UNIVERSIDAD DE CARABOBO FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA DE BIOANLISIS-VALENCIA DEPARTAMENTO MORFOFISIOPATOLOGA PROGRAMA PRCTICO DE TOXICOLOGA VALENCIA, 2005

PRCTICA No 3 IDENTIFICACIN DE MANCHAS DE SANGRE Y SEMEN Introduccin: Las manchas de sangre tienen aspecto diferente segn sean recientes o antiguas. Recin desecada es roja, despus se hace morena y an negruzca, por la transformacin de la hemoglobina en hematina sucesivamente. Debe tenerse presente como preservarlas y embalarlas para su envo al laboratorio, ya que, en el lugar de los hechos no debe hacerse ningn tipo de anlisis, porque ninguna prueba realizada en tal forma sera concluyente y adems se desperdicia material que puede hacerle falta al analista del laboratorio. Una vez en el laboratorio, procedemos a la investigacin del soporte (objeto, ropa, etc.) que contiene la mancha, en el cual vamos a descubrir si la mancha es: A. Sangre B. Si es de origen humano o animal C. Si es humana. A quin corresponde?
Objetivo: Realizar diferentes reacciones de Identificacin, de orientacin probabilidad y certeza en manchas de sangre sobre diferentes soportes, tales como tela, madera, paredes, etc. Identificacin:

Los caracteres macroscpicos de las manchas de sangre son insuficientes para diferenciarlas de falsas manchas que tiene la misma apariencia: manchas de frutas, jugos vegetales, jugos de aceitunas frescas, herrumbre, excrementos de pulgas, chinches, mohos, etc. Es pues, necesario someterlas a reacciones de identificacin tras haberlas disuelto por maceracin, en algunas gotas de agua destilada. Para las manchas antiguas es preciso emplear el cido actico glacial o de preferencia amonaco puro. Las reacciones de identificacin de la sangre utilizada en medicina legal no tienen todas el mismos valor desde el punto de vista de su especificidad y de su sensibilidad. De aqu la necesidad de clasificarlas segn su categora probatoria en tres grupos: reacciones de orientacin, reacciones de probabilidad y reacciones de certeza.

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MATERIAL 1.- Porta-objetos 2.- Cubre-objetos 3.- Papel de filtro 4.- Pipetas 5.- Tubos de ensayo 6.- Microscopio 7.- Soportes 8.- Mechero de Bunsen Lmpara de alcohol MATERIAL BIOLGICO: sangre

REACTIVOS 1.- Agua oxigenada 10 Vol. 2.- Reactivo de Adler (Bencidina al 10% en cido actico glacial) 3.- NaOH al 10% 4- cido actico glacial 5- Fenolftaleina 6.- KOH anhidro 7.- Piridina 8- Glucosa, sol. saturada

ENSAYOS DE ORIENTACIN O PRESUNCIN

1.- Reaccin a la lmpara de Word. Las manchas de sangre a la luz ultravioleta, no presentan fluorescencia y se observan de color rojizo-parduzco. 2.- Reacciones de orientacin. Reaccin de Schaenbein: Una gota de agua oxigenada o de hipobromito sdico, depositada sobre una mancha de sangre, hace aparecer gran nmero de pequeas burbujas gaseosas, visibles a la lupa; pero ciertas materias orgnicas, herrumbre, etc., producen el mismo fenmeno. Tambin puede colocarse un fragmento de tela sospechosa, o de materia orgnica en un porta objetos, se coloca el cubre-objeto y se deja caer en un borde el H 2O2 o el hipobromito de Na, con igual resultado al anterior al observarlo al microscopio. 3. Reaccin de probabilidad. Reaccin de las Oxidasas: Fundamento: La oxidasa sangunea en presencia del agua oxigenada la descompone, liberando oxgeno naciente; ste se pone de manifiesto mediante un indicador de oxidacin, cuyo cambio de color seala la positividad de la reaccin. Ciertas materias colorantes poseen la propiedad de ser incoloras si son reducidas, (leucoderivados) y de recuperar su coloracin original por oxidacin, en presencia de una peroxidasa y un perxido tal como el agua oxigenada (H2O2). Estas reacciones tintoriales se esquematizan as: Leucoderivado + Peroxidasa + Perxido (Reactivo) (Sangre) Catalizador (H2O2) Coloracin

La sangre por su pigmento ferruginoso tetraprirrlico, es una de las peroxidasas ms activas y las reacciones coloreadas se observan incluso cuando est desecada o putrefacta. Pero no slo las peroxidasas sanguneas dan estas reacciones, as tenemos, que las peroxidasas presentes en la leche, jugos de frutas, etc., ciertos catalizadores minerales (sales de cobre, de nquel, de cobalto, de hierro), algunos oxidantes (permanganatos, bicromatos, etc.) pueden igualmente dar positivas las reacciones que se indican a continuacin, porque no son reacciones especficas para la sangre, son reacciones de probabilidad, muy til por su gran sensibilidad.

