ardenerella vaginalis y mobiluncus en la etiologa de la vaginosis bacteriana

Francisco Hernndez

Resumen Las vaginitis y las vaginosis bacterianas (VB) son infecciones muy frecuentes en la mujer. La primera se asocia con agentes especficos como Candida, Trichomonas y Chamydea. Sin embargo, hay una alta frecuencia de casos etiolgicamente no definidos, que en el pasado fueron considerados como "vaginitis inespecficas". Actualmente la mayora de esos casos se definen como VB, un sndrome comn y mal diagnosticado, cuya etiologa es polimicrobiana asociada con un desequilibrio de la flora vaginal. Dos de los agentes ms importantes, relacionados con VB son Gardnerella vaginalis y Mobiluncus spp. El primero fue descrito en 1953 como el agente responsable de las vaginitis inespecficas; no obstante, su prevalencia similar en casos y controles y las inoculaciones en voluntarias no confirmaron su papel en las vaginitis. Hoy, los anlisis cuantitativos de la poblacin vaginal y el hallazgo de una citotoxina en este agente confirman su accin causal en las VB. Mobiluncus es una bacteria anaerobia, toxignica relacionada con las VB y con otras patologas, como coriomnionitis, nacimientos a pretrmino, enfermedad inflamatoria plvica post aborto y endometritis post cesarea. Este agente es de cultivo fastidioso; sin embargo, la tincin de Gram es el mtodo diagnstico ms comn para las VB. Palabras clave Gardnerella vaginalis, Mobiluncus. Spp. Vaginosis Bacteriana, Vaginitis.

Abstract Vaginitis and bacterial vaginosis (BV) are the most frequent infections in women. The former is associated with specific agents, such as Candida, Trichomonas, and Chamydea.; nevertheless, there are a high frequency of cases without defined agent, that were considered in the past as "inespecific vaginitis". Actually the majority of those cases as defined BV, common and underdiagnosed syndrome, in which etiology are associated a poly-micorobial population from the altered vaginal flora. Two of the most important agents related with BV are Gardnerella vaginalis and Mobiluncus spp. The former was described in 1953 as the agent responsible of inespecific vaginitis; however, its prevalence in cases and controls was similar and inoculations in volunteers do not confirm its role in the vaginitis. Today, the quantitative analysis of bacterial populations, cytotoxin found in this agent confirms its role in the ethiology of BV. Mobiluncus is a toxigenic anaerobic agent related with VB and with other pathologist as choriomnionitis, preterm birth, post-abortal pelvic inflammatory disease and post-caesarean endometritis. This agent is anaerobic and fastidious; nevertheless, the Gram stein is the most common diagnosis tool for BV. Key words Gardnerella vaginalis, Mobiluncus. Spp. Bacterial vaginosis, vaginitis.

Introduccin De acuerdo con las observaciones del tercer simposio internacional sobre vaginitis/ vaginosis bacteriana (VB), se considera que esta ltima entidad constituye la infeccin ms frecuente en mujeres frtiles. Se calcula que afecta a un 10% de la poblacin general y un 30 % o ms segn grupos especficos de poblacin (Citado en 1). Esta condicin presenta un espectro clnico que usualmente suele pasar inadvertido para la paciente, o que ella misma, por

considerarla trivial, no consulta con el mdico ya que en la mayora de los casos las nicas molestias suelen ser prurito y una secrecin blanquecina mal oliente (2). Ese espectro clnico leve, unido al hecho de que la VB es una condicin cuya notificacin no es obligatoria, hace que se desconozca su frecuencia real en la comunidad y que exista una nebulosa de dudas en relacin con esta condicin, tal como ha sido sealado por el "CDC" (3). Estos hechos obligan a prestar ms atencin a esta patologa, ignorada o tildada de falta de importancia para algunos. Y esta revisin en un afn por divulgar el conocimiento existente en relacin con las VB y en especial su importancia en Costa Rica.

