La Serologa aplicada a la deteccin de bacterias

Biol. Brbara Hernndez Macas Laboratorio de Bacterias CNRF DGSV

2009

Senasica

Serologa
La ciencia que estudia las reacciones, preparaciones y uso del suero sanguneo. Usos dentro de la fitopatologa:
Estudios ecolgicos para determinar el origen, diseminacin y supervivencia de diferentes patgenos. Identificacin rpida de los fitopatgenos. Deteccin e identificacin de fitopatgenos que se transmiten por semilla y suelo.

Los anticuerpos son un grupo de inmunoglobulinas que tienen propiedades y funciones especficasson producidos por antgenos o sustancias extraas al organismo animaly slo reconocen al antgeno que les di orgen.

Las inmunoglobulinas son proteinas que se sintetizan en clulas del tejido linftico de los mamferos.

Clases de Anticuerpos

80% del total de Ig. Se encuentran en la sangre y pueden atravesar las paredes de los vasos conductores. Protegen contra bacterias, virus y toxinas

10-15% del total de Ig en la sangre. Mas abundantes en secreciones mucosas como saliva, lgrimas,etc

5-10% de Ig en la sangre. No pasa libremente en los tejidos. Aparece temprano en las infecciones. Inicia la cascada de complemento

0.2% del Ig en la sangre. Se halla en las clulas B inmaduras. Probablemente juega un rol en la regulacin

0.002% en la sangre normalmente.Se incrementa en respuestas alrgicas. Su Fc se adhiere a la mayoria de clulas y causa degradacin

Los Inmunoensayos se basan en anticuerpos.

Los mamferos producen anticuerpos que especficamente se unen a los sitios de reconocimiento ( epitopes o determinante antignico) de las macromolculas como lo son: proteinas, glicoproteinas, lipopolisacaridos, constituyentes de un fitopatgeno (Antgenos) Cada determinante antignico lo constituyen 8 aminocidos.

Inmunizacin con el antgeno

Estructura de la Gamma globulina IgG

Sitio de unin del Anticuerpo

PARATOPE

Sitio de unin del Antgeno

EPITOPE

Fragmento Fab

C H 2

C H 2

Fragmento Fab

Fragmento Fc C H 3 C H 3

COOH

COOH

carbohidrato

Antgenos

Anticuerpo Policlonal
Antgeno Colecta de la sangre; se separa el suero Purificacin del antisuero Inmunoensayo

Caractersticas que debemos recordar

1. Los anticuerpos son bivalentes (slo dos lugares de unin con el antgeno) y altamente especficos (regularmente slo reconocen al antgeno que les dio origen) 2. La mayora de los antgenos son multivalentes o polivalentes (varios determinantes antignicos, iguales o diferentes, en su estructura)

La inmunoprecipitacin es la tcnica que permiti el desarrollo de nuevas tcnicas inmunolgicas o mtodos que ahora conocemos

Inmunoprecipitacin

Aadir anticuerpo especfico

PRECIPITADO

antgeno

Incubar (37C) 1 hr

Tcnicas serolgicas
unin de Ag - Ac

Precipitacin Aglutinacin inmunoaislamiento Inmunoadsorcin con enzimas conjugadas ( ELISA ) Tiras de flujo lateral (Immunostrip) Inmunoimpresin Inmunoflourescencia Inmunocaptura - Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Doble Difusin en gel

Propiedades de las tcnicas Inmunolgicas

Rpidas Sensibles Especficas Diagnstico de enfermedades Deteccin de patgenos

ELISA
Tcnica serolgica de inmunoadsorcin con enzimas conjugadas

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

Tcnica de inmunoadsorcin con enzimas conjugadas

Materiales
Equipo: micropipetas, potencimetro,lector de placas,incubadora Muestra vegetal Juego de antisueros Soluciones amortiguadoras Sustrato Placas de microtitulacin

ELISA
Indirecta / Directa
Directa = el antgeno es detectado directamente por el conjugado (enzima + anticuerpo) Indirecta = la enzima conjugada detecta primero a un anticuerpo y no directamente al antgeno. DAS ELISA (doble anticuerpo) El antgeno queda atrapado entre dos anticuerpos (el de deteccin y el conjugado) La reaccin Positiva se observa mediante una reaccin enzimtica con un sustrato cromognico = cambio de color

