Carlos Maurcio G.

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Nutrio e Crescimento Bacteriano

1. Nutrio - corresponde ao fornecimento de substncias nutritivas para o desenvolvimento de um microrganismo. O reconhecimento das necessidades nutricionais bacterianas importante para assegurar seu cultivo em condies artificiais, no laboratrio de bacteriologia. 2. Nutrientes - so definidos como substncias utilizadas pela clula para a construo, organizao e manuteno de sua estrutura, inclusive como fonte de energia, quando esta de natureza qumica. Os nutrientes essenciais, podem ser divididos, didaticamente, em classes distintas, de acordo com seu papel no metabolismo. Torna-se importante ressaltar que as bactrias apenas se nutrem de substncias em soluo sendo portanto a gua um fator indispensvel para seu crescimento. Os elementos qumicos principais para o crescimento da clula so: carbono, nitrognio, oxignio, enxofre e fsforo 2.1. Doadores de Hidrognio - So substratos oxidveis, que sob a forma de doadores de eltrons, fornecem energia para os microrganismos quimiossintetizadores. Estes substratos capazes de perder eltrons, podem ser compostos orgnicos como glicdios, lcoois, aminocidos, ou inorgnicos como nitritos, sulfitos, enxofre e o prprio hidrognio. Os microrganismos fotossintetizadores exigem doadores de eltrons com a finalidade de realizar a fotossntese.

2.2. Receptores de Hidrognio - Quando um substrato se oxida doando eltrons, geralmente pela perda de tomos de hidrognio; outro substrato se reduz, recebendo estes tomos, ou seja, as reaes de oxidao so sempre acopladas a reaes de reduo. O oxignio gasoso utilizado como aceptor de H+, pelos microrganismos aerbios. Os anaerbios podem usar compostos inorgnicos (sulfato, nitrato, carbonato) ou orgnicos, no caso da fermentao, usando a fonte de carbono, ou algum fragmento dela derivado. 2.3. Fonte de Carbono - Todos os organismos requerem carbono de alguma forma. Em geral os compostos orgnicos so os que possuem carbono. O carbono o elemento fundamental na constituio das molculas orgnicas, formando o esqueleto das 3 maiores classes de nutrientes orgnicos: carbohidratos, lipdeos, e protenas - estes fornecem energia para o crescimento da clula e servem como unidade bsica do material celular. Os microrganismos em geral, necessitam de uma fonte de carbono para sntese dos numerosos compostos orgnicos que constituem o protoplasma. O carbono um elemento indispensvel sntese dos componentes celulares, e deve ser fornecido bactria seja como composto orgnico como por exemplo os carbohidratos, ou inorgnicos, sob a forma de CO2. As bactrias capazes de utilizar CO2 como nica fonte de carbono so denominadas como autotrficas. Os heterotrficos utilizam compostos orgnicos como sua principal fonte de carbono, obtendo tais molculas a partir do meio, ou ingerindo organismos autotrficos ou mesmo heterotrficos. Em muitos casos, um mesmo composto pode funcionar como fonte de carbono, doador de hidrognio e fonte de energia. O carbono utilizado primariamente pelos seres vivos est presente no ambiente, combinado ao oxignio e formando as molculas de gs carbnico presentes na atmosfera ou dissolvidas nas guas dos mares, rios e lagos. O carbono passa a fazer parte da biomassa atravs do processo da fotossntese. Os seres fotossintetizantes incorporam o gs carbnico atmosfrico, transformando-se em molculas orgnicas. O ciclo do carbono o seguinte: O carbono absorvido pelas plantas. Uma vez incorporado s molculas orgnicas dos produtores, poder seguir dois caminhos: ou ser liberado novamente para a atmosfera na forma de CO2, como resultado da degradao das molculas orgnicas no processo respiratrio, ou ser transferido na forma de molculas orgnicas aos animais herbvoros quando estes comerem os produtores (uma parte ser transferida para os decompositores que liberaro o carbono novamente para a atmosfera, degradando as molculas orgnicas presentes na parte que lhes coube). Os animais, atravs da respirao, liberam atmosfera parte do carbono assimilado, na forma de CO2. Parte do carbono contido nos herbvoros ser transferida para os nveis trficos seguintes e outra parte caber aos decompositores e, assim, sucessivamente, at que todo o carbono fixado pela fotossntese retorne novamente atmosfera na forma de CO2.

