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ENCAPSULACIN DE EMBRIONES SOMTICOS DE Laelia anceps ssp. dawsonii PARA LA PRODUCCIN DE SEMILLA SINTTICA
H. E. Lee-Espinosa1; J. Murgua-Gonzlez1; A. Laguna-Cerda2; B. Garca-Rosas1; M. R. Gmez-Pastrana1; M. E. Galindo-Tovar1; I. Landero-Trres1; L. Iglesias-Andreu3; N. Santana-Buzzy4
Universidad Veracruzana. Facultad de Ciencias Biolgicas-Agropecuarias, Laboratorio de Micropropagacin Vegetal. Carretera Peuela-Amatln, km 1, Peuela, municipio de Amatln de los Reyes, Veracruz. MXICO. Tel-Fax: (271)71-66410 y 66129. Correo-e: hlee@uv.mx ( Autor responsable). 2 Universidad Autnoma del Estado de Mxico, Programa de Maestra y Doctorado en Ciencias Agropecuarias y Recursos Naturales, Centro Universitario El Cerrillo, km 15 Carretera Toluca-Ixtlahuaca. MXICO. 3 Laboraborio de Biotecnologa y Ecologa Aplicada (LABIOTECA), Universidad Veracruzana. Campus para la cultura, las Artes y el Deporte, Xalapa, Veracruz,C. P. 91001, MXICO. 4 Unidad de Bioqumica y Biologa Molecular de Plantas, Centro de Investigacin Cientfica de Yucatn, Calle 43 Nm. 130, Chuburn de Hidalgo. Mrida, Yucatn, C. P. 97200, MXICO.
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RESUMEN
Los embriones somticos de Laelia anceps ssp. dawsonii, obtenidos a partir de semillas germinadas en un medio MS suplementado con cido naftalen-actico (ANA), 6, bencilaminopurina (BAP) y cido indol-3-actico (AIA), 2 mglitro -1 de cada uno fueron encapsulados en matriz de alginato de sodio en complejo con cloruro de calcio (CaCl22H2O) 75 mM, para producir semillas sintticas, como una estrategia de rescate y conservacin. Para determinar el efecto de factores fsicos y qumicos tales como temperatura y tiempo de almacenamiento, consistencia de la matriz de alginato, concentracin de nutrimentos minerales y reguladores del crecimiento vegetal, sobre el porcentaje y tiempo de germinacin, as como viabilidad de las semillas sintticas, se probaron concentraciones de alginato de sodio al 2.0, 3.0 y 4.0 %, de sales de MS (37.5, 50 y 100 %) y BAP (0.5, 1.0 y 2.0 mglitro-1) adicionados a la matriz de encapsulacin, adems de diferentes temperaturas (4, 20 y 25 C) y tiempos de almacenamiento (15 y 30 das). Se observ el 100 % de germinacin cuando las semillas fueron encapsuladas con 3 % de alginato de sodio en complejo con CaCl22H2O a 75 mM; con las sales MS al 100 y 50 % en la matriz de encapsulacin, suplementando 2.0 mglitro-1 de BAP, se logr un porcentaje de germinacin del 64.54 y 62.77 %, respectivamente, sin existir diferencia significativa entre ellas. PALABRAS CLAVE ADICIONALES: Orchidaceae, semilla artificial, embriognesis somtica.

SOMATIC EMBRYOIDS ENCAPSULATION OF Laelia anceps ssp. dawsonii TO PRODUCE SYNTHETIC SEED ABSTRACT
Somatic embryoids obtained from germinated seeds in an MS culture media supplemented with naphthalene acetic acid (NAA), 6, bencylaminopurine (BAP) and indole-3-acetic acid (IAA), 2 mgliter-1 each, were encapsulated in sodium alginate in complex with calcium chloride (CaCl22H2O) 75 mM matrix, to produce synthetic seeds, as a rescue and conservation strategy. In order to determinate the effect of physical and chemical factors, such as stored temperature and time, sodium alginate consistency, and mineral nutriments an plant growth regulators concentration on percentage and time for germination, and the viability of the synthetic seeds, different concentrations of: sodium alginate (2.0, 3.0 and 4.0 %), MS salts (37.5, 50 and 100 %) and BAP (0.5, 1.0 and 2.0 mgliter-1) added to the encapsulation matrix, were tested at different temperatures (4, 20 and 25 C) and incubation times (15 and 30 days). A hundred percent germination of synthetic seeds was obtained when 3 % sodium alginate in complex with CaCl22H2O at 75 mM was used; MS salts at 100 and 50 % and 2.0 mgliter-1 BAP supplemented to the encapsulation matrix, achieved 64.54 y 62.77 % germination rate, respectively. No meaningful difference was observed between concentrations. ADDITIONAL KEY WORDS: Orchidaceae, artificial seed, somatic embryogenesis.
Recibido: 29 de abri, 2009 Aceptado: 17 de septiembre, 2009 Revista Chapingo Serie Horticultura 15(2): 33-40, 2009.

