Sade & Ambiente em Revista, Duque de Caxias, v.2, n.2, p.
11-22, jul-dez 2007
DNA FORENSE ARTIGO DE REVISO Luciana Cresta Dolinsky', Lissiane Miranda Campelo Veras Pereira' 'Cincias Biologicas IBC, Universidade do Grande Rio-Unigranrio
RESUMO Este trabalho tem a importncia de conceituar, por meio de diIerentes percepes, o DNA Iorense, bem como caracterizar seu uso e aplicaes. As tecnicas Iorenses permitem identiIicar pessoas pela analise de suas moleculas de DNA podendo, inclusive, auxiliar a justia na identiIicao de criminosos, utilizando analise de STRs e VNTRs. Estas analises so Ieitas em laboratorios de analise de DNA, e utilizam qualquer tipo de tecido ou Iluido biologicos que possam ser utilizados como Ionte de DNA, uma vez que so Iormados por celulas.
Palavras-chave: DNA Forense, identiIicao, material biologico.
ABSTRACT The main importance oI this work is to characterize use and applications oI Iorensic DNA. The Iorensic techniques can identiIy people by DNA molecular analysis including criminal analysis, using STR`s and VNTR`s, to help justice. These analysis are made in DNA`s laboratories and can use as DNA source any samples oI tissue or biological Iluids, composed by cells.
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INTRODUO
O primeiro caso de identiIicao criminal atraves de exames de DNA ocorreu em 1985, na Inglaterra. Num pequeno condado, rodeado de montanhas e com uma unica estrada de acesso, uma mulher Ioi estuprada e assassinada. "La havia um geneticista, Alec JeIIreys, que colheu o esperma encontrado na vitima e Iez o exame de DNA. Mais tarde houve outro crime similar. Novamente JeIIreys analisou o smen encontrado na vitima. Era do mesmo homem que cometera o primeiro crime", conta Jose Maria Marlet, proIessor de medicina legal da USP. As autoridades locais Iorjaram uma campanha de doao de sangue cuja Iinalidade era identiIicar o agressor. Todos os habitantes Ioram doar sangue, mas nenhum deles possuia DNA igual ao do estuprador. "A policia prosseguiu com as investigaes e descobriu que havia um viajante no condado. Quando o sujeito voltou, Ioi convidado a doar sangue. Feito o teste de DNA no sangue colhido, JeIIreys concluiu que o codigo genetico do viajante era o mesmo do estuprador", conta Marlet (AMABIS & MARTHO, 1995). A identiIicao humana por DNA e uma Ierramenta poderosa para casos de paternidade, assim como investigao criminal pela tipagem de evidncias biologicas coletadas em cenas de crime como estupro, homicidio, rapto, troca ou abandono de crianas e tambem na identiIicao de restos mortais em desastres ou campos de batalha. Contudo, devem-se utilizar os conhecimentos cientiIicos, tecnologicos e metodos de analise, para que essa associao seja Ieita de maneira correta. As evidencias biologicas (manchas de sangue, smen, cabelos, etc.) so encontradas em cenas de crimes e o DNA pode ser extraido dessas evidncias e estudado por tecnicas moleculares no laboratorio, permitindo a identiIicao do possivel suspeito. Assim, para que a tecnica de identiIicao pelo DNA seja plenamente realizada, a amostra biologica a ser analisada deve ser corretamente escolhida, transportada, coletada e armazenada (SILVA & PASSOS, 2006). O uso do DNA Forense na investigao criminal, no pode por si so provar a culpabilidade do criminoso, e tambem a inocncia do mesmo, mas pode estabelecer uma ligao entre esta pessoa e a cena do crime. Atualmente a identiIicao humana por DNA Forense, ja e aceita em processos judiciais em todo o mundo, sendo possivel inclusive a identiIicao de pessoas mortas, a dezenas, centenas de anos, utilizando DNA obtido de ossos ou dentes. O perIil de DNA ou PerIil genetico tem sido considerado um metodo importante na identiIicao individual, pois a inIormao contida no DNA e determinada pela seqncia como as letras do alIabeto genetico esto dispostas nos cromossomos. No caso do homem, existem trs bilhes dessas letras escritas nos cromossomos de cada celula do corpo humano, sempre na mesma ordem em todas as celulas do individuo. E a ordem como essas letras esto escritas nos cromossomos que Iaz com que cada individuo seja diIerente dos demais. Quanto mais diIerentes so os individuos, mais distinta e a ordem das letras no genoma. Individuos aparentados, irmos, pais e Iilhos, etc, apresentam proporcionalmente maior similaridade na seqncia gnica. Somente gmeos idnticos, que so clones humanos naturais, apresentam a mesma ordem ou seqncia gnica (BOREM et al., 2001). No perIil de DNA, somente algumas regies do DNA so analisadas. As regies escolhidas so aquelas que apresentam maior variao individual e Iacilidade de estudo. Essas regies so denominadas de marcadores geneticos ou moleculares. Os marcadores moleculares podem ser utilizados para caracterizar o DNA de um individuo em um padro ou perIil de Iragmentos que lhe e particular. Neste caso so utilizados marcadores polimorIicos, ou seja, regies que apresentam mais de um alelo por locus; em loci Iorenses, o alelo mais comum tem a Ireqncia menor que 0,6 (DUARTE et al., 2001). O metodo de STR (Short Tanden Repeats) e mais usado hoje em dia, e estuda regies repetitivas de DNA chamadas de minissatelites (VNTRs) e microssatelites (STRs). Na
