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nduccin de cncer en rata wistar (Rattus norvegicus) mediante el uso de dimetil benzo(a)antraceno (DMBA)
Instituto de Investigaciones Qumico Biolgicas

Juan Carlos Corts-Garca, Asdrbal Aguilera-Mndez, Ana Edith Higareda-Mendoza, Elda Beltrn-Pea y Marco Aurelio Pardo-Galvn

Resumen
El cncer est considerado dentro de las cinco primeras causas de muerte en el humano; su tratamiento incluye acciones individuales o combinadas de quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, ciruga y recientemente terapia gnica. A nivel experimental el manejo teraputico debe probarse en modelos animales de cncer. En el presente trabajo se implement un modelo de cncer en ratas Wistar expuestas a dimetilbenzo(a)antraceno (DMBA) por va subcutnea. Nueve semanas posteriores a la exposicin a 20 mg DMBA se obtuvo en las ratas un volumen tumoral de siete cm3, en tanto que la concentracin de 10 mg de DMBA indujo un tumor de 4.3 cm3. En las ratas expuestas a las dos dosis de DMBA los tumores se localizaron a nivel subcutneo en forma de ndulos. El tejido tumoral present clulas con ncleos hipercromticos y pleomorfismo caractersticos de celulas cancerosas. Palabras clave: Cncer, dimetilbenzo(a)antraceno, rata.

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Abstract
Cancer induction in Wistar rats (Rattus norvegicus) through the use of dimethylbenzo (a) anthracene (DMBA). Cancer is considered among the five main causes of death in humans; its treatment includes individual or combined actions of chemotherapy, radiotherapy, immunotherapy, surgery and most recently, genetic therapy. At experimental level, the therapeutic treatment must be tested in animal models of cancer. In the present study we obtained a model of cancer in Wistar rats by the subcutaneous exposure to dimethylbenzo(a)anthracene (DMBA). Nine weeks after exposed to 20 mg of DMBA a tumoral volume of 7 cm3 was obtained, whereas the administration of 10 mg of DMBA induced a 4.3 cm3 tumor. The nodular appearance was recognized in subcutaneous tumors of rats exposed to either DMBA doses. The tumoral tissue presented cells with hyperchromatic and pleomorphic nuclei, typical of carcinogenic cells. Keywords: Cancer, dimethylbenzo (a) anthracene, rat

