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VERSIN 1.6
INTRODUCCIN
El Clculo de Datos es un mdulo exclusivo de InfinicytTM que proporciona una potente herramienta para calcular distintas caractersticas de las clulas en parmetros que no han sido medidos directamente. El Clculo de Datos est basado en el conocimiento de estas caractersticas en clulas fenotpicamente similares que ya han sido medidas en una alcuota diferente. Para fusionar y calcular los parmetros, los archivos originales deben tener tantos parmetros comunes como sean necesarios para permitir la identificacin inequvoca de la poblacin en la cual queramos calcular los parmetros. El nmero de parmetros comunes necesarios y el diseo del panel de anticuerpos apropiado son dos cuestiones fundamentales para obtener resultados satisfactorios con la herramienta de Clculo de Datos.
Estas tablas muestran un ejemplo de 9 archivos (columnas) que forman parte de un panel, con los parmetros que se han medido en cada tubo (filas). Hay tres tipos de parmetros: Parmetros comunes C: Caractersticas que se han medido repetidamente en todos los tubos y que sern utilizadas por el programa como base para el Clculo en clulas similares.
Parmetros reales R: Parmetros que han sido medidos realmente en cada tubo y que no son parmetros comunes. Datos Calculados D: Nueva informacin generada tras el proceso de Clculo.
InfinicytTM reconstruye de forma multidimensional los nuevos archivos de datos que contienen tanto Parmetros Reales como Datos Calculados para aquellos parmetros que no han sido medidos directamente. El nmero total de parmetros del nuevo archivo ser el nmero total de parmetros medidos en el conjunto de los tubos. Esto posibilita una identificacin y caracterizacin ms potente de las poblaciones. La caracterizacin de la poblacin se lleva a cabo con datos procedentes de todos los marcadores del panel para cada clula en cada tubo. En el siguiente diagrama se muestra el resultado del Clculo de Datos; tras los clculos es posible representar en un diagrama de puntos la expresin de marcadores que haban sido medidos inicialmente en tubos diferentes.
Para que el algoritmo del Clculo funcione correctamente, el archivo FCS que vamos a calcular debe cumplir los siguientes requisitos: El proceso de Clculo de Datos est limitado a clulas clonales, que muestran la misma expresin para todos los marcadores calculados. En relacin con el diseo del panel, los parmetros comunes de la poblacin que queremos calcular deben mostrar caractersticas diferentes, es decir, los marcadores con distinta expresin en una misma poblacin deben estar presentes en el mismo tubo. Las opciones de adquisicin en el citmetro deben ser las mismas en cada tubo para que pueda realizarse el Clculo de Datos. InfinicytTM tambin es capaz de armonizar las caractersticas de FSC/SSC en casos en que hay
tinciones de superficie y e intracelulares, buscando las mismas clulas seleccionadas en los diferentes archivos. InfinicytTM incluye un sistema de control interno del proceso de Clculo de Datos que verifica que se aplican todas las condiciones anteriormente mencionadas. En todo caso, siempre es posible llevar a cabo un control propio del Clculo de Datos comparando los resultados de los datos calculados con un archivo en el que se hayan medido realmente los parmetros. Nota: La validacin del Clculo de Datos debe hacerla cada usuario para sus propios paneles teniendo en cuenta las condiciones previamente citadas.
Tubo
1 2 3 4 5 FSC-A FSC-A FSC-A FSC-A FSC-A SSC-A SSC-A SSC-A SSC-A SSC-A
APC
APC-H7
PO
En el tubo 1, hay dos marcadores conjugados con el mismo fluorocromo para varios canales de fluorescencia. Esto es posible porque cada uno de los dos marcadores es especfico para una poblacin diferente. Por ejemplo, CD8 es un marcador especfico para clulas T, muestras que IgL (inmunoglobulina lambda) es especfica de clulas B. Por tanto, a la hora de analizar la muestra, es posible identificar la expresin del marcador especfico de cada poblacin modificando la visibilidad de las poblaciones.
CALCULAR DATOS
El proceso de Clculo de Datos, es muy simple, slo hay que seguir los pasos del Asistente Calcular Datos que se explica a continuacin.
Podemos seleccionar los archivos uno a uno mediante clic + Ctrl o todos juntos con la tecla Shift o Mays. Cuando los archivos estn seleccionados, pulsar Seleccionar.
