plexes (IC) in circulating blood (Medlea and Hnilica
2006). The underlying cause of this loss of self- toler-
ance is unknown. In SLE IgM and IgG autoantibodies fix
complement producing a direct cytotoxic effect or render
cells susceptible to phagocytosis. Autoantibodies may
also bind to platelets or red blood cells, explaining the
immune-mediated anemia and thrombocytopenia found
in SLE. IC are deposited in different tissues such as the
vascular endothelium, glomeruli, synovial membranes and
articular capsule, as well as the basal membrane of the
epidermis (Scott et al 2003). The fixation of complement
by IC is a central step in the pathogenesis of the tissue
injury observed in SLE. Complement activation induces
anaphylatoxin generation and neutrophil infiltration. The
latter produces phagocytosis of IC, and release of lysosomal
enzymes and free radicals. IC also lead to aggregation of
platelets and activation of Hageman factor which in turn
contribute to the inflammatory process, local ischemia
and necrosis (Abbas 2005, Thurman and Holers 2006).
SLE is rare in cats and not very common in dogs, except
for the German shepherd and Collie breeds which seem
to be predisposed to this condition (Medlea and Hnilica
2006). The disease has shown a much higher prevalence in
certain research kennels, higher than can be accounted for
by genetics. In fact, the disease has been linked to certain
class I major histocompatibility complex molecules in a
line of German Shepherds (Teichner et al 1990). It has
been suggested that environmental influences may also
play a role as the disease is aggravated by exposure to
216
J OJEDA ET AL
sunlight in both dogs and humans. Several studies have
also linked the onset of SLE to transmissible factors such
as viruses, parasites or other infectious agents (Berent
and Cerundolo 2005, Menke et al 2008).
MATERIAL AND METHODS
Clinical history: A 5-year old German shepherd dog,
weighing 35 kg, was presented to the Veterinary Hospital
of the Universidad Austral de Chile with a history of
perianal fistulas (figure 1a) and interdigital dermatitis
(figure 1b) diagnosed 2 months previously based on
clinical examination. The dog was initially treated with
amoxi clavulanic acid at a dose of 20 mg/kg/12 hours and
2% topical chlorhexidine every 12 hours during 15 days
without showing any clinical improvement.
Clinical examination: The initial clinical examination
revealed painful perianal fistulas and serous discharge,
the interdigital zones of the four limbs demonstrated
alopecia, erythema, depigmentation, ulceration, serous
discharge and granulation tissue. Moreover, it was evi-
dent that an increased volume of the carpal and tarsal
articulations were causing a plantigrade footstep, and
pain after forced flexion/extension evaluation (figure 1b).
The hematology exam showed a normocytic macrocytic
anemia (27% PCV) with slight regeneration and eosino-
philia (2.8 mil/L), while biochemical values (ALT:
55U/L, Creatinine: 87 mol/L, GGT: 2U/L, Alkaline
fosfatase: 159 U/L, Uremia: 2.65 mmol/L) and urine
analysis were normal.
Histological studies: Skin biopsies of the perianal and
interdigital areas were performed under general anes-
thesia. All biopsies were taken from affected skin and
included a 1 cm margin of healthy looking skin. The
biopsies were placed in 10% neutral buffered formalin,
embedded in paraffin, sectioned at 4 m and stained with
hematoxylin-eosin and Peryodic acid Schiff (PAS) for
evaluation by light microscopy. The immunohistochemical
characterization was performed using an antigen retrieval
method (Pea-Mnzenmayer et al 2005). In brief, tissue
sections were incubated in buffer citrate-HCl pH 6.0 at
90C in a microwave. Next, the sections were treated with
3% hydrogen peroxide for 15 minutes to inhibit endogen
peroxidases. Then, the tissue sections were washed with
phosphate-buffered saline and incubated consecutively
with: polyclonal antibodies anti-IgG (P01214, DAKO,
Carpintera, CA, USA), anti-IgM (P01215, DAKO), anti-IgA
(P01216, DAKO) or anti-C
3
(Q0368, DAKO) biotinylated
secondary antibody, and then with streptavidin-peroxidase
complex (Kit LSAB Plus, DAKO). Peroxidases were
revealed with diaminobenzidine. The preparations were
counterstained with hematoxylin. The controls included
omission of the first antibodies and their substitution by
non-immune mouse or rabbit IgG.
RESULTS AND DISCUSSION
The histopathology exam revealed zones with epider-
mal erosions, moderate vacuolization of epidermal basal
cells, partial separation of the epidermodermal junction
and cellular debris (figure 1c). An abundant histiocytic
and lymphoplasmacytic infiltrate was detected under the
epidermis, extending between the hair follicles and reach-
ing the deep zone of the dermis (figure 1d). Aggregates of
eosinophils were evident in blood vessels. In the affected
skin, the epidermis, epidermodermal junction and papil-
lary dermis revealed immunoreactivity for IgM and C
3
(figure 2a). The dermis in healthy skin also showed deposits
of IgM, C
3
and in a minor degree IgA (figure 2b). Both
affected and healthy skin failed to reveal immunoreactivity
to IgG. In addition, PAS method revealed a loss of basal
membrane in injuried skin with areas of partial thickening
in both affected and non-affected skin (figure 2d).
The clinical and morphologic features of this condition
suggested an immunological base for the lesions and the
following therapy was carried out: i) prednisone 2 mg/kg
once a day during 15 days, which was gradually tapered
every 7 days until reaching a dose of 0.25 mg/kg prescribed
for the length of the dogs life; ii) ranitidine at 2 mg/kg
once a day during 15 days; iii) cephalexine administered at
20 mg/kg every 12 hours during 10 days. Improvement of
the perianal and interdigital lesions was apparent after 30
days of treatment without relapse. The immunosuppressor
therapy was instituted as is usually prescribed for lupus
and perianal furunculosis, and cases in which histopathol-
ogy results support an immune-mediated process (Fournel
et al 1992, Scott et al 2003, Doust et al 2005, Patterson
and Camphell 2005).
Canine anal furunculosis is a chronic, painful, pro-
gressive inflammatory and ulcerative disease suspected
to be immunomediated (Patterson and Campbell 2005).
Moreover, the general histopathological examination,
including interdigital lesions, corresponds to interface
dermatitis. These histological features are characterized
by an inflammatory infiltrate that abuts or obscures the
dermoepidermal junction, similar to those observed in
other immuned-mediated conditions such as discoid lupus
erythematosus, systemic lupus erythematosus, fixed ery-
thema, toxic epidermal necrolysis, dermatomyositis and
erythema multiforme (Crowson and Magro 2001). In the
present case the clinical signs, the results of histopathology
and immunohistochemistry exams suggested a diagnosis
compatible with SLE.
SLE is an autoimmune multisystem disease of pro-
tein manifestations with non-specific clinical signs. The
guidelines of the American College of Rheumatology are
valuable in establishing the diagnosis (Tan et al 1982).
Based on this protocol, Berent and Cerundolo (2005)
proposed SLE diagnosis based on the presence of certain
signs classified as major and minor signs. The classifica-
tion of signs from major (e.g. skin lesion, polyarthritis,
217
SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS, PERIANAL FURUNCULOSIS, AUTOIMMUNE DISEASES
Figure 2. a) Immunoreactivity for C
3
complement in dermoepidermal junction in skin with erosion. b) Dermic IgM deposits in unin-
volved skin. c) Immunohistochemical control in damaged skin incubated with mouse non immune IgG. d) Moderate thickening of the
basement membrane (arrows) in uninvolved skin, PAS reaction. (a-d, counterstained with hematoxylin; bar: a-c, 100 m; d, 60 m).
a) Se observa inmunorreaccin para fraccin del complemento C
3
presente en unin dermoepidrmica de piel lesionada. b) Inmunorreac-
cin de IgM en piel no lesionada. c) Control realizado con IgG de ratn en piel lesionada. d) Tincin PAS demuestra moderado engrosamiento de la
membrana basal (flechas) en piel no lesionada. (a-d, contratincin realizada con hematoxilina; barra: a-c, 100 m; d, 60 m).
Figure 1. Interdigital (a) and perianal (b) lesions demonstrating alopecia, erythema and skin erosions. Hematoxylin eosin stain showed
a dermoepidermal separation in lesional skin (c). Vacuolization of epidermal basal cells, abundant dermal histiocytic and lymphoplas-
macytic infiltrate (d) Bar 60 m.
Lesiones alopcicas y eritema sobre la piel de las zonas interdigital (a) y perianal (b). Tincin de hematoxilina eosina muestra a la separa-
cin de la unin dermoepidermal en piel afectada por lesiones (c). Vacuolizacin de las clulas basales de la epidermis, la dermis presenta abundante
infiltrado histioctico y linfoplasmoctico (d). Bar 60 m.
218
J OJEDA ET AL
hemolytic anemia, glomerulonephritis, polymyositis, leu-
copenia, thrombocytopenia) to minor (e.g. fever of unknown
origin, CNS signs, oral ulceration, lymphadenopathy) are
good guides to establish a diagnosis. This classification
is useful, and when applied in conjunction with serologi-
cal and immunohistochemical tests, can lead to a more
accurate diagnosis (Patterson and Campbell 2005, Smee
et al 2007). Skin damage is classified among the major
signs and they mean about 15% of the lesions under the
suspicion of SLE (Smee et al 2007). Thus, signs observed
in the present case such as anemia, polyarthritis and skin
lesions at interdigital and perianal zones are classified as
major signs of SLE.
In the present study we used immunoperoxidase tech-
niques to demonstrate the presence of IgM and C3 at the
epidermodermal junction in involved skin (Choi et al 2004)
and IgA in uninvolved skin. The lupus band test showing
IgM or IgA deposits at the basal membrane has been par-
ticularly important for the diagnosis of lupus erythematosus
in humans. In addition, experimental models of systemic
lupus erythematosus have demonstrated the presence of
IgM and C3 at the dermoepidermal junction in damaged
and non-damaged skin (Choi et al 2004). However, the im-
munoglulin deposition does not necessarily correlate with
cutaneous lesions their prevalence in SLE is high. A wide
array of autoantibodies are produced in SLE, therefore,
searching particularly for antinuclear antibodies (ANA)
is an important diagnostic tool. Since other major signs
of SLE had been documented (i.e. polyarthritis, immuno-
mediated anemia) in this reported case, the use of ANA
would not have been as essential to support a diagnosis
of SLE. In this case, the lack of a positive ANA and/ or
the major signs of SLE (in addition to the skin lesions)
make the final diagnosis of SLE impossible. Thus only
a probable diagnosis of SLE can be made. Some authors
emphasize that the test for ANA is effective only when
there are at least 2 major signs (Smee et al 2007) because
the presence of ANA may be associated with SLE-related
diseases (Hansson-Hamlin et al 2006). The relevance of
the ANA test for SLE in dogs has often been questioned
due to the presence of these antibodies in several bacterial,
protozoan and tick-borne pathogens (Gershwin 2007).