Introduccin
El cncer es una enfermedad caracterizada por el desarrollo de una masa anormal de tejido nuevo (neoplasia) producida por una multiplicacin celular descontrolada. Este padecimiento ha sido estudiado mediante diversas estrategias metodolgicas que incluyen: modelos animales (Hanausek et al., 2001), clulas en cultivo (Minaguchi et al., 1999), tejidos animales y/o humanos, tcnicas de biologa molecular y el monitoreo de la frecuencia de cncer en la poblacin humana (Harris 1991). En Mxico los tumores cancerosos estn considerados dentro de las cinco primeras causas de mortalidad a partir de los 15 aos de edad (I.N.E.G.I. 2005), y en el mundo representan el 13% del total de muertes (O.M.S. 2006). En algunos tipos de cnceres se han identificado alteraciones genticas; por ejemplo la familia de oncogenes H-ras, K-ras y N-ras, en los adenomas (tumores benignos de origen epitelial de estructura parecida a la de una glndula) presentan alteraciones en el gen K-ras (Collado et al., 2005), y en los carcinomas de clulas epiteliales se encuentra alterado el gen H-ras (Parada et al., 1982), este ltimo codifica la protena p21, la cual es activada mediante el intercambio de GDP por GTP, favoreciendo as la proliferacin y diferenciacin celulares. La forma mutada de p21 permanece activa de manera permanente debido a la prdida de regulacin por GTP (Kammouni et al., 2002). Actualmente el tratamiento de los tumores es eficaz en etapas tempranas del desarrollo de la enfermedad, y en casos avanzados solo se inhibe su progreso. Adems de las estrategias generales de curacin (ciruga, quimioterapia, radioterapia e inmunoterapia), el tratamiento del cncer se particulariza dependiendo del tipo de tumor. En el cncer gstrico se recomienda evitar los factores de riesgo como: una dieta deficiente en fibra y vitaminas y
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la infeccin por Helicobacter pylori (Muoz y Franceschi, 1997) donde se ha reportado el gene cagA como el principal factor de virulencia (Akhter et al., 2007). En cncer de mama se requiere ciruga, quimioterapia y prescripcin de tamoxifeno, compuesto antiestrognico que evita la proliferacin en tumores positivos para receptores estrognicos (Hankinson y Stampfer, 1997; Wang et al., 2006). La vacuna contra el virus del papiloma humano (VPH) previenen la formacin de lesiones preneoplsicas, este agente biolgico est presente en el 70 % de casos de cncer crvico uterino (Wheeler, 1997; Barclay y Vega, 2007). La vitamina C, los carotenos, el zinc y la fibra de los cereales son posibles agentes profilcticos para el tratamiento de cncer de esfago, en tanto que la vitamina E, con propiedades antioxidantes, ayuda a la prevencin del cncer de pulmn (Buiatti 1997). Debido al grave problema de salud que genera el cncer, continuamente se evalan nuevos tratamientos, siendo uno de las ms recientes la terapia gnica, que consiste en usar fragmentos de DNA que al ser liberados intracelularmente actan adicionando o eliminando una funcin de la clula (Cheney et al 1998). Por ejemplo, el gen mda7 que codifica para la protena cinasa dependiente de RNA de doble cadena (PKR) se incorpor en el genoma del adenovirus y se administr conjuntamente con geldanamicina, aumentando la mortalidad de las clulas tumorales a travs de un efecto antiangiognico (Patear et al., 2007). Independientemente del sistema que se use para la introduccin del material gentico (electroporacin, pistola gnica, liposomas o virus) se requiere demostrar la eficacia de la terapia empleada antes de usarla en el humano, con esta finalidad se emplea como modelo de estudio roedores que presenten cncer. Estos modelos animales son necesarios para determinar los efectos de frmacos y agentes txicos, as como los mecanismos de dao y de curacin. La ventaja de su uso es el costo moderado para exponer un nmero grande de individuos en condiciones controladas. La rata Wistar se ha utilizado como modelo de estudio y se ha secuenciado su genoma lo que facilita determinar blancos gnicos y proteicos de las sustancias en investigacin (Gibbs 2004). Desde la dcada de los cincuenta el uso del DMBA para generar tumores (Steiner y Edgecomb, 1952) se ha mantenido, en 1997 Irwin produjo tumores de mama en rata (Irwin 1997) y en este sistema se han hecho estudios de factores angiognicos que participan en el desarrollo de dichos tumores (Yan et al 2004). El DMBA tambin induce efectos mutagnicos en bacterias y en clulas de mamferos y produce tumores en ratones expuestos a DMBA por diferentes vas: oral, intraperitoneal, subcutnea, intramuscular y en aplicacin tpica (Irwin 1997). El mecanismo de accin de DMBA en la rata y ratn, se basa en la interaccin directa de epxidos derivados del DMBA con el DNA (de Boer y Glickman, 1998), generando transversiones A:T por T:A y G:C por T:A a travs de dos mecanismos probables: la formacin de aductos de DMBA adenina y DMBA guanina (de Boer y Glickman, 1998), y la prdida de purinas producida por lisis espontnea del complejo formado entre epxido de DMBA y purinas del DNA blanco (Melendez et al., 1999). Es interesante notar que los metabolitos del DMBA necesarios para el efecto cancergeno son similares entre el humano y la
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rata (Vater et al., 1991) en tanto que en ratn dichos metabolitos son diferentes a los que inducen tumores en humanos (Digiovanni et al., 1980). El estudio del desarrollo tumoral por DMBA ha sido llevado a cabo en ratones, mientras que las ratas han sido usadas para producir cncer de mama (Kimura et al., 2007, Natsume et al., 2007). El objetivo del presente trabajo fue inducir cncer en ratas Wistar expuestas a DMBA por va subcutnea, para lo cual se evalu el volumen del tumor y se registraron las observaciones morfolgicas para valorar y clasificar las neoplasias.

Materiales y Mtodos
Se usaron ratas Wistar (Rattus norvegicus) macho de aproximadamente 300 g de peso, a las cules se permiti libre acceso al alimento y al agua (Shimizu et al., 2000). Se inyectaron por va subcutnea 2, 10 y 20 mg de DMBA disuelto en aceite de oliva estril, en la zona media del dorso de los animales, previamente rasurada. Dicho procedimiento se realiz en dos sesiones los das cero y siete, se evaluaron los animales durante 20 semanas (Rodrguez et al., 1997; Henserson et al., 1998).

