Archaea predominam entre amnia oxidante procariontes em solos

Oxidao de amonaco o primeiro passo na nitrificao, um processo chave no ciclo de azoto global que resulta na formao de nitrato atravs atividade microbiana. O aumento na disponibilidade de nitrato em solos importante para a nutrio de plantas, mas tambm tem considervel de impacto sobre a poluio das guas subterrneas, devido lixiviao. aqui ns mostram que os oxidantes do amonaco archaea so mais abundantes em solos do que os seus homlogos bacterianas bem conhecidas. Investigou-se o abundncia do gene que codifica para uma subunidade da enzima chave monooxygenase amnia (amoA) em 12 intocada e agrcola solos de trs zonas climticas. amoA gene cpias de Crenarchaeota (Archaea) foram at 3.000 vezes mais abundante do que bactrias genes amoA. Altas quantidades de lipdios especficos Crenarchaeota, incluindo crenarchaeol, correlacionada com a abundncia de archaeal gene amoA copia. Alm disso, estudos de transcrio reversa e PCR quantitativo de anlise de ADN complementar usando novel pyrosequencing tecnologia de clonagem independente demonstraram a actividade do archaea in situ e suportado a numrica predominncia de archaeal sobre oxidantes de amnia bacterianas. Nosso Crenarchaeota resultados indicam que pode ser a mais abundante amnia-oxidante organismos nos ecossistemas do solo da Terra. Autotrophic bactrias oxidantes de amnia ( AOB ) do b- e g- subgrupos de proteobacteria tm sido at agora considerado o mais importantes contribuintes para amnia aerbico oxidation3 , 4. Estes organismos , normalmente, apenas uma pequena frao do microbiota5 -7 . Recentemente , verificou-se genes que codificam para subunidades de um potencial amonaco monooxigenase (AMO ), a enzima -chave da AOB , numa clone solo metagenomic ao lado de um RNA operon ribossomal de Archaea , filiada filo Crenarchaeota8 . Depois disso de amonaco em amostras de solo granel sua transcrio foi induced 8. AmoA altamente semelhantes e sequncias amoB e um gene ligado AMOC tambm foram identificadas em um estudo de metagenmica do Mar dos Sargaos indicando a presena de todos os trs 0subunidades da enzima em crenarchaeota9 , 10. A existncia previsto de archaea amnia oxidante (AOA ) foi finalmente confirmada pelo cultivo de uma chemolithoautotrophic , tenso marinho que usou amnia como fonte de energia nica e produzido em nitrito conversion11 quase estequiomtrica . continha amoA , amoB e AMOC genes altamente semelhantes aos do clone solo metagenmica e as seqncias marinhas. O objetivo deste estudo foi quantificar a amnia - oxidante Crenarchaeota em ecossistemas terrestres para avaliar seu potencial de impacto ecolgico . Para isso, temos nos concentrado em dois biomarcadores , o amoAgene , que tem sido frequentemente utilizado para quantificar bacteriana amnia oxidantes , e tetraether lipdios diagnstico para crenarchaeota12 . Porque os genes amoA archaeal e bacterianas so suficientemente divergentes de cada other8 , 13,14 , dois conjuntos de primers especficos foram utilizado em tempo real de reaco em cadeia (quantitativo ) polimerase (qPCR ) para determinar a abundncia relativa e absoluta de Archaea e oxidantes de amnia bacterianas. Doze diferentes solos na sequncia de uma seqncia do norte para o sul da Europa foram investigados , incluindo os ecossistemas naturais e manejados expositoras solo diferente tipos com uma vasta gama de pH , carbono e azoto gua extravel (para mais informaes sobre os solos ver Quadro 1 e Fig. Complementar. S1 e Tabela S1 suplementar) .