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identiIicao humana utiliza-se quase que exclusivamente marcadores microssatelites STR. O estudo dos marcadores STR e Ieito utilizando a tecnica de reao em cadeia de polimerase (PCR, do ingls Polvmerase Chain Reaction). Com essa tecnica e possivel Iazer a tipagem do DNA utilizando quantidades minimas de amostras, como Iio de cabelo, celulas coletadas na borda de um copo usado pelo suspeito ou manchas de sangue em uma arma. Esse processo se Iaz in vitro (em vidro) para Iazer muitas copias de um Iragmento de DNA. A tipagem do DNA Forense se baseia nos mesmos principios Iundamentais e usa as mesmas tecnicas empregadas nas areas medica e genetica, tais como o diagnostico e mapeamento genetico, que analisam o proprio DNA. O sucesso da tipagem de DNA depende basicamente da qualidade e quantidade de DNA extraido das diversas Iontes. Nos exames de paternidade, o DNA e geralmente extraido de amostras colhidas em condies ideais: sem contaminao e com material genetico integro. Ja na determinao de identidade, o material obtido nem sempre esta em boas condies: as vezes ha pouco DNA, ou este esta contaminado ou degradado. Nesses casos, a extrao de DNA adequado para a analise talvez seja a etapa mais importante do processo. So tambem analisados polimorIismos presentes no DNA mitocondrial e no cromossomo Y, que so usadas em algumas ocasies. Mais recentemente, os abundantes polimorIismos de nucleotideo unico (SNP, do ingls single nucleotide polvmorphisms) e os polimorIismos de insero/deleo (indels) tm emergido como possiveis alternativas (LIMA, 2006).
USO FORENSE DO DNA
O DNA Forense e usado hoje na esIera criminal, para a investigao criminal e na esIera civil, para investigao de paternidade. O DNA Forense e aplicado na identiIicao de suspeito em casos de crimes sexuais (estupro, atentado violento ao pudor, ato libidinoso diverso da conjugao carnal); identiIicao de cadaveres carbonizados, em decomposio, mutilados, etc.; relao entre instrumento lesivo e vitima; identiIicao de cadaveres abandonados; aborto provocado; inIanticidio; Ialta de assistncia durante o estado puerperal; investigao de paternidade em caso de gravidez resultante de estupro; estudo de vinculo genetico: raptos, seqestros e traIico de menores; e anulao de registro civil de nascimento (LEITE, et al., 2005). Alem dos cuidados que devem ser tomados com todas as evidncias criminais e civis, nos casos que envolvem a analise de DNA, deve-se ter ateno em relao a contaminao das evidncias criminais que contenham material genetico. Por isso e importante o uso de luvas descartaveis, mascaras e gorros cirurgicos quando Ior Iazer a coleta, manuseio e processamento das evidncias.
Amostras biolgicas de Interesse Forense Qualquer tipo de tecido ou Iluido biologico pode ser utilizado como Ionte de DNA, uma vez que so Iormados por celulas. Nas celulas, o DNA de interesse Iorense encontra-se tanto no nucleo como nas mitocndrias (BEZERRA, 2004). Os tipos de amostras mais comuns so sangue, smen, cabelo, saliva, urina, pele, unha, ossos, liquidos amnioticos, vilosidade corinica, Iigado, musculo, suor, Iezes.
Podem ocorrer degradao e contaminao de DNA nos laboratorios e nos locais de crime. A degradao biologica do DNA e Ieita por enzimas produzidas por Iungo e bacterias, por causa da umidade e do calor. O DNA resiste bem ao calor (temperatura de ate 100C no o destroi), mas existe o problema da contaminao, que e a deposio de material biologico de outra pessoa na amostra. Por exemplo, num caso de estupro, quando o material coletado com swab pode conter smen (espermatozoide) do estuprador e Iluido vaginal com celulas da vitima (SILVA & PASSOS, 2006). Para um eIetivo controle da integridade Iisica do material biologico coletado, Iaz-se necessario a documentao de sua cadeia de custodia, que diz respeito a identiIicao de todas as pessoas que Iicaram responsaveis pela guarda da amostra, e das condies em que as mesmas se encontravam a cada nova transmisso, desde a
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coleta ate sua analise em laboratorio. As amostras biologicas merecem especial ateno devido a sua susceptibilidade a degradao e contaminao. Este controle e obtido mediante recibos assinados a cada transmisso de posse da amostra (SILVA & PASSOS, 2006).