Evaluacin del desarrollo tumoral

Durante el periodo de observacin se determin el volumen del tumor, rea bajo la curva del volumen (AUC) y el crecimiento tumoral promedio (PC), de acuerdo con las siguientes frmulas (Barrington et al., 1998). El volumen tumoral se evalu cada semana. Volumen = (longitud x amplitud2) / 2 AUC = [(V1 + V2 )/ 2] x (dia2 dia1) PC = [(suma AUC)- (vol1 x (dia0-dia1))] / (dan-dia1)2 Asimismo, se registr el peso corporal (Warner 1962), el consumo de alimento y agua (Newberne, 1978). Al trmino del periodo de observacin se sacrificaron los animales.

Observaciones microscpicas
Se tomaron muestras de tejido subcutneo en la zona de aplicacin del tratamiento farmacolgico, esta zona se identific previamente por la presencia de una masa tumoral en el lomo de los animales y se disecaron los tumores. Los tejidos se fijaron en solucin de formol 10% y se deshidrataron con soluciones de etanol a diferentes concentraciones y finalmente se incluyeron en bloques de parafina. Los cortes histolgicos de 5 m de espesor se tieron con la mezcla de colorantes Hematoxilina Eosina (substancias que identifican cidos nucleicos y molculas de colgena respectivamente) para su anlisis microscpico (Hanausek et al., 2001).

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Criterios histolgicos para identificar las clulas cancerosas

Estos criterios se basaron en alteraciones que presentan las clulas tumorales en relacin a las clulas normales y son los siguientes: presencia de pleomorfismo (variacin de tamao y forma celular), DNA hipercromtico (DNA compacto), relacin anormal ncleo citoplasma (rango normal 1:4 o 1:6); y presencia de cromatina con grumos gruesos (Fanburg Smith et al., 1998). En los cortes histolgicos se hizo la bsqueda de las siguientes clulas tumorales epiteliales: fibrosarcomas (fibroblastos presentes desde la dermis hasta al tejido adiposo subcutneo), carninomas de clulas escamosas (clulas con ncleos atpicos) (Cotran et al., 2000), papilomas (ejes fibrovasculares de clulas, revestidos por epitelio escamoso) (Henserson et al., 1998) y queratoacantomas (clulas escamosas grandes con citoplasma eosinfilo y zonas de queratinizacin) (Shimizu et al., 2000). Estos tipos tumorales se determinaron de acuerdo con los criterios reportados por Shimizu et al., 2000; Cotran et al., 2000; Henserson et al., 1998.

Resultados y Discusin
Incremento del volumen tumoral
El volumen tumoral se calcul a travs de la medicin del largo y ancho de los tumores en cada animal; el valor promedio obtenido de cada grupo (0, 2, 10 y 20 mg de DMBA), se grafic contra el tiempo de observacin en semanas (Figura 1). Como se esperaba con la administracin de 10 y 20 mg de DMBA se desarrollaron masas tumorales detectadas como incrementos de volumen. Nueve semanas despus de la exposicin al DMBA observamos que el tratamiento con 20 mg de DMBA produjo un tumor de 7 cm3, con 10 mg un tumor de 4.3 cm3 y con 2 mg se present un volumen tumoral de 0.5 cm3. Es decir, se encontr una relacin directamente proporcional entre la cantidad del agente tumoral y el volumen del tumor inducido. Un efecto dosis dependiente ha sido reportado en ratones, donde la exposicin tpica creciente al DMBA aument la formacin de aductos entre los epxidos de DMBA y el DNA (Melendez et al., 1999). A la semana 20 los animales tratados con 10 y 20 mg de DMBA presentaron el mismo volumen tumoral (Figura 1), en el caso de 20 mg el desarrollo tumoral disminuy entre las 16-20 semanas, probablemente debido a que el volumen alcanzado por la masa tumoral afect el suministr de oxgeno y nutrientes, ocasionando la inhibicin del crecimiento del tumor (Korc 2003). Las fluctuaciones observadas en las masas tumorales fueron similares en los grupos tratados con 10 y 20 mg de DMBA: un aumento en la semana 9 (Figura 1) y oscilaciones del volumen en los grupos desde la semana 10 hasta la semana 16. Este comportamiento oscilante puede explicarse por la manifestacin alternada de procesos de proliferacin y de inhibicin tumoral que involucran mecanismos de proteccin y la respuesta inmunolgica. El mecanismo de proteccin corrige los daos producidos por agentes cancergenos, medianCiencia Nicolaita No. 47 61 Agosto de 2007

