UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

PRACTICAS DE LABORATORIO

MICROSCOPIA
Maye Bernal Rivera Profesora Asistente

El MICROSCOPIO
1. 2. 3. 4. 5. 6. Historia Componentes Uso Cuidado Mantenimiento y Precauciones Utilidad para el mdico

HISTORIA
La palabra microscopio viene del griego mikro, pequeo y skop, visin. Los microscopios son instrumentos que nos permiten observar objetos pequesimos que no se pueden ver a simple vista ni con la ayuda de una lupa. La palabra microscopio fue utilizada por primera vez por los componentes de la "Academia dei Lincei" una sociedad cientfica a la que perteneca Galileo y que publicaron un trabajo sobre la observacin microscpica del aspecto de una abeja. El primer microscopio fue inventado, por una casualidad en experimentos con lentes segn los Italianos hacia 1610 por Galileo y segn los holandeses por Zacharas Janssen (15801638) quien invent un microscopio con una especie de tubo con lentes en sus extremos, de 8 cm. de largo soportado por tres delfines de bronce; pero se obtena imgenes borrosas a causa de las lentes de mala calidad. Estos primeros microscopios aumentaban la imagen 200 veces. Sin embargo las primeras publicaciones importantes en el campo de la

Microscopio desarrollado por Anthony van Leeuwenhoeks

microscopia aparecen en 1660 y 1665 cuando Malpighi prueba la teora de Harvey sobre la circulacin sangunea al observar al microscopio los capilares sanguneos y el ingls Robert Hooke (1635-1701) publica su obra Micrographia, con dibujos de sus observaciones. Sus aparatos usaban lentes relativamente grandes. A mediados del siglo XVII un comerciante holands, Leenwenhoek, utilizando microscopios simples de fabricacin propia describi por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glbulos rojos. Durante este siglo muchos estudiosos de las lentes y los microscopios hicieron toda clase de pruebas y ensayos para lograr un resultado de mayor precisin. Entre los intentos fue el del italiano Marcello Malpighi (1628-1694) que en 1660 logr ver los vasos capilares de un ala de murcilago. El holands Antonie

van Leeuwenhoek (1632-1723), perfeccion el microscopio usando lentes pequeas, potentes, de calidad, y su artefacto era de menor tamao. Alrededor del 1676 logr observar la cantidad de microorganismos que contena el agua estancada. Tambin descubri los espermatozoides del semen humano; y ms adelante, en 1683, las bacterias. Durante el siglo XVIII el microscopio sufri diversos adelantos mecnicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso aunque no se desarrollaron mejoras pticas. Las mejoras mas importantes de la ptica surgieron en 1877 cuando Abbe publica su teora del microscopio y por encargo de Carl Zeiss mejora la microscopa de inmersin

sustituyendo el agua por aceite de cedro lo que permite obtener aumentos de 2000A principios de los aos 30 se haba alcanzado el limite terico para los microscopios pticos no consiguiendo estos, aumentos superiores a 500X o 1000X sin embargo exista un deseo cientfico de observar los detalles de estructuras celulares ( ncleo, mitocondria... etc.). Los microscopios pticos actuales permiten agrandar la imagen ms de 2000 veces. Pero recin en el Siglo XX lleg el gran cambio, el microscopio electrnico de transmisin (T.E.M.) fue el primer tipo de microscopio electrnico desarrollado; este utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de 100.000 X. Fue desarrollada por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931. Posteriormente, en 1942 se binocular de ptica avanzada. Siglo IX desarrolla el microscopio Microscopio electrnico de barrido (SEM). Estos microscopios podan ampliar las imgenes hasta 7000 veces. Se continu perfeccionando hasta llegar a aumentar unos dos millones de veces. Y en la actualidad los Microscopios Electrnicos de efecto tnel amplan la imagen hasta 10 millones de veces.

PARTES DE UN MICROSCOPIO PTICO

cabezal

oculares

revlver objetivos platina

brazo Desplazamiento platina condensador macromtrico

foco

micromtrico

base

Sistema ptico OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo. OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta.

CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

Sistema mecnico SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. PLATINA: Lugar donde se coloca la preparacin. CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y Micromtrico que consigue el enfoque correcto

MANEJO DEL MICROSCOPIO PTICO

Observacin de preparaciones en fresco 1. Bajar la platina hasta el tope 2. Colocar el objetivo de menor aumento (4x) en posicin de observacin 3. Colocar la preparacin sobre la platina 4. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos 5. Mirar a travs de los oculares y lentamente, ir separando el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntido la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino. 6. Pasar al objetivo 10x La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 4.

