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Las muestras no necesitan ser vaporizadas para su anlisis. Se separan compuestos orgnicos e inorgnicos voltiles o no, trmicamente inestables
Caractersticas
-Una muestra en estado lquido es arrastrada por una corriente lquida llamada eluyente (fm) es el parmetro fundamental de la separacin. -Como fase estacionaria acta un slido finamente dividido (dimetro de partcula 3, 5, 10 m), o una pelcula lquida a l adherida. -Dependiendo de la retencin de los componentes de la muestra por la fase estacionaria y de su solubilidad en el eluyente se provocar su migracin diferencial.
Caractersticas
- NO Destructivo recupera muestra - Picos angostos (alta eficiencia) - Rpida - Presiones de 1000 - 6000 psi (pounds square inch = libras por pulgada cuadrada, 1 atm = psi/14.7)
Desgasificados
Elucin isocrtica vs elucin con gradiente Elucin isocrtica: solvente de composicin constante. Elucin con gradiente: solventes de distinta polaridad. Se vara la composicin de la FM en forma continua o escalonada. Elucin con gradiente Elucin isocrtica
Sistemas de bombeo
Requerimientos Generacin de altas presiones (1000 - 6000 psi) Caudales 0.1 10 mL/min Componentes resistentes a la corrosin (acero inoxidable, tefln)
Precolumna
Composicin similar a la columna cromatogrfica Se trata de una pequea columna (0,5 3 cm) colocada entre el inyector y la columna
PRE-COLUMNA
Elimina materia en suspensin y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la FE Se usa para mejorar la vida de la columna. Se reemplaza cuando se contamina.
COLUMNA
Columna
Tubos de acero inoxidable. Ocasionalmente de vidrio resistente Columnas termostatizadas: en general se trabaja a T ambiente. La T constante mejora el cromatograma Rectas (10 - 30 cm de longitud) y 4-10 mm d.i. Tamao partculas de relleno: 3 10 m
Columna
Relleno
Relleno de partculas. Micropartculas porosas de slica, almina o polmero de 3 10 m de dimetro. Se recubren con pelculas orgnicas que se unen qumicamente o fsicamente a la superficie.
Mecanismos de interaccin en HPLC Particin o reparto Existen dos modos bsicos de operacin: Fase normal. fase estacionaria polar fase mvil no polar. Fase reversa. fase estacionaria no polar fase mvil polar.
Segn empleemos fase normal o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucin de bandas y el tiempo de anlisis.
Detectores
Requisitos Sensibilidad adecuada Respuesta rpida y reproducible Manejo sencillo Clasificacin Basados en la medida de una propiedad del eluyente -Indice de refraccin -Constante ielctrica -Densidad - Absorbancia - Fluorescencia, - Corriente lmite
Detectores
Principales detectores empleados en HPLC: - UV/Vis - Fotodiodos - ndice de refraccin - Fluorescencia - Conductividad - Dispersin de luz - Espectrometra de masas
Detectores
Detector uv/vis - El ms usado - Para sustancias que absorben radiacin UV/VIS - Con lmparas de deuterio, xenon o wolframio - Desde 190 a 900 nm
Al desecho Ventanas de cuarzo Fuente UV Detector De la columna
Detectores
Detector de ndice de refaccin - Van a medir variaciones en el ndice de refraccin del eluato con respecto al del disolvente puro. - Slo se pueden usar si la elucin es isocrtica. - Responden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad. - Son muy sensibles a las variaciones de temperatura. - Deben estar termostatizados.