Tambin podemos cargar directamente los archivos a fusionar arrastrando y soltando los archivos FCS (Drag & Drop) desde la carpeta en que estn guardados hasta el cuadro de la lista de archivos, o bien directamente al icono de InfinicytTM que aparece en el escritorio. Para este tutorial emplearemos archivos simples, pero para el Clculo tambin puede utilizarse archivos fusionados.
Tubo
1 2 3 4 5 FSC-A FSC-A FSC-A FSC-A FSC-A SSC-A SSC-A SSC-A SSC-A SSC-A
Para resolver las discordancias en las etiquetas, haremos clic en el botn Agrupar.
Aparecer un cuadro de dilogo para seleccionar las etiquetas que deben ser agrupadas.
Agrupar CD20
Veamos un ejemplo de cmo agrupar el parmetro CD20. Como hemos visto, CD20 tiene una escritura diferente en el archivo 1 (tubo 1). Haciendo clic en , aparecer una lista con todos los parmetros.
Seleccionamos la casilla del primer parmetro, CD20+CD4:PB-A. Nos fijamos que al seleccionar, algunos parmetros desaparecen de la lista (los pertenecientes al mismo archivo). Se crear un nuevo grupo llamado CD20+CD4: PB-A. Este nombre aparecer por defecto en la matriz de fusin como marcador comn, pero los nombres de los grupos pueden personalizarse.
Despus, seleccionamos de la lista los siguientes parmetros que se agruparn con el primero. En este ejemplo, queremos agrupar CD20+CD4: PB-A con CD20: PB-A.
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Si hacemos clic en el botn Hecho, en la matriz de fusin aparecer ya CD20 como parmetro comn con el nombre asignado por defecto.
Agrupar CD19
Ahora agruparemos el parmetro CD19. Seguimos los pasos que hemos explicado previamente para CD20, pero en este caso agrupamos CD19+TCRgd: PE-Cy7-A y CD19: PE-Cy7-A.
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Al tiempo que se crean los grupos de etiquetas, InfinicytTM elabora un diccionario con las etiquetas agrupadas. De este modo, la siguiente vez que se cargue el mismo tipo de archivos para realizar el Clculo de datos, el programa podr hacer los grupos automticamente.
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Hacemos clic en
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Se pueden mostrar dos tipos de diagramas: Diagramas que muestren parmetros comunes Diagramas que muestren parmetros no comunes; en stos aparecer el mensaje Regiones desactivadas.
Slo es posible dibujar regiones en los diagramas que muestren parmetros comunes dado que si queremos calcular una poblacin que est presente en todos los archivos, dicha poblacin slo puede ser seleccionada mediante parmetros comunes.
Ahora dibujaremos regiones sobre parmetros comunes para seleccionar las poblaciones que queremos calcular. En este tutorial slo queremos calcular una poblacin de inters (clulas B); en caso de que quisisemos clasificar ms de una poblacin el procedimiento sera el mismo. En nuestro ejemplo, haremos las siguientes regiones consecutivas: Dibujamos una regin en el diagrama de puntos FSC vs. SSC incluyendo los eventos presentes en la zona de linfocitos. Si necesitamos ver el diagrama en modo pantalla completa, haremos doble-clic en la barra superior del diagrama. Despus, dibujamos una regin en el diagrama de puntos CD45 vs. SSC incluyendo tambin los eventos de la zona de linfocitos. Por ltimo, dibujamos otras dos regiones consecutivas en los diagramas CD19 vs. SSC (incluyendo los eventos positivos) y CD20 vs. SSC (incluyendo los eventos positivos). De este modo, los eventos CD19 y CD20 positivos que no estn en la zona de linfocitos se eliminarn de la seleccin; slo el rea de interseccin de las cuatro regiones aparecer seleccionada (en este caso, en negro). Asignamos los eventos a la etiqueta Clulas B del rbol de Poblaciones.
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InfinicytTM muestra el nmero de eventos que tiene la poblacin y el nmero de eventos que todava no se han calculado antes del inicio del proceso de Clculo de Datos. Hacemos clic en y continuamos con el proceso.
Ahora el programa calcular todos los parmetros presentes en el archivo para la poblacin seleccionada. Cuando el proceso de Clculo haya terminado, el programa nos mostrar una ventana con la informacin sobre el proceso. En este caso los eventos se han calculado correctamente, por lo que los Eventos no Calculados son 0. Haremos clic en Aceptar para continuar con el paso 4.