INFORMAES SOBRE O DNA
Localizao do DNA O DNA esta na Iorma de cromossomos microscopicos, localizados no interior da celula, no nucleo (DUARTE, 2001). Fora do nucleo, no citoplasma da celula tambem e encontrado DNA de interesse Iorense. Este DNA esta localizado nas mitocndrias, organelas especializadas na produo de energia. Nos estudos rotineiros de identiIicao humana somente se estuda DNA nuclear. Nos casos em que no e possivel a tipagem utilizando-se DNA nuclear, pode ser usado DNA mitocondrial. Por exemplo, Iios de cabelos que no possuem mais bulbos e ossos antigos podem ser utilizados para extrao de DNA mitocondrial. Qualquer tecido ou Iluido biologico pode ser utilizado como Ionte de DNA, desde que possua celulas proprias ou celulas de outros tecidos. Por exemplo, na urina podemos encontrar celulas oriundas da bexiga, mucosa do pnis e celulas brancas do sangue, que podem ser utilizada em estudos de identiIicao. Da mesma Iorma podem ser encontradas celulas na saliva, lagrimas, suor, e em outras substncias orgnicas (SILVA & PASSOS, 2006). Nos seres humanos, o DNA que carrega o codigo genetico ocorre em todas as celulas que possuem nucleo, inclusive os globulos brancos, os espermatozoides, as celulas que envolvem as raizes capilares e as celulas encontradas na saliva. Estas so as celulas que oIerecem maior interesse para os estudos Iorenses (DUARTE, 2001). O DNA mitocondrial (mtDNA) e de origem extranuclear, e seu genoma circular e encontrado em grande quantidade no citoplasma das celulas. Esse DNA Ioi completamente seqenciado, e a regio que possui variaes de seqncia e chamada de regio controle. Uma das caracteristicas de interesse e o seu carater monoclonal, sendo que todo o mtDNA de um individuo apresenta a mesma seqncia. Entretanto, uma condio chamada de heteroplasmia pode existir, quando uma pessoa apresenta mais de um tipo de mtDNA. Dessa maneira, a analise de Iios de cabelo pode demonstrar resultados diIerentes ou ambiguos (JOBIM et al., 2006). O mtDNA e um marcador genetico de grande interesse na area Iorense, pois uma unica celula possui mais de 5.000 copias de mtDNA, associados a resistncia do mtDNA com estruturas circular, a digesto enzimatica. Assim, em grandes desastres (incndios, exploses, queda de avies,), quando e mais diIicil identiIicar os corpos, analisa-se o mtDNA e compara-se com seqncias obtidas de possiveis irmos ou ascendentes maternos (LIMA, 2006). Utiliza-se mtDNA quando a amostra em questo tem uma quantidade pequena ou no tem DNA nuclear; como, por exemplo, quando a unica amostra que temos do possivel criminoso e um plo ou cabelo sem bulbo. A tecnica tambem pode ser usada quando se quer Iazer um exame de maternidade e no se tem o pai. O mtDNA e de herana materna, sendo que recebemos esses marcador de nossas mes e temos identidade com nossos irmos e parentes proximos pela linhagem materna (JOBIM, et al.,2006). O cromossomo Y (crY) e transmitido pelo pai somente para os Iilhos homens, e a analise destas regies pode Iornecer importante inIormao quanto a origem parental dos individuos, embora no Iornea inIormao individuo-especiIico. Seus microssatelites so importantes na analise Iorense do DNA. Devido a Ialta de um cromossomo homologo, no existe recombinao durante a meiose. So so identiIicados alelos de origem masculina, herdados em bloco dos antepassados masculinos. A herana em bloco de alelos de diIerentes STR do mesmo cromossomo e denominada herana haplotipa, e o conjunto dos alelos chamam-se haplotipos (JOBIM, et al., 2006). A analise de microssatelites existentes no cromossomo Y (crY) tem sido utilizada para
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elucidar casos de estupro onde se tem mistura de material biologico e, por isso, de DNA. Alem disso, pode-se realizar teste de paternidade sem a me (LIMA, 2006). No cromossomo Y existem trs regies distintas. Duas pequenas regies so homologas ao cromossomo X e podem soIrer recombinao. No entanto, ha uma parte do cromossomo Y que e exclusiva e que no soIre recombinao com o cromossomo X e por isso e passada de pai pra Iilho sem soIrer qualquer alterao (LIMA, 2006). Estudos apontam um baixo indice de mutao, podendo os mesmos haplotipos serem encontrados em varias geraes de homens, alcanando talvez algumas centenas de anos (JOBIM, et al., 2006). Enquanto que no estudo de microssatelite de DNA de cromossomos somaticos um mesmo individuo pode possuir dois alelos, diIerentes ou no, para a mesma regio (o que signiIica homo ou heterogozidade), no estudo de microssatelite de cromossomo Y, cada homem possui apenas uma alelo, uma vez que possui apenas um cromossomo Y (LIMA, 2006).