Histopathological evidence, antibody deposits for IgM,
IgA and C3 and PAS analysis of epidermodermal junction
help to support the final clinical diagnosis as an SLE case
(Zipfel et al 1992, Jones 1993, Gerhauser et al 2006).
Dogs with articular, muscle inflammation and cutane-
ous lupus manifestations improve after immunesupression
treatment and may have a long term remission of clinical
signs. Standard treatment for SLE with prednisone has
been adequate to reach remission in the first week of treat-
ment (Scott et al 2003). Nevertheless, many dogs do not
improve with prednisone treatment and ciclosfosfamide
or azathioprine may be needed. Azathioprine combined
with prednisone is a safe and potentially effective regimen
treatment of SLE (Berent and Cerundolo 2005, Medlea
and Hnilica 2006).
Discoid lupus erythematosus could be associated to a
clinical history of anal furunculosis or perianal dermatitis
(Gerhauser et al 2006). However, hematological findings,
interdigital wounds, carpal arthritis and tarsal arthritis
discard this differential diagnosis.
Some authors have proposed a similarity between canine
anal furunculosis and Crohns disease. In humans, this ill-
ness is the result of an imbalance of the immune response
in the intestines in genetically susceptible individuals
(Ahmad 2002, Newman and Siminovitch 2005). Since
German shepherd dogs with anal furunculosis also have
clinical and histological evidence of colitis (i.e. inflam-
matory bowel disease), it has been suggested that enteral
antigens could be a trigger forcanine anal furunculosis as
well (Patterson and Campbell 2005). It has been speculated
that immune complexes can damage perianal mucosa and
subsequently induce furunculosis in SLE.
In conclusion, this was a case of chronic, erosive,
and painful interdigital and perianal lesions with clinical
characteristics of perianal fistula, developed in a German
shepherd dog, and the histopathological and immunohis-
tochemistry features were compatible with a diagnosis of
SLE. Perianal lesions observed in this case represent an
uncommon pattern of SLE. A complete study, including
testing for circulanting antibodies in perianal dermatitis,
can be useful in leading to an accurate diagnosis and treat-
ment when there is suspicion of SLE, in orden to avoid
the onset of other signs.
SUMMARY
The clinical signs of systemic lupus erythematosus (SLE) are not
specific. The classification of signs according to their diagnostic importance
from major to minor signs has proved to be useful, and when employed
together with serological and immunohistochemical tests can lead to an
accurrate diagnosis. Skin lesions are classified among the major signs
corresponding to about 15% of lesions under the suspicion of SLE in
dogs. A 5-year old German shepherd dog that was presented to clinical
examination had developed perianal fistulas and infectious interdigital
dermatitis. The dog was treated with antibiotics for 3 months and did
not improve. Clinical signs included skin changes: alopecia, erythema,
depigmentation, pain, ulceration and granulation tissue in the perianal
zone and limbs, and articular changes: carpal and tarsal joint effusion and
pain during the evaluation of forced flexion/extension. Histopathology
from perianal and interdigital zones of affected skin revealed partial
separation of epidermodermal junction and presence of cellular debris,
moderate vacuolization of epidermal basal cells, and abundant dermal
histiocytic and lymphoplasmacytic inflammatory infiltrate and collections
of eosinophils in blood vessels. The Peryodic acid Schiff (PAS) reaction
showed basal membrane discontinuity in diseased skin and partial
thickening in both affected and healthy skin. Both affected and healthy
skin revealed immunoreactions of IgM, IgA and C
3
but not of IgG at
the epidermodermal junction. According to clinical, histopathology and
immunohistochemistry evidence we suggest that the present report is a
probable case of SLE.
219
SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS, PERIANAL FURUNCULOSIS, AUTOIMMUNE DISEASES
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221
Arch Med Vet 42, 221-227 (2010)
COMMUNICATION
Accepted: 14.07.2010.
* Rod Admar Gonzaga, 1346, 88040-900; Florianpolis, SC, Brasil;
mlaterca@cca.ufsc.br
Hematology and agglutination titer after polyvalent immunization and subsequent
challenge with Aeromonas hydrophila in Nile tilapia (Oreochromis niloticus)
Hematologa y ttulo de aglutinacin despus de inmunizacin polivalente y
desafo con Aeromonas hydrophila a tilapias del Nilo (oreochromis niloticus)
RL Bailone
a
, ML Martins
a
*, JLP Mourio
a,b
, FN Vieira
a,b
, FS Pedrotti
a,b
, GC Nunes
a
, BC Silva
a,b
a
Laboratrio AQUOS - Sanidade de Organismos Aquticos, Departamento de Aqicultura
Centro de Cincias Agrarias (CCA), Universidade Federal de Santa Catarina, Florianpolis, SC, Brasil.
b
Setor de Microbiologia, Laboratrio de Camares Marinhos, Departamento de Aqicultura, CCA, Universidade Federal
de Santa Caterina, Florianpolis, SC, Brasil.
RESUMEN
Este trabajo evalu el efecto de la vacuna polivalente sobre las respuestas hematolgicas y inmunolgicas de tilapias del Nilo desafiadas con
Aeromonas hydrophila. Dos dosis, 1 x 10
4
y 1 x 10
8
Unidades Formadoras de Colonias (UFC)/mL, de vacuna conteniendo proporciones iguales de
Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa y Enterococcus durans inactivadas con formalina, fueron testeadas por inyeccin intraperitoneal
(i.p.). Los peces fueron desafiados 10 das despus de la vacunacin i.p. con la dosis (DL
50-96h
) de 1 x 10
7
UFC de A. hydrophila/mL resuspendida en
solucin salina estril. Por lo tanto, para analizar los parmetros hematolgicos, la actividad antimicrobiana y aglutinante del suero de las muestras,
fueron colectadas 48 h despus del desafo. Antes de la infeccin experimental, el nmero de eritrocitos fue superior en los peces vacunados con 1 x 10
8

UFC/mL. Sin embargo, despus del desafo, el nmero total de trombocitos fue mayor en los peces vacunados con la mayor dosis. Antes y despus del
desafo, el nmero total de leucocitos y el nmero de linfocitos presentaron mayores valores en los peces vacunados. El nmero de monocitos en los
peces vacunados y en los inyectados con solucin salina fue mayor antes del desafo. El mayor ttulo de aglutinacin frente A. hydrophila, P. aeruginosa
y E. durans fue observado en los peces vacunados con 1 x 10
8
UFC/mL. Antes del desafo la actividad antimicrobiana del suero sanguneo fue mayor
en los peces no vacunados y en los vacunados con 1 x 10
8
UFC/mL, y mismo despus del desafo los peces no vacunados y los inyectados con solucin
salina presentaron mayor actividad antimicrobiana. En este trabajo fue posible comprobar que despus de 10 das la vacuna polivalente en la concentracin
de 1 x 10
8
UFC/mL estimul la produccin de eritrocitos, leucocitos, trombocitos y linfocitos circulantes reduciendo los niveles de glucosa.
Key words: oreochromis niloticus, vaccination, Aeromonas hydrophila, challenge.
Palabras clave: oreochromis niloticus, vacunacin, Aeromonas hydrophila, desafo.
INTRODUCTION
The rapid development of aquaculture allied to intensive
production systems favour stress conditions in captive fish,
leading to diseases and economic losses (Schreck 1996).
One of the most important challenges in aquaculture is
the enhancement of performance and disease resistance in
reared fish. In this sense bacterial diseases are one of the
limitant factors (Abdel-Tawwab et al 2008, Martins et al
2009
a
). Bacteria are part of microrganisms present in the
water of rivers and ponds, and its pathogenic potential may
be altered under physical and chemical characteristics of
the environment (Walters and Plumb 1980). Gram nega-
tive, worldwide and opportunist bacterium Aeromonas
hydrophila, may cause disease in a several freshwater
fish species for example in cyprinid as related by Rahman
et al (1997).
Antibiotics are frequently utilized in aquaculture
to increase larval resistance but this practice can also
result in microbial resistance, residual accumulation in
tissue (Vadstein 1997) and fish immunesuppression (Van
Muiswinkel et al 1985). The immuneprophylaxis as the
specific and non-specific immune system stimulation is
the key for sustainable aquaculture development (Gudding
et al 1999). Vaccination with inactivated antigens as well
as the probiotic addition in the diet of cultured fish may
contribute to reduction of chemicals and antibiotics in
aquaculture (Gudmundsdttir and Bjrnsdttir 2007,
Jatob et al 2008).
In Brazil, studies on fish immunology are scarce. The
administration of vaccines against bacterial and viral diseases
has demonstrated good results in relation to scientific and
economic approaches by reducing the chemical use (Costa
2004). Several factors can interfere on fish immune response
such as developmental stage, size, nutritional status, water
222
RL BAILONE Y COL
quality and vitamin supplementation (Tatner and Manning,
1983, Bly et al 1997, Nakanishi and Ototake 1997, Moraes
and Martins 2004, Martins et al 2008
a
). On the other hand,
the efficacy of the vaccine is strongly influenced by the type
of administration, dose and nature of antigens, adjuvant
addition, environment and water temperature (Tatner 1987,
Lillehaug et al 1993, Bly et al 1997). Thus, information on
the infectious agent and the host response must be considered
for the development of an efficient vaccine (Gudmundsdttir
and Bjrnsdttir 2007).
The resistance of fish can be evaluated by analyzing
the survival rate after experimental infection (Wasson and
Kelly 1990) as well as hematological and immunological
parameters (Martins et al 2009
a
). A combined vaccine
against Streptococcus iniae administrated intraperitoneally
in tilapia has demonstrated more protection compared to
a single isolate (Klesius et al 2000). The authors argued
that antigen heterogenicity in Streptococcus exists and a
combined vaccine may enhance fish response.
