UNIVERSIDAD NACIONAL DE UCAYALI

FACUALTAD DE CIENCIAS FORESTALES

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA FORESTAL

DETERMINACIÓN DEL PROTOCOLO DE DESINFECCIÓN DE SEMILLAS DE

BOLAINA BLANCA (Guazuma crinita, Mart.) Y CEDRO (Cedrela odorata, L.) PARA
GERMINACION IN VITRO.

Plántulas de cedro y bolaina germinadas en el laboratorio.

Bach. FRANK PETTER APONTE SHUPINGAHUA.

PUCALLPA – PERU.
2008
 DETERMINACIÓN DEL PROTOCOLO DE DESINFECCIÓN DE SEMILLAS DE
BOLAINA BLANCA (Guazuma crinita, MART.) Y CEDRO (Cedrela odorata, L.), PARA
GERMINACIÓN IN VITRO.

DETERMINATION OF THE PROTOCOL OF DISINFECTION OF SEEDS OF

BOLAINA BLANCA (Guazuma crinita, MART.) AND CEDAR (Cedrela odorata, L.)
FOR IN VITRO GERMINATION.

Frank Petter Aponte Shupingahua.(1)

RESUMEN

Con la finalidad de establecer un procedimiento ideal en la esterilización de semillas de

bolaina blanca (Guazuma crinita) y cedro (Cedrela odorata), para su germinación In Vitro, se
probaron diferentes tiempos de exposición al hipoclorito de sodio al 2%, que consistieron en
10, 30 y 40 min. Los resultados fueron que, para el cedro se requiere 40 min de exposición al
desinfectante, obteniéndose 0% de contaminación, mientras que en bolaina blanca se requiere
30 min, con iguales resultados. Asimismo se obtuvo que en el porcentaje de germinación se
alcanzó 26.66% y 28% para el cedro y bolaina respectivamente.

PALABRAS CLAVES: Tiempos de exposición, hipoclorito de sodio, Guazuma crinita Mart,

Cedrela odorata L, porcentaje de contaminación, porcentaje de semillas germinadas.

ABTRACT.

With the purpose of establishing an ideal procedure in the sterilization of seeds of bolaina
blanca (Guazuma crinita) and cedar (Cedrela odorata), for his In vitro germination, they were
proved different times of exhibition to the hipoclorito of sodium to 2 %, which consisted of
10, 30 and 40 min. The results were that, For the cedar 40 min of exhibition are needed to the
disinfectant, 0 % of pollution being obtained, whereas in bolaina blanca are needed 30min,
with equal results. Likewise there was obtained that in the percentage of germination 26.66 %
and 28 % were reached for the cedar and bolaina respectively.

KEY WORDS: Times of exhibition, hipoclorito of sodium, Guazuma crinita Mart, Cedrela
odorata L, percentage of pollution, percentage of germinated seeds.

(1) Bachiller en Ciencias Forestales - UNU

INTRODUCCION
 Ante el poco conocimiento de las técnicas y procedimientos de propagación in Vitro para
la especie Guazuma crinita, Mart, y Cedrela odorata, se hace difícil determinar la
metodología adecuada para introducir de manera aséptica las semillas al cultivo in Vitro, que
es el primer paso para propagar micro estacas de plántulas germinadas en condiciones de
laboratorio en un medio MS, con el objeto de cultivar grandes cantidades de individuos en
espacios reducidos (CALZADA. 1980).

Al determinarse el protocolo de desinfección de Guazuma crinita, y Cedrela odorata, se

podrá establecer una metodología dentro de un programa de multiplicación In Vitro de la
especie en cuestión, además de la posibilidad de multiplicación de explantes de alto valor
genético y libre de enfermedades, con lo cual se podrá abastecer a los empresarios dedicados
a realizar reforestación, motivo por el cual se convertirá en una actividad rentable para todo
aquél que se dedique a la producción de plántulas bajo este método, que a su vez evitará la
dependencia de semillas provenientes de los bosques y disminuirá el impacto causado sobre
las poblaciones naturales.