34 INTRODUCCIN La propagacin vegetal utilizando semilla sinttica o artificial, desarrollada con embriones somticos o cigticos, abre una nueva visin en la agricultura. La semilla sinttica constituye una tcnica promisoria, pudindose aplicar a la propagacin de plantas que no producen semillas, o poliploides con caractersticas lite y lneas vegetales con problemas de propagacin (Redenbaugh, 1993). La tecnologa de semilla sinttica puede tener un impacto significativo en la produccin de cultivos, tanto en los de propagacin vegetativa como en los que se propagan por semilla. Para la propagacin vegetativa de plantas, la semilla sinttica permitira la siembra directa de variedades clonadas y puede proveer un medio para el mantenimiento de germoplasma lite. De esta manera, la semilla sinttica puede convertirse en una tecnologa que posibilite el escalamiento extensivo requerido para la produccin comercial de clones lite (Bornmann, 1993). La produccin de semillas sintticas por encapsulacin de embriones somticos y propgulos vegetativos est convirtindose rpidamente en una tcnica aplicada con potencial para la propagacin masiva de especies vegetales lite. Las ventajas del uso de la semilla artificial, incluyen la facilidad de manipulacin, transportacin y almacenamiento, potencial para el escalamiento y bajos costos de produccin y subsecuente propagacin (Ganapathi, 2001). En muchos sentidos el protocolo para la produccin de semilla sinttica imita el desarrollo cigtico, la produccin de semilla, y la siembra en campo, lo cual no es sorprendente, ya que el objetivo de la tecnologa de semilla sinttica es producir anlogos de semillas naturales (Redenbaugh, 1993). Las atractivas caractersticas de la orqudea silvestre Laelia anceps ssp. dawsonii, han despertado gran inters, provocando su sobre colecta para venderla como planta para maceta, as como sus flores cortadas, por lo que actualmente se encuentra en peligro de extincin (Halbinger, 1993) y se incluye en la Norma Oficial Mexicana NOM059-ECOL-2001. Aunado a esta situacin, se encuentra su baja tasa de propagacin, ya que al igual que en las dems orqudeas, sus semillas carentes de endospermo poseen baja capacidad de germinacin (1-5 %), relacionada con la obligatoria asociacin micorrzica (Martin y Pradeep, 2003). El desarrollo de metodologas que permitan la propagacin eficiente de esta especie, representa una alternativa viable para su conservacin y uso sustentable, as como una estrategia para evitar la colecta de ejemplares en la naturaleza. Debido a que los embriones somticos (ESs) todava no son tan robustos y vigorosos como los embriones cigticos, ha sido imposible de manera rutinaria producir grandes cantidades de semillas sintticas que pueden plantarse como semillas verdaderas con su caracterstico desarrollo en el invernadero y campo; a la fecha se han desarrollado muchos de los ms recientes conceptos para esta tecnologa, por lo que cientficos de todo el mundo han trabajado para el mejor entendimiento de la embriognesis somtica, la cual ha sido y sigue siendo la principal limitacin para la comercializacin de semilla sinttica (Redenbaugh, 1993).
Encapsulacin de embriones...

Hasta este momento, el sistema de semilla sinttica ms avanzado es el de alfalfa (Medicago sativa L.), debido principalmente a que es en esta especie, entre otras muy pocas, que se ha alcanzado calidad de los embriones, hasta el punto donde se acompaa de la plantacin directa en campo. Se han logrado avances en embriognesis somtica para varias especies en los ltimos diez aos, sin embargo, no se han desarrollado nuevas cubiertas para semilla sinttica desde inicios del decenio de 1980 cuando por primera vez fueron utilizados el polioxietileno y el alginato de sodio (Redenbaugh, 1993). El uso de la tecnologa de semilla artificial para el rescate y la conservacin de Laelia anceps ssp. dawsonii, an no ha sido desarrollado, sin embargo, se cuenta con el protocolo para su propagacin por la ruta de la embriognesis somtica (Lee et al., 2007) que permite su propagacin masiva y la obtencin de material ideal para la encapsulacin, por lo que en el presente estudio, se analizarn los factores que influyen en el mantenimiento de la viabilidad durante el almacenamiento, as como la germinacin de embriones somticos encapsulados en esta especie, para la creacin de semilla sinttica, como un sistema de rescate y conservacin.

MATERIALES Y MTODOS La presente investigacin consisti en la encapsulacin de embriones somticos de Laelia anceps ssp. dawsonii, en estado de plmula, en matriz de alginato en complejo con cloruro de calcio, y posteriormente el estudio del efecto que tiene ciertos factores fsicos y qumicos, como temperatura y tiempo de almacenamiento, concentracin de alginato, concentracin de sales MS y BAP, sobre el porcentaje y tiempo de germinacin de los embriones encapsulados, a fin de desarrollar un sistema de produccin de semilla sinttica para esta especie. Los experimentos se llevaron a cabo en el laboratorio de Micropropagacin Vegetal de la Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias, de Crdoba, Ver., Universidad Veracruzana, ubicada a 817 metros de altitud, 212122LN y 974108LW. Encapsulacin de los embriones somticos Fuente de embriones somticos para encapsulacin. Los embriones somticos de Laelia anceps ssp. dawsonii