DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LA CASEINA Adriana sierra, Yaneth Herrera RESUMEN Se llev a cabo la determinacin del punto

Isoelctrico de la casena una vez extrada mediante el procedimiento qumico de la leche entera liquida. En las protenas existen 20 tipos de aminocidos diferentes los cuales estn en un nmero y secuencia determinados por el cdigo gentico. Con respecto a su tamao, las protenas van desde un peso molecular de 6000Dalton hasta varios millones de Dalton con una considerable variacin de formas y estructuras. Para su estudio se consideran cuatro niveles de complejidad estructural; siendo la ms simple la estructura primaria y la ms compleja la estructura cuaternaria cuya conformacin depende de diferentes fuerzas qumicas de atraccin y repulsin que son ejercidas sobre la estructura molecular de la protena y por lo tanto son responsables de su estabilidad. Los factores que pueden afectar la solubilidad de una protena son: La fuerza inica del medio, el pH. La temperatura y la constante dielctrica del solvente .Cuando hay un cambio de cualquiera de estos factores, la protena responde con una intensidad proporcional al cambio, esto es, que puede afectar la estructura proteica de una manera superficial o lo hace tan drsticamente que desnaturaliza a la protena. Por fortuna, en nuestro organismo, la variacin de tales factores es mnima por lo que son imperceptibles los cambios en la protena ABSTRACT Was carried out to determine the isoelectric point of casein once extracted by the chemical liquid whole milk. In proteins there are 20 different amino acids which are in a certain sequence number and by the genetic code. With regard to their size, proteins ranging from a molecular weight of up to several million 6000Dalton Dalton with a considerable variety of shapes and structures. For

study considers four levels of structural complexity, the simplest being the primary structure and quaternary structure more complex whose formation is dependent on different chemical forces of attraction and repulsion which are exerted on the molecular structure of the protein and therefore are responsible for their stability. Factors which may affect the solubility of a protein are: The ionic strength of the medium pH. Temperature and the solvent dielectric constant. When a change of any of these factors, the protein responds with an intensity proportional to the change, that is, which can affect the protein structure of a superficial or does so drastically that denatures protein. Fortunately, our bodies, the variation of these factors is minimal so that are imperceptible changes in the protein INTRODUCCIN En la leche hay tres clases de protenas: casena, lacto albminas y lactoglobulinas (Todas globulares).

La casena representa el 80% de las protenas presentes en la leche y el 2,7% en composicin de la leche lquida, hay varios tipos de casena, estas protenas precipitan del lquido cuando esta toma un pH cido. El pH en el que precipitan las protenas se denomina punto isoelctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas presentando una carga neta de 0 y la protena presenta su mxima posibilidad para ser precipitada ya que la partculas se agregan. Debido a la composicin en aminocidos de la protena, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catinicos, neutros y aninicos, y as cada protena tendr un pI diferente. La propiedad caracterstica de la casena es su baja solubilidad a pH

4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la casena cargada negativamente y solubilizada como sal clcica. Si se aade cido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la protena neutra precipita: Ca2+Caseinato + 2HCl Casena + CaCl2 La conformacin de la casena es similar a las protenas desnaturalizadas globulares. El alto numero de residuos de prolina en la casena causa un especial plegamiento en la cadena de protena e inhibe la formacin de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La casena no contiene puentes di sulfuro. La funcin biolgica de las micelas de casena es transportar grandes cantidades de Ca y P altamente insoluble en forma liquida a los lactantes y formar un coagulo en el estomago para favorecer una nutricin eficiente. Adems de casena, Ca y P la micela formada tambin contiene citrato, iones, lipasa, enzimas plasmticos y suero. Estas micelas ocupan del 6-12% del volumen total de la leche. DESARROLLO EXPERIMENTAL Primero se realiz el Aislamiento de la casena: Calentando a un vaso de precipitado 150ml de agua destilada a 38C, aada 50ml de leche y luego gota a gota y con agitacin, adicion cido actico 1M hasta que se observ que se forma un precipitado (la leche se corta). Se Dej sedimentar y se filtr sobre papel de filtro usando un embudo de cristal. Posteriormente se Lav el precipitado con 20ml de etanol en el mismo filtro. Se Seco el precipitado colocando varios pliegues de papel de filtro. Colocando el precipitado en un vaso de precipitado pequeo previamente pesado, se volvi a pesar el vaso con el precipitado y luego se adicion 5ml/g de ter etlico. Filtrando nuevamente. Se Desech el lquido quedando un precipitado blanco de fcil manipulacin que es la casena. Segundo se efectu Preparacin de la solucin de casena:

Se Coloco aproximadamente 250 mg de casena en un vaso de 50ml. Agregamos 20ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 1N; y se agit hasta lograr una solucin total de la casena. Una vez disuelta la casena, se verti en un matraz aforado de 50 ml, adicionamos 5 ml de cido actico 1N y diluya con agua destilada hasta 50ml. La solucin resultante fue clara y limpia. Finalmente realizamos la Determinacin del pI de la casena: En diez tubos de ensayo de de 10 ml limpios y secos se adicione exactamente los volmenes de los reactivos segn la siguiente tabla:

RESULTADOS Y DISCUSIN Se realiz la lectura de las muestras en el espectrofotmetro, los datos obtenidos para esta lectura se registran a continuacin: ABSORBANCIA A MUESTRA pH 640 nm 1 3,2 0,083 nm 2 3,6 0,081nm 3 3,8 0,082nm 4 4 0,090nm 5 4,2 0,079nm 6 4,5 0,080nm 7 4,7 0,082nm 8 5,1 0,095nm 9 5,5 0,113nm 10 6,1 0,063nm Tabla 1: datos absorbancias soluciones casena

A partir de los datos registrados en la tabla 1, se realizaron una grfica, donde se muestra la variacin del pH de la solucin de casena respecto a la absorbancia como se muestra a continuacin.

ABS Vs pH
0.12
0.095 0.09 0.083 0.082 0.081 0.082 0.079 0.08 0.113

0.1

0.08 Abs a 640 nm

0.063

0.06

0.04

0.02

0 0 1 2 3 pH 4 5 6 7

Grfica 1. Absorbancia Vs pH La casena es una protena de la leche, del tipo fosfoprotena. Representa cerca del 77% al 82% de las protenas de la leche Esto ayuda a entender porque esta sustancia era muy sensible a los cambios de temperatura, acidez o basicidad; La propiedad caracterstica de la casena es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la casena cargada negativamente y solubilizada como sal clcica. Si se aade cido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la protena neutra precipita.

Este principio fue el utilizado en el laboratorio para obtener la casena, para lo cual se agreg cido actico a la muestra de leche, obteniendo una masa blanca e inodora. Se puede hacer precipitar la protena (casena) que contiene la leche, acidificando el medio y lograr regenerarla aplicando un compuesto lcali Con esto se explica el porqu, al agregar NaOH 0.1N, la casena (en ese momento una masa slida), se hizo soluble; ya que el Hidrxido de Sodio es una base (se repona las condiciones iniciales de la leche). El punto Isoelctrico (o pH isoelctrico) de la casena es 4.6. A este pH, la casena se encuentra en su punto de menos solubilidad, debido a que hay menos repulsiones intermoleculares, por lo que precipita. Este es un dato curioso, ya que en la prctica se hall un valor de punto Isoelctrico similar a ese dato (4.7= Pi), con lo cual nos podemos afirmar que estuvimos realizando la practica de manera adecuada. El mtodo turbidimetrco empleado se basa en la medida de la turbidez de una solucin o suspensin en la que la cantidad de luz transmitida se cuantifica con un espectrofotmetro o se estima mediante comparacin visual con soluciones de turbidez conocida. Se sabe que la absorbancia de un analito solubilizado es proporcional a su concentracin (Ley de Beer). Por lo tanto, es de esperar que no se registren valores de absorbancia de una protena en su punto isoelctrico, pues no se encontrara como soluto. Por el contrario es posible analizar la absorbancia de la misma en soluciones de pH superiores o inferiores al isoelctrico, obtenindose dos posibles relaciones lineales. Por este motivo fue que se us el espectrofotmetro para analizar la solubilidad en las muestras Con los datos obtenidos del laboratorio, solubilidad y pH, de la muestra de casena se lleg a elaborar una grfica. De donde podemos resaltar que: la trayectoria de la lnea era una especie de funcin logartmica, hasta que llega al pH 4.5 y sufre una cada, considerando que el punto isoelctrico es a pH 4.6y con las teoras anteriores, se hace la siguiente suposicin: Que la casena permanece soluble cuando el pH es demasiado elevado y se precipita al llegar a 4.5 (cercano al 4.6) y retorna a soluble cuando el pH continua ascendiendo

BIBLIOGRAFIA 1. http://dspace.c3sl.ufpr.br/dspace/bitstream/1884/2496/3/det+proteina .pdf, 2. http://www.arrakis.es/~lluengo/pproteinas.html, 3. http://72.14.209.104/search?q=cache:kckEAoOx_MsJ:www.upo.es/dep a/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practica3FQB.pdf+casein a+punto+isoelectrico&hl=es&ct=clnk&cd=10&gl=pe