El presente trabajo tiene como objetivo encontrar el tiempo más adecuado a la exposición
de hipoclorito de sodio en la esterilización de las semillas de BOLAINA BLANCA
(Guazuma crinita, Mart.) Y CEDRO (Cedrela odorata, L.) para la germinación en
condiciones de In Vitro.
Según FONT QUER (1978), la especie Guazuma crinita Mart., se clasifica dentro del
Orden malvales; Familia Sterculaceae: Genero Guazuma. Además que es un árbol de
crecimiento rápido, fuste recto, madera blanda de propagación fácil, abundante semilla, sufre
ataque de hormigas. Su madera es comercial en la región, se utiliza principalmente para
viviendas rurales por su bajo costo.

Cedrela odorata perteneciente al Orden Sapindales, de la familia Meliaceae. Habita

en tierras altas de la selva y márgenes inundables de los ríos. Es un árbol maderable conocido
como cedro y cedro real y se distribuye desde el norte de México hasta el norte de Argentina.
Asimismo, es fácil de trabajar, cepillar, tallar, tornear y lijar y posee una alta resistencia al
ataque de hongos e insectos (INIFAD. 1994). Al igual que Swietenia microphylla, el cedro es
atacado por el barrenador de brotes, Hypsipyla grandella
 Las especies heliófitas como la BOLAINA BLANCA (Guazuma crinita, Mart.) Y
CEDRO (Cedrela odorata, L.), son bastante requeridos en el mercado de la madera por sus
múltiples usos (TARIQUE. 1987), además VIDAURE (1992), afirma que bolaina blanca se
adecua bien a suelos del tipo Ultisol, Entisol e Inceptisol, mientras que el Cedro se adapta a
una gran variedad de suelos, principalmente bien drenados, de textura arenosa, franco arenosa
y arcillosa (CATIE, 1997).

Según DÍAZ, (2000) en 1 kilogramo hay aproximadamente 750,000 semillas de

bolaina, el Porcentaje de germinación es de 65 % para semillas frescas en condiciones
ambientales con temperatura promedio de 25 °C. Las semillas se pueden almacenar en
condiciones ambientales hasta un tiempo máximo de 280 días con un porcentaje de
germinación esperada de 40 %. En la propagación por semilla directamente a nivel de
investigación se obtuvo 19.75 % de germinación en campo definitivo en suelo mineral con
una cobertura de hojas pequeñas secas y 14.75 % en suelo mineral con una cobertura de
plantación de arroz.

Un kilogramo contiene aproximadamente de 15,000 a 69,000 semillas de cedro, con

un promedio de 32,000 y un contenido de humedad de 30%; presenta un porcentaje de pureza
de 40 a 70. Bajo condiciones ambientales, la viabilidad de las semillas disminuye
rápidamente después de un mes, La semilla fresca presenta una viabilidad del 80% y se
logran porcentajes de germinación de 85 a 95%, sin tratamiento pre germinativo. La
germinación se inicia de 8 a 15 días después de la siembra y se completa a los 15 a 18 días
(PROSEFOR, 1997).

El medio de cultivo es la combinación sólida o líquida de nutrientes y agua.

Usualmente incluye sales inorgánicas, carbohidratos y vitaminas y aminoácidos. A menudo se
denomina Medio Basal y puede ser suplementado con algún regulador de crecimiento y
ocasionalmente con otras sustancias varias. El medio de cultivo mas conocido es el MS o de
Murashige y Skoog (1962)
 En un trabajo de investigación realizado por VILLEGAS (2008), se utilizó una
concentración al 2% de hipoclorito de sodio durante 10, 20 y 40 min. para esterilizar semillas
de bolaina a ser sembradas en condiciones de In Vitro, donde determinó que no se obtuvieron
diferencias entre los tiempos de exposición de las semillas al hipoclorito de sodio, ya que se
dio una desinfección del 100% para las tres variables utilizadas.

MATERIAL Y METODO.