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2.4. Fonte de Nitrognio - O nitrognio um elemento que entra na constituio de duas molculas orgnicas extremamente importantes: as protenas e os cidos nuclicos. a parte essencial dos aminocidos, que formam as protenas. Embora esteja presente em grande porcentagem no ar atmosfrico, na forma de N2, poucos so os organismos que o assimilam nessa forma. As bactrias so mais versteis para usar o nitrognio que os organismos eucariotos. Apenas certas bactrias e algas cianofceas podem retir-lo do ar na forma de N2 e incorpor-lo s suas molculas orgnicas. Como conseqncia, os demais seres vivos dependem daqueles organismos para a fixao do nitrognio ambiental. Em bactrias o nitrognio compreende aproximadamente 10% do peso seco das clulas. Algumas bactrias necessitam de fontes orgnicas de nitrognio como peptdeos, aminocidos ou sais orgnicos de amnia, enquanto outras so capazes de utilizar fontes inorgnicas de nitrognio como nitratos, nitritos e sais de amnia ou o prprio N 2 (nitrognio atmosfrico) - fixao de nitrognio. As bactrias que fixam o nitrognio diretamente da atmosfera vivem prximo superfcie do solo. Ao morrer e ser degradadas, essas bactrias liberam seu nitrognio no solo, na forma de molculas de amnia. Outros tipos de bactrias transformam a amnia em nitratos e , nessa forma, que as plantas absorvem o nitrognio do solo, por meio de suas razes. Os herbvoros obtero nitrognio ao comerem as plantas. Certas bactrias fixadoras de nitrognio atmosfrico, ao invs de viverem livres no solo, vivem no interior dos ndulos formados em razes de plantas leguminosas, como a soja e o feijo. Ao fixarem o nitrognio do ar, essas bactrias fornecem parte dele s plantas. A rotao de culturas uma prtica recomendvel, porque as plantas leguminosas colocam em disponibilidade o nitrognio para outras culturas. A devoluo do nitrognio atmosfera, na forma de N2, feita graas ao de outras bactrias, chamadas denitrificantes. Elas podem transformar os nitratos do solo em N2, que volta atmosfera, fechando o ciclo. 2.5. Minerais - Necessrios ao crescimento e metabolismo de clulas bacterianas. 2.5.1. Enxofre - um componente de muitas substncias orgnicas da clula, necessrio para a biossntese dos aminocidos cistena, cistina, e metionina, aparecendo em protenas, dentre outros compostos, sob a forma de grupamentos sulfidrila. Alguns microrganismos exigem enxofre orgnico, mas muitos podem reduzir sulfato forma orgnica. 2.5.2. Fsforo - O fosfato exigido como um componente do ATP, dos cidos nuclecos e de coenzimas como NAD, NADP e as flavinas. O fosfato sempre assimilado sob a forma de fosfato inorgnico livre. 2.5.3. Ativadores de Enzimas - No preparo de um meio nutritivo para cultivo da maioria dos microrganismos, necessrio oferecer fontes de potssio, magnsio, clcio e ferro, em geral sob a forma de seus ons. Estes funcionam como ativadores enzimticos. Os ons de magnsio e ferro so encontrados nas porfirinas; o magnsio na molcula de clorofila, e o ferro como parte das coenzimas dos citocromos e peroxidases. O Mg ++ e o K+ so ons essenciais no funcionamento e integridade dos ribossomos. O Ca++ necessrio na parede celular de bactrias Gram positivas. Outros minerais necessrios nutrio porm em concentraes to baixas que so supridas como impurezas dos demais componentes utilizados no preparo do meio. 2.6. Fatores de Crescimento - Um fator de crescimento um composto orgnico de que uma bactria necessita para crescer, mas no capaz de sintetiza-lo. Assim determinados aminocidos, vitaminas, coenzimas ou outros compostos devem ser acrescentados ao meio no intuito de assegurar o desenvolvimento bacteriano. 3. Classificao dos Tipos Nutricionais - as bactrias podem ser divididas em grupos com base em suas exigncias nutritivas. A principal separao corresponde a forma de obteno de energia, sendo denominados como fototrficos aqueles microrganismos capazes de utilizar a energia radiante (energia luminosa), e aos microrganismos que obtm energia a partir