Vaginitis o vaginosis? Las infecciones vaginales inicialmente se definieron como cuadros de vaginitis, clasificados segn el agente etiolgico involucrado. Los primeros agentes sealados fueron Candida y Trichomonas (4). La primera es la causa ms frecuente de vaginitis y se extrapola que el 20% de las mujeres sufren al menos una infeccin por Candida durante su vida; adems, usualmente es la causa en la que ms piensan mdicos y pacientes cuando se enfrentan con un cuadro cuya manifestacin ms relevante es la secrecin vaginal (2). En tanto la frecuencia de tricomoniasis era menor del 5% (5). Sin embargo, estudiando ambas causas, quedaba una proporcin importante de casos de etiologa desconocida que fueron denominados "vaginitis inespecficas" y cuya dilucidacin ha sido motivo de numerosas investigaciones. En la dcada de 1950 se identific una bacteria que ms tarde sera denominada Gardnerella. En aquella poca se pens que este nuevo agente sera responsable de esos cuadros de etiologa inespecfica (6). No obstante, la evidencia epidemiolgica posterior no apoy esas suposiciones. Posteriormente se describi el gnero Chlamydia, involucrado con este tipo de patologa y que actualmente se considera el agente infeccioso ms frecuente en humanos. Las clamidias se involucran en una amplia gama de cuadros relacionados con transmisin sexual, que incluyen el linfogranuloma venreo, uretritis no gonocccicas que pueden evolucionar hasta epididimitis e infecciones del tracto genitourinario, en las cuales se incluyen cervicitis, sndrome uretral agudo, piuria no bacteriana, endometritis y salpingitis; a parte de las infecciones oculares y pneumonas especialmente del recin nacido, en las cuales la contaminacin de origen materno es obvia (7). Los tres agentes mencionados (Candida, Trichomonas y Chlamydia) se relacionan con cuadros vaginales preponderantemente inflamatorios en los cuales hay secrecin purulenta. No obstante, an quedaba una proporcin importante de casos etiolgicamente no definidos y en los cuales la inflamacin no siempre se presenta, por lo que en 1984 se defini la VB ( 4-5), como una nueva entidad en la cual el componente inflamatorio no era importante y en cuya etiologa no se involucra a un determinado germen, sino ms bien se define como una trama multicausal. Esta trama obedece a un desequilibrio ecolgico de la flora vaginal, en la cual desaparecen los lactobacilus, encargados de mantener un pH cido, y restrictivo a otras bacterias, y se establece una flora variada, integrada por agentes anaerobios, anaerobios facultativos y aerobios (8).

Gardnerella vaginalis: Como se mencion previamente, el descubrimiento en 1953 de la bacteria que ms tarde sera clasificada como Gardnerella, fue anunciado como la respuesta etiolgica a las vaginitis inespecficas (6). Sin embargo, la evolucin del conocimiento llevara a menospreciar su papel en esta condicin clnica, para reestablecerlos en la dcada de 1990, nuevamente como una bacteria con un potencial de virulencia, que la hace capaz de inducir cuadros clnicos importantes.