MATERIAL

De Laboratorio

Matraces Erlenmeyers de 250 y 500 ml

Vasos de precipitado de 500 ml
Placas petri
Pipetas de 1 y 10 ml
Probetas de 100 ml
Mechero de alcohol
Pinzas
Tubos de ensayo autoclavable
Varillas de vidrio
Frascos ámbar
Tubo de ensayo
Papel aluminio
Cintas selladoras
Mangos de bisturí
Hoja de bisturí
Cuchillas
Equipos de Laboratorio

Autoclave
Estufa
Balanza analítica
Cámara de flujo laminar
Aire acondicionado
Refrigeradora
Cocina eléctrica
Horno Pasteur

METODO

Se empleó el método experimental, que consistió en cualificar y cuantificar el efecto

del tiempo de exposición del hipoclorito de sodio al 2% en la asepsia de las semillas de
bolaina y cedro, con lo cual se obtuvo una metodología adecuada para el protocolo de
desinfección de esta especie.

Preparación del germoplasma.

Las semillas utilizadas para el desarrollo del presente trabajo de investigación fueron
proporcionadas por el CIDRA (Centro de Investigación y Desarrollo Rural Amazónico), las
mismas que fueron extraídas de árboles seleccionados con características fenotípicas
superiores, provenientes de plantaciones ubicadas en el bosque Macuya, perteneciente al
distrito de Tournavista, Provincia de Puerto Inca, Región Huánuco. Las semillas se
conservaron en una bolsa de papel dentro de un refrigerador para mantener su viabilidad
hasta el día del trabajo en el laboratorio. Las semillas no fueron expuestas a ningún tipo de
tratamiento pre germinativo.
Procedimiento de desinfección.

El experimento se desarrollo en las instalaciones del laboratorio de cultivos y

vegelates perteneciente a la Facultad de Trópicos y Sub Trópicos de la Universidad de
Agricultura de Praga en Republica Checa.

Para el procedimiento de desinfección se utilizó en todos los tratamientos, una

concentración de alcochol de 96º por 60 segundos, y después se colocó en hipoclorito de
sodio al 2%, los tiempos de exposición a dicha concentración se muestran en el siguiente
cuadro:

Tabla 1.-Tiempo de exposición a una concentración de hipoclorito de sodio al 2%, para el

proceso de desinfección de semillas de BOLAINA BLANCA (Guazuma crinita, Mart.) Y
CEDRO (Cedrela odorata, L.), en condiciones de In Vitro.

Tratamientos por especie Tiempo de inmersión al

hipoclorito de sodio al
2%
T E
T1 cedro 20 min.
T2 cedro 30 min.
T3 cedro 40 min.
T4 bolaina 20 min.
T5 bolaina 30 min.
T6 bolaina 40 min.

Para todos los tratamientos se agregó 2 gotas de Tween 80, como detergente líquido
para mejorar la capacidad desinfectante, además cada tratamiento fue expuesto durante dos
minutos en alcohol al 96º. Se utilizó un agitador electrónico para garantizar la homogeneidad
en la solución. Al finalizar el tiempo de exposición al desinfectante, se enjuagó las semillas
con agua estéril 3 veces, esto se realizó dentro de la cámara de flujo laminar justo antes de la
siembra.
Preparación del medio de cultivo.
La preparación del medio de cultivo se realizó en base a la constitución de sales de
Murashige Skoog (MS), más 4 gr. De Fitagel/litro, también se agrego 30 gr. De sacarosa/litro.
Seguidamente el medio de cultivo se distribuyo en frascos de vidrio y cerrados con papel
aluminio. Finalmente se introdujo en el autoclave a 121ºC, y 6.8 Kg/cm2, por 15 min.,
finalmente se dejo enfriar hasta que la solución se gelatinice.

Procedimiento de siembra.
Se procedió a la siembra de las semillas ya esterilizadas, para esto se utilizo una pinza
con la cual se colocaron las semillas en la superficie del medio de cultivo, a razón de una
semilla por frasco, haciendo un total de 166 muestras distribuidos en 6 tratamientos. Los
frascos se rotularon y colocaron dentro de la cámara de incubación a condiciones controladas
de temperatura (25 ºC), y una intensidad lumínica de 4000 luz.