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Reaccin de Luminol: Solucin de Luminol: 3 aminoftalilhidrazida hidroclorhidrato 1 g. Carbonato sdico 5 g. Perxido de hidrgeno (10 Vol.) 50 cc. H2O destilada c.s.p. 1000 cc Fundamento: Una solucin de 3 aminoftalilhidrazida clorhidrato, fresca, mezclada con una fuente de 02 tal como Perborato sdico o agua oxigenada en solucin alcalina, produce luminiscencia en presencia de sangre. Tcnica: La solucin preparada se coloca en un atomizador y se roca sobre la mancha. Aparecen, en caso positivo, manchas luminosas. Nota: No es especfica para sangre, ya que diversas sustancias qumicas dan cierta luminiscencia, ejemplo: sales de Cu.
REACCIONES DE COLORACIN:

a) Reaccin de Adler o ensayo de la Bencidina: En un tubo de ensayo se coloca 1 cc de la solucin de la mancha y se le agrega 1 cc del reactivo. Si hay sangre, se produce una coloracin verde que va pasando a azul intenso. La sensibilidad de esta reaccin es de 1 / 2.000.000 cc de sangre. Es necesario tener en cuenta que adems de la sangre, una coloracin similar se obtiene con: secrecin nasal, hipoclorito, pus, formalina, sales de hierro, gluten, jugos de plantas, etc. No sirve para tejidos corporales que se guarden en formol. b) Reaccin de Kastle-Meyer o ensayo de la Fenolftalena: Fundamento: El cromgeno es la fenolftalena, que por reduccin en medio alcalino se transforma en fenolftaleina incolora, pero susceptible de reoxidarse de nuevo a fenolftaleina. Tcnica: Se toman unas gotas del macerado sospechoso, se colocan en un vidrio de reloj y se aaden 1-2 gotas del reactivo. Luego varias gotas de perxido de hidrgeno (20 vol). La aparicin de un color rosado ms o menos intenso de la fenolftalena alcalina, nos indica que la reaccin es positiva. La sensibilidad de esta reaccin es de 1/1.000.000 cc de sangre, incluso da positivo con manchas muy viejas, lavadas y an en ropa hervida. Las manchas de cobre, jugo gstrico, leche cruda tambin dan ese color. El empleo simultneo de las reacciones de Adler y de Kastle-Meyer permite, en cierta medida, evitar los errores debidos al cobre, nquel, cobalto (R. De Adler negativa) y los debidos al herrumbre, (R. De K Kastle-Meyer negativa). Las reacciones testigos, sin agua oxigenada, permiten descartar los errores debidos a los oxidantes directos. Finalmente, las peroxidasas vegetales son destruidas a 80-90 grados por el cido actico glicerinado, que respeta la peroxidasa sangunea. Con esta tcnica es posible dar a las reacciones de probabilidad un valor real demostrativo, cuando las pruebas de certeza son imposibles.

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ENSAYOS DE CERTEZA:

La sangre es identificada con certeza ya sea por los cristales que forman en ciertas condiciones, ciertos derivados de Hb, ya sea por las propiedades espectrales muy caractersticas de estos.
REACCIONES DE MICROCRISTALIZACIN

Ensayo de Teichman. Fundamento: En presencia de cloruro sdico, el cido actico transforma en caliente la hemoglobina en hemina o clorhidrato de hematina, que se presenta al microscopio bajo el aspecto de pequeos cristales muy caractersticos. Tcnica: A una gota de H2O destilada colocada sobre una lmina porta-objeto, se aaden unos cristales de NaC1 adems de residuos o fragmentos de la mancha sospechosa 2 gotas del macerado, se cubre con un cubre-objeto, se presionan ambas lminas de vidrio y se calienta suavemente sobre la llama de un mechero movindolo constantemente hasta que comience a hervir o aproximidad de ebullicin. Luego se le introduce varias veces por capilaridad cido actico glacial y se calienta nuevamente sobre el mechero hasta ebullicin. Se deja enfriar y se examina la preparacin al microscopio. Si la muestra contiene sangre, se formaran cristales de clorhidrato de hematina en forma de prismas o rombos alargados de extremidades oblicuas de color castao. Los cristales no se formaran: 1.- Si la sangre ha sido calentada por encima de 142 C ya que su temperatura ptima de formacin es 60 C aproximadamente. 2.- Si ha estado sometida al efecto de la luz del sol. 3.- Si la putrefaccin de la sangre es de 4 a 6 meses. 4.- Si hay cromgenos, hematoporfirina, hematina cida por contacto prolongado de la sangre con hierro, acetato bsico, acetato de plomo, etc. Ensayo de Takayama. Fundamento: La hemoglobina de la sangre al ponerse en contacto con el reactivo de Takayama se transforma en cristales hemocromgenos caractersticos, inmediatamente cuando se somete a calentamiento suave y al cabo de hora, si este ensayo se realiza al fro. Tcnica: El extracto seco sospechoso se coloca sobre un porta-objeto. Luego se aaden 23 gotas del reactivo de Takayama. Si hay sangre se formaran cristales de hemocromgenos en forma de plumas, racimos, discos, rombos rectngulos o agujas largas o cruces con cuatro puntas de color moreno. Este ensayo da buenos resultados con sangre vieja, calentada, alterada o putrefacta. Mtodos Histolgicos: Cuando se trata de manchas recientes, en las que hay la posibilidad de que tanto los hemates como los otros componentes del suero no hayan sufrido modificaciones, se procede a realizar la investigacin, si es sangre humana o animal. Macere la mancha en solucin salina isotnica, centrifugue:

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a) Investigue la presencia de hemates en el sedimento. b) Determinacin del grupo y Rh sanguneo. c) Reaccin de suero precipitante, cuyo fundamento es la reaccin precipitante observada, cuando se pone en presencia de una solucin de sangre o suero sanguneo humano, suero con antgeno especfico, preparado por la inyeccin a un animal de experimentacin.

IDENTIFICACIN DE MANCHAS DE ESPERMA

Introduccin La importancia de las manchas de esperma es considerable ya que su presencia tiene una significacin absolutamente precisa y constituye un testimonio acusador irrefutable en los delitos contra la honestidad.
Objetivo:

Identificar la presencia de manchas de semen en un soporte cualquiera.

MUESTRA BIOLGICA: Semen. MATERIAL USADO REACTIVOS

Pipetas de 1 y 2 ml Tubos de ensayos Lminas Laminillas Lmpara de Wood Microscopio Gradillas

- Yoduro de Potasio - Yodo slido - Sol. saturada de cido pcrico - Suero antihumano -Solucin salina fisiolgica - Eritrosina amoniacal 0,5% - Azul de metileno - Blsamo de Canad - Fuscina cida - Verde malaquita - Alcohol al 95% - Fuscina cida 1% - Suero anti A
PARTE EXPERIMENTAL

Para llegar a un diagnstico definitivo acerca de la presencia o no de una mancha de semen, debemos realizar las siguientes tcnicas: a) Orientacin: 1.-Fluorescencia espermtica 2.-Reaccin de Flrense 3.-Reaccin de Barberio b) Diagnstico de especie suero antihumano (Mtodo de los sueros precipitantes).

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c) Reacciones de certeza: Identificacin del espermatozoide especfico. Diagnstico individual de las manchas. Mtodos de las fosfatasas cidas (Mtodo cuantitativo).
PRUEBAS DE ORIENTACIN

Fluorescencia espermtica: Las manchas espermticas en presencia de la luz ultravioleta presentan una coloracin blanco azulada, muy apreciable a la oscuridad. Esta fluorescencia, debida a la espermina es ms fuerte cuanto ms vieja sea la mancha. No es especfica, pues ciertos lquidos desecados: orina, moco nasal, o vagina, tienen una fluorescencia idntica o parecida. Reaccin de Florence: Se coloca en una lmina porta-objeto, una gota del macerado en agua destilada y una gota del reactivo de Florence, con una separacin entre ellas ms o menos de 1 cm. Se cubren con una laminilla cubre-objeto y se observa al microscopio. Hay la aparicin de cristales color caoba oscura, romboidales, con las extremidades cortadas oblicuamente. Estos cristales son de Peryoduro de Colina. Reaccin de Barberio: Similar a la anterior, pero el reactivo utilizado es el de Barberio. Los cristales son en forma de agujas, largos, estrechos y en su lnea media puede verse una arista muy refringente. Los cristales son de Picrato de espermina.
DIAGNSTICO DE ESPECIE

Mtodos de los sueros precipitantes: Se basa en el mismo principio de identificacin de las

manchas de sangres. La mancha problema se macera en suero fisiolgico durante 24 horas, se filtra o centrifuga, si es preciso, para que quede transparente y luego se decanta. En un tubo de precipitado se colocan 0.9 cc de macerado y 0.1 cc de suero precipitante. Se coloca en la estufa a 37 C. Los resultados se leen a los 15 20 minutos, confirmndose a las 24 horas. Esta reaccin es negativa con el esperma de los animales. Da un precipitado en cambio, con las soluciones de esperma humana an muy diludas. Es negativa con el esperma putrefacto. REACCIONES DE CERTEZA

La nica prueba de certeza es el hallazgo de espermatozoides, esta puede realizarse: Sin coloracin: Coloque una o dos gotas del macerado en un porta-objeto, cbrala con un cubre-objeto y observe directamente sin colorear. Con coloracin: 1.Solucin Eritrosina Amoniacal: Tome un trozo de tela donde est la mancha sospechosa, sumrjala aproximadamente 30 a 60 segundos en una solucin de eritrosina amoniacal al 0.5%, lave con agua destilada, llvela luego a un portaobjeto, disciela con ayuda de agujas o alfileres en medio de 1 a 2 gotas de azul de metileno, seque con papel filtro y agregue una gota de blsamo de Canad, cubra la preparacin y observe al microscopio. Los espermatozoides se habrn coloreado, la cabeza en violeta intenso y la cola azul, adems estarn agrupados a lo largo de las fibras.

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2.-

Sumerja la tela o los hilos manchados supuestamente con esperma en la solucin B, durante 20 minutos: luego decolore en alcohol al 70% por 1 2 minutos, seque en papel filtro, coloree por 5 a 6 minutos en la solucin A, decolore en alcohol de 95 por 20 segundos, decolore de nuevo en alcohol absoluto por 45 a 60 segundos y agregue una gota de blsamo de Canad, cubra la preparacin y observe al microscopio. Los espermatozoides se habrn coloreado, la cabeza en verde y la cola en rojo. Solucin A Fuscina cida Verde malaquita Agua destilada Alcohol Solucin B Fuscina cida 1% Agua destilada 0,75 g 0,75 g 125 cc 25 cc 1g 5g

Diagnstico individual de las manchas de esperma. 1.- El esperma humano presenta propiedades aglutinantes y de absorcin especfica de isoaglutininas normales, anlogas de la sangre. 2.- Dichas propiedades permiten aplicar las experiencias de isoaglutinacin. Para poner en evidencia estas propiedades grupo-especficas, se siguen las mismas tcnicas que para la sangre. Como sabemos es necesario demostrar la existencia de los aglutingenos que son ms resistentes al calor, envejecimiento y a agentes qumicos, que las aglutinas. Tcnica: Suero del grupo A y suero del grupo B se mezclan con suero fisiolgico para hacer disoluciones de 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, etc. A 0,1 cc de cada dilucin se le aade la misma cantidad de fluido seminal en un tubo de ensayo. Los tubos con las preparaciones se dejan reposar por 2 horas a la temperatura ambiente y despus se centrifugan, el fluido sobrenadante y los efectos de la absorcin previa se anotan cuidadosamente. Por estos estudios es posible, en ciertos casos, demostrar a que grupo del fluido seminal pertenece y as difiere el fluido seminal del sospechoso.
PREPARACIN DE REACTIVOS

Reactivo de Adler: (Extemporneo): Solucin de Bencidina al 10% en cido actico glacial. Perxido de Hidrgeno 20 Vol. Ambos deben ser recin preparados. A una parte de la Bencidina se aaden 2 partes del perxido.

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Reactivo de Kastle-Meyer: - Fenolftalena 2g - KOH anhidro 20 g - Agua destilada c.s.p. 100cc Se hierve la Fenolftaleina y el KOH en el agua destilada, luego se agrega en caliente, 20 g de polvo de zinc (reductor). Se debe hervir hasta que la solucin sea incolora. Debe dejarse una cantidad de polvo de zinc en el fondo de la botella color mbar, para asegurarse de la reduccin y se guarda en un frasco bien cerrado, con una delgada capa de aceite de parafina en la superficie del lquido. Reactivo de Takayama: - NaOH al 10% 3 ml - Piridina 3 ml - Glucosa (Sol. saturada) 3 ml - Agua destilada 7 ml El primer reactivo acta como solvente alcalino de la sangre y la glucosa como agente reductor. Es estable este reactivo por espacio de 1-2 meses en frasco color mbar. Reactivo de Florence: Yoduro potsico 1,65 g Yodo metaloide 2,54 g Agua destilada 30 cc Disuelva primero el yoduro en el mnimo de agua posible. Reactivo de Barberio: Solucin saturada de cido pcrico. Una vez finalizada la prctica realice un informe de la manera siguiente: Grupo N________ Alumno___________________________________________________________________ Manchas de sangre Reacciones Realizadas Orientacin Lmpara de Word ______________________________________________ Schaenbein ____________________________________________________ Probabilidad Oxidasas ______________________________________________________ Luminol ______________________________________________________ Adler ________________________________________________________ Kastle Meyer __________________________________________________ Creteza Teichman _____________________________________________________ Takayama _____________________________________________________ Manchas de Esperma Reacciones Realizadas Orientacin Florescencia ___________________________________________________ Florence ______________________________________________________ Barberio ______________________________________________________ Diagnstico de especie ______________________________________________________ Certeza Identificacin de Espermatozoide __________________________________ 55

Diagnstico Individual __________________________________________

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