Directa, Doble Ac Sandwich ELISA = DAS

TAS ELISA - Indirecta

(triple antibody sandwich)
Reaccin de color

Sensibilizar - Primer anticuerpo

Antgeno = Fitopatgeno

segundo anticuerpo + Enzima conjugada (tercer Ac)

Sustrato

ELISA indirecta
Muestra Antgeno- Bacteria Primer anticuerpo

Enzima conjugada

Reaccin de color

LECTURA DE LA PLACA

Lector de placas de microtitulacin

Reaccin de la placa

Reaccin positiva: si el valor de la densidad ptica de la muestra es mayor o igual a tres veces la media del testigo negativo
Control Positivo 1.689 Control negativo 0. 030
MUESTRA A MUESTRA B MUESTRAS C

Blanco 0.0002

O.055

0. 099

1.999

Propiedades y ventajas
La sensibilidad de esta tcnica es superior a otras pruebas serolgicas, por lo que ha sido extensamente utilizada para la deteccin de patgenos en humanos, animales y plantas. Es un mtodo confiable y rpido para la deteccin de virus y bacterias fitopatgenos. Se pueden procesar varias muestras a la vez. Se obtienen resultados cualitativos y cuantitativos.

Desventajas
Sensibilidad Relativa puede ser menor que otros metodos. Se trabaja con protenas. La especificidad vara de acuerdo a los productos empleados riesgo de falsos + o falsos Costo

Deteccin por tiras de flujo lateral

Lnea control

Segundo anticuerpo

Positiva

Anticuerpos especficos

Muestra A

Muestra B

antgeno

Resultados negativos

Resultados positivos

Conjugado Muestra anticuerpo vegetal ANTGENO especifico (patgeno)

Complejo Antigeno conjugadoanticuerpo

Formacin del complejo anticuerpo antgenoenzima

No hay unin del conjugadocon anticuerpo inespecfico

Almohadilla con el Conjugado Almohadilla para la muestra

Almohadilla para manejo de la tira Membrana de Nitrocellulosa

Material del envs de la tira

Vista Seccional de una tira de flujo lateral Resultado Positivo

Linea de prueba

Linea de control

Environlogix, Inc.

Vista Seccional de una tira de flujo lateral Resultado Negativo

Muestra vegetal
Conjugado con anticuerpos especificos Sana, sin antgeno
Almohadilla con el Anticuerpo Conjugado Almohadilla de muestra Backing Material Almohadilla para manejo de la tira

conjugadoanticuerpo sin antgeno

No hay formacin del complejo

No hay unin del conjugadocon anticuerpo inespecfico

Membrana de Nitrocellulosa

Linea de prueba

Linea de Control

Environlogix, Inc.

ELISA vs. Tira de flujo Lateral Cmm

1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 1 Immunostrip Result 2 3 BID- Absorbance 650 nm

0 = negativo; 1 = deteccin positiva ligera; 2 = positivo

NCM-ELISA

Inmunofluorescencia (IF)
Generalmente usada para la identificacin de bacterias y esporas de hongos El marcador es Fluorescente Los reactivos y pasos a seguir son similares a los de ELISA Se emplea microscopio epifluorescente

Ensayo para Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus

1 Anticuerpo en PBS-Tween Incuba 2 hr, 22C Lavar 6X, PBS-Tween 2 Anticuerpo (Alexa Fluor 488, 1:500) en PBS-Tween Incubar 1 hr, 22 C en obscuridad Lavar 6X, PBS-Tween

Microscopa Epifluorescente

Phakopsora pachyrhizi

IF = especificidad

P. pachyrhizi Puccinia graminis

Inmunocaptura - PCR
ELISA:

Las tcnicas basadas en la deteccin del DNA, son altamente sensibles y la variante immunocaptura PCR (IC-PCR) es todava ms sensible al combinar anticuerpos y PCR.

Ac captura + Antgeno

Bao mara