Evaluación de parámetros.

La evaluación de los índices de contaminación y germinación se realizaron a los 3, 7 y 15

días después de haber sido sembradas las semillas.

Tratamiento de datos.

Para el ensayo se utilizó un Diseño Completo al Azar (DCR), los porcentajes de los
promedios obtenidos en la contaminación y germinación de las semillas en cada tratamiento
se sometieron a una prueba de Independencia al 95% grados de libertad.
 RESULTADOS.

Contaminación de las semillas.

Para esta variable se determinó que existe relación entre los tres tiempos de exposición al
hipoclorito de sodio y la asepsia de las semillas de cedro y bolaina, como se muestra en los
cuadros siguientes:

Tabla 2.- Prueba de independencia para el porcentaje de contaminación de cedro.

Prueba de
N° de semillas
Tratamiento independencia (0,05)
sembradas
(% de contaminación)
T3 30 0
T2 40 60
T1 25 100

Tabla 3.- Prueba de independencia para el porcentaje de contaminación de bolaina blanca

Tratamiento N° de semillas Prueba de independencia
sembradas (0,05) (% de
contaminación)
T5 50 0
T6 20 0
T4 25 100
 % 100 100 100

d 90
e
80
c
o 70
n 60
t 60
a
m
50
i
n
40
a
c
30
i 20
o
n 10
0 0 0
0
T1 T2 T3 T4 T5 T6
% de contaminacion
Tratamientos

Figura 01. Porcentaje de contaminación de semillas de bolaina y cedro sometidas a diferentes

tiempos de exposición a una concentración de 2% de hipoclorito de sodio.

En la Figura 01 se observa que T1 y T4 muestran una contaminación de una 100%, mientras

que T2 logró disminuir la contaminación a 60%, pero con los tratamientos T3, T5 y T6, la
contaminación se disminuye a 0 %.

Germinación de las semillas.

Para esta variable se determinó que existe relación entre los tres tiempos de exposición al
hipoclorito de sodio y la germinación de las semillas de cedro y bolaina, como se muestra en
las tablas siguientes:
Tabla 4.-Prueba de independencia para el porcentaje de germinación de semillas de Cedro.
N° de semillas Prueba de independencia (0,05) Resistencia a
TRATAMIENTO
sembradas % de Germinación la germinación
T3 30 26.66 9 - 15 días
T2 16 12.5 9 - 15 días
T1 25 0 0

Tabla 5.- Prueba de independencia para el porcentaje de germinación de semillas de bolaina

 N° de semillas Prueba de independencia (0,05) % Resistencia a la
TRATAMIENTO
sembradas de Germinación germinación
T5 50 28 6 - 15 días
T6 20 25 6 - 15 días
T4 25 0 0
%
30 28,00
d 26,66
e 25,00
25
g
e
r
20
m
i 15
n 12,50
a
c 10
i
o
n 5
0,00 0,00
0
T1 T2 T3 T4 T5 T6
% de Germinación Tratamientos

Figura 02. Porcentaje de germinación de semillas de bolaina y cedro sometidas a diferentes

tiempos de exposición a una concentración de 2% de hipoclorito de sodio.

En la Figura 02 se tiene que, tanto T1 como T4 no muestran germinación debido a que estas
semillas se eliminaron por presentar contaminación, mientras que T2 muestra 12,5%, de
germinación, seguido de T6 con 25%, el tratamiento T3 con 26,66% y T5 con 28%.

DISCUSIONES.
 En el cuadro 2 se muestra el porcentaje de contaminación en las semillas de cedro,
donde se tiene que las semillas de cedro expuestas a 20 min a la concentración de hipoclorito
de sodio a 2% (ver Tabla 1) no muestra resultados favorables, ya que se obtuvo un 100% de
contaminación de las semillas, siendo el tiempo óptimo para esta especie 40 min, al obtenerse
un 0% de contaminación. El porcentaje de contaminación de semillas de bolaina (Tabla 3), se
observa que éstas, expuestas a 20 min a la concentración de hipoclorito de sodio a 2% (ver
Tabla 1), no tiene efecto positivo para la esterilización de la especie, pero que con 30 y 40
min se tiene que la contaminación disminuye en un 100%.