Em todas as amostras , os nmeros amoAcopy archaea eram elevados , variando de 7 de 10 1 108 por g de solo seco (Fig. 1a, Suplementar Tabela S1) . Em contraste, genes amoA bacterianas variaram consideravelmente ao longo trs ordens de magnitude , semelhantes s descobertas anteriores de abundncia AOB na agricultura soils5 -7 , 15,16. ArchaealamoAgenes dominado a amoAgenes bacterianas em todos os solos , com propores que variam de 1,5 a longo 230 em topsoils . Para analisar a distribuio de AOA e AOB em diferentes profundidades , investigamos um solo agrcola (de Bad Lauchsta dt), que foi tratada com diferentes quantidades e qualidades de fertilizantes para mais de 100 anos (ref. 17) , e uma naturais Site solo intocada calcrio pastagens (Am Rotbo LL18 , fig. 1b e c). AmoAgenes bacterianas na antiga diminuiu significativamente com a profundidade nos locais no fertilizados e inorganically fertilizado enquanto archaeal amoAgenes permaneceram altos , resultando em um AOA mximo a proporo de AOB 3000 . Em contrapartida, os nmeros da cpia amoA tanto archaea e bactrias pouco com profundidade variada no local tratado adicionalmente com esterco (LH) e estes nveis mais elevados de AOA e AOB amoAwere associado com a maior biodisponibilidade de azoto e carbono (Tabela 1). Curiosamente, archaeal copiar nmeros amoA tambm variou pouco com profundidade no ecossistema arenoso ( RUD ), enquanto que a abundncia de bacterianas cpias do gene amoA novamente diminuda significativamente , resultando em uma relao de AOA para AOB amoA de .1,000 a 40 cm (Fig. 1c , Complementar Tabela S2). A abundncia relativa de AOA com respeitar a microbiota total variou principalmente entre 1% e 5% (Recurso Tabela S2 , assumindo arbitrariamente um microbiana mdia tamanho de genoma de 4 megabases , Mb), enquanto a maior fraco AOB na microbiota do solo foi de apenas 0,23% (STO) . Para analisar possveis diferenas na estrutura das comunidades de archaea em solo e mais profundas horizontes do solo , ns clonados e seqenciados AOA amoA da areia ecossistema em profundidades de 0-10 cm e 60-70 cm. Uma comparao de 36 sequncias de genes de cada profundidade mostra amoA altamente semelhantes ( com 24% de divergncia mxima de sequncia ao nvel do ADN ), mas tambm agrupamento , indicando diferenas na estrutura populacional de AOA com a profundidade que pode refletir a ocorrncia de diferentes " ectipos " ( ver rvore na figura Complementar. S3). Para excluir a possibilidade de quantificao foi influenciada por diferenas na sensibilidade dos conjuntos de iniciadores ou a eficincia de os mtodos de qPCR , cinco combinaes de primers diferentes para archaeal e amoAand 16S rRNA genes bacterianos , respectivamente, foram utilizados numa mais - provvel - nmero (MPN ) experimento PCR (Recurso Informaes , S3 quadro suplementar e figo Complementar. S4 ). Os resultados obtidos em diluies em srie de dois DNAs solo confirmada, com primer Independente define o domnio da AOA sobre AOB. Isoprenides glicerol tetraethers glicerol dialquilicos ( GDGTs ) so lipdios de membrana nicas de archaea e so muitas vezes utilizados como biomarcadores para estudar a sua presena e distribution19 , 20. Dentre esses lipdios , crenarchaeol foi identificada exclusivamente em Crenarchaeota , particularmente em ambientes marinhos , mas tambm em sedimentos de gua doce e turfa bogs12 , 21. Foi investigada a quantidade de derivado de archaea GDGT isoprenoidal em dez dos solos . Os valores variaram entre 0,04 a 3.24mg por g de solo , das quais uma fraco significativa foi crenarchaeol , mostrando -se que ocorre em quantidades considerveis nos ecossistemas do solo estudados ( 0.02- 0.33mg por g de solo ; quadros suplementares S1 e S2). Foi encontrada uma boa correlao entre a quantidade de GDGT (ou crenarchaeol sozinho) ea abundncia de