REGIES HIPERVARIVEIS DA MOLCULA DE DNA
A analise de DNA tem como objetivo diIerenciar um individuo de outro, atraves de um grande numero de caracteristicas, dando-lhe uma identidade absoluta como pessoa, podendo assim ser diIerenciado dentre bilhes de outras (BONACCORSO, 2004). A variabilidade humana em termos de DNA e enorme. Dois genomas humanos escolhidos ao acaso diIerem aproximadamente em um de cada 500 pares de bases do DNA (nucleotideos). Como o genoma humano tem cerca de 3.109 pares de bases, isto implica em 6 milhes de diIerenas entre duas pessoas (LEE & GAENSSLEN, 1990; BONACCORSO, 2004). Na especie humana existem cerca de 50 mil genes que codiIicam, atraves de RNA, proteinas. Estes genes codiIicadores de proteinas representam, aproximadamente, 10 do genoma. Todo o restante trata-se de seqncias repetitivas que tm Iuno estrutural (PENA, 1997). E a variabilidade deste restante, quais sejam as regies hipervariaveis ou polimorIicas, de Iuno estrutural, que se utiliza nos exames Iorenses de DNA (BONACCORSO, 2004).
Tipos de polimorfismo Os polimorIismos presentes nas regies hipervariaveis do DNA podem ser agrupados em dois tipos: polimorIismos de comprimento e polimorIismos de seqncia. O primeiro tipo inclui as regies STR ("short tandem repeat") e VNTR ("variable number of tandem repeat"), e e caracterizado por seqncias de nucleotideos que se repetem em multiplas copias, variando o numero de repeties entre os individuos para cada locus. Os polimorIismos de seqncia so compostos de diIerentes nucleotideos em uma determinada localizao do genoma. Estas variaes em seqncia podem ser maniIestadas como regies de alelos alternativos ou substituies, adies ou delees de bases. Em geral, originam-se de mutaes pontuais (PARADELA et al, 2006). A grande diversidade nestas regies e que o numero de repeties de uma dada seqncia de bases, que pode ser de 1 a 4 bases nos STRs e de 10 a 100 pares de bases nos VNTRs, varia entre individuos. Assim, em Iuno da quantidade de repeties presentes, cada individuo tera um tamanho diIerente para a regio do DNA que contem um dado STR ou VNTR. Cada possibilidade de tamanho (ou de numero de repeties) que pode ser encontrada representa um alelo (LIMA, 2006). Os minissatelites so Iormados por seqncias de varios nucleotideos, por exemplo, (AATGCGGTACTGAGCC)n, repetidas em numeros diIerentes em cada individuo, dando-lhe uma caracteristica unica. Um locus de minissatelites pode ter muitos alelos em Iuno do numero de vezes (n) em que essa estrutura e repetida ao longo do DNA, deixando a populao polimorIica em relao ao locus. Os loci de minissatelites so conhecidos tambem como numero variavel de repeties em seqncia
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(VNTR, do ingls variable number of tandem repeats) (JOBIM, et al., 2006). -Os loci de microssatelites, ou repeties curtas consecutivas (STR, do ingls short tandem repeats), so parecidos com minissatelites, mas com estrutura repetida menor (GATA)n (JOBIM et al, 2006). Para a identiIicao de individuos e necessario a utilizao de regies polimorIicas de DNA. Quanto mais loci so testados, maior a probabilidade de acerto. Para testes de paternidade e Iorense, ate 18 loci diIerentes so testados. Normalmente so utilizados STR (short tandem repeats), que so regies repetitivas de DNA (de 1 a 4 nucleotideos), altamente polimorIicos (polimorIismo de tamanho) e Iacilmente tipados. As bases para a utilizao dos testes de identiIicao da individualidade humana, pelo estudo, do DNA, encontram-se na diversidade ou polimorIismo dos diversos loci de minissatelites, microssatelites ou HLA (antigenos leucocitarios humano). Cada um de nos apresenta um cromossomo materno e um paterno, e as segregaes destas estruturas repetitivas seguem a lei de Mendel, em que um alelo e de origem materna e outro, paterna, para cada locus (JOBIM, et al., 2006).