Park and Jeong (1996) reported improved resistance
in tilapia injected with protein-bound polysaccharide
(PS-K) against Edwardsiella tarda. Sarder et al (2001),
found that lysozyme and phagocytic activities in tilapia
were higher after challenge with A. hydrophila, but
no difference was noted in the differential counting
of leukocytes. On the other hand, Castro et al (2008)
observed good results in turbot Scophthalmus maximus
vaccinated against E. tarda characterized by the highest
survival rate and antibody levels for at least six months
after immunization.
According to Balfry et al (1997) lymphocyte number
decreased after challenge with Vibrio parahaemolyticus
but no difference in thrombocyte, neutrophill and mono-
cyte was found. The study of Harikrishnan et al (2003)
in carp infected by A. hydrophila showed an increase in
the leukocyte number. But the opposite was foud in pacu
Piaractus mesopotamicus experimentally infected with
A. hydrophila (Garcia et al 2007). Martins et al (2008
b
)
have reported that Enterococcus-injected tilapia showed not
only a high number of thrombocytes, but also an increase
in white blood cell and lymphocyte when compared to non-
injected. Phagocytyc activity and circulating lymphocyte
number were also enhanced after Enterococcus injection
(Martins et al 2009
a
).
This study evaluated the effects of polyvalent vaccination
containing A. hydrophila, Pseudomonas aeruginosa and
E. durans, on the hematological and serum agglutination
responses in Nile tilapia challenged with A. hydrophila.
MATERIAL AND METHODS
The experiment was carried out at the Aquaculture
Department, Laboratory AQUOS-Aquatic Organisms
Health, CCA, UFSC, Florianopolis, Santa Catarina State,
with GIFT tilapia from Fundao 25 de Julho, Joinville,
SC, Southern Brazil.
The strains of A. hydrophila ATCC 7966, Enterococcus
durans ATCC 19492, Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853 and Escherichia coli ATCC 25922 used in this assay
were donated by Institute Andr Tossello (Campinas, So
Paulo State), and cultured at the Microbiology Laboratory of
Marine Shrimp Laboratory, UFSC, Florianpolis, SC.
LETHAL DOSE (LD
50-96H
) TO AERoMoNAS HYDRoPHILA
Fish with 196.97 25.00 g weight and 18.53 1.20
cm length were distributed in 150 L tanks with constant
aeration and water renewal 30% a day, and fed ad libitum
with a commercial diet 28% crude protein twice a day.
After acclimation for 5 days, fish were intraperitoneally
(i.p.) injected with 0; 1 x 10
5
; 1 x 10
6
; 1 x 10
7
and 1 x 10
8

Forming Colony Units (FCU)/mL per fish diluted in
1 mL esterile saline solution, in triplicates with 5 fish in
each repetition. The water quality was daily monitored
as follows: dissolved oxygen 5.54 0.44 mgL; tempera-
ture 24.93 2.49 C; pH 7.29 0.30; total ammonia
0.45 0.48 mg/L.
After 96 h of mortality observation, DL
50-96h
was
estimated for A. hydrophila by the method Trimmed
Spearman-Karber (Hamilton et al 1977). Bacterial concen-
tration that provoked 50% mortality in 96 h was utilized
to challenge the fish. Furthermore, as an experimental
vaccination, a previously reported lower dose (Martins
et al 2008
b
) and a time collection that caused no severe
mortality were used.
VACCINATION AND CHALLENGE
Bacterial strains of A. hydrophila, P. aeruginosa and
E. durans were reproduced in separate tubes of 10 mL
containing BHI broth (Brain and Heart Infusion, Difco),
incubated at 30 C for 24 h under continuous agitation.
After verifying the bacterial population, equal portions of
bacteria were added to formalin 0.5%, being incubated
again under agitation at 30 C for 24 h. Bacterial cultures
were centrifuged at 4,000 g for 30 min, the supernatant
with formalin was discarded and the pellet re-suspended
in sterile saline solution. The vaccine was determined to
be sterile by lack of growth in TSA (Tryptic Soy Agar,
Difco) medium culture at 30

C for 24 h.
Fish with 255.52 21.16 g weight and 21.28 1.93
cm length were distributed in 150 L tanks with constant
aeration and water renewal 30% a day. Fish were accli-
mated for 10 days and fed ad libitum with a commercial
diet 28% crude protein twice a day. Water quality was daily
monitored as follows: dissolved oxygen 5.43 0.48 mg/L;
temperature 26.09 3.13 C; pH 7.02 0.32 and total
ammonia 0.90 0.67 mg/L.
The experiment was entirely randomized with i.p. vac-
cinated fish with 1 x 10
4
and 1 x 10
8
FCU/mL polyvalent
vaccine formalin-inactivated; control saline-injected fish
and non-injected ones, 10 fish per treatment, in triplicates.
223
oREoCHRoMIS NILoTICUS, VACCINATION, AERoMoNAS HYDRoPHILA, CHALLENGE
Before inoculation and for blood collection fish were
anethestized with a benzocaine solution (50 mg/L)
(Ethic Committee n 23080.024659/2007-99 CEUA/
UFSC). Fish were maintained in starvation for 24 h
before challenge by i.p. 1 mL of DL
50-96h
A. hydrophila
(1 x 10
7
UFC/mL). This trial was carried out 10 days
after immunization.
HEMATOLOGY AND GLUCOSE
Blood samples were collected before and 48 h after
challenge with A. hydrophila. After fish anesthetizes, the
blood was withdrawn from the caudal vein using a 3 mL
(21G) syringe with 10% EDTA and a syringe without
anticoagulant. Blood collected without anticoagulant
was left to clot for 2 h at 25 C, and then centrifuged at
1,400 g for 10 minutes. Serum aliquot was taken with
assist of a micropipette and stored at -20 C until analysis.
Serum of 3 fish from the same experimental aquarium
was pooled for immunological analyses. The blood col-
lected with anticoagulant was used to produce duplicates
of blood ex tensions stained with Giemsa/MayGrunwald
(Rosenfeld 1947), for differential counting of leukocytes
and total counting of thrombocytes and leukocytes. One
aliquot was used to determine hematocrit (Goldenfarb
et al 1971) and the rest was stored in glass flasks on ice
to quantify the total number of erythrocytes in a hemo-
cytometer. Total number of thrombocytes and leukocytes
were counted in blood extension by the indirect method
described by Ishikawa et al (2008). One aliquot of serum
was used to determine glycemic index in spectrophotometer
(Biotcnica

kit) at 505 nm.


In the first collection (ten days after immunization), three
fish per each treatment were used for blood collection and
euthanized. For the second collection (48 h after challenge)
the other seven fish were utilized finally used.
AGGLUTINATION TITER
The test for agglutination titer was realized individu-
ally for each bacterium strain (A.hydrophila, E. durans
and P. aeruoginosa) according to Yildirim et al (2003).
The concentration of inactivated cells used in the test
was of 0.8 in 550 nm wave length (DO
550nm
). Briefly,
each well of a 96-round well microplate was plated
with 50 L of phosphate-buffered saline (PBS 0.2M
monobasic phosphate, 0.2M dibasic phosphate, 0.11M
sodium chloride, pH 7.4) and then 50 L of serum was
added to the first well, and diluted serum was serially
diluted into the remaining wells. After that, 50 L of each
bacterium strain was added to each well and incubated
in humidified air at 25 C for 18 h. The agglutination
was measured as the amount of a required substance to
react with a given amount of other substance, that was
considered as reciprocal of the last dilution that presented
agglutination.
STATISTICAL ANALYSIS
Data were analized using the Bartlett test and hemato-
logical parameters with no homogenicity in variance were
transformed in log (x + 1) prior to analysis of variance
with parcels subdivided in time ( < 0.05). Differences
in means were detected by the Student Newman Keuls
test (SNK), and agglutination titer data was log
2
(x + 1)
transformed prior to analysis.
RESULTS AND DISCUSSION
LETHAL DOSE
The first mortalities occurred 11 h after challenge in all
experimental units of the dose 1 x 10
8
UFC/mL (table 1).
Except for saline-injected fish, all dead animals showed
typical symptoms such as reddish on ventral body surface,
scaleness, fin and integument hemorrhages with exposi-
tion of muscular tissue. After 23 h the first mortality was
detected in fish that received the dose 1 x 10
7
UFC/mL.
Park and Jeong (1996) found mortality in tilapia 48 h
after infection with E. tarda. Our results were similar to
the findings of Sarder et al (2001) who observed tilapia
mortality 12 h after infection with A. hydrophila. Balfry
et al (1997) reported 28.9% mortality in black strain tilapia
24 h after challenge with V. parahaemolyticus. The mortality
in saline-injected fish (6.66%) has probably been caused
by injection handling stress corroborating the findings
of Sarder et al (2001). The stress due to saline injection
was related in the studies of Martins et al (2006) in pacu
(Piaractus mesopotamicus).
Except for the increased mortality rate in fish that re-
ceived 1 x 10
5
CFU/mL in relation to those that received
1 x 10
6
CFU/mL, the mortality was proportional to the
concentration of pathogen inoculums. Fish inoculated
with 1 x 10
7
CFU/mL showed 50% mortality (DL
50-96h
A.
hydrophila). Contrarily to here observed, Wang and Wang
Table 1. Mortality rate in Nile tilapia 96 h after intraperitoneal
injection of saline solution and crescent dosis of Aeromonas
hydrophila/mL, to determine the DL
50-96h
.
Tasas de mortalidad en tilapia del Nilo despus de 96 h de la
inyeccin intraperitoneal inyeccin de solucin salina y la creciente dosis
de Aeromonas hydrophila/mL, para la determinacin de la DL
50-96h
.
Colony forming units of
Aeromonas hydrophila/mL
Mortality
(%)
Saline solution 6.66
1 x 10
5
39.96
1 x 10
6
26.64
1 x 10
7
53.28
1 x 10
8
79.92
224
RL BAILONE Y COL
(1997) found that injection with 1 x 10
7
CFU A. hydrophila/
mL in tilapia and carp caused 100% mortality (DL
100
). It
depends on several factors as environmental conditions
and bacterial strain.