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te un sistema de reparacin de nucletidos que dejan sitios apurnicos en el DNA y probablemente participan en el desarrollo tumoral (Braithwaite et al., 1998). En lo que se refiere al sistema inmunolgico, este detecta y marca a las clulas tumorales para su eliminacin (Burger et al., 1971) a travs de linfocitos B y T (CD4 y CD8 citotxicos), los cuales aparecen en forma lenta y prolongada (Visser et al., 2006). Por otra parte, la activacin del sistema inmune tambin libera protenas (factor de necrosis tumoral alfa y el factor nuclear kB) que favorecen el desarrollo tumoral. Cabe mencionar que el sistema inmune es tan importante, que se ha observado en los sistemas animales deficientes en interfern gamma (factor clave de la respuesta inmune) el crecimiento espontneo de tumores en piel (Visser et al., 2006).

Figura 1. Curso temporal del volumen de tumores en la rata Wistar expuesta a diferentes dosis de DMBA. La administracin de DMBA se realiz en dos sesiones (recuadro vacio) durante un periodo de 7 das. El volumen se midi cada semana en los grupos expuestos a 0, 2, 10 y 20 mg de DMBA subcutneo (x ee, n=3).

Por otra parte, es importante sealar que entre las 16-20 semanas, se observ que el volumen tumoral del grupo tratado con 10 mg de DMBA fue mayor que el presentado por el grupo expuesto a 20 mg, lo que contradice la dependencia de la dosis en el crecimiento tumoral hasta la semana 20. Para verificar este hecho se calcul el rea bajo la curva (AUC) del volumen tumoral.

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Figura 2. Anlisis global del volumen tumoral. Se determin el rea bajo la curva del volumen tumoral producido durante 20 semanas por 0, 2, 10 y 20 mg de DMBA en ratas Wistar. Los tratamientos se aplicaron por va subcutnea. Los resultados se expresan como x ee y n=3.

Desarrollo global del volumen tumoral como rea bajo la curva (AUC)
Se determin el AUC del volumen tumoral representado en la Figura 1. Al trmino de 20 semanas los resultados se sumaron para representarlos en un solo grupo de acuerdo al tratamiento. Este parmetro (AUC) describe en forma total el volumen tumoral a lo largo del periodo de observacin. Como puede observarse en la Figura 2 la administracin de 20 mg de DMBA gener mayor AUC durante las 20 semanas de observacin. Como los animales se expusieron al DMBA en dos ocasiones, es posible que se afectaran slo unas cuantas clulas durante esos eventos. Dado que el crecimiento tumoral se presenta en relacin al nmero de clulas afectadas por el DMBA y su capacidad de proliferacin; entonces, si el nmero inicial de clulas transformadas fue diferente de acuerdo a la dosis administrada el crecimiento de las masas tambin lo ser. Aunque en este estudio no se muestra el nmero de clulas, en la Figura 3 puede observarse que el crecimiento tumoral promedio por da expresado como cm3/da en los animales expuestos a 20 mg de DMBA fue el ms alto.

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Figura 3. Crecimiento promedio (cm3/dia) de las masas tumorales de Rattus norvegicus. Las ratas se expusieron a 0, 2, 10 y 20 mg de DMBA por va subcutnea, en dos sesiones y con siete das de diferencia entre las sesiones. Los resultados se expresan como x ee y n=3.

