PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIFUNGICA PARA LEVADURAS POR DISCO DIFUSION M44-A2, M44-S3 (2009)

Lic. ROBERTO E. ROJAS LEON Instituto Nacional de Salud del Nio rerojasle@yahoo.com 2013

EVOLUCION TAXONOMICA DE LAS LEVADURAS

Fuente

Ao

Referencia

N Gneros

Increment o%

N Especies

Increment o%

Practical handbook of microbiology, 2008

Epidemiologa
Levaduras en IIH del torrente sanguneo
41.4%, comunicacin personal (INSN, 20062008)

Entre 1999 y 2000, casos de sepsis por hongos se incrementa en 207% (USA)
Candida spp, Aspergillus spp y Cryptococcus spp

CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, 20(1):133-163, 2007

CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, 20(1):133-163, 2007

Normas CLSI
Incremento de IFI y de antifngicos
Pruebas de susceptibilidad antifngica GANAN reconocimiento

Mtodos de referencia tanto macro y microdilucin de CLSI

Levaduras, M27
P (1992); T (1995); A (1997); A2 (2002)

Mohos, M38
P (1998); A (2002)

P 2003 A 2004

Mtodo disco difusin

Solo para levaduras
Solo para Candida spp.
No abarca otros gneros de levaduras ni dimrficos en su fase de levadura

Azoles y equinocandinas Resultados, 20 a 24 h. de incubacin Mueller-Hinton en lugar de RPMI

Disponibilidad Bajo costo

Mtodo disco difusin

Punto de corte
Caspofungina Fluconazol voriconazol

Mtodo disco difusin

Parmetros de QC
Caspofungina Fluconazol Posaconazol voriconazol

Seleccin de los antimicrobianos en disco para pruebas de rutina y reporte

Pese a criterios interpretativos, no recomendado en rutina:
Decisin tomada por mdico infectlogo, comit de farmacia y teraputica, personal de microbiologa clnica y el comit IIH.

Para minimizar confusin, emplear nombres genricos. Nmero de agentes testados, deben ser limitados, an con pocos antifngicos.

Equipo y materiales
Incubadora a 35 C (2 C), con ambiente aerbico. Estndar de turbidez McFarland 0.5 Hisopos de algodn estriles Solucin salina fisiolgica estril (8.5 g/L NaCl; 0.85%).

Reactivos
Medio Agar Mueller-Hinton + Glucosa 2% + Azul de Metileno 0.5 g/mL (MHS)
Fcil disponibilidad Aceptable reproducibilidad lote a lote Suplemento
Glucosa 2%, apropiado crecimiento Azul de metileno 0.5 g/mL, incrementa zona de definicin

Puede ser suplementado ya sea pre o pos produccin

Preparacin del medio de Mueller-Hinton agar suplementado (1) y suplementacin de las placas de MHA (2).

Gua Prctica de Identificacin y Diagnstico en Micologa Clnica, Pemn. 2007

Reactivos
pH de MHS
7.2 7.4, T amb. despus de solidificado
Macerar medio para sumergir el electrodo Dejar que una pequea cantidad de agar se solidifique alrededor del electrodo en un recipiente de vidrio Usar electrodo de superficie calibrado

Humedad
Exceso en la superficie, secar en incubadora o cabina de flujo laminar, tapa entreabierta (10-30 min).

Reactivos
Almacenamiento de discos
Refrigerar los recipientes a 8 C o congelacin a -14 C, hasta ser utilizados.

Preparacin del estndar de turbidez

Estndar de turbidez McFarland 0.5

PROCEDIMIENTO
Preparacin del inculo
Cepas subcultivadas, sobre AS ASD (pureza y viabilidad). T 35 C (2 C) Inculo preparado picando 5 colonias distintas de aprox. 1 mm de , 24 h, 5 ml de SSF estril Agitar por 15 s y ajustar turbidez (1x106 a 5x106 cel/mL

Preparacin inculo levaduras (M44-A2).

Gua Prctica de Identificacin y Diagnstico en Micologa Clnica, Pemn. 2007

Desarrollo de Levaduras sobre ASD 2%: Gold Standar

Verificar pureza del aislamiento: evita dolores de cabeza

bacterias

Chrom Agar: excelente alternativa Coinfeccin

PROCEDIMIENTO
Inoculacin de las placas
Dentro de los 15 min despus de ajustar la turbidez del inculo, embeber el hisopo en la suspensin, rotar varias veces y presionar firmemente contra la pared interna del tubo evitando el nivel del fluido. Agar MHS es inoculado por estriado uniforme del hisopo en toda su superficie, dos o mas veces, rotando la placa aprox. 60 cada vez, finalmente el borde del agar. Tapa entreabierta, 3-5 min., no mas de 15 min

PROCEDIMIENTO
Aplicacin de los discos
Los discos son dispensados sobre la superficie de la placa inoculada, ligera presin, aproximacin entre discos no menor de 24 mm de centro a centro Invertir las placas e incubar dentro de los 15 min despus que los discos son aplicados

DISCOS DE FLUCONAZOL 25 g

DISCOS DE VORICONAZOL 1 g

PROCEDIMIENTO
Lectura de las placas e interpretacin
Examinar despus de 20-24 h de incubacin Zonas de inhibicin uniformemente circulares y desarrollo semiconfluente Sobre fondo negro no reflejante, iluminado Medir el dimetro de prominente reduccin de crecimiento Ignorar microcolonias en los bordes o grandes colonias dentro de la zona de inhibicin. Leer a las 48 h solo cuando insuficiente desarrollo es observado a las 24 h

INTERPRETACION

M44-S3 2009

J Clin Microb; 2008, 46(6):1927-1929

CONTROL DE CALIDAD
Propsito (monitorear)
Precisin (repetitibilidad) y exactitud Performance de reactivos Performance de la persona que realiza la prueba y lee los resultados

CONTROL DE CALIDAD
Utilizar cepas de referencia para el QC
Candida albicans ATCC 90028 Candida parapsilosis ATCC 22019 Candida tropicalis ATCC 750 Candida krusei ATCC 6258.

CONTROL DE CALIDAD
Almacenamiento de cepas para el QC
Minimizar posibilidad de mutacin APD a -70 C Cepas de trabajo, AS o ASD a 2-8 C, subcultivadas cada semana, no mas de tres semanas Cepas congeladas o liofilizadas, subcultivadas al menos dos veces antes de su uso

CONTROL DE CALIDAD
Dimetros lmites del control de calidad
Diario, si es satisfactorio semanal

CARTILLA DE MICOTECA

MUCHAS GRACIAS