HEMATOLOGY AND GLUCOSE
As a result of stress, normal hematological parameters
could be changed in infected fish (Martins et al 2008
b
). In
this study, after challenge with A. hydrophila, the number
of thrombocytes in the circulating blood of 1 x 10
8
vac-
cinated tilapia was higher than the number observed in
non-vaccinated ones (table 2).
The results showed an increase in the number of total
leukocyte and lymphocyte in 1 x 10
8
vaccinated fish in
relation to other treatments either after immunization
or challenge (table 3). In the studies of Harikrishnan
et al (2003) in carp (Cyprinus carpio) infected i.p. with
A. hydrophila, the number of leukocyte increased until
30 days after infection. In contrast to that observed
by Harikrishnan et al (2003), in this work erythrocyte
number and hematocrit did not alter after challenge. On
Table 2. Blood characteristics in the blood of Nile tilapia, before (6 days after immunization) and 48 h after challenge with Aeromonas
hydrophila. Non-vaccinated fish, fish injected with 1 mL saline solution, fish vaccinated with 1 x 10
4
and 1 x 10
8
CFU of polyvalent
vaccine/mL. Different letters indicate significant difference among the treatments in each time of collection by SNK test of mean
comparison (P < 0.05).
Caractersticas de la sangre de tilapia del Nilo, antes (6 das despus de la inmunizacin) y 48 h despus de infectarlas con Aeromonas hydro-
phila. Peces no infectados, e inyectados con 1 mL solucin salina y peces vacunados con 1 x 10
4
y 1 x 10
8
CFU con la vacuna polivalente/mL. Las letras
distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos en los distintos tiempos de colecta por el test de comparacin de medias SNK (P < 0.05).
Collection Treatment
Glucose
(mg/dL)
Hematocrit
(%)
Erythrocyte
(10
6
/L)
Thrombocyte
(10
3
/L)
Leukocyte
(10
3
/L)
Before challenge
Non-vaccinated 85.62 45.88
a
18.83 4.19
a
1.02 0.30
b
35.20 5.41
a
18.19 1.50
b
Saline 75.56 55.00
a
24.78 2.80
a
1.25 0.14
ab
46.66 12.68
a
21.80 5.65
b
1 x 10
4
21.91 21.77
b
26.83 2.80
a
1.34 0.28
ab
46.66 6.49
a
26.35 5.20
b
1 x 10
8
42.81 18.69
b
23.33 4.93
a
1.70 0.22
a
49.41 10.41
a
34.72 10.09
a
After challenge
Non-vaccinated 90.79 38.75
a
22.19 2.82
a
1.16 0.07
a
18.13 10.77
b
17.46 9.58
b
Saline 58.48 44.25
a
22.25 3.26
a
1.12 0.08
a
27.39 5.21
ab
19.12 1.12
b
1 x 10
4
34.17 25.79
b
22.33 2.04
a
1.17 0.28
a
30.44 8.84
ab
26.42 3.28
b
1 x 10
8
21.05 17.24
b
21.86 1.91
a
1.19 0.12
a
42.46 4.21
a
37.66 4.21
a
Table 3. Differential counting of leukocytes in the blood of Nile tilapia, before challenge (6 days after immunization) and 48 h after
challenge with Aeromonas hydrophila. Non-vaccinated fish, fish injected with 1 mL saline solution, fish vaccinated with 1 x 10
4
and
1 x 10
8
CFU of polyvalent vaccine/mL. Different letters indicate significant difference among the treatments in each time of collection
by SNK test of mean comparison (P < 0.05).
El conteo diferencial de leucocitos en la sangre de tilapia del Nilo, antes del desafo (6 das despus de la inmunizacin) y 48 h despus
del desafo con Aeromonas hydrophila. Peces no vacunados, peces inyectados con 1 mL de solucin salina y peces vacunados con 1 x 10
4
y 1 x 10
8

UFC de vacuna polivalente/mL. Las letras distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos en los distintos tiempos de colecta por el test
de comparacin de medias SNK (P < 0.05).
Collection Treatment
Basophill
(10
3
/L)
Neutrophill
(10
3
/L)
Lymphocyte
(10
3
/L)
Monocyte
(10
3
/L)
Before challenge
Non-vaccinated 0.58 0.55
a
7.83 3.72
a
9.51 4.46
b
0.27 0.23
b
Saline 0.26 0.13
a
11.08 0.98
a
9.55 5.76
b
0.91 0.06
a
1 x 10
4
0.33 0.13
a
9.50 1.40
a
14.21 3.17
b
1.66 0.88
a
1 x 10
8
0.47 0.20
a
8.51 6.02
a
22.63 1.02
a
0.98 0.35
a
After challenge
Non-vaccinated 0.27 0.39
a
6.92 4.38
a
10.11 5.16
b
0.08 0.07
a
Saline 0.05 0.08
a
10.62 1.88
a
8.44 2.93
b
0.00 0.00
a
1 x 10
4
0.00 0.00
a
9.36 6.39
a
10.89 4.39
b
0.19 0.25
a
1 x 10
8
0.17 0.16
a
9.99 8.78
a
20.28 2.70
a
1.08 1.07
a
225
oREoCHRoMIS NILoTICUS, VACCINATION, AERoMoNAS HYDRoPHILA, CHALLENGE
the other hand, reduced glucose concentration either
before or after challenge corroborated the findings of
Harikrishnan et al (2003).
Reduced number of erythrocytes and hemoglobin
concentration was reported in cichlid (Etroplus suratensis)
infected by ulcerative epizootic syndrome (Pathiratne and
Rajapakshe 1998). Although no difference was observed
in erythrocyte number of A. hydrophila infected fish,
our results showed an increase after immunization when
compared to unvaccinated fish.
According to Haney et al (1992), a decrease in the eryth-
rocyte number and hemoglobin concentration may be caused
by bacterial agent. A decrease in the number of erythrocyte
and hematocrit percentage suggests that erythrocyte has
been destructed by leukocytic activity. On the other hand,
increased hematocrit is a result of oxygen depletion (Kirk
1974). In the present study, the infection and/or vaccine did
not cause alteration in hematocrit percentage.
Similarly to the present results, an increase in the
number of thrombocyte, lymphocyte and hematocrit
percentage was also found in tilapia after challenge
with Enterococcus sp. (Martins et al 2008
b
). In contrast
to the observations in this assay, Martins et al (2008
b
)
did not relate influence of infection on glucose levels
and erythrocyte number. They argued that this event
occurred due to either insufficient inoculums to provoke
these blood alterations or hematopoiesis. Contrarily to
our results, Lamas et al (1994) and Balfry et al (1997)
found a reduced number of lymphocytes in the blood of
rainbow trout and tilapia, infected with V. anguillarum
and V. parahaemolyticus, respectively. Our results with
1 x 10
8
bacteria-injected fish can be explained by the
fact that lymphocytes have migrated to injured site, as
found by Martins et al (2009
b
).
After immunization the number of monocytes was sig-
nificantly lower (P < 0.05) in non-vaccinated fish (table 3).
Monocytes have phagocytic activity and differentiate
in macrophages in order to migrate to an inflammatory
site like a defense response (Griffin 1984, Martins et al
2009
a
). This is especially true by the fact that vaccinated
and saline-injected fish showed an increase in these cells
confirming their action on the fish defense system.
Glucose concentration can increase in short periods
in order to supply the energetic demand in stress situ-
ations as commented by Barton (2000). In this assay
glucose levels did not alter before and after challenge in
non-vaccinated and saline-injected fish. In 1 x 10
4
and
1 x 10
8
vaccinated fish glucose decreased after challenge
(table 2). On the other hand, in infected carp treated with
herbal extract an increase in the glucose concentration
was observed 30 days after infection (Harikrishnan et al
2003). Our results confirmed the comments of Barton
(2000). In fact, after both immunization and challenge,
the fish was trying to supply the energetic demand in
this situation of bacterial stress.
AGGLUTINATION TITER
After immunization and challenge fish vaccinated with
1 x 10
8
CFU inactivated bacteria/mL stimulated the ag-
glutination titer against A. hydrophila, P. aeruginosa and
E. durans (table 4). An increase in the agglutination titer
in fish after immunization was reported by other authors.
In the Studies on Seriola quinqueradiata vaccination
Table 4. Agglutination titer (log
2
(x +1)) in the serum of Nile tilapia, before challenge (6 days after immunization) and 48 h after
challenge with Aeromonas hydrophila. Non-vaccinated fish, fish injected with 1 mL saline solution, fish vaccinated with 1 x 10
4
and
1 x 10
8
CFU of polyvalent vaccine/mL. Different letters indicate significant difference among the treatments in each time of collection
by SNK test of mean comparison (P < 0.05).
Ttulo de aglutinacin (log
2
(x +1)) en el suero de tilapia del Nilo, antes del desafo (6 das despus de la inmunizacin) y 48 h despus
del desafo con Aeromonas hydrophila. Peces no vacunados, peces inyectados con 1 mL de solucin salina y peces vacunados con 1 x 10
4
y 1 x 10
8

UFC de vacuna polivalente/mL. Las letras distintas indican diferencia significativa entre los tratamientos en los distintos tiempos de colecta por el test
de comparacin de medias SNK (P < 0.05).
Collection Treatment
Agglutination titer
Aeromonas hydrophila Pseudomonas aeruginosa Enterococcus durans
Before
challenge
Non-vaccinated 2.64 0.92
b
0.00 0.0
b
3.51 1.39
b
Salina 2.89 0.49
b
0.00 0.0
b
3.57 1.79
b
1 x 10
4
3.17 0.55
b
0.00 0.0
b
5.05 0.97
b
1 x 10
8
8.34 0.58
a
5.38 1.12
a
7.01 0.99
a
After
challenge
Non-vaccinated 2.08 0.43
c
0.53 0.92
b
4.73 0.55
b
Salina 3.23 1.57
bc
0.77 1.34
b
4.09 0.00
b
1 x 10
4
4.73 0.55
b
1.83 0.43
b
4.41 0.55
b
1 x 10
8
11.33 0.58
a
6.04 0.57
a
6.68 0.57
a
226
RL BAILONE Y COL
against Photobacterium damsela piscicida, Gravningen
et al (2008) detected increased antibody levels three and
four weeks after immunization.
