LIPOPOLISACARIDOS Constituyen el antigeno O y la endotoxina de las bacterias Gram negativas. Localizados en la membrana externa de la envoltura celular bacteriana.

Tienen un papel importante en la patognesis de infecciones bacterianas y en la interaccin con el hospedador y su sistema de defensa A menudo es llamado como endotoxina (activo), nombre dado para describirlo como el componente bacteriano de los fenmenos patofisiologicos.

Porcion hidrofilica *compuesta por azucares *gran variabilidad estructural Porcion lipidica *Inmersa en la membrana externa

Le confiere a la bacteria su especifidad serolgica (anticuerpos) Funcion estructural de union

propiedades patofisiologicas de las endotoxinas

LPS: principales constituyentes de la membrana externa de las bacterias Gram negativas Han sido aislados de bacterias gram negativas y cianobacterias, pero estudiados mas a fondo en Salmonella Typhimurlum y Escherichia coli. Tienen relevancia en el choque sptico (afeccin grave que ocurre cuando una infeccin devastadora lleva a que se presente hipotensin arterial potencialmente mortal) Su estudio viene desde los aos 50, llevando al descubrimiento de su estructura (Salmonella Typhimurlum) en los 70 Gran cantidad de cepas mutantes han contribuido al descubrimiento de la biosntesis de los LPS y a los genes involucrados en esta.

ARQUITECTURA GENERAL DE LOS LIPOPOLISACARIDOS Existe una inmensa diversidad estructural en bacterias Gram negativas, pero todas comparten los mismos elementos. S.Typhimurlum heteropolisacarido fosforilado covalentemente unido a un lpido de la membrana que contiene glucosamina, el lpido A

*Regin inmuno dominante de la molcula *Calificacin serolgica de la S.Typhimurlum: Enterobactriaceae *Actividad endotoxica: activacin de macrfagos, produccin de citoquinas y otros mediadores que afectan a los rganos. a) CEPAS LISAS capaces de sintetizar molculas de lipopolisacarido completas. Reaccionan con anticuerpos especficos contra sus cadenas 0 Forman colonias de apariencia lisa (en medios slidos) Salmonella, E.Coli y otras bacterias Gram negativas b) CEPAS RUGOSAS incapaces de sintetizar polisacrido 0 (antigeno 0) morfologa colonial rugosa sus mutaciones (mutantes rugosos) se deben a fallas en la sntesis de la cadena 0 o del ncleo lpido A con forma hexagonal, especialmente cuando hay presencia de cationes divalentes (Mg++, Ca++)

Estructura minima necesaria de LPS necesaria para en crecimiento de bacterias (lpido A + 2 unidades de acido Kdo) ES ACTIVA COMO ENDOTOXINA Las cepas mutantes que contienen la est. minima son hipersensibles a antibiticos hidrofobitos, detergentes y colorantes. Poseer una estructura completa de LPS le otorga ventajes evolutivas a la bacteria al ser mas resistente a las condiciones ambientales

BIOQUIMICA DE LOS LPS 1. ESTRUCTURA LIPIDO A S.Typhimurlum y E.coli Disacrido de glucosamina Unido por un enlace 1-6 4 cidos grasos asociados Sustituido por dos grupos fosfatos en los extremos 1 y 4 Peso molecular: 1700 La unin de este al primer residuo de Kdo esta dada por un enlace ax2-6 No ha sido establecida su estructura 3D pero se considera que tiene un arreglo con dominios polares y apolares bien definidos, compatibles con su insercin en la membrana. Es probable que en las membranas biolgicas existan interacciones entre: (1) molculas de lpido A (2) lpido A protenas Las cuales tendran un papel fundamental en el ensamblaje de la membrana externa. Bacterias fototrpicas (Rodopseudomonas sp.), bacterias nodulantes (Bradyrhizobium sp.), bacterias del suelo (Thiobacillus sp.), algunos patgenos (Brucilla sp.) poseen diferencias estructurales en su lipido A:

+ Ausencia del grupo fosfato unido al esqueleto de diglucosamina y sustitucin por 4 aminoarabinosa + Presencia de 2,3- diaminoglucosa (GlcN3N) + Presencia de una amplia gama de cidos grasos de diferente longitud

NCLEO O CORE - Posee 2 subdominios: (1)SUBDOMINIO INTERNO Compuesto por azucares nicos caractersticos del LPS (Kdo, Hep) Presenta una variabilidad mucho menor en enterobacterias que la sub. Externa. La mayora contiene 2 Kdo y 2 unidades de heptosas. Al menos un residuo de Kdo, o un derivado, est presente en todos los LPS, lo cual indica un papel esencial de este azcar en la supervivencia y crecimiento de bacterias, particularmente a nivel del ensamblaje de la membrana externa.

