UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS ESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA CARRERA QUIMICA DE ALIMENTOS LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA

Nombre: Rentera Vanessa Fecha de e !re"a: 04/04/2011 TEMA: Da: Lunes #ora: 10:00-13:00

$RODUCCION DE BIOMASA

La biomasa es la cantidad de materia viva producida en un rea determinada de la superficie terrestre o por or!anismos de un tipo especfico en este caso los microor!anismos siendo una variable ecol"!ica importante por#ue representa la cantidad de ener!a almacenada en un se!mento partculas de una comunidad biol"!ica$ La determinaci"n de la biomasa es una de las variables ms importantes en un bioproceso por#ue su determinaci"n nos lleva a la comprensi"n de la eficiencia del mismo$ %u& 'til para establecer las ta(as de producci"n de consumo de nutrientes & el clculo de los balances dems de cual#uier proceso biol"!ico$ METODOS DE $RODUCCION DE BIOMASA Los m)todos #ue cuantifican la cantidad de c)lulas son 'tiles principalmente para enumerar or!anismos como bacterias o levaduras mientras los #ue miden la masa o actividad celular pueden utili(arse para todos los microor!anismos incluidos los *on!os filamentosos en los #ue es difcil cuantificar las c)lulas individuales Lo ms prctico para la determinaci"n de la biomasa microbiana se basa en pruebas: Detectando la presencia de compuestos bioqumicas especficos que indican la presencia de microorganismos. +ual#uier componente celular seleccionado para la estimaci"n de la biomasa viva de una muestra debe responder a tres criterios fundamentales: ,star presente 'nicamente en c)lulas vivas$ -er rpidamente de!radado cuando las c)lulas mueran$ -er relativamente constante en concentraci"n respecto a cambios en el estado fisiol"!ico celular & entre distintas especies

M%TODOS INDIRECTOS DE DETERMINACI&N DE LA BIOMASA AT$ La medida de ./0 puede usarse para calcular la biomasa microbiana sin embar!o e1isten dificultades para el clculo e1acto pues en al!unos casos la concentraci"n de ./0 cambia se!'n sus condiciones alteradas como las nutricionales & fisiol"!icas$ La me2or medida sera la cantidad total de compuestos adenilados: A: ATP+ ADP + AMP ,sto se calcula con el fin de calcular la car!a ener!)tica$ EC: (ATP + ADP )/ (ATP + ADP + AMP) ,sta car!a ener!)tica es una medida del estado fisiol"!ico de los microor!anismos presentes en la muestra$ 'CIDOS NUCLEICOS ,l .34 & el .R4 son dos componentes de las bacterias cu&a sntesis es proporcional a la tasa de crecimiento$ %ientras #ue las concentraciones de .R4 varan considerablemente con el estado fisiol"!ico celular la cantidad de .34 es relativamente ms constante$ La cantidad de .34 se determina mediante espectrofotometra tras su e1tracci"n & purificaci"n$ ,1isten diversas t)cnicas si bien presentan la desventa2a de #ue los procedimientos de purificaci"n son comple2os con diversas interferencias & bastante costosos COM$ONENTES DE LA $ARED CELULAR La ma&ora de las bacterias poseen acido murmico en su pared celular & esta es la *erramienta 'til para la determinaci"n de la biomasa microbiana$ ,sta se basa en la liberaci"n de lactato por parte del acido murmico & posteriormente el anlisis #umico para determinar la concentraci"n de dic*o lactato$ La conversi"n de la medida de acido murmico 5%.6 en biomasa indica #ue las bacterias 7ram positivas presentan una proporci"n de 448! %./m! + & las 7ram ne!ativas 12448! %./m! +$ L($IDOS Los lpidos son un componente fundamental de las membranas celulares$ -u determinaci"n para la estimaci"n de la biomasa de una poblaci"n bacteriana ofrece muc*as venta2as sobre otros m)todos$ La principal venta2a es su alto contenido especfico & #ue se encuentran en cantidades relativamente constantes$ 9tra venta2a mu& importante es #ue los lpidos no forman parte de las reservas celulares & se de!radan rpidamente durante la lisis bacteriana$ .pro1imadamente entre un :0-:; < de los lpidos de las membranas celulares est en forma de fosfolpidos$ Las t)cnicas de anlisis se basan fundamentalmente en la e1tracci"n celular de los fosfolpidos con un disolvente or!nico su posterior *idr"lisis cida para liberar el fosfato & por 'ltimo 1a determinaci"n colorim)trica de )ste$ -on t)cnicas relativamente sencillas reproducibles & sensibles 5de 0 1 a 1 nmol de fosfato6