Similar to our results, higher antibody levels for two
weeks were reported in tilapia vaccinated intraperitoneally
with A. hydrophila (Ruangpan et al 1986). On the other
hand, Swain et al (2007) have related the efficacy of poli
or monovalent vaccine in cyprinid fish (Labeo rohita) with
the maximum values of agglutination titer after 4 weeks.
In this assay, the highest agglutination titer was found after
injection with 1 x 10
8
CFU bacteria/mL.
In conclusion, polyvalent vaccine at a concentration
1 x 10
8
CFU/mL stimulated the erythrocyte production,
total leukocyte counting, monocyte and lymphocyte number,
important cells involved on the specific and nonspecific
immunological process.
Fish vaccinated with the highest dose also stimulated
the thrombocyte and leukocyte production after challenge.
An increase in the agglutination titer against A. hydrophila,
P. aeruginosa and E. durans was found either after im-
munization or challenge with A. hydrophila. However,
further studies must be developed to solve the defense
mechanisms in the Brazilian cultured fish to enhance the
vaccine efficacy. Moreover, studies should be carried out
to evaluate the cumulative mortality in fish treated with
different vaccine doses regarding to field application and
the duration of vaccine efficacy.
SUMMARY
This study evaluated the effects of polyvalent vaccination on the
hematological and serum agglutination responses in Nile tilapia challenged
with Aeromonas hydrophila. Two dosis, 1 x 10
4
and 1 x 10
8
) Colony
Forming Units (CFU)/mL, of vaccine containing the same amount of
Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa and Enterococcus durans
formalin-inactivated were tested by intraperitoneal (i.p) injection. Fish were
challenged ten days after vaccination i.p. with a DL
50-96h
of 1 x 10
7
CFU A.
hydrophila/mL. Samples were collected 48 h after challenging fish to check
the hematological parameters, antimicrobial activity and agglutination titer
of serum, samples were collected 48 h after challenge. Before challenge,
the number of erythrocytes was higher in fish vaccinated with 1 x 10
8

CFU/mL. After challenge, total number of thrombocytes was higher in
fish that received the greatest dose of vaccine. Before and after challenge,
total number of leukocytes and the number of lymphocytes showed the
highest values in vaccinated fish. Before challenge, increased number of
monocytes in vaccinated and saline-injected fish was observed. The highest
agglutination titer against A. hydrophila, P. aeruginosa and E. durans was
related in 1 x 10
8
CFU/mL vaccinated fish. Before challenge, high values of
antimicrobial activity in non-vaccinated fish and 1 x 10
8
CFU/mL

vaccinated
ones was also related. Therefore, after challenge, non-vaccinated fish and
saline-injected ones showed the highest antimicrobial activity. This study
showed that 10 days after immunization with a polyvalent vaccine at a
concentration 1 x 10
8
CFU/mL, there was an increase on erythrocytes,
leukocytes, thrombocytes and circulating lymphocytes production, while
the glucose levels were reduced.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors thank CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento
Cientfico e Tecnolgico) for financial support (CNPq 472968/2007-6)
and grant to M.L. Martins (CNPq 301072/2007-8).
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tilapia experimentally infected with Enterococcus sp. Fish Physiol
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and immune response of channel catfish (Ictalurus punctatus) fed
diets containing graded levels of gossypol-acetic acid. Aquaculture
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INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES
ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA
Fundada en 1969 ISSN 0301-732x
Revista seleccionada por los siguientes repertorios cientfcos internacionales:
Current Contents Agriculture, Biology and Environmental Sciences (CC/AB and
ES), Commonwealth Agricultural Bureaux, International (C.A.B.I.), Dairy Science
Abstracts, Veterinary Bulletin, Animal Breeding Abstracts; Helminthological Abstracts
S.A., Biological Abstracts; Agrindex, Periodica, Focus on: Veterinary Sciences and
Medicine.
Archivos de Medicina Veterinaria publica, en espaol o
ingls, contribuciones cientfcas originales en la forma de ar-
tculos cientfcos, revisiones bibliogrfcas y comunicaciones
cortas que pueden incluir observaciones clnicas, descripciones
de tcnicas o mtodos, y avances en todos los aspectos de las
ciencias veterinarias y bienestar animal.
ENVO DE LA PUBLICACIN
Los artculos deben ser enviados al Editor en forma electrnica
a travs de www.equipu.cl, e incluir:
Unaversinelectrnicadeltexto,cuadros(preferentemente
en formato MS Word), fguras (en formato Excel, JPG o TIFF,
300 dpi) y una declaracin de la responsabilidad de autora,
con la frma de todos los autores.
Lostrabajosdebenseroriginalesy,porlotanto,nodeben
estar en proceso de arbitraje en otra revista.
Losartculosquesepresentensinconsiderarlasnormasde
estilo sern devueltos sin ser sometidos a revisin.
Para experimentos con animales o humanos, el Comit
Editor podr solicitar que se adjunte la autorizacin de un
Comit de Biotica o instancia similar.
SedeberincluirunacartadirigidaalEditorsolicitandola
publicacin de su trabajo y sealando a uno de los autores
como responsable de la revisin de las pruebas de imprenta
y de la correspondencia.
Lapropiedadintelectualdelostrabajospublicadospertenece
a los autores.
LosrevisoresdeArchivos de Medicina Veterinaria asesoran al
Comit Editor para decidir si el trabajo puede ser publicado.
Los autores podrn sugerir revisores. Todos los artculos
enviados para publicacin sern enviados a dos revisores
seleccionados por el Comit Editor y pueden incluir, o no, los
sugeridos por los autores. En caso de existir controversia en
los informes, se recurrir a un tercero en carcter de rbitro-
arbitrador, que asesorar al Comit Editor para decidir el
destino del trabajo. Los revisores estn obligados a mantener
el carcter confdencial de toda la informacin de los trabajos,
aun cuando no sean publicados.
Previo a la publicacin de un trabajo aceptado se
debe pagar un valor cuyo monto se seala en la Web
www.veterinaria.uach.cl
FORMA Y PREPARACIN DEL ARTCULO
Tipos de artculos
Artculos de revisin: son realizados por expertos que re-
sumen y proyectan el conocimiento actualizado en un campo
particular en las Ciencias Veterinarias, y no necesariamente
se ajustan a un formato defnido de presentacin. Los autores
deberan previamente consultar a los editores antes de iniciar el
trabajo de revisin. El Comit Editor podr solicitar a expertos el
envo de artculos de revisin, los que tambin sern sometidos
al proceso de arbitraje y edicin. No deben exceder de 30 pgi-
nas, incluidos cuadros, fguras y referencias. Slo se aceptarn
revisiones escritas en ingls.
Artculos cientfcos: stos informan un nuevo avance en
Ciencias Veterinarias basados en una investigacin original. El
formato de ellos deber incluir summary, introduccin, material
y mtodos, resultados, discusin, resumen, agradecimientos
(cuando corresponda) y referencias. No deben exceder de 20
pginas, incluidos cuadros, fguras y referencias.
Comunicaciones cortas: informan de manera breve un
avance, resultado de un experimento, observaciones clnicas o
nueva metodologa, ajustndose al siguiente formato: summary,
introduccin, material y mtodos, resultados y discusin (seccin
conjunta), resumen, agradecimientos (cuando corresponda) y
referencias. No deben exceder de 12 pginas, incluidos cuadros,
fguras y referencias.
ESTILO Y FORMATO DE LA REVISTA
Presentacin general: la revista publica artculos en espaol
o ingls.
Los artculos debern ser escritos con letras Times New
Roman 12, por un solo lado de las hojas, a interlineado y medio,
en tamao carta (21,5 x 27,9 cm), dejando un margen de 2 cm
en los cuatro bordes.
Todas las pginas deben ser numeradas de manera conse-
cutiva en el ngulo superior derecho, y las lneas debern ser
numeradas en cada pgina, inicindose con el nmero 1, junto
al margen izquierdo, en todo el trabajo.
Los ttulos de captulos deben ser escritos en mayscula,
justifcados al lado izquierdo, en lneas separadas y sin punto
fnal. Ejemplo: MATERIAL Y MTODOS. En los subttulos
slo la primera letra es mayscula (Ejemplo: Diseo experi-
mental) y deber ser justifcado al lado izquierdo. Subttulo
secundario debe ser justifcado al lado izquierdo y en letra
cursiva. No debern usarse subrayado ni numeracin de sub-
ttulos o lista de tems.
Las cifras deben ser escritas en nmeros. Cuando estn al
inicio de una frase, o cuando la claridad del texto lo requiera,
deben ser expresadas en palabras. Un decimal deber ser pre-
cedido de un numeral usando punto cuando el artculo es en
ingls o coma cuando el artculo es en espaol (Ejemplo: 0,5
no ,5). Mltiplos de mil deben escribirse separados por punto
(Ejemplo: 1.000). Las medidas de cantidad debern ajustarse
al Sistema Internacional de Unidades, a menos que la prctica
en una disciplina use derivados de ellos (Ejemplo: la unidad
internacional de Curie). Las fechas deben ser expresadas como
07 de septiembre de 1954 en el texto, pero pueden presentarse
abreviadas en los cuadros y fguras. El tiempo diario se debe
expresar segn las 24 horas cronolgicas (Ejemplo: 13:00 h).
Para la nomenclatura qumica se deben utilizar las normas
de la Sociedad de Bioqumica (Biochem J 209, 1-27, 1983),
los frmacos o drogas deben ser mencionados por sus nombres
genricos (en minsculas), si es necesario colocar marcas y sus
fuentes debern ir a pie de pgina. Las enzimas deben ser identi-
fcadas, cuando se mencionan por primera vez, segn la Enzyme
Commission of the International Union of Biochemistry.
Los trminos en latn y sus abreviaciones que son de uso
comn en la literatura cientfca, tales como: in vitro, in vivo,
ad libitum debern ir en cursiva. Los valores de probabilidad
deben ser dados en la forma de P < 0,05 o P < 0,01. Des-
viacin estndar, error estndar de la media e intervalos de
confanza, se abreviarn en la forma siguiente: DE, EE y IC,
respectivamente.