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Cuando el proceso de Clculo ha terminado, tenemos dos opciones: Hacer clic en el botn de Anlisis Manual si queremos trabajar directamente con el archivo generado. Hacer clic en Guardar como si no queremos analizar el archivo en ese momento y preferimos guardarlo; se salva en formato .cyt.
Si seleccionamos las opciones Anlisis Manual o Men Principal, el asistente para Calcular Datos se cerrar. InfinicytTM nos mostrar un mensaje de advertencia sobre el cierre de la ventana Calcular Datos; haremos clic en S y continuaremos con el anlisis.
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1. Anlisis Manual
Si elegimos Anlisis Manual en el Paso 4 del Asistente para Calcular Datos, iremos directamente al mdulo de Anlisis Manual. Desde la ventana de Anlisis Manual tambin es posible guardar el nuevo archivo generado (Archivo Guardar Archivo Analizado) o podemos continuar con el anlisis sin salvar los datos. Al entrar en el mdulo de Anlisis Manual, se mostrar un archivo analizado con la poblacin calculada (en este caso, Clulas B) y el resto de los eventos no analizados (en este caso, Eventos), as como el rbol de Poblaciones y los diagramas.
Analizaremos el archivo como si se tratase de un archivo fusionado (vase tutorial de Fusin de Archivos).
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Nos fijamos en que en el archivo calculado, cada archivo incluye datos de todos los parmetros para la poblacin calculada. Es posible mostrar nueva informacin, por ejemplo, diagramas de puntos con parmetros que fueron combinados en la misma fluorescencia o parmetros que fueron medidos en diferentes archivos, como se puede apreciar en la siguiente figura.
2. Guardar como
Si hemos elegido la opcin Guardar como en el Paso 4 del Asistente, para analizar el archivo generado accederemos al mdulo de Anlisis Manual en la pantalla principal y seleccionaremos en la ventana de Anlisis Manual Archivo Abrir Archivo Analizado. Seleccionamos el archivo calculado para abrirlo y despus realizamos en anlisis como de costumbre.
3. Men Principal
Al seleccionar Men Principal, abandonamos el Clculo de Datos sin opcin de poder salvar el proceso.
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Como se ha mencionado previamente, al finalizar el Clculo el software muestra una ventana con informacin sobre la ejecucin del proceso.
Con una configuracin de controles ms estricta, aparecen 1106 eventos como no calculados. La razn es que el con un umbral ms estricto para la Mxima distancia en el espacio de poblacin para excluir un evento, el rea donde un evento dado tiene que encontrar su evento equivalente es ms restringida y, por tanto, no siempre es posible encontrar un evento equivalente. Aceptamos para continuar con el Paso 4 (Verificar y Guardar resultados).
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b. Eliminar de la matriz de parmetros aquellos marcadores cuya expresin no es la misma dentro de la poblacin si sta se selecciona con los marcadores comunes, y hacer el Clculo sin esos parmetros. En este tutorial no hemos excluido KAPPA y LAMBDA porque la poblacin seleccionada es clonal para KAPPA (todas las clulas B CD19+ patolgicas son KAPPA). En las siguientes figuras podemos ver qu ocurre cuando hacemos el Clculo con una muestra normal sin clonalidad para KAPPA o LAMBDA. En este caso, FSC, SSC, and CD19 son marcadores comunes y tratamos de calcular los parmetros KAPPA y LAMBDA en clulas B CD19+.
1.- Dibujamos una regin en FSC vs. SSC en la zona de linfocitos y seleccionamos las clulas CD19+.
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2.- Calculamos la poblacin de clulas B CD19+ y el resultado para KAPPA y LAMBDA ser el siguiente:
Como podemos observar hay un conflicto puesto que en las clulas B CD19+ hay unas clulas que son Kappa+ y otras Lambda+, pero no hay dobles positivos ni dobles negativos; con estos marcadores no podemos calcular la expresin de KAPPA y LAMBDA.
En resumen, para poder usar esta herramienta correctamente, deben usarse como marcadores comunes aquellos que permitan la identificacin inequvoca de una poblacin de clulas inmunofenotpicamente idnticas, que ser la poblacin calculada. Slo bajo estas condiciones la herramienta de Clculo de Datos funcionar correctamente y dar resultados fiables.
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