cpias amoAgene archaeal em oito de cada dez amostras de solo testados, o que consistente com archaea amnia oxidante constituindo uma proporo significativa de Crenarchaeota (Fig. 2 e Tabela S1 complementares e suplementares FIG. S5 para crenarchaeol : amoA ). Para determinar se os genes a partir de populaes amoA AOB AOA e so transcritas activamente no solo e se a transcrio correlaciona-se com a abundncia de genes , foram isoladas a partir de RNA total de trs solos e quantificados cpias de cDNA relativas de amoAgenes aps reversa transcrio. Notavelmente, amoA cDNA de ambas as populaes foi detectada em todos os solos e sua relao se correlacionou com o quantitativo Medidas de DNA , ou seja , os transcritos de arqueia dominados em RUD ( ecossistema arenoso ) e KRO (pastagem ), enquanto quantidades quase iguais de cpias de cDNA foram detectadas em STO ( pastagem ) ( fig. 3). Para analisar a atividade de AOA e AOB ao nvel da comunidade e verificar as suas abundncias relativas atravs de uma tcnica independente, foi realizada uma anlise em larga escala de uma biblioteca de ADNc utilizando tecnologia de pyrosequencing . A biblioteca de cDNA foi obtido a partir de RUD solo, no qual 16S rRNA e amoA genes foram encontrados em archaea nmeros aproximadamente iguais e 16S rRNA archaeal sequncias genticas O dono exclusivamente para Crenarchaeota 1.1b subgrupo em que o amo genes foram detectados (ref. 18 e TU e CS , indito dados). Aps a sntese segunda vertente sobre aleatoriamente reversetranscribed RNA totais resultante double-stranded cDNA foi usado diretamente para o seqenciamento sem um procedimento de clonagem ou PCR amplification22 . De 210.523 atribuvel leituras cDNA ( de um total de 314.041 leituras) 1,37% eram filiados com archaea (Recurso Tabela S4 ) , uma proporo semelhante ao estimado por amoA qPCR de a mesma amostra (1,0 % das clulas microbianas continha uma arquea gene amoA Complementar tabela S2 , RUD 0-10 cm) . Isto consistente com a suposio de que a maioria, se no todas as archaea neste solo so capazes de oxidao da amnia . WhileamoAcDNA de archaea e as bactrias foram quantificadas prontamente preparados a partir dos mesmos RNA por qPCR (Fig. 3) , encontramos apenas dois l ' piro- biblioteca " de 30 Mb que poderia ser atribudo a arquea amoA e nenhum foi relacionado com amoA bacteriana (Recurso Tabela S5). No entanto , este no inesperado dado que a grande quantidade de ADNc parece ser derivado de transcries de RNA ribossomal estveis ( pelo menos 30% do leituras representam genes 16S rRNA , Suplementar Tabela S4 ) . Para comparar as outras propores relativas no termfila Crenarchaeota e MAA , utilizou 16S completos de ambos os genes de rRNA grupos para consultar este banco de dados . Foram identificados 570 Crenarchaeota e 37 sequncia atribuda l - MAA (Fig. 4a ), a proporo de 15:01 semelhante AOA : AOB proporo determinada por cpias amoAcDNA na mesma amostra ( numa proporo de 16:1, RUD ver Fig. 3 . ) . Da mesma forma, mais seqncias de Crenarchaeota que de AOB foram identificados ao consultar o base de dados com uma sonda universal, ou com vrias sondas especficas para o grupo em diferentes regies do gene de rRNA 16S (Fig. 4b, c e complementar Tabela S5 ), que mais uma vez consistente com a dominncia de activa AOA sobre AOB na amostra. Em concluso, nossos dados fornecem evidncias em alta abundncia de AOA em solos e extrapolao sugere que eles representam a maioria abundantes organismos oxidantes de amnia nos ecossistemas do solo sobre Terra. Os nmeros elevados de vrios ecossistemas e em maior profundidades indicam que estes organismos so adaptados a uma vasta gama das condies de crescimento e , por conseguinte, pode ter uma mais verstil metabolismo de MAA , talvez, ser capaz de crescer mixotrophically . Genes previsto para codificar os componentes de uma modificao do ciclo -3- hidroxipropionato de carbono conhecido na