Ttulo
El ttulo del trabajo debe ser conciso, especfco e informa-
tivo. Slo la primera letra ser mayscula, en negritas, centrado,
inicindose en la lnea 10, sin usar marcas comerciales o abre-
viaciones. Se deber sealar, con superndice (#) la fuente de
fnanciamiento, si lo hubiese, que se detallar a pie de pgina.
Separado por el espacio de una lnea se deber escribir el ttulo
en ingls.

Autores y direcciones
Los nombres de los autores se escribirn bajo el ttulo
separados por un espacio. Use iniciales (sin puntos) y apellido
separando por comas entre los autores, ajustndose al siguiente
ejemplo: CT Westwood, E Bramley, IJ Lean. Al trmino de cada
nombre de autor debe identifcarse con una letra en superndice,
el nombre de la seccin, departamento, servicio o institucin a la
que pertenece o perteneci dicho autor, durante la ejecucin del
trabajo. La letra con un asterisco indica el autor responsable de la
correspondencia, debindose sealar a pie de pgina el nmero
de fax, correo electrnico y casilla de correo.
Pie de pgina
Sern usados para elaborar abreviaciones citadas en el ttulo
de cuadros, marcas comerciales, nombre y direccin de empresas.
Deben ser indicados con nmeros.
Summary
La segunda pgina debe contener un summary, de no ms de 250
palabras y que describa los propsitos del estudio o investigacin,
el material y mtodos empleados, los resultados principales y las
conclusiones ms importantes. No se deben emplear abreviaturas
no estandarizadas. En lnea aparte, separado por un espacio y
justifcadas a la izquierda se deben incluir key words (palabras
clave) en minsculas, las que no deben ser ms de 4.
Introduccin
En la tercera pgina en la lnea 1 se escribir el ttulo del
captulo. En la lnea siguiente, con sangra, predeterminada de
un tabulador en 5 espacios, se plantearn los antecedentes que
sustentan el propsito del artculo, sin un despliegue extensivo
del tema y utilizando slo las referencias ms pertinentes. Se
deben indicar, cuando corresponda, la hiptesis que se postula
y los objetivos de la investigacin.
Entre prrafos debe conservar el interlineado y medio.
Material y Mtodos
Separado por un espacio de la seccin anterior, se deber
describir el captulo con sufcientes detalles para permitir a otros
repetir el estudio. Despus de la primera referencia en el texto a
drogas o reactivos, se deben sealar el nombre genrico, dosis y
va de administracin. Para el caso de equipo especializado se
indicarn la marca, el modelo y el nombre del fabricante.
Los mtodos estadsticos utilizados deben ser sealados como
subttulos: Anlisis estadstico y deben incluir un adecuado
detalle, que permita a los lectores establecer con precisin cmo
han sido analizados y presentados los datos y las unidades de
medidas en que estn expresadas (medias aritmticas, desvia-
ciones estndares, errores estndares de la media, medianas,
rangos o lmites de confanza, etc.). Si las pruebas usadas fueron
paramtricas (Chi cuadrado, prueba t de Student, Anova, etc.)
o no paramtricas (Wilcoxon, Kruskal-Wallis, etc.). Se debern
identifcar el nombre, la versin y el proveedor del programa
computacional utilizado, ejemplo: SPSS versin 9.0 para Win-
dows (SPSS Inc, Chicago IL, USA).
Resultados
Separado por el espacio de una lnea de la seccin anterior,
se deber describir el captulo de resultados, presentado en forma
concisa y lgica, sin discusin o referencia a otro trabajo. Los
cuadros y fguras deben ser los mnimos necesarios y los datos no
deben ser repetidos en el texto y tampoco debern ser mostrados
simultneamente o reiterados.
Discusin
Esta seccin, separada por una lnea de la anterior, debe
evaluar e interpretar los resultados, relacionndolos a los de otros
estudios relevantes. No debe repetir resultados o presentar nuevos.
Debe ser diligentemente tratada en su desarrollo, hacindola de
manera lgica y concisa, estableciendo conclusiones, relevancias
y proyecciones del trabajo. Debe evitarse formular conclusiones
que no estn respaldadas con sus hallazgos ni sustentadas en
trabajos an no publicados.
Resumen
El resumen en espaol deber ser escrito en hoja aparte, y
deber ajustarse a las mismas normas sealadas para el summary.
Separadas por el espacio de una lnea se debern escribir las
palabras clave en letras minsculas, no debiendo ser ms de
cuatro y justifcadas en el lado izquierdo.
Agradecimientos
Deben ser breves y slo incluir personas o instituciones que
han hecho una contribucin directa, han provisto material necesario
o dado las facilidades para la realizacin del estudio.
Referencias
La precisin con la que son sealadas las referencias es de
responsabilidad de los autores y deben corresponder al artculo
original; asegrese que todos los artculos citados en el texto
estn incluidos en el listado de referencias y viceversa. En el
texto, las citas se deben indicar entre parntesis y en orden
cronolgico, citando el apellido del autor y la expresin y
col despus del apellido del primer autor, cuando son ms
de dos, Ej.: (Prez 1994, Castro y Martnez 1996, Cifuentes
y col 2002).
El listado de referencias debe ir en orden alfabtico de acuerdo
al apellido del primer autor y debe incluir el apellido e iniciales de
todos los autores. Cuando no se dispone del nombre del autor, use
el trmino annimo entre comillas, tanto en el texto como en el
listado de referencias. Las referencias, cuando son del mismo autor,
solo o con ms autores, deben ser escritas en orden cronol gico.
Las letras a, b, c, etc., deberan ser agregadas como superndice
cuando un autor escribe ms de un trabajo en el mismo ao. Los
nombres de los autores deben escribirse en minsculas, sin punto
entre las iniciales. Los nombres de las revistas y de los libros deben
ser en letra cursiva, usando la abreviatura estandarizada. Use los
siguientes ejemplos como gua.
Para artculos en revista:
Matamoros R, C Gmez, M Andaur. 2002. Hormonas de utili-
dad diagnstica en medicina veterinaria. Arch Med Vet 34,
167-182.
Severino G, M del Zompo. 2004. Adverse drug reactions: role of
pharmacogenomics. Pharmacol Res 49, 363-373.
Para captulos en libros o publicaciones ocasionales:
Horneck DA, RO Miller. 1998. Determination of total
nitrogen in plant tissue. In: Kalra YP (ed). Handbook of
Reference Methods foor Plant Analysis. 2
nd
ed. CRC Press,
Washington DC, USA, Pp 75-83.
Flrez J. 1992. Frmacos analgsicos opiceos. En: Flrez J (ed).
Farmacologa Humana. 2 ed. Masson-Salvat, Barcelona,
Espaa, Pp 25-28.
WHO, World Health Organization. 1972. International Drug
Monitoring: The role of national centres. Tech Rep Ser
WHO N 48.
SAG, Servicio Agrcola y Ganadero, Chile. 1996. Resolucin
Exenta N 3599 del 29 de noviembre de 2006.
Weinstein L, MN Swartz. 1974. Pathogenic properties of inva-
ding microorganisms. In: Sodeman WA Jr, Sodeman WA
(eds). Pathogenic physiology: Mechanism of Disease. WB
Saunders, Philadelphia, USA, Pp 457-472.
Para artculos y resmenes publicados en series regulares:
Contreras PA, V Ruiz, F Wittwer, H Bhmwald. 1998.
Valores sanguneos de triyodotironina (T
3
) y tiroxina (T
4
)
en vacas lecheras del sur de Chile. Resmenes del X Con-
greso Chileno de Medicina Veterinaria, Valdivia, Chile,
Pp 135-136.
Para memoria de ttulo:
Matthei SM. 2002. Determinacin de la presencia del receptor del
factor activante plaquetario en membranas de neutrflos de
bovino. Memoria de ttulo, Escuela de Medicina Veterinaria,
Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
Para tesis:
Vilanova LT. 2002. Presencia y funcionamiento del receptor GM-
CSF en espermatozoides bovinos y su relacin con la motilidad
espermtica. Tesis Doctoral, Facultad de Ciencias Veterinarias,
Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
Minimice el uso de resmenes como referencias. Evite usar
datos no publicados o comunicacin personal al menos que
de ello exista una forma escrita. Si esto ocurriera, debe hacerse
referencia en el texto como pie de pgina, pero no debe aparecer
en el listado de referencias. Las referencias a trabajos que han
sido aceptados para publicacin deben ser citados como en
prensa; sin embargo, trabajos que han sido sometidos a publi-
cacin, pero no han sido aceptados todava, deben ser referidos
como datos no publicados.
Direcciones de pginas Web no deben ser incluidas en las
referencias; si su uso es imprescindible, la direccin debe ser
sealada en el texto como pie de pgina, incluyendo fecha de
consulta.
INSTRUCCIONES COMPLEMENTARIAS
Cuadros
Las leyendas de los cuadros y fguras deben ser autoexpli-
cativos y presentarse en espaol e ingls.
Los cuadros deben ser el menor nmero posible, presentados
en hoja aparte, con sus respectivos ttulos en espaol e ingls en
la parte superior. La informacin de los cuadros no debe repetir
lo del texto. Los cuadros deben ser numerados consecutivamente
con nmeros arbigos, en el orden en que aparecen en el texto,
asignndoseles un ttulo breve y autoexplicativo que indique su
contenido. Sobre cada columna del cuadro debe colocarse un
encabezamiento corto o abreviado. Slo los encabezamientos de
las columnas y los ttulos generales se separan con lneas hori-
zontales. Las columnas de datos deben separarse por espacios y
no por lneas verticales. Cuando se requieran notas aclaratorias,
deben agregarse al pie del cuadro. Las notas aclaratorias para
todas las abreviaturas no estndar y las unidades de medidas
deben ser agregadas entre parntesis. Si se usan superndices para
sealar diferencias entre valores use a, b, c, minimice el nmero
DIRECCIN
Comit Editor Archivos de Medicina Veterinaria
Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile
e-mail: archmv@uach.cl - Fono-Fax: (56-63) 221459
www.veterinaria.uach.cl
www.scielo.cl
Casilla 567, Valdivia, CHILE
Representante Legal:
Vctor Cubillos Godoy
Rector de la Universidad Austral de Chile
de dgitos en cada columna. Informe el valor de cero como 0. El
ancho mximo de los cuadros no debe exceder los 80 mm para
una columna, o los 170 mm para dos columnas.