Esto forma un contraste en lo obtenido por VILLEGAS (2008), ya que encontró que
no existen diferencias entre los diferentes tiempos de exposición de las semillas de bolaina al
hipoclorito de sodio , siendo los resultados de esterilización de las semillas favorables en un
100% a los 10, 20 y 40min., esto deja en evidencia que la procedencia de las semillas y el
trato que reciben al momento de ser cosechadas y transportadas juegan un papel importante
en la asepsia de las mismas (HARTAMAN. 1995), lo cual se refleja en la complejidad y
efectividad para esterilizar el material genético.

En la Tabla 4, se tiene el porcentaje de germinación de las semillas de Cedro después

del proceso de desinfección, donde las semillas expuestas a 40 min al desinfectante tienen
mejores resultados (26.66%), cuya germinación se da entre los 9 y 15 días, esto último
coincide con lo obtenido por PROSEFOR (1997), con respecto a la germinación de la especie
en el estado natural. En el porcentaje de germinación de las semillas de bolaina blanca se
aprecia que las semillas expuestas a 30 min a la concentración de hipoclorito de sodio a 2 %
muestran 28% de efectividad, que es el mejor resultado para esta especie, la germinación
comenzó desde el día 6 después de la siembra hasta el día 15.

Es interesante mencionar que VILLEGAS (2008) obtuvo porcentajes similares de

germinación para la especie de Guazuma crinita Mart, y que, al igual que ahora, la relación
tiempo de exposición al hipoclorito de sodio al 2% (X) - porcentaje de germinación (Y) es
parabólica, es decir que a mayor tiempo de exposición menor será la germinación. Al
respecto HARTAMAN (1995), señala que la desinfección requiere el empleo de materiales
químicos que son tóxicos para los organismos pero relativamente inocuos para le material
vegetal. Tanto la efectividad del tratamiento como el daño al tejido viviente aumentan como
respuesta al tiempo-dosis, de manera que se debe buscar un equilibrio efectivo de esos
factores.

CONCLUSION.

1. Los resultados del experimento de esterilización superficial permitió confirmar que el uso
de hipoclorito de sodio fue necesario para obtener semillas libres de contaminantes
superficiales.
2. Las semillas de Cedro (Cedrela odorata, L.), expuestas por 40 min a una concentración
de hipoclorito de sodio al 2 % obtienen 0% de contaminación en el proceso de siembra en
condiciones In Vitro.
3. Las semillas de bolaina (Guazuma crinita, Mart.), expuestas por 30 min a una
concentración de hipoclorito de sodio al 2 % es óptimo para ser sembradas en
condiciones In Vitro, ya que no se obtuvo contaminación alguna.
4. El tratamiento T3 influye favorablemente en el rompimiento de la dormancia de las
semillas de cedro, al obtenerse un 26.66 % de germinación en un periodo de 6 a 15 días
después de transcurrida la siembra.
5. Para la especie de bolaina blanca, el tratamiento T5 es le mas indicado, obteniéndose un
28% de germinación en un periodo de tiempo de 6 a 15 días después de transcurrida la
siembra.

AGRADECIMIENTOS.
Mi sincero agradecimiento:

A Dios y a mi madre por haberme apoyado en todo momento durante todo el proceso de mis
estudios.

A La Universidad Nacional De Ucayali, a la Facultad De Ciencias Forestales y al Centro de

Investigación y Desarrollo Rural Amazónico por haber hecho posible el convenio de
intercambio de estudiantes entre la Universidad Nacional de Ucayali y la Universidad de
Agricultura de Praga en República Checa.

A la Universidad De Agricultura En Praga por haber brindado sus instalaciones durante el

semestre académico “I 2008. “

Al Ing. Pablo P. Villegas por sus enseñanzas en el Laboratorio De Cultivo De Tejidos y

Meristemas de la Universidad Nacional de Ucayali.

BIBLIOGRAFIA.
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