7. Pasar al objetivo de 40x el cual enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin. Observacin de preparaciones con objetivo de inmersin 1. Bajar al tope la platina. 2. Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que colocarse la gota de aceite. 3. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de x40. 4. Dejar caer una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz, sin permitir que el gotero toque la preparacin 5. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin. 6. Mirar directamente al objetivo y lentamente subir la platina hasta que la lente toque la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. 7. Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. 8. Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operacin desde el paso 3. 9. Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin. 10. Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio.

CUIDADO

En la observacin 1. Colocar el microscopio en una mesa fija, de modo tal que pueda sentarse con comodidad para ver el ocular sin apoyarse. 2. No bajar la lente mientras se est mirando por el microscopio. Puede golpear el portaobjeto y romperlo o romper la lente. 3. El objeto a observar debe estar muy bien iluminado. Si los objetos son opacos deben ser iluminados desde arriba para poder verlos en detalle. 4. Colocar el portaobjeto sobre la platina de manera tal que la parte que se quiera observar se encuentre bajo la lente. 5. Fijar siempre el portaobjeto con los broches Al finalizar el trabajo 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Bajar la preparacin Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de observacin Limpiar con papel suave secante la platina Limpiar los objetivos con papel ptico Bajar la intensidad de luz de la lmpara Apagar el microscopio Desenchufar Dejar enfriar el bombillo, antes de transportarlo a la Sala de Microscopios

9. Colocar una mano en la base y la otra en el brazo o columna y desplazarlo en posicin erguida. No inclinarlo ya que se pueden caer los oculares. 10. Cubrir el microscopio con la funda y colocarlo en su estuche correspondiente

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
1. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macromtrico, micromtrico, platina, revlver y condensador). 2. El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. 3. No cambiar nunca de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est observando a travs del ocular. 4. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algn lquido, secarlo con un papel suave absorbente. 5. No dejar los preparados sobre la platina, y menos an si el microscopio est encendido. Tanto en la lupa como en el microscopio ptico se destruir

6. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o etanol-ter (9:1). NUNCA utilizar xilol para limpiar las lentes. 7. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesin prctica y, al acabar el curso, encargar a un tcnico el ajuste y revisin general de los mismos. 8. No extraer las lentes ni tocarlas con los dedos. 9. Apagar mientras no se est utilizando

PRACTICA DE LABORATORIO
OBJETIVOS Utilizar el Microscopio de luz corriente como instrumento ptico para visualizar en preparaciones previamente coloreadas, estructuras de diferentes grados de complejidad biolgica que, por su tamao, no son observables con el ojo desnudo. Identificar el microscopio de luz, definir sus partes y especificar la funcin que cumple cada una. Describir los principios pticos y no pticos que rigen el poder amplificador del microscopio y definir sus lmites de amplificacin. Enfocar una preparacin en fresco con los objetivos de pequeo aumento (10X) y mediano aumento (40X). Enfocar una preparacin coloreada con los objetivos de pequeo (10X), mediano (40X) y gran aumento (100X). Enfocar la misma preparacin con el objetivo panormico (4x) Verificar y calcular la ampliacin de un objeto de dimensin dado, de acuerdo al objetivo y ocular usados.

MATERIALES Microscopio de luz Papel Arroz Aceite de inmersin Solucin limpiadora de lentes (Etanol-ter 9:1) Lminas y laminillas Muestra en fresco y gotero Lminas coloreadas

PROCEDIMIENTO CONOCIMIENTO DEL MICROSCOPIO - Ubicar en su microscopio cada una de las partes (ptica y mecnica). - Determinar la funcin de cada una de estas partes. (Figura 1). MANEJO DEL MICROSCOPIO