Tcnicas de deteco do DNA Apos a extrao do DNA presente no material em questo, segue-se a analise dos polimorIismos geneticos. Nos ultimos anos Ioram desenvolvidas diversas tecnicas para estudo de diIerentes tipos de polimorIismos de DNA, no qual os cientistas e laboratorios podem escolher o metodo mais adequado para solucionar o problema. A expresso correta e 'teste em DNA (LIMA, 2006). O polimorIismo de tamanho para Iragmento de restrio (RFLP, do ingls Restriction Fragment Length Polvmorfism), e uma tecnica em que os organismos podem ser diIerenciados pela analise de padres derivados da clivagem do seu DNA. Se dois organismos diIerirem na distncia entre os sitios de clivagem de uma endonuclease de restrio, o comprimento dos Iragmentos produzidos vai diIerir quando o DNA Ior digerido com uma enzima de restrio (CARRAPA, A et al.,2005). Para a deteco de RFLP`s, pode ser usada a metodologia de 'Shouthern Blot, descrita em 1975 por Edmund Southern, que permite a identiIicao de Iragmentos de DNA com seqncias idnticas ou similares a sonda utilizada, e pode tambem auxiliar no posicionamento relativo de diIerentes Iragmentos dentro de um Iragmento maior de DNA. Essa tecnica pode ser utilizada tambem na identiIicao de polimorIismos que determinam a alterao de clivagem obtidos a partir de uma determinada regio do DNA (RFLP) (ZAHA, 2003). Apos restrio enzimatica os Iragmentos de DNA genmico so sujeitos a eletroIorese em gel e so transIeridos para um suporte solido de nitrocelulose atraves do arrastamento por capilaridade. Apos hibridizao com sondas radioativas, este processo possibilita a identiIicao, entre milhares de Iragmentos de restrio obtidos, de seqncias bem determinadas. (CARRAPA et al., 2005). Os VNTR so seqncias curtas de bases que ocorrem em numeros variaveis dentro dos grupos de repeties em tandem (so encontrados proximos uns aos outros). O numero de repeties encontradas em um grupo pode variar de um local para o seguinte dentro do genoma de um determinado individuo, e ira variar entre individuos, exceto em gmeos idnticos (MALACINSKEI, 2005; ZAHA, 2003). Existem dois tipos de repeties: repeties de microssatelites ou STR, que so repeties curtas em tandem de 2 a 5 nucleotideos ocorrendo em muitos locais pelo genoma inteiro, e as repeties minissatelites, que so unidades de repeties maiores de 30 a 35 pares de bases contendo uma seqncia-cerne comum mais curta. Essas repeties tendem a ocorrer em menos locais dentro do genoma do individuo (MALACINSKEI, 2005). Para detectar os padres de VNTR, o DNA e cortado com uma enzima de restrio que no corta o VNTR, mas corta para incluir todo o trecho repetido. Os Iragmentos de restrio produzidos so separados via eletroIorese em gel. A transIerncia de Southern e Ieita, usando sonda
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radioativa que se hibridiza com a unidade basica de repetio. Com a radiograIia, se revela a presena de um grande numero de Iragmentos de DNA de tamanhos diIerentes que se hibridiza com a sonda. O numero de repeties em tandem diIere de um individuo para o outro, e o que ocorre e um padro altamente individual de Iragmentos de DNA, chamado de fingerprint de DNA, que e usado hoje na area Iorense (MALACINSKEI, 2005). Portanto, pequenas amostras de DNA, presentes em uma gota de sangue, Iragmentos de pele ou Ioliculo capilar podem ser ampliIicadas via PCR e usadas para inocentar ou incriminar um suspeito (MALACINSKEI, 2005). Apresentam um padro que varia de pessoa para pessoa, exceto em gmeos idnticos (ZAHA, 2003). Os VNTR tm uma taxa de mutao muito elevada, o que leva a alterao em seu comprimento. Cada mutao altera o comprimento em apenas uma ou poucas unidades de repetio. O resultado e um numero muito grande de alelos, nenhum deles sendo comum (DUARTE, 2001). As sondas de DNA so curtos seguimentos de Iita simples, marcados quimica ou radioativamente, que so usadas para detectar a presena de uma seqncia particular de DNA atraves de hibridizao a sua seqncia complementar (DUARTE, 1999). Existem sondas unilocais (SLP), que estudam cada locus individualmente, e sonda multilocais, que avaliam muitos loci ao mesmo tempo, conhecidos como impresso digital do DNA (JOBIM et al .,2006 a pud JEFFREYS, 1987). As sondas unilocais (SLP) analisam cada locus de minissatelites do DNA (VNTR) individualmente pelo metodo de RFLP, permitindo a observao de alelo de origem materna e outro de origem paterna (JOBIM et al., 2006 a pud Balazs,1993). Os sistemas de SLP so adotados por serem mais sensiveis, mais Iacilmente