Figuras
Las fguras deben ser presentadas en hojas separadas con
sus respectivos ttulos en espaol e ingls en la parte inferior y
numeradas consecutivamente usando nmeros arbigos, segn
el orden en que aparecen en el texto. Ej.: Figura 1, no Fig. 1.
Denomine fgura a cualquier ilustracin que no sea cuadro,
Ej.: grfcos, radiografas, ecografas, electrocardiogramas,
fotografas, etc. Las fguras deben ser orientadas verticalmente
y acompaadas de una corta descripcin que contenga la expli-
cacin de todos los marcadores, lneas y smbolos usados. Si la
fgura tiene secciones, stas deben ser identifcadas como a, b,
c, etc., en la esquina superior derecha y debern ser descritas
en la leyenda.
Para el caso de fotografas, en el reverso y con lpiz a carbn,
deben sealarse con fecha la orientacin espacial, el nmero de
la fgura y el nombre del autor principal. Los smbolos, fechas
o letras, empleados en las fotografas, deben tener un tamao y
contraste sufcientes para distinguirlos de su entorno. Enve las
fguras protegidas en un sobre grueso y de tamao apropiado.
Las fguras pueden disearse a una o dos columnas de ancho (80
y 170 mm, respectivamente). Las reproducciones en colores de
las fguras deben ser fnanciadas por los autores.
Cuando las fguras no son originales debe sealarse la autora,
y cuando corresponda, se debe adjuntar la autorizacin del autor
para ser reproducidas.
Pruebas de imprenta
Una prueba de imprenta ser enviada al autor encargado de
la correspondencia, para su lectura y correccin puntual, y debe
ser devuelta al editor dentro del plazo que se especifque. Por
otra parte, el editor se reserva el derecho a corregir la prueba de
imprenta cuidadosamente, pero sin asumir responsabilidad de
tal, y de esta manera agilizar el proceso de publicacin.
La decisin fnal para la publicacin del trabajo ser en el
momento en que el Comit Editor acepte las correcciones, que
a sugerencia de los rbitros han realizado los autores. Modifca-
ciones a las pruebas de imprenta que no sean de errores menores
no sern aceptadas. Ni los editores ni la imprenta aceptarn
responsabilidad por la impresin de errores de los ar tculos que
los autores no hayan corregido en la prueba de imprenta.
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
JOURNAL ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA
Archivos de Medicina Veterinaria publishes, in Spanish
or English, original scientifc contributions such as scientifc
articles, reviews and short communications which can include
clinical observations, descriptions of methods or techniques
and advances in all aspects of veterinary science and animal
welfare.
SUBMISSION OF MANUSCRIPTS
Manuscripts should be submitted to the Editor via the on
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involving animals or humans.
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fulflls publication requirements. The authors may suggest
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be assessed by two referees. The referees will be selected by
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nominated by the authors. In the case of a disagreement
between the referees reports, a third referee will aid the
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PREPARATION AND FORM OF MANUSCRIPTS
Types of articles
Review articles: provide expert summaries of current
knowledge in a particular feld of veterinary science, and do
not necessarily have a set format. Authors should consult with
the Editor before initiating a review. The Editorial Committee
may solicit an expert to prepare a review, which will also be
refereed and edited. Reviews must not exceed 30 pages in length,
including tables, fgures and references. Only reviews in english
will be accepted.
Scientifc articles: report new advances in veterinary science
based on original research. The format must include summary,
introduction, material and methods, results, discussion, resumen,
acknowledgements (when pertinent) and references. The maximum
length of the manuscript is 20 pages, including tables, fgures
and references.
Short communications: briefly inform of an advance,
experimental result, clinical observations or new methodology,
with the following format: summary, introduction, material
and methods, results and discussion (combined), resumen,
acknowledgements (when pertinent) and references. The maximum
length of the manuscript is 12 pages, including tables, fgures
and references.
JOURNAL STYLE AND LAYOUT
General presentation: The journal publishes articles in
English or Spanish. Manuscripts must be written using 12 point
Times New Roman font with one and a half-line spacing, on one
side only of letter paper (21.5 x 27.9 cm) using 2 cm margins
on all sides. Pages must be numbered consecutively in the top
right corner, and lines must be numbered on the left, starting
with number one, on all pages.
Headings must be in upper case, left-justifed on a separate line
with no full stop following, eg. MATERIAL AND METHODS.
Only the frst letter of sub-headings is capitalized. Primary
sub-headings (eg. Experimental design) should be left-justifed;
secondary sub-headings are left-justifed and italicized. Do not use
underlining and do not number sub-headings or itemized lists.
In the text, numbers must be written in numerals. When a
sentence begins with a number or when necessary for clarity, this
should be written in words. A decimal point must be preceded
by a number (eg. 0.5 not .5) and a point is used to denote the
decimal in English and a comma in Spanish. All measurements
should be reported in IS units unless it is normal practice in a
discipline to use derivatives (eg. the Curie international unit).
Founded in 1969 ISSN 0301-732x
Journal indexed by the following international scientifc repertoires: Current Contents
Agriculture, Biology and Environmental Sciences (CC/AB and ES), Commonwealth
Agricultural Bureaux, International (C.A.B.I.), Dairy Science Abstracts, Veterinary
Bulletin, Animal Breeding Abstracts; Helminthological Abstracts S.A., Biological
Abstracts; Agrindex, Periodica, Focus on: Veterinary Sciences and Medicine.
Dates must be formatted as 07 September, 1954 in the text, but
they may be abbreviated in tables and fgures. Use the 24-hour
clock for times of day (e. g. 13:00 h).
Chemical nomenclature must be expressed using the
Biochemical Society Standards (Biochem J 209, 1-27, 1983),
generic names (in lower caps) must be used for medications.
If brands and sources of medications need to be included, this
should be included as a foot-note. Enzymes must be identifed
at frst mention, in accordance with the Enzyme Commission
of the International Union of Biochemistry.
Latin terminology and abbreviations commonly used in
scientifc literature, such as in vitro, in vivo, ad libitum must
be italicized. Probability values must be presented as P<0.05
or P<0.01. Standard deviation, standard error of the mean and
confdence intervals are abbreviated as follows: SD, SEM and
CI, respectively.
Title
Titles should be short, specifc and informative. The title is
centred in bold, starting at line 10 without using trade names or
abbreviations. Only the frst letter is capitalised. The superscript
symbol
#
should be used to indicate the source of funding, with
details given as a footnote, if appropriate.
Authors names and addresses
Authors names are written underneath the title, separated by
a space. Use initials (without stops) and surnames only, separated
by comas, as in the example: CT Westwood, E Bramley, IJ Lean.
Superscript letters should be used after each authors name to
identify the section, department, service or institute of the author
where the work was conducted. The corresponding author is
indicated using the superscript letter followed by an asterisk,
with the full contact details, including fax number and email
address indicated in the footnote.
Footnotes
These are used to defne abbreviations used in table titles,
commercial brands, the name and address of companies. They
must be indicated with numbers.
Resumen
The second page must contain a summary in Spanish (Resumen),
of no more than 250 words, that describes the objectives of the
study or research, the material and methods used, the principal
results and the most important conclusions. Non-standard
abbreviations must not be used. On a separate line, left-justifed
and separated by a space, up to four palabras clave (key words)
should be identifed.
Introduction
The subheading Introduction is written on the third page
on line 1. In the following line, indented by 5 spaces, the context
of the study is briefy presented without an extensive revision of
the theme, and only citing the most relevant references. When
appropriate, the hypothesis and objectives of the study must be
clearly and concisely presented. The one and a half-line spacing
between paragraphs must be kept.
Material and methods
Separated by one space from the previous section, this section
should contain suffcient detail to allow others to repeat the study.
When the frst reference in the text is made to medications or
chemicals, the generic name, dose and route of administration
should be indicated. For specialized equipment, the brand, model
and manufacturers name must be indicated.
Details of all statistical methods used must be given at the
end of this section under the sub-heading Statistical analysis
and should include adequate detail to allow readers to determine
precisely how data have been analysed and the units that are used
to express the results (mathematical mean, standard deviation,
standard error of the mean, mediums, ranges or confdence limits,
etc.). The use of parametric (Chi-square, students T-test, ANOVA,
etc.) or non-parametric (Wilcoxon, Kruskal-Wallis etc.) analyses
must be indicated. The name, version and sources of computational
statistical analysis programs must be identifed, eg. SPSS version
9.0 for Windows (SPSS Inc, Chicago IL, USA).
Results
Separated by one space from the previous section, this section
should contain a concise and logical description of the results
obtained without discussion or reference to other work. The
minimum number of tables and fgures should be included to
present the pertinent data without repetition, and data presented
in tables and fgures should not be repeated in the text.
Discussion
This section, separated by one space from the previous
section, should evaluate and interpret the results and relate these
to other relevant results. The results should not be repeated and
new results must not be presented in this section. Care should
be taken to ensure that the discussion is developed in a logical
and concise manner, and conclusions are reached, as well as a
discussion of their relevance. Conclusions that are not directly
supported by the data of the study or other unpublished studies
should not be presented.
Summary
The summary is written in English, and must be presented on
a separate page. The summary should contain the same elements
as the Resumen. On a separate line, following the summary,
left-justifed in small caps and separated by a space, up to four
key words should be identifed.
Acknowledgements
This section should be brief, and should only include people
or institutions that have made a direct contribution, provided
necessary material or have provided the facilities for the studys
development.
References
The accuracy of the reference section is the responsibility of
the authors and references must be verifed against the original
article. Please ensure that all articles cited in the text are included
in the reference list and vice versa. In the text, citations should
be listed in parentheses in chronological order, citing authors
names, and using et al after the frst authors name where there
are more than two (e.g. Prez 1994, Castro and Martnez 1996,
Cifuentes et al 2002).
The reference list must be ordered alphabetically according
to the frst authors name, and all authors names and initials
must be included. When no author is given, use the term
Anonymous in both text and reference list. References with
the same author, single or with coauthors, should be listed in
chronological order. The letters a, b, c, etc. should be appended
as a superscript when more than one work is cited from the
same author within the same year. Authors names should
appear with the initials and frst letter of the surname in upper
caps and the remainder of the surname in lower caps, with no
dots between initials. Journal titles and names of books should
be in italics using standard abbreviations. Use the following
examples as a guide:
For journal articles:
Matamoros R, C Gmez, M Andaur. 2002. Hormonas de utili-
dad diagnstica en medicina veterinaria. Arch Med Vet 34,
167-182.