CLOROFILA La biomasa de los microor!anismos fotosint)ticos se determina a partir de la determinaci"n de la clorofila$ ,sta se puede e1traer con disolvente como la acetona o el metanol & cuantificarse midiendo su absorbancia en un espectrofot"metro a una lon!itud de onda de ==>nm$ $ROTEINA Las protenas son fcilmente cuantificables & estas con !rupos *emo pueden ser detectadas especficamente mediante #uimioluminiscencia$ ,sta determinaci"n es apropiada solamente cuando se encuentra solamente una poblaci"n$ Adems existen los mtodos clsicos de determinacin de biomasa son mtodos directos que se basan en el nmero de clulas o en el peso celular. os mtodos de enumeracin celular! son mtodo de obser"acin! basados en propiedades fsicas o en la acti"idad biolgica: M%TODOS DIRECTOS DE DETERMINACI&N DE LA BIOMASA M%TODOS GRAVIM%TRICOS La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en t)rminos de peso seco por unidad de volumen &a sea como s"lidos en suspensi"n totales 5--/6 o s"lidos en suspensi"n voltiles 5--V6$ Las c)lulas se separan del l#uido bien por centrifu!aci"n bien por filtraci"n$ La principal desventa2a de estas t)cnicas es #ue su determinaci"n inclu&e no s"lo microor!anismos activos sino microor!anismos muertos material inerte polmeros e1tracelulares & materia or!nica adsorbida$ .dems no puede aplicarse cuando los sustratos a de!radar son insolubles$ Los m)todos !ravim)tricos son simples pero consumen bastante tiempo & son poco reproducibles$ M%TODOS ES$ECTROFOTOM%TRICOS -e basan en la e1istencia de una relaci"n directa entre el n'mero total de microor!anismos presentes en una muestra & su valor de turbide($ /ras la determinaci"n de la turbide( de la suspensi"n celular mediante espectrofotometra el resultado se e1presa en unidades de absorbancia$ -in embar!o antes de utili(ar la turbide( como m)todo de recuento *a& #ue reali(ar una recta de calibrado #ue relacione medidas directas 5microsc"picas por recuento en placa o peso seco6 con las indirectas de la turbide($ ,sta recta contiene datos sobre el n'mero de c)lulas permitiendo la estimaci"n de tal parmetro a partir de una sola medida de la turbide($ -e trata de m)todos rpidos pero de ba2a sensibilidad & #ue presentan problemas de calibraci"n 5tipo de cultivo medio de cultivo6 & de interferencias con partculas M%TODOS MICROSC&$ICOS DE RECUENTO CELULAR EN C'MARAS ,1isten diversos tipos de cmaras para el recuento de microor!anismos tales como la cmara de 4eubauer$ /*oma ?@rAer /@rA Buc*s-Rosent*al %alasse( 0etroff Causer etc$

,l recuento de microor!anismos se reali(a en la cuadrcula central de la cmara & se multiplica por la profundidad obteni)ndose el n'mero de microor!anismos por unidad de volumen 5n'mero de c)lulas$ ml-1 !eneralmente6$ ,l recuento de microor!anismos en cmaras no es un m)todo mu& e1acto debido a las irre!ularidades en la distribuci"n de la muestra$ .dems$ 0ueden confundirse las c)lulas con otras formas or!nicas e inor!nicas e1istentes en el medio & no permite distin!uir c)lulas vivas de c)lulas muertas$ Las venta2as de este tipo de recuentos son el e#uipo sencillo & escaso #ue se re#uiere la rapide( para obtener los resultados & la facilidad para observar la morfolo!a de los microor!anismos presentes$ -us desventa2as se dan por#ue no se diferencian los microor!anismos vivos de los muertos es tedioso & no es 'til para recuento de poblaciones con ba2a concentraci"n de microor!anismo Dna cmara de recuento est constituida por una placa base de vidrio de tamaEo especial parecida a un portaob2etos su parte central se encuentra separada de los e1tremos por unas ranuras$ ,n dic*as ranuras de encuentran las cuadriculas de recuento cu&a forma & disposici"n dependen de la estructura de fabricaci"n siendo lo normal #ue e1ista una ranura de 0$1 mm entre el campo central & un portaob2etos situado encima$ Referente a la cuadricula de recuento de 0$1mm podemos decir #ue e1isten tres tipos de cuadriculas diferentes: +uadricula de /*omas$ +uadricula de ?@rAer$ +uadricula de 4eubauer$

La cuadricula ms utili(ada es la de 4eubauer$ M%TODOS MICROSC&$ICOS MEDIANTE E$IFLUORESCENCIA La epifluorescencia es debida a un a!ente fluorocromo a la adici"n de al!'n anticuerpo marcado con fluorescencia 5inmunofluorescencia6 o a una autofluorescencia natural debida a la e1istencia de al!'n componente celular autofluorescente$ +uando la epifluorescencia se debe a un a!ente fluorocromo el procedimiento consiste en la tinci"n de las bacterias con dic*o a!ente & posterior recuento mediante microscopa "ptica con iluminaci"n de epifluorescencia$ Los sustratos fluorescentes o fluorocromos #ue se *an empleado para la observaci"n directa de bacterias se clasifican en dos !rupos$ ,n el primero de ellos #uedaran en!lobados a#uellos fluorocromos #ue tras ser adsorbidos act'an especficamente sobre cidos nucleicos u otros componentes celulares$ ,l se!undo incluira a

todos a#uellos #ue tras ser sustratos de una determinada actividad metab"lica son convertidos en mol)culas fluorescentes$ .F primer !rupo pertenecen los principales fluorocromos utili(ados para la estimaci"n de la poblaci"n total de una muestra: el naran2a de acridina & el 4 =-diamidino-2-fenilindol 53.0F6$ ,stos fluorocromos permiten distin!uir c)lulas de partculas e identificar bacterias no s"lo por su color sino tambi)n por su forma & tamaEo$ ,l naran2a de acridina colorea tanto el .34 como eF .R4 de las c)lulas emitiendo a una lon!itud de onda apro1imada de 4G0 nm$ Los cidos nucledos de *ebra simple se colorean de un color naran2a-ro2o fluorescente mientras #ue los de doble *ebra adoptan un color verde fluorescente$ ,F fluorocromo 3.0F es un colorante especfico del .34 & su pico de e1citaci"n se encuentra pr"1imo a la re!i"n ultravioleta 53=> nm6$ . pesar de las venta2as #ue supone el uso de estos fluorocromos no permiten distin!uir entre las c)lulas muertas metab"licamente inactivas & las vivas &a #ue el .34 conserva sus propiedades incluso en c)lulas muertas$ M%TODOS C(N%TICOS La base de estos m)todos es la medida del consumo de sustrato o de la formaci"n de producto en ensa&os en discontinuo$ ,l e2emplo ms tpico en microor!anismos aerobios es la determinaci"n de la 3?9 #ue indica la biode!radabilidad de un sustrato en disoluci"n a trav)s del consumo de o1!eno del medio$

BIBLIOGRAFIA: o *ttp://booAs$!oo!le$com/booAsH idI2ctdv?n/a1;+Jp!I0.=31Jlp!I0.=31Jd#IproduccionKdeKbiomasa <2?biotecnolo!iaJsourceIblJotsILpM3G!&&1cJsi!IN,:p:-tbFL0FBO-4P4!:BQGro;J*lIesJeiI;3-P/d3=RRS70Q7%#/t+MJsaIPJoiIbooALresultJctIresult JresnumI>JvedI0+3DQ=.,M?.TvIonepa!eJ#JfIfalse o *ttp://MMM$bvsde$pa*o$or!/bvsaidis/ar!entina11/biomcult$pdf

o .rni( +$ Fsac L$ & Lebrato N$ 2000$3eterminaci"n de la biomasa en procesos

biol"!icos$ -evilla$