Carlos Maurcio G. Ribeiro http://geocities.yahoo.com.br/mauriciogrib - e-mail: mauriciogrib@yahoo.com.br da oxidao de compostos qumicos, cabe a denominao de quimiotrficos. Os organismos de uma forma geral, incluindo-se os microrganismos requerem alguma forma de carbono; todos necessitam, ao menos, de pequenas quantidades de dixido de carbono (CO 2), mas a maior parte requer certos compostos orgnicos de carbono, como os aucares e outros carbohidratos. Os vegetais utilizam o CO 2, convertendo-o pela fotossntese em carbohidratos. Muitas bactrias tambm exigem apenas o CO 2 como sua fonte nutritiva, e de acordo com essa caracterstica, esses microrganismos so classificados como autotrficos. No entanto existem outras bactrias que apresentam um comportamento semelhante aos animais, no sentido de serem incapazes de usar o CO 2 como nica fonte de carbono e portanto dependerem de organismos autotrficos para a produo de carbohidratos entre outros compostos utilizados como alimentos. As formas bacterianas que necessitam de uma fonte orgnica de carbono so caracterizadas como heterotrficas. Tabela 1 - Distribuio das Bactrias Quanto aos Tipos Nutritivos Tipo Nutricional Fotolitotrfico Fotorganotrfico Quimiolitotrfico Quimiorganotrfico Energia Luminosa Luminosa Qumica Qumica Fonte de Carbono CO2 Composto orgnico CO2 Composto orgnico Doador de H2 Inorgnico Orgnico Inorgnico Orgnico Exemplo de Organismo Vegetais clorofilados Sulfobactrias (Chromatium) Bactrias Purpurinas (Rhodopseudomonas) Nitrobactrias (Thiobacillus) Animais, Maioria das bactrias (Escherichia )

4. Meios para o Cultivo de Bactrias Os meios escolhidos para o cultivo de bactrias especficas normalmente simulam o habitat normal das mesmas, dessa forma para as bactrias que preferem os nutrientes encontrados no sangue, adiciona-se sangue ao meio. Se a glicose o constituinte comum de um nicho bacteriano, adiciona-se acar ao meio. Para aquelas bactrias que apresentam maiores exigncias nutricionais (fastidiosas) utilizam-se meios complexos, os quais contm uma grande variedade de substncias orgnicas preparadas a partir de matrias naturais. 4.1. Meios Seletivos - servem para selecionar um microrganismo permitindo um tipo particular ou suprimindo o crescimento de outros. Exemplos: gar sabourad para fungos; gar verde brilhante para Salmonella , o corante verde brilhante adicionado ao meio inibe as bactrias gram-positivas comuns do trato intestinal; o gar fenil-etanol inibe o crescimento de gram-negativas, mas no das gram-positivas. Recentemente os antibiticos vem sendo adicionados aos meios, tornando-os seletivos para os microrganismos resistentes estes agentes antimicrobianos

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4.2. Meios Diferenciais - servem para diferenciar os vrios tipos de microrganismos em uma placa com gar. Exemplos: quando uma amostra de secreo da garganta semeada numa placa de gar sangue, pode-se diferenciar as bactrias hemolticas (produzem enzimas que lisam as hemcias, formando uma zona clara ao redor da colnia) das no hemolticas (que no dissolvem as hemcias, e portanto no formam este halo ao redor das colnias). 4.3. Meios Seletivos/Diferenciais - agem tanto como seletivos como diferenciais, so particularmente teis em microbiologia de sade pblica, como na determinao da qualidade da gua ou na identificao de causas de infeco alimentar. Exemplos: gar MacConkey - contm sais biliares e corante cristal violeta, os quais inibem o crescimento de gram-positivos e permitem o desenvolvimento de gram-negativas, e ainda a lactose, que distingue as fermentadoras (produtoras de cido a partir do acar tornando-as vermelhas) das no fermentadoras (no produtoras de cido). 4.4. Meios de Enriquecimento - utilizados para selecionar um microrganismo que est presente em determinado local, em pequenas quantidades com relao populao. O meio favorece o crescimento da espcie desejada, mas no o crescimento das outras espcies presentes em uma populao mista, ao contrrio do meio seletivo, nenhum agente inibidor utilizado para prevenir o crescimento de microrganismos indesejveis. Um exemplo so as bactrias que oxidam o fenol - que podem ser isoladas de amostras do solo, utilizando um meio de enriquecimento, constitudo de sais de amnia, e fenol como nica fonte de carbono e energia - assim somente os microrganismos capazes de oxidar o fenol estaro presente em grande nmero depois de vrios cultivos seletivos 4.5. Meios de Estocagem - utilizados para a manuteno da viabilidade e das caractersticas fisiolgicas de uma cultura, a qual pode exigir um meio diferente daquele timo para o seu crescimento - o desenvolvimento rpido e luxuriante pode estar