Severino G, M del Zompo. 2004. Adverse drug reactions: role of
pharmacogenomics. Pharmacol Res 49, 363-373.
For chapters in books or occasional publications:
Horneck DA, RO Miller. 1998. Determination of total
nitrogen in plant tissue. In: Kalra YP (ed). Handbook of
Reference Methods foor Plant Analysis. 2
nd
ed. CRC Press,
Washington DC, USA, Pp 75-83.
Flrez J. 1992. Frmacos analgsicos opiceos. En: Flrez J (ed).
Farmacologa Humana. 2 ed. Masson-Salvat, Barcelona,
Espaa, Pp 25-28.
WHO, World Health Organization. 1972. International Drug
Monitoring: The role of national centres. Tech Rep Ser
WHO N 48.
SAG, Servicio Agrcola y Ganadero, Chile. 1996. Resolucin
Exenta N 3599 del 29 de noviembre de 2006..
Weinstein L, MN Swartz. 1974. Pathogenic properties of inva-
ding microorganisms. In: Sodeman WA Jr, Sodeman WA
(eds). Pathogenic physiology: Mechanism of Disease. WB
Saunders, Philadelphia, USA, Pp 457-472.
For articles and proceedings published in regular series:
Contreras PA, V Ruiz, F Wittwer, H Bhmwald. 1998. Valores
sanguneos de triyodotironina (T
3
) y tiroxina (T
4
) en vacas
lecheras del sur de Chile. Resmenes del X Congreso Chileno
de Medicina Veterinaria, Valdivia, Chile, Pp 135-136.
For dissertations:
Matthei SM. 2002. Determinacin de la presencia del receptor del
factor activante plaquetario en membranas de neutrflos de
bovino. Memoria de ttulo, Escuela de Medicina Veterinaria,
Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
For Theses:
Vilanova LT. 2002. Presencia y funcionamiento del receptor GM-
CSF en espermatozoides bovinos y su relacin con la motilidad
espermtica. Tesis Doctoral, Facultad de Ciencias Veterinarias,
Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
Minimise the citation of abstracts as references. Authors
are specifcally discouraged from citing unpublished data or
personal communication, unless this information exists in written
form, in which case the text should be referred to as a footnote,
but this should not appear in the list of references. References
to papers which have been accepted but not published should
be cited as in press, whereas manuscripts which have been
submitted for publication but not accepted should be referred
to as unpublished data.
Web pages should not be included as references. If so required,
web page addresses should be written as footnotes, including
date of consultation.
COMPLEMENTARY INSTRUCTIONS
Tables
The titles to tables and fgures should be self-explanatory
and must be presented in both Spanish and English.
The number of tables should be kept to a minimum and
presented on separate pages with their respective titles in
English and Spanish at the top. Information in tables must not
be repeated in the text. Tables must be numbered consecutively
with Arabic numbers in the order in which they are referred to in
the text. The brief title to the table should indicate the contents
of the table and should be understandable without reference
to the text. Each column of each table must have a short or
abbreviated heading. Only column headings and general titles
should be separated with horizontal lines. Data columns should
be separated by spaces and not vertical lines. When additional
explanatory information is required, this should appear at the
foot of the table. Explanatory information for non-standard
abbreviations and units should appear within parentheses. If
superscripts are used to indicate signifcant differences between
values, use a, b, c. Minimise the number of digits in each column.
Indicate a zero value as 0. Table widths should not exceed 80
mm for one column or 170 mm for two columns.
Figures
Figures should be submitted on separate pages, with their
respective titles in English and Spanish at the bottom and
numbered consecutively using Arabic numerals in the order they
are referred to in the text. Eg. Figure 1, not Fig. 1. Figures include
all illustrations that are not Tables, eg. graphs, radiographies,
ecographies, electrocardiograms, photographs, etc. Figures must
be vertically oriented and be accompanied by a short descriptive
caption that contains an explanation for all markers, lines and
symbols used but no abbreviations. If the fgure contains sections,
these should be labelled as a, b, c, etc. in the top right corner and
must be described in the caption.
The reverse of photographs must be marked using graphite
pencil with the number of the fgure, the frst author and an arrow
showing the orientation of the photograph. Symbols, arrows or
letters used should be of an adequate size and contrast to be
easily visible. Photographs should be submitted in a protective,
adequately sized envelope. Figures may be one or two column-
widths (80 or 170 mm, respectively). The cost of printing coloured
fgures must be met by the authors.
The authorship of non-original fgures must be acknowledged,
and when appropriate, authorization to reproduce these fgures
must be provided.
Proofs
A proof will be sent to the corresponding author for proof-
reading, and must be returned within the specifed time. Otherwise
the Editor reserves the right to carefully proof-read the article
but without assuming responsibility for errors, to continue with
the publication process.
The fnal decision regarding acceptance of the manuscript will
be taken when the Editorial Committee accepts the manuscript
following correction according to the referees comments.
Alterations to the proof that do not correspond to minor errors
will not be accepted. Neither the Editor nor the Publisher accept
any responsibility for printed errors which were not noted by the
authors at the time of proof-reading the proof.
BALOS, Pedro
ACOSTA, Gerardo
ADARMES, Hctor
AGUIRRE, Isabel
ALBERIO, Ricardo
ALFARO, Marta
ALFARO, Ana
ALOMAR, Daniel
ANTICEVIC, Sonia
APAOBLAZA, Ariel
ARAYA, Ariel
ARIAS, Sergio
BAHUAUD, Diane
BARR, Frances
BIANCHI, Gianni
BORIE, Consuelo
BONTEMPO, Valentino
BORROFKA, Susanne
BRIONES, Mario
BURGOS, Rafael
CARMONA, Jorge
CARRILLO, Bernardo
CARVALLO, Francisco
CASTRO, Fidel
CEBALLOS, Alejandro
CELEDN, Orfelia
CERN, Jos Joaqun
CHIHUAILAF, Ricardo
CONCHA, Ilona
CONTRERAS, Pedro
CORTI, Paulo
DE LOS REYES, Mnica
DUCHENS, Mario
DUFFY, Sergio
ESCOBAR, Arturo
FARAS, Carlos
FELMER, Ricardo
FERNNDEZ, Heriberto
FERREIRA, Adelina
FIGUEROA, Carlos
FREEMAN, Larry
FOLCH, Hugo
FRANJOLA, Rene
FUENTEALBA, Carmen
GAGLIOSTRO, Gerardo
GAJARDO, Gonzalo
GALECIO, Sebastin
GALLEGUILLOS, Marco
GALLO, Carmen
GANDARILLAS, Mnica
GARCA-PREZ, Ana
GIL, Horacio
GIL, Mnica
GONZLEZ-ACUA, Daniel
GOYCOECHEA, scar
GUTIRREZ, Claudio
GUTIRREZ, Luis
HENRQUEZ, J Eduardo
HERMOSILLA, Carlos
HIDALGO, M. Anglica
HUAQUN, Laura
ILLANES, scar
IRAIRA, Sergio
IVERSEN, Martin
JARAMILLO, Roberto
JEREZ, Viviana
KAUSEL, Gudrun
KENNEDY, Mark
LAGGER, Jos Rodolfo
LANUZA, Fancisco
LAPORTE, Jos
LARRAN, Rafael
LATORRE, Alejandra
LATORRE, Etel
LEDESMA, Paola
LEN, Ricardo
LETELIER, Claudia
LEYN, Vctor
MAGNADOTTIR, Bergljot
MARTNEZ, Emilio
MARTNEZ, Mario
MEDINA, Gonzalo
MNDEZ, Gabriela
MERINO, Victoria
MIERES, Marcelo
MOLINA, Eduarda
MONTI, Gustavo
MORALES, Mara A.
MORN, Jos M.
MOREIRA, Marcos
MUOZ, Pamela
MUOZ, Lisandro
MUOZ-ZANZI, Claudia
MURCHISON, Elizabeth
MURA, Roberto
NEIRA, Miguel
NEIRA, Roberto
NORO, Mirela
NOVALES, Manuel
NEZ, Mara Jos
NEZ, Ivn
NEZ, Rafael
OJEDA, Javier
OLIVA, Dolores
OLIVA, Marcelo
OLIVA-HERNNDEZ, Jorge
ORTEGA, Marcelo
ORTEGA, Csar
ORTLOFF, Alexander
OTTO, Brbara
ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA
El Comit Editor agradece a los revisores del volumen 42, 2010
PARRAGUEZ, Vctor
PERALTA, scar
PREZ, Benigna
PREZ, Rubn
PREZ, Patricio
PERFUMO, Carlos
POKNIAK, Jos
POMROY, Bill
PRITCHARD, Joy
PULIDO, Rubn
QUEZADA, Manuel
RAMREZ, Alfredo
REBBECK, Clare
RECABARREN, Sergio
REINHARDT, Germn
ROS, Carolina
RIVEROS, Luis
ROBLES, Carlos
ROMERO, Alex
ROSENFELD, Carla
RUBILAR, Luis
RUDORF, Heike
RUIZ, lvaro
SALMAN, Mo
SAUDO, Carlos
SHOEMAKER, Craig
SIEVERS, Gerold
SMITH, Pedro
SMULDERS, Juan Pablo
STEHR, Wolfgang
TAMAYO, Rafael
TARABLA, Hctor
TELLO, Luis
ULLOA, Jorge
VALDEBENITO, Ivn
VALENZUELA, Eduardo
VALENZUELA, Gastn
VANASCO, Bibiana
VARGAS, Luis
VERA, Milba
VERDUGO, Claudio
VERSTEGEN, Martin
VILA, Fernando
VITS, Luca
VON BRAND, Elisabeth
VON KEYSERLINK, Nina
WARAN, Nathalie
WIEGAND, Roberto
WIGGER, Antje
WILLIAMS, Jos de Jess
WINKLER, Federico
WITTWER, Fernando
YEZ, Alejandro
YUNG, Vernica
ZRRAGA, Ana Mara
SUSCRIPCIN
ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA
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Para renovar la suscripcin anual de nuestra revista (3 nmeros, abril/agosto/diciembre) puede visitar nuestra
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Editor, adjuntando el presente cupn.
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