Crecimiento tumoral en la rata y morfologa de las clulas tumorales

Los animales sometidos a 10 mg (Figuras 4A y 4B) y 20 mg de DMBA (Figuras 4C y 4D) desarrollaron tumores, y en el caso del tratamiento con 20 mg los animales presentaron lesiones ulcerosas de aproximadamente 2.5 cm de dimetro encerradas en un crculo (Figura 4C) y 2.2 cm de dimetro (Figura 4D). Las ulceras se localizaron en la zona dorsal de la rata, en el cuadrante superior derecho que correspondi a la zona de aplicacin del DMBA; en el momento del sacrificio no se observaron a simple vista restos de DMBA ni del vehculo utilizado para administrarlo. Otros autores han reportado desarrollo de carcinomas en los ratones despus de 23 semanas de tratamiento con DMBA y derivados de forbol. Samarth et al., en 2007, encontraron 67% de incidencia de cncer pulmonar en ratones despus de nueve semanas con el uso de benzo(a)antraceno y Henserson et al., en 1998 detectaron tumores (papilomas) en ratones, 11 semanas despus de tratarlos con DMBA. En este estudio, el seguimiento del desarrollo tumoral se prolong hasta la semana 20, a este tiempo el dimetro tumoral fue el mismo en los grupos tratados con 10 y 20 mg de DMBA (Figuras 1, 4B y 4D).
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Figura 4. Desarrollo tumoral en la rata Wistar por efecto de DMBA. (A, B) 10 mg y (C, D) 20 mg de DMBA, la administracin del agente se aplic por va subcutnea en dos sesiones con 7 das de diferencia. (A, C) Desarrollo tumoral despus de 9 semanas y (B, D) desarrollo tumoral despus de 20 semanas. En los crculos se muestran las lesiones tumorales y las ulceras.

No se realizaron cortes histolgicos de las ratas expuestas a 20 mg de DMBA debido a que la presencia de ulceras en la piel, es un foco de infeccin bacteriana que podra complicar la interpretacin de los resultados. El anlisis histolgico del tejido de ratas expuestas a 10 mg de DMBA se realiz en secciones de tejido teidos con Hematoxilina Eosina, donde la Hematoxilina permiti la identificacin de los ncleos en tono oscuro y denso en tanto que la Eosina se uni a la colgena del citoplasma destacndola en diversas tonalidades de gris (Clark et al., 1981; Guerra 1999). En la Figura 5A se muestra una seccion de tejido representativo del grupo control, donde puede observarse, la disposicin de las clulas a nivel subcutneo, identificando los ncleos como grnulos densos obscuros y al citoplasma como bandas en tonos grises; es importante sealar que la distribucin de este tipo de clulas fue uniforme en todo el campo visual. En la figura 5B se muestra una banda densa obscura que corresponde a la epidermis y dermis, con un arreglo regular de las clulas a nivel subcutneo similar a lo descrito anteriormente. En la Figura 5C se observa una probable zona de necrosis del tejido evidenciada por una porcin oscura densa y difusa en el campo visual debido a la Hematoxilina, que identifica al DNA. En los animales tratados con 10 mg de DMBA se observ la presencia de clulas con un dimetro nuclear aumentado, ncleos hipercrmicos y diferentes tamao celulares (Figura 5D) que segn los criterios reportados por Wang y colaboradores en el 2005 corresponCiencia Nicolaita No. 47 65 Agosto de 2007

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den a clulas tumorales (probablemente fibrosarcomas). En esta misma figura, tambin se puede observar entre dos y tres clulas tumorales por campo (indicadas por una flecha) con dimetro aproximadamente 2 veces mayor que en las clulas normales, lo cual es otra de las caractersticas de las clulas tumorales donde el espacio citoplsmico est ocupado casi totalmente por el ncleo.

Figura 5. Secciones de tejido de ratas Wistar tratadas con DMBA. Se muestran cortes de 5 m de tejido subcutneo de rata, con una amplificacin de 400X. El DMBA se administr en dos sesiones con siete das de diferencia entre ellas. A) Tejido subcutneo del grupo control, B) zona donde se observa la epidermis y la dermis indicada por la flecha, en el grupo control, C) Zona con tejido probablemente en estado necrtico, D) presencia de clulas tumorales indicadas por la flecha en el grupo tratado con 10 mg de DMBA subcutneo.

La deteccin microscpica de clulas tumorales en este estudio se realiz nueve semanas despus de la administracin de DMBA, este periodo de desarrollo fue ms largo que el reportado por Wang en el 2005, donde los animales que recibieron implantacin de tumores malignos, desarrollaron tumores de 3 mm de dimetro en hgado, hueso y pulmn en un lapso de seis a ocho semanas despus de la implantacin (Wang et al., 2005). La diferencia en el desarrollo tumoral probablemente se deba a que las clulas tumorales malignas humanas implantadas slo requieren adaptarse al entorno donde fueron colocadas; mientras que en el caso del tratamiento con DMBA el desarrollo tumoral se inici a partir de clulas normales que debieron transformarse en clulas tumorales.
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Conclusiones
El DMBA a una concentracin de 10 mg fue un agente adecuado para inducir tumores subcutneos en ratas Wistar en un tiempo relativamente corto comparado con los reportados en otros sistemas biolgicos.

Bibliografa
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