(2)SUBDOMINIO EXTERNO Compuesto por hexosas, principalmente glucosa, galactosa y N-acetil-glucosamina. La diversidad estructural de esta regin esta limitada a los LPS de enterobacterias, en los que se encuentran de 1 (Salmonella) a 5 (E.coli) tipos de ncleos. En bacterias no entericas el ncleo externo puede estar presente, pero por lo general este est completamente ausente.

CADENA 0 Protege a las bacterias contra fagocitosis y contra la accin bactericida del suero. Enterobacterias Secuencia repetida de unidades de trisacrido o pentasacrido lineal, o bien pueden ser polmeros de oligosacridos ramificados de 4 a 6 azucares.

La longitud de sus cadenas 0 difiere aun en un mismo organismo, varia de 0 hasta 40 unidades repetidas Los monosacridos que componen las unidades repetitivas son azucares neutros y acdicos, amino azucares y raras veces azucares inusuales. La orientacin espacial de la cadena 0 es mas bien enrollada, o doblada. Bacterias no entericas Cadena 0 totalmente ausente. En Brucella la cadena es un homo polmero de un solo amino azcar llamado perosamina. la diversidad estructural de la cadena 0 puede ser aumentada por el proceso de conversin por bacterifagos (capaz de dirigir alteraciones estructurales en las unidades repetitivas) algunos autores sugieren que la diversidad y composicin de la cadena 0 pudo deberse a la evolucin , al menos en especies ENDOSIMBIOTICAS, con el fin de escapar al sistema inmune del hospedador mediante la presentacin de nuevas especificaciones en la superficie celular y as esconder las unidades mas profundas (lpido A, ncleo interno) las cuales son esenciales para el crecimiento y la multiplicacin bacteriana

2. BIOSINTESIS LIPIDO A.

Molcula de Nacetil glucosamina activada con bifosfato de uridina (UDP-

Sufre una acilacin (Agregar un grupo acilo a un compuesto) con una molcula de cido bhidroximiristico (14 carbonos)

Sufre segunda

una

Da como resultado una molcula precursora llamada lpido X

Reaccin del lpido X con un derivado activado del lpido X (UDP-2,3 diacilGlcN)

Se produce un precursor disacrido con 4 grupos acilos, el lpido IVA

Es sustituido con 2 unidades de Kdo para formar Kdo2IVa. El cual finalmente es acilado en las

La mayora de las enzimas del ensamblaje del ncleo-lpido A son probablemente protenas perifricas de la membrana. Estas estaran asociadas a la membrana interna durante la catlisis, debido a que los intermediarios claves (lpido X o lpido IVA) estn unidos a la membrana citoplasmtica. Asimismo, las enzimas deben funcionar en la superficie interna de la membrana, ya que todos los precursores estn en el citoplasma.

NCLEO O CORE 1. 2. la sntesis del Kdo se inicia con la condensacin de arabinosa-5fosfato con fosfoenolpiruvato Luego, el Kdo recin sintetizado es activado a Kdo-CMP (monofosfato de citidina), un nucletido-azcar que sirve como precursor para el LPS Un sistema enzimtico transfiere sucesivamente dos unidades de Kdo al lpido A, formndose as la estructura mnima de LPS, llamada Kdo-lpido IVA Los residuos de heptosa que son aadidos al LPS naciente se derivan probablemente de sedoheptulosa-7-fosfato, y son activados como ismeros de configuracin L-glicero-D mano Otra serie de enzimas son responsables de la adicin de sustituyentes polares, tales como fosfatos y etanolamina Cada una de las hexosas del ncleo externo es aadida una a una en forma independiente. La sntesis de esta regin involucra una serie de glicosiltransferasas (catalizan la transferencia secuencia de azcares) unidas a la membrana Derivados de UDP (difosfato de uridina) funcionan como donadores de azcares activados.

3.

4.

5. 6.

7.

CADENA O. Es sintetizada independientemente del lpido A y el ncleo. El polisacrido 0 es ensamblado como un polmero unido a un lpido de membrana y transferido posteriormente a la glucosa terminal del ncleo. 1. Sntesis de una sola unidad una sola unidad repetitiva (tetrasacrido) unido covalentemente al bactoprenol, que funciona como lpido acarreador. Las unidades repetitivas individuales son polimerizadas hasta formar la cadena 0 completa todava unida al bactoprenol. Transferencia del polmero recin sintetizado desde el lpido acarreador hacia el ncleo completo.

2.

3.

Todos estos pasos son realizados por una serie de enzimas asociadas a la cara citoplasmtica de la membrana.