Carlos Maurcio G. Ribeiro http://geocities.yahoo.com.br/mauriciogrib - e-mail: mauriciogrib@yahoo.com.br associado com a rpida morte celular. Assim por exemplo, a glicose, que favorece com freqncia o crescimento, tambm desenvolve maior quantidade de cidos no meio, sendo prefervel omitir a glicose na preparao de um meio de estocagem. 5. Crescimento - no sentido conferido a organismos unicelulares como as bactrias, crescimento aumento do nmero de indivduos presentes na populao. Esse aumento ocorre em funo da diviso binria, processo em que uma clula d origem a duas outras pela separao do material celular em duas metades equivalentes. A multiplicao celular uma conseqncia do crescimento, e nos microrganismos unicelulares conduz a um aumento no nmero de clulas que constituem uma populao ou cultura. Quando bactrias so cultivadas em meios lquidos seu crescimento causa a turvao do meio, denominando-se cultura bacteriana a esta populao de bactrias distribudas no meio. O crescimento de bactrias em meio slido permite a obteno de colnias de bactrias. 5.1. Reproduo - durante o ciclo de crescimento, o processo mais comum e importante envolve a fisso binria transversal, onde uma nica clula cresce at atingir o dobro do tamanho inicial e divide-se em duas. As clulas bacterianas inoculadas em um meio de cultura recentemente preparado, ingerem seletivamente os nutrientes do ambiente. A seguir iniciam-se seqncias de snteses bioqumicas, que convertem esses nutrientes em novas substncias celulares (RNA, DNA, protenas, enzimas, entre outras macromolculas). H um aumento da massa e tamanho celular. A substncia da nova parede celular sintetizada, seguindo-se o processo de fisso binria que culmina no aparecimento de duas novas clulas. Essa diviso binria um mtodo de reproduo assexuada. 5.2. Fases de Crescimento - no decorrer do seu desenvolvimento, uma cultura bacteriana apresenta quatro fases de crescimento caractersticos.

5.2.1. Fase Lag ou de demora (A) - Logo aps a inoculao no meio de cultura lqido (caldo), de clulas bacterianas viveis, estas comeam a ajustar-se s condies fsicas, aos nutrientes disponveis, iniciando a sntese de enzimas e coenzimas necessrias ao seu crescimento. Nesta fase no ocorre diviso celular, existindo intensa atividade metablica. No final da fase lag, as clulas que se adaptaram ao meio, sintetizam componentes celulares, aumentando sua massa e comeam a se dividir. Esse aumento de indivduos gradual, e quando todas as clulas da cultura esto aptas a se dividir em tempos regulares, inicia-se a fase seguinte do crescimento. 5.2.2. Fase Logartmica ou exponencial (B) - Durante esta fase as clulas se acham estabilizadas, enquanto novo material celular est sendo sintetizado a uma velocidade constante, e assim a intervalos regulares de tempo as clulas dividem-se resultando num aumento exponencial do nmero de indivduos na populao. Isto contnua at que um ou mais nutrientes no meio se esgotem ou os produtos txicos resultantes do metabolismo bacteriano se acumulem inibindo o crescimento. 5.2.3. Fase Estacionria (C) - Decorrente da diminuio do ritmo de crescimento, que ocorre ao fim da fase exponencial, a fase estacionria corresponde ao perodo onde o nmero de indivduos permanece constante no decorre do tempo. H uma perda lenta de clulas por morte equilibrada exatamente pelo aparecimento de novas clulas s custas de crescimento e diviso celular. 5.2.4. Fase de Declnio ou morte (D) - De acordo com o tipo de microrganismo e com as condies de cultura, a taxa de morte aumenta at atingir certo nvel de estabilidade, aps determinado perodo de tempo na fase estacionria. A durao na fase de declnio, tambm bastante varivel.

5.2.5. Grfico - Fases do Crescimento Bacteriano.

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6. A Medida do Crescimento: A determinao do crescimento requer a medida quantitativa da populao celular no momento da inoculao e outra vez aps a incubao. Existem muitas possibilidades de se aferir o crescimento microbiano, no entanto, duas modalidades so mais usadas. A concentrao celular (o nmero de clulas por unidade de volume da cultura), onde o recurso habitual consiste em medir a absoro ou disperso da luz por uma cultura, com o auxlio de meios fotoeltricos, relacionando-se as contagens viveis com as leituras pticas e construindo-se uma curva padro. Atravs da curva padro, todas as leituras subsequentes podem ser convertidas em concentrao celular. Na densidade celular (peso seco de clulas por unidade de volume da cultura), vrios mtodos indiretos so recomendados, como medidas fotoeltricas, determinao do nitrognio e centrifugao em recipientes especiais. Para cada mtodo, necessrio determinar previamente uma curva padro que estabelea a relao entre os valores das medidas com os pesos secos conhecidos.