interpretados e por possuirem uma genetica deIinida (JOBIM et al., 1999). As sondas multilocais estudam um grande polimorIismo na mesma reao, com isso podem conIundir o tecnico pela quantidade exagerada de bandas de DNA existente. Esses testes tm sido pouco utilizados. Atualmente os STR so mais utilizados na area Iorense. A PCR Ioi descrita em 1985, por Kary Mullis que, em 1993, recebeu o prmio Nobel em quimica por seu Ieito. Desde o inicio, a PCR Ioi reconhecida como uma resposta em potencial para quantidade de liquido biologico Ireqentemente encontrado na area Iorense. Estas amostras so diminutas para serem utilizadas com os metodos de RFLP (JEFFREYS et alii, 1988). A reao em Cadeia da Polimerase (PCR, do ingls Polvmerase Chain Reaction), e uma tecnica qualitativa simples, pelo qual moleculas de DNA ou DNA complementar so ampliIicadas milhares de vezes ou milhes de vezes de uma Iorma bastante rapida. Todo o procedimento e realizado in vitro, gerando DNA em quantidade suIiciente para analises posteriores. A tecnica e extremamente sensivel, possibilitando a ampliIicao de DNA a partir de uma quantidade minima de amostra (ZAHA, 2003). O DNA e resistente a muitas condies que destroem a maioria dos outros compostos biologicos, como as proteinas, e somente pequenas quantidades de DNA so necessarias. A PCR tem um grande potencial na medicina Iorense. Sua sensibilidade torna possivel utilizar uma amostra bastante pequena (traos minimos de sangue e tecido que poderiam conter os restos de somente uma unica celula) e ainda se obter uma 'impresso digital de DNA da pessoa da qual a amostra Ioi coletada, podendo assim Iazer comparaes com aqueles obtidos de vitimas e suspeitos de casos de inIrao penal (SILVA & PASSOS, 2006). Os loci de microssatelites conhecidos como STR (short tandem repeats ou repeties curtas consecutivas) apresentam alelos ou Iragmentos de DNA de 100 a 300 pares de bases, e so usados na analise pericial de casos de identiIicao humana em que a amostra e escassa ou parcialmente degradada (JOBIM et al, 2006 a pud MULLIS, 1987; HOCHMEISTER,1998). Nas regies polimorIicas, o genoma de cada ser humano (exceto dos gmeos idnticos) e diIerente, sendo possivel ampliIicar essas regies.
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Portanto usa-se a pesquisa de STRs (Small Tandem Repeats) atraves da PCR, utilizando um conjunto de iniciadores que cobrem estas partes altamente variaveis do genoma humano, e podem gerar uma impresso digital caracteristica de DNA para cada individuo (BRUCE, 1999). Segundo JOBIM et al (2006), com a tecnica, por exemplo, de PCR, pode se Iazer a identiIicao do sexo do individuo que deixou o vestigio biologico. O locus da amelogenina apresenta um alelo de 106 pares de bases nas mulheres e um de 106 e outro de 112 pares de bases nos homens. PCR Multiplex e a ampliIicao de diversos STR no mesmo tubo de ensaio. E uma tecnica de PCR na sua Iorma mais simples, que ampliIica regies especiIicas do DNA, e utiliza um conjunto de iniciadores diIerentes. Quanto mais regies so ampliIicadas, mais conIiavel e a tecnica e se tem o conhecimento previo das seqncias (ou seja, do gene/ regio de interesse). Essa metodologia de ampliIicao multipla depende de que a temperatura de anelamento dos primers seja idntica e o tamanho dos alelos diIerentes, para que possam ser analisados no mesmo gel de poliacrilamida, corado com prata, ou identiIicado pelo laser de um seqenciador automatico. A possibilidade de marcao dos loci de STR com diversos Iluorocromos permite a identiIicao dos multiplex de tamanhos semelhantes (JOBIM et al., 2006 a pud BRI NKMAN, 1998). Atualmente, so comercializados produtos que ampliIicam ate 16 loci em uma unica reao de PCR, analisando-se o produto ampliIicado pela PCR em seqenciadores de DNA. Escalas alelicas (ladders) possibilitam a identiIicao dos alelos existentes nos loci analisados (JOBIM et al., 2006). Os marcadores bialelicos (SNP`s), tem sido muito utilizado na genetica Iorense, mesmo com seu pequeno poder de discriminao. Mais de um milho de SNP esto dispersos no genoma humano, sendo que em cada loco, existe a possibilidade da existncia de somente um (homozigose) ou dois nucleotideo (heterozigose). A possibilidade de ampliIicao em Iorma de multiplex Iacilita a utilizao dessa tecnologia (JOBIM, et al., 2006). Essa tecnica e recente e soIisticada. A grande vantagem sobre os microssatelites e que podem ser estudados em produtos de ampliIicao muito curtos (50pb ou menos), sendo muito uteis quando se tem DNA muito degradado (LIMA, 2006).
PERFIL DO DNA
O perIil de DNA e uma simples e rapida maneira de se comparar seqncias de DNA de dois ou mais individuos. O exame de perIil do DNA tambem pode ser usado para casos de disputa por propriedade de linhagens e variedades melhoradas, paternidade, determinao de sucesso de bens por herana, propriedade de orgos construidos em laboratorio e identiIicao de cadaveres, entre outros (BOREM et al., 2001). As impresses digitais podem ser alteradas por cirurgias, o DNA de uma pessoa no pode ser alterado (BOREM et al., 2001). Existem casos em que a mesma pessoa nasce com dois perIis diIerentes de DNA, e no ha como conIirmar. E raro, mas a cincia ja diagnosticou a existncia de pessoas portadoras de dois perIis de DNA, um diIerente do outro. O Ienmeno causa diIiculdades na soluo de crimes, pois a excluso ou a conIirmao do envolvimento de um suspeito em casos de homicidios, estupros, identiIicao de ossadas e testes de paternidade Iica prejudicada, ja que o sangue do individuo pode apresentar um DNA diIerente da amostra coletada em um dos tecidos do organismo do suspeito (MUG, 2006). Durante a gestao, gmeos no idnticos podem se Iundir no utero, Iormando um unico embrio a partir de dois ovulos e dois espermatozoides com carga genetica distinta, e originar um individuo com dois tipos de celulas diIerentes. O Ienmeno e chamado de quimerismo, o termo quimera vem do grego e designava uma criatura mitica, parte leo, parte serpente e parte bode (MUG, 2006).
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Obteno do perfil do DNA. O padro de Iragmento do DNA ou perIil de DNA de uma pessoa pode ser obtido pela analise do seu material genetico. O procedimento inclui sete etapas: Coleta da amostra; Isolamento do DNA; Corte do DNA; Separao dos Fragmentos; TransIerncia do DNA; Hibridizao de sondas; e PerIil do DNA. * Coleta da amostra: sangue, saliva, smen, plo, dente, ossos ou qualquer outro tecido ou Iluido do individuo (BOREM et al., 2001). Segundo BUDOWLE (1996), a qualidade, exatido e conIiabilidade dos resultados obtidos na analise de DNA, em vestigios coletados ou relacionados a ocorrncias criminais, dependem de procedimentos proprios, que devem ser rigorosamente adotados nas etapas do isolamento do local do delito e do levantamento das amostras biologicas a serem encaminhadas para a unidade orgnica responsavel pela genotipagem Iorense, no mbito da respectiva Instituio. As evidncias Iisicas soIrem com Iatores ambientais (luz, elevadas temperaturas, reativos quimicos, substncias corrosivas, ataque enzimatico, contaminao/degradao por microorganismos, com conseqentes quebras e outras alteraes da cadeia de polinucleotideos) que modiIicam a composio e a estrutura normal de seu DNA. Essas evidncias esto ainda sujeitas as mais diversas Iormas de contaminao por material genetico exogeno, derivado de outros seres humanos que no necessariamente esto ligados a cadeia de eventos do ato delituoso em questo (BONACCORSO, 2004). * Isolamento do DNA: O DNA deve ser extraido das celulas ou dos tecidos das amostras. Dependendo do metodo de analise utilizado, uma pequena quantidade da amostra pode ser suIiciente, como, por exemplo, as celulas descamadas da epiderme da testa do individuo, depositadas em um bone por ele utilizado. Uma goticula de saliva deixada em um teleIone ou no selo de uma carta pode tambem conter DNA suIiciente para as analises (BOREM et al.,2001). * Corte do DNA: a etapa seguinte e a digesto ou Iragmentao do DNA com uma enzima de restrio. As enzimas Hind III, EcoR I, entre outras, tm sido utilizadas para essa Iinalidade. Apos o DNA ser tratado com a enzima de restrio (Uma enzima que cliva a molecula de DNA em uma determinada seqncia curta de base), ira conter um grande numero de Iragmentos de diIerentes tamanhos; (BOREM et al., 2001). * Separao dos Fragmentos: os Iragmentos de DNA so ordenados por tamanhos, utilizando- se a tecnica da eletroIorese (tecnica em que diIerentes moleculas so separadas com base na sua velocidade de migrao em um campo eletrico). Esse procedimento consiste em submeter os Iragmentos do DNA de um gel, a uma corrente eletrica. O gel utilizado e Ieito com agarose, substncia extraida de algas marinhas. O gel de agarose possui uma consistncia similar a da gelatina. O procedimento consiste em depositar os Iragmentos de DNA em uma canaleta (um pequeno sulco) moldada na extremidade do gel proxima ao eletrodo negativo. Com a corrente eletrica, o DNA migrara dentro do gel na direo oposta, isto e, em direo ao eletrodo positivo. Os Iragmentos menores de DNA migram mais rapidamente que os maiores, permitindo, separa- los por tamanho (BOREM et al., 2001). * TransIerncia do DNA: apos a separao dos Iragmentos no gel, eles so transIeridos do gel para uma membrana de nailon, por capilaridade. Uma vez Iixados nessa membrana, os Iragmentos podem ser manipulados para sua visualizao (BOREM et al., 2001). * Hibridizao de sondas: a adio de sondas coloridas ou radioativas a membrana de nailon permite a visualizao dos Iragmentos, que possuem seqncias gnicas complementar a sonda. Cada sonda utilizada evidncia apenas alguns dos Iragmentos presentes na membrana (BOREM et al., 2001). * PerIil do DNA: o perIil Iinal do DNA e constituido, apos a hibridizao, de diIerentes sondas a membrana. O resultado e um padro de bandeamento de diIerentes tamanhos (BOREM et al., 2001).
EXAME COMPARATIVO DO DNA
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O DNA pode ser extraido de uma pequena amostra de qualquer material biologico, como sangue, cabelo, unha, smen, saliva, urina, entre outros. O exame de DNA da-se de Iorma comparativa, ou seja, de cada uma das amostras so selecionados trechos signiIicativos do DNA (locus). No minimo, 13 loci so analisados veriIicando-se o comprimento das seqncias das bases do DNA (alelos). A partir disso, so gerados perIis de DNA que so comparados entre si. A relao entre os alelos e que vai mostrar se existe vinculo genetico Iamiliar ou no. Depois, so realizados calculos estatisticos para estimar o numero de vezes em que esse perIil ocorre na populao. A possibilidade de que duas pessoas tenham as mesmas seqncias dos trechos de DNA e estimada em uma em seis bilhes (GUERRA, 2007).
BANCO DE DADOS CRIMINAL
E usado para Iazer comparao dos perIis geneticos obtidos de suspeitos com os cadastrados no banco e identiIicao de criminosos a partir de outros crimes. A tecnologia em questo pode ser usada para provar a inocncia ou culpa de suspeitos, identiIicar restos mortais e amostras biologicas. Usa-se o Sistema CODIS (Combined DNA Index Svstem) do FBI / EUA (todo o pais), que preconiza no minimo 13 regies de STR (SILVA & PASSOS, 2006). As 13 regies so: D3S1358, VWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820, CSF1PO, TPOX, THO1 e D16S539 (GRATTAPAGLIA et al., 2001).
CONCLUSO E RECOMENDAES
Conclui-se, que houve nos ultimos anos, um grande crescimento da area Iorense no Brasil e novas tecnicas so empregadas nos laboratorios, que ja se encontram com equipamentos de primeiro mundo. Apontada como a maior revoluo cientiIica na esIera Iorense desde o reconhecimento das impresses digitais como uma caracteristica pessoal, as tecnicas de identiIicao Iundamentada na analise do DNA, ostentam duas vantagens sobre os metodos convencionais de identiIicao: a estabilidade quimica do DNA, mesmo apos longo periodo de tempo, e a sua ocorrncia em todas as celulas nucleadas do organismo humano, o que permite condenar ou absolver um suspeito com uma unica gota de sangue ou atraves de um unico Iio de cabelo encontrado na cena do crime. O estudo do DNA e seu emprego na area Iorense auxiliam muito na apurao de paternidade, quando ja e Ialecido o suposto pai. As amostras mais Ireqentes nos laboratorios, para realizao de pericias, so, pela ordem, o sangue (liquido ou sob a Iorma de mancha seca), o smen (colhido no exsudato vaginal, peas intimas ou manchas), os plos (no qual o DNA esta concentrado na raiz) e os objetos com saliva (a saliva no contem celulas, mas nela podem ser encontradas celulas epiteliais da cavidade bucal, as quais possuem DNA); restos cadavericos, amostra de musculos, ossos e polpa dentaria. Considerando que a analise de DNA e uma tecnica poderosa de identiIicao, ela deve ser utilizada de Iorma correta. O nivel de sensibilidade de alguns dos procedimentos de identiIicao por DNA e to alto que as celulas das mos de quem manipulam as amostras ou aqueles presentes em um espirro podem contaminar as evidncias criminais que contenham material genetico. Dessa Iorma, o cuidado na coleta, custodia e manipulaes da amostra so determinantes para a validade das analises. Portanto e importante a utilizao de luvas descartaveis, alem de mascaras e gorros cirurgicos quando da coleta e processamento das evidncias. Os procedimentos de coleta e as analises iniciais devero ser padronizados, atraves de manuais de coletas. Os laboratorios que prestam esse tipo de servio devem ser submetidos a testes, para assegurar que eles estejam trabalhando com um controle de qualidade aceitavel, uma vez que esta em jogo a liberdade de um inocente e a sentena para o autor do delito.
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As inIormaes de carater tecnico no so completamente entendidas por uma parcela dos proIissionais da lei. E muito diIicil estabelecer um paralelo com outras Ierramentas cientiIicas empregadas pela justia, ja que nenhuma se compara a investigao genetica no tocante ao seu alto poder de discriminao.
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Recebido em / Received: Agosto de 2007 Aceito em/ Accepted: Novembro de 2007