Cada tetrasacrido recin sintetizado es incorporado en el extremo reductor de la cadena creciente. Sin embargo, este ciclo biosinttico no parece ser comn a todos los lipopolisacridos estudiados. 3. GENTICA LIPIDO A Los genes que participan en la biosntesis del A no estn agrupados de manera tan evidente Varios genes de las reacciones tempranas se hallan localizados en un operon (unidad de funcionamiento de ADN genmico) complejo y heterogneo, el cual tambin contiene genes relacionados con el crecimiento y la sntesis de macromolculas Otros genes estn diseminados alrededor del cromosoma.

El primer paso de la sntesis lo lleva a cabo una aciltransferasa muy especifica codificada por el gen IpxA localizado en el minuto 4 del mapa de E. coIi

La posterior acilacin de esta molcula para formar el lpido X es realizada por los productos de los genes IpxC y IpxD.

La reaccin de condensacin que lleva a la formacin del lpido IVA es catalizada por el producto del gen

NCLEO O CORE Grupo rfa El lpido IVA es la primera estructura La mayora de los genes que que exhibe participan algunas en la biosntesis de las del ncleo se encuentran caractersticas agrupados en que el grupo definen rfa, que la comprende 17 genes endotoxina en E. coli Kl2 bacteriana, aun cuando no es txica como el LPS mismo. Asmismo, aun cuando muchos de los genes del ncleo estn organizados en el grupo rfa, parte de esos genes estn tambin involucrados en la unin de la cadena 0 al core. Codifican a una serie de glicosiltransferasas que actan en forma secuencial, as como por otras enzimas accesorias que aaden grupos funcionales a diversas regiones del ncleo.

Sntesis del Kdo Hay genes que no estn localizados en este grupo principal. Dichos genes estn involucrados en la sntesis del Kdo y son: 1. gen kdsA, localizado en el minuto 27, que codifica por a Kdo-8-fosfato sintetasa la cual genera el Kdo-fosfato. 2. gen kdsB, localizado en el minuto 85, cerca del grupo ,la, codifica por la enzima que activa el Kdo a CMPKdo. 3. gen k dtA, localizado en un extremo del grupo rfa, codifica a su vez por una enzima bifuncional que transfiere en forma secuencial las dos molculas de CMPKdo al lpido IVA y adems posee caractersticas que la hacen capaz de servir como anclaje de la molcula naciente de LPS a la membrana. CADENA 0

Los genes tanto del ncleo como del antgeno 0 estn organizados principalmente en agrupaciones de genes contiguos. En E. coli K12 y S. typhimurium estos grupos estn presentes en dos regiones del cromosoma: 1. El grupo de genes rfa se localiza en la regin entre el minuto 81 y el minuto 85, que flanquea el sitio de origen de la replicacin del cromosoma. El grupo rfa, adems de codificar por la biosntesis del oligosacridos nuclear, lo hace tambin de la unin del antgeno 0 al ncleo. 2. Por su parte, el grupo de genes rfb esta situado entre el minuto 44 y el minuto 4 del mapa fsico del cromosoma de estas bacterias El grupo rfb contiene 16 genes en S. typhimurium, los cuales estn involucrados en la sntesis del antgeno 0 yen su unin al ncleo. El nmero de genes en este grupo vara con la composicin de azucares en el antgeno 0.

En ambos grupos Ja mayora de genes codifican por protenas solubles que de alguna forma estn asociadas con la superficie interna de la membrana citoplasmtica. Muchas de estas protenas operan como complejos multienzimticos que sintetizan precursores activados de azcares y como transferasas de residuos glicosdicos a las cadenas crecientes de azcares Mientras que un nmero reducido de protenas se encargan de la polimerizacin de las unidades y de la transferencia del antgeno 0 al complejo lpido A-ncleo.

CONCLUSIONES Dado que tanto las unidades repetitivas de la cadena 0, as como el lpido A-ncleo son sintetizados en la cara interna de la membrana citoplasmtica , debe existir un sistema de transporte de intermediarios biosintticos y sustratos precursores a travs de la membrana hacia el sitio de su utilizacin.

Un rea sumamente interesante de investigacin actual es el mecanismo de translocacin del LPS hacia la membrana externa. Se ha demostrado que el LPS es sintetizado en la membrana citoplasmtica y es translocado de manera irreversible a la membrana externa. Sin embargo, no se conoce cmo se da este proceso en la clula bacteriana. Actualmente se ha acumulado evidencia de que parte de este proceso de transporte podra llevarse a cabo en el espacio periplsmico, como en el caso del peptidoglucano pero las teoras son complejas y difciles de demostrar. Se ha sugerido tambin la participacin de canales proteicos que permitan el paso de polisacridos a travs de membranas, o bien de protenas que recubran los polisacridos de alguna forma durante su translocacin.