fixao Crenarchaeota hipertermoflicas , bem como um ciclo de cido tricarboxilico oxidativo foram encontrado no parente marinho, a esponja simbiontes Cenarchaeum symbiosum23 . Isto consistente com um tanto autotrfico e uma estilo de vida organotrophic . Alm disso , o genoma do Cenarchaeum genes que codificam reveladas homlogos de urease e uria transportadores ao lado da amoA , amoB e genes AMOC , indicando o potencial de AOA para oxidar vrios reduzida azoto compounds23. Embora numericamente abundante e transcricionalmente ativa, continua a ser mostrado se archaea no solo tambm dominam com respeito s suas atividades de nitrificao . Ser importante identificar os parmetros que influenciam populaes AOA e AOB no solo e quantificar e comparar as suas atividades especficas sob diferentes condies ambientais. Se archaea contribuir significativamente para a nitrificao , como sua abundncia sugere agora , as estimativas do ecolgica impacto da oxidao da amnia (incluindo as emisses de gases de efeito estufa ) com base em actividade bacteriana amonaco- oxidante dever ser reavaliado . MTODOS Extraco e preparao de cidos nucleicos. O cido nucleico ( RNA e DNA ) extraces a partir de todos os solos foram realizados utilizando uma modificao do mtodo descrito na ref . 25 aps a otimizao dos tempos batendo de contas , o que levou a rendimento mximo de DNA ou de cpias quantificados de amoA em qPCR (ver Informao Complementar para detalhes). cDNA foi preparada como descrito previously8 . A concentrao de ADN foi medida atravs da incubao de diluies diferentes ADN extrado com o corante fluorescente SYBRGreenI ( Molecular Probes , ver Informao Suplementar ) . PCR em tempo real . Para cada amostra de solo , 5 ng de DNA reunidas a partir de trs repeties As amostras de 2 ml ou de cDNA , espectivamente , foi utilizado para quantificar os nmeros de cpias genes e transcries archaeal amoA como descrito before8 . O mesmo procedimento foi aplicada por amoA a partir de bactrias utilizando os iniciadores especficos do bacterianas e amoA SYBRGreenI . Ambas as tcnicas de tempo real rendeu padro altamente reprodutvel curvas com fosmid 54d9 (ref. 8 ) (para archaeal amoA ) e os amoAgenes clonados de Nitrosomonas europaea ATCC 19,718, Nitrosospira multiformisATCC25196 , Nitrosospira NpAV e Nitrosovibrio tenuis NV -12, respectivamente. todos qPCR reaes tiveram altas eficincias e limites de deteco foram um preo to baixo quanto dez cpias da AOB amoAand 30 cpias do AOAamoA (ver informao complementar para detalhes). Todas as reaces de amostra e padro foram realizadas em triplicado e um foi calculado o valor mdio . Possveis efeitos inibitrios sobre o desempenho do PCR foram estimados a partir de compostos polifenlicos co- extrados em extractos de solo por trs tcnicas diferentes , como descrito na informao suplementar . Os efeitos inibitrios foram negligenciveis em todas as amostras . Extraco e quantificao da GDGTs.GDGTs foram extrados com solo um solvente polar e extractos foram limpos por Al2 O3 extrao em fase slida (SPE) e filtrao atravs de filtros de 0,45 milmetros de politetrafluoretileno ( PTFE) . GDGT As fraces foram analisadas por cromatografia em qumica presso atmosfrica lquida espectrometria de ionizao de massa ( LC -MS - APCI ) num cianopropilo (CN )- coluna e ons moleculares protonados foram registrados em monitoramento de on selecionado (SIM) como descrito previously21 , 26 ( para mais detalhes veja informaes complementares). Sequenciamento de alto rendimento de RNA cDNA.Total

isolado do RUD solo era submetido a transcrio reversa com hexanucleotides aleatrios e sntese secondstrand (para detalhes veja informaes complementares). o resultando ADNc foi cortado em fragmentos de 100 a 500 pares de bases ( pb) de comprimento e subsequentemente utilizada para a construo da biblioteca como descrito previously22 . Uma executado em R $ formato PicoTiterPlate mm 70 75 foi realizada num GS20 Genoma Sequencer (Roche Applied Sciences/454 Cincias da Vida ), produzindo 314.041 seqenciamento sucesso l . Seqncia de dados foram processados como arquivos fasta para todas as outras Dados da anlise , incluindo megablast ou primer pesquisas , tal como descrito no Informaes Complementares .