Enfoque de preparaciones en fresco en 10X y 40X - Colocar sobre un porta objetos una gota de la preparacin en fresco y cubrir con una laminilla - Conectar el microscopio - Prender la fuente de luz - Revisar que las siguientes partes del microscopio estn en posicin: - La platina en su tope inferior - Objetivo 10X abajo - El carro de transporte centrado - El condensador en su tope inferior - El diagrama casi cerrado - Observar que el campo del microscopio se encuentre uniformemente iluminado. - Colocar la preparacin en fresco - Sujetar la lmina con la palanca del carro de transporte. - Centrar la preparacin sobre la fuente de luz en la apertura circular de la platina. - Mirar la platina por el lado y mover el botn de ajuste, subir, hasta llegar al tope. - La distancia que queda del objetivo 10X es de aproximadamente 0.5 cm. - Mirar ahora por el ocular y bajar suavemente la platina hasta lograr captar la imagen del objeto en observacin. - Hacer el ajuste de las lentes oculares a su distancia interpupilar desplazando los tubos porta-oculares con ambas manos hasta que en el campo microscpico aparezca solamente una imagen. - Ajustar la nitidez de la imagen moviendo lentamente el tornillo micromtrico de ajuste. NOTA: En algunos microscopios antiguos se mueve el tubo del ocular hasta colocar el objetivo a esta distancia de la platina. Obtener el contraste ptimo de la imagen regulando: La intensidad de la lmpara La posicin del condensador y la apertura del diafragma. Podemos afirmar que a menos luz, mayor contraste de tal modo que este se obtiene bsicamente cerrado el diafragma y colocando el condensador en su tope inferior. Con el diafragma podemos graduar la magnitud del cono de luz que sale del condensador, aumentando la profundidad de foco de la imagen. Dibujar los hallazgos

Enfoque con el objetivo 40X Sealar con una flecha en el esquema que acaba de realizar, la clula, o la estructura que desea estudiar con el objetivo 40X Centrar sobre la parte iluminada de la platina la clula o estructura sealada. Este paso es muy importante pues de no quedar centrado podra salirse del campo microscpico ya que al cambiar el objetivo 10X a 40X el campo queda reducido en la misma proporcin. Sin mover la posicin de la platina, girar el revolver hasta colocar el objetivo 40X en posicin. Abrir un poco el diafragma Subir a la mitad el condensador La imagen aparecer en el microscopio con aspecto borroso.

Ajustar la nitidez de la imagen moviendo lentamente el tornillo micromtrico de ajuste. Dibujar los hallazgos Bajar la lmina de la platina y descartarla en el recipiente de descarte que contiene hipoclorito

Enfoque con el objetivo 100X. Revisar que las siguientes partes del microscopio estn en posicin: La platina en su tope inferior Objetivo 10X abajo El carro de transporte centrado El condensador en su tope inferior El diagrama casi cerrado Observar que el campo del microscopio se encuentre uniformemente iluminado. Colocar la lmina coloreada sobre la platina Enfocar en 10X Por la parte posterior dejar caer sobre la preparacin una gota de aceite de inmersin, teniendo el cuidado de no tocar la lmina. Sin mover la posicin de la platina, girar el revolver hasta dejar el objetivo 100X en su tope Subir el condensador Abrir completamente el diafragma Bajar el objetivo de 100X hasta que quede en contacto con el aceite. NOTA: El aceite de inmersin tiene el mismo ndice de refraccin del vidrio (1.5) e impide la refraccin de los rayos de luz que salen de la preparacin antes de entrar al objetivo. Al no utilizar el aceite y dejar la capa de aire que tienen un ndice de refraccin 1, parte de los rayos luminosos no penetran al objetivo que por su alta curvatura tiene un dimetro muy pequeo y la imagen aparece borrosa. Mirar ahora por el ocular y observar la imagen de nuevo en el campo. Obtener la nitidez de la imagen con el tormillo micromtrico - Dibujar los hallazgos Bajar la lmina y limpiarla suavemente con papel de arroz Colocar la lmina en la bandeja destinada para ello.

Devolucin del microscopio Antes de abandonar su mesa de trabajo limpiar perfectamente su microscopio como se indica a continuacin: Apagar el microscopio Colocar la platina en su tope inferior Colocar el objetivo 10X en posicin. Con el papel arroz limpiar la parte ptica del microscopio empezando por los objetivos 10X y 40X: Retirar ahora el aceite del objetivo 100X. - Nota: Al no retirar el aceite, este se seca sobre la lente objetivo formando una capa espesa que interfiere con la funcin de la lente. Limpiar la platina completamente y centrar el carro de transporte Revisar todas las partes

Dejar enfriar completamente la lmpara, antes de transportarlo a la sala de Microscopios.