Las primeras descripciones de esta bacteria datan de 1953, cuando Leopold lo aisl de 58 (27%) mujeres con cervicitis y de dos hombres con uretritis inespecfica (6). Luego en 1955 Gardner y Dukes lo aislaron de 127 (92%) mujeres con vaginitis inespecficas y la denominan Haemophilus vaginalis, por aislarse inicialmente slo en agar sangre. La asociaron con los requerimientos nutricionales de Haemophilus (9), pero ms tarde se descart y la relacionaron con otros gneros de bacilos Gram positivos como:Corynebacterium, Butyribacterium e incluso Lactobacillus, para finalmente clasificarla en el nuevo gnero Gardnerella, con una sola especia G. vaginalis (10). Este gnero solo tiene relacin filognetica con Bifidobacterium, y constituye un grupo taxonmicamente bien definido (11). Gardnerella vaginalis es un bacilo inmvil, no encapsulado, puede presentar fimbrias y es corto con una longitud de 0,5 a 1,5 m, lo que hace que aparezca como un coco-bacilo pleomrfico, que usualmente se tie como Gram negativo o Gram variable (12). Ultraestructuralmente su pared corresponde a la de un Gram positivo y la discrepancia en su carcter tintorial radica en el poco espesor de su capa de peptidoglican, que hace que se decolore fcilmente durante el proceso de la tincin de Gram y que por lo tanto aparece como Gram negativo (13). Es un organismo anaerobio facultativo y se aisla en agar sangre incubado en anaerobiosis o en una atmsfera de 5% de CO2, a 35C por 48 horas, y se originan colonias translcidas de 0,3 a 0,5 mm de dimetro, con hemlisis tipo beta. La hemlisis se presenta en agar sangre con eritrocitos de origen humano o de conejo, pero no de otros animales. Adems, es catalasa y oxidasa negativo. Estas caractersticas aunadas al carcter tintorial de formas cocobacilares Gram negativas, permiten identificarla, y tambin puede confirmarse mediante el sistema API20 (12). Tambin se han aislado, de secreciones vaginales, otras bacterias que por su similitud con sta se han denominado agentes similares a Gardnerella o a Corynebacterium. Recientemente estos agentes fueron clasificados genticamente como Actinomycesy difieren de Actinomyces pyogenes (14) por lo cual se propuso la nueva especie A. turicensis (11).

Gardnerella y su relacin con vaginitis/vaginosis: Tratando de probar la virulencia de G. vaginalis, Gardner y Dukes en 1955 (15-16) intentaron satisfacer los postulados de Kock inoculando la bacteria en vagina de 13 mujeres sanas, de las cuales slo una desarroll la infeccin, aunque el agente se aisl de 10 de las mujeres inoculadas. Sin embargo, dado que en los frotis vaginales de los casos de "vaginitis inespecfica" apareca una flora bacteriana muy variada, Criswell y colaboradores en 1969 (1516) recurrieron a inocular secreciones de mujeres con ese cuadro clnico en la vagina de 15 voluntarias sanas, de las cuales 10 desarrollaron el cuadro, por lo que se asumi que ese agente requera la presencia de otras bacterias para manifestarse clnicamente (15-16). Aunque con esos estudios experimentales en humanos se ignor la multicausalidad de las VB, se estableci la importancia de G. vaginalis. No obstante, esos datos y otros que mostraban una prevalencia de G. vaginalis similar en casos y testigos llev a restarle importancia a ese agente; y considerarlo un habitante normal de flora vaginal (17). Sin embargo, empleando medios de aislamiento ms sensibles que los utilizados por Gardner y Dukes se ha aislado G. vaginalis de un 98 a 100% de las mujeres con VB y de un 40 a 50% de las mujeres sanas, lo que s muestra una diferencia estadsticamente significativa entre casos y testigos (18). Pero el hallazgo ms importante en este sentido es la cuantificacin de la bacteria, pues en la VB la poblacin de G. vaginalises de 1000 a un milln de veces mayor que la recuperada de pacientes normales (4,19). Tambin se ha descrito en esta bacteria la presencia de una toxina citoltica, capaz de lisar especficamente los eritrocitos de humanos, pero no los de otras especies (20). Esta toxina ha sido considerada una "protena similar a una perforina" y que adems de los eritrocitos, rompe las clulas epiteliales, lo cual podra explicar las alteraciones ultraestructurales observadas en las clulas gua, ya que aparecen prcticamente sin citoplasma, y se hace evidente su citoesqueleto. Se han detectado anticuerpos especficos tipo IgA contra esta toxina en el 60%

de los lavados vaginales de pacientes con VB, lo que demuestra que induce una respuesta inmune especfica local. Por otra parte G. vaginalis ha sido relacionada con patologa como endometritis, cistitis, amnionitis, septicemia neonatal y meningitis (20), hallazgos que aunados al descubrimiento de la toxina en esta bacteria y su alta capacidad para adherirse in vivo oin vitro a clulas epiteliales (21) respaldan la necesidad de considerar a G. vaginalis como una bacteria potencialmente patgena, que al formar parte del complejo bacteriano involucrado con la etiologa de las VB, no debe menospreciarse.

Mobiluncus spp. En 1913 Curtis aisl una bacteria anaerobia, curva y mvil a partir de las secreciones vaginales de una mujer con una endometritis post partum y tambin la detect en secreciones de pacientes con leucorrea. Posiblemente esos fueron los primeros aislamientos de un agente que en 1984 sera identificado como Mobiluncus y que sera sealado como uno de los agentes involucrados con la etiologa de las VB (22). Mobiluncus, cuyo nombre deriva de los trminos griegos: mvil y gancho -uncus-, es un gnero de bacterias curvas, anaerobias, de cultivo lento y altamente fastidioso. Tintorialmente se comporta como Gram variable, aunque usualmente se tie como Gram negativo; sin embargo, ultraestructuralmente su pared corresponde a Gram positivo (23). El gnero comprende dos especies bien definidas y morfolgicamente diferentes: M. mulieris y M. curtisii. La primera mide de 1,9 a 6 m (x 2,9 a 3m) de largo, aparece curvada en media luna e incluso forma semicrculos e invariablemente se tie como Gram negativa y tiene de 1 a 8 flagelos con origen mltiple. M. curtisii debe su nombre al doctor Curtis, quien posiblemente fue el primero en aislarla en 1913. Esta bacteria mide de 0,8 a 3m (x 1,5 a 1,7m) de largo, puede teirse como Gram positiva o Gram negativa, tiene de 1 a 6 flagelos que salen de una insercin comn. En esta especie se describieron dos subespecies M. curtisii curtisii y M. curtisii holmesii, basadas en la movilidad diferente que exhiban en agar suave y en la capacidad de la ltima para utilizar los nitratos (4-5, 22-23). Sin embargo, su caracterizacin bioqumica y la secuencia de su ARN 16S no apoyan tal subdivisin (24) y por el contrario el gnero se seala como muy complejo fenotipcamente, lo que con frecuencia lleva a la descripcin de especies atpicas (24-25), o bien a una heterogeneidad antignica tal que amerita una nueva clasificacin de las especies de este gnero (26).

Mobiluncus como agente infeccioso: En la dcada de 1980 Mobiluncus pas a ser el candidato etiolgico ms importante relacionado con las VB. Se le incrimin con un 50 a 70% de los casos, en cuyo diagnstico se incluy la presencia de clulas gua, en este caso recubiertas por bacterias curvas (27), como se muestra en la figura 1. Su potencial patognico se refleja en la causalidad de abscesos umbilicales, en mamas (28-29), en cuero cabelludo de neonatos, en heridas quirrgicas, en membranas corioalantoideas y en septicemias (30-31), adems, se asocia con ruptura de membranas, parto prematuro y prematuridad (4). El hallazgo de una toxina citotxica, capaz de desprender monocapas celulares o inducir la prdida de cilios en clulas cultivadas de oviducto (32 Taylor-Robinson) representa un mecanismo de virulencia importante para esta bacteria. Aunque la excrecin de esta toxina parece ser leve, su efecto parece potenciarse por el hecho de que la bacteria coloniza el epitelio adhirindose a l posiblemente mediante su flagelo.

Aislamiento e identificacin de mobilunicus:

El cultivo de esta bacteria se hace en agar sangre o en medios selectivos con antibiticos (2223), tambin se ha descrito que el enriquecimiento en fro por 2 a 4 horas favorece su aislamiento (33). La muestra recomendada es el lquido obtenido del lavado vaginal realizado con solucin salina estril. En nuestra experiencia no hay diferencia significativa entre su aislamiento a partir del lavado o de un frotis vaginal; en ambos casos la muestra se inocula en platos de agar sangre tratando de realizar un rayado adecuado para aislar colonias, las placas se incuban en jarras tipo GasPak con sobre generador de anaerobiosis y con catalizador, por lo menos durante 10 das a 35C. Al cabo de ese tiempo se examinan las placas en busca de colonias de menos de 1 mm de dimetro, translcidas e incoloras, compuestas por bacilos curvos Gram negativos; para esta tincin de Gram se sustituye la contratincin de safranina por fucsina bsica (34). Sin embargo, hay una infinidad de otros agentes, tanto cocoides como bacilares rectos, con morfologa colonial similar a la descrita ; adems, el tamao de esas colonias es igual o menor que el dimetro de la aguja bacteriolgica, por lo cual prcticamente toda la colonia se pierde en la tincin, eso significa que una vez identificada es difcil recuperarla nuevamente del plato para un subcultivo. Ante esa situacin en nuestro laboratorio recurrimos a rayar cada colonia por estra en un nuevo plato de agar sangre e incubarla nuevamente por 10 das en anaerobiosis, de manera que la tincin de Gram la hacemos de esa segunda incubacin, de la cual fcilmente se recupera la bacteria para un subcultivo (35). En la figura 2 se muestra un cultivo puro de M. mulieris. A partir de esas colonias es factible hacer una tincin de flagelos siguiendo el mtodo descrito por Kodaka (36), para corroborar la morfologa y el tipo de flagelos (Fig. 3). Obviamente el cultivo no es la forma ms prctica para diagnosticar Mobiluncus, pues la obtencin de la bacteria en cultivo puro puede llevar hasta ms de un mes (35). Se ha empleado tambin inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales o cromatografa de las secreciones tratando de identificar los productos metablicos de la bacteria (37). Sin embargo, la identificacin de bacterias curvas Gram negativas en la tincin de Gram realizada a un frotis vaginal es prueba suficiente para su identificacin, pues en la flora vaginal no se ha descrito ningn otro agente bacteriano con esta morfologa (37-42). En la figura 4 se muestra un frotis vaginal en el que predomina el morfotipo de Mobiluncus.

Conclusin La etiologa de las VB o bien de las otrora denominadas vaginitis inespecficas ha variado conforme se han identificado nuevos agentes infecciosos involucrados con este tipo de patologa. Sin embargo, el concepto ms nuevo en este sentido es que la VB no es un cuadro debido a un determinado agente infeccioso, sino que por el contrario obedece a una multicausalidad simultnea, debido a un desequilibrio en la flora normal de la vagina (3-4). El enfoque de la causalidad de las VB debe ser de tipo ecolgico; una alteracin del ecosistema vaginal puede llevar a la desaparicin de los lactobacilos acidfilos y con ello a un cambio en el pH vaginal. En consecuencia, otras bacterias, que bien pueden ser parte de una flora propia de este nicho, pero que usualmente estn en baja proporcin, como es el caso de G. vaginalis, pueden multiplicarse y tornarse en flora preponderante (43). Tambin otros agentes pueden llegar de otros sitios, por ejemplo por contaminacin fecal, como podra ser el caso de muchos anaerobios e incluso de enterobacterias (44). En todo caso, las VB se caracterizan por la presencia de una flora variada e independientemente del agente o agentes involucrados, debe prestrsele atencin a esta condicin, pues si bien la sintomatologa suele ser leve, los efectos secundarios en el parto y su producto son importantes (45-47).

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Figura 1. Micrografa de contraste de fases de una clula gua una paciente con vaginosis bacteriana. Se observa los bacilos curvos, especialmente en el borde izquierdo de la clula. Figura 2. Micrografa de una placa de agar sangre con un cultivo de Mobiluncus mulieris de 10 das de incubacin en anaerobiosis. Figura 3. Micrografa de luz, de una tincin de flagelos(tincin de Kodaka, referencia 36) de Mobiluncus muliers, se observan bacilos curvos, algunos prcticamente en forma de " media luna". La punta de flecha muestra la insercin de los flagelos. Figura 4. Micrografa de luz de un frotis vaginal de una paciente con vaginosis bacteriana, tincin de Gram. Las flechas sealan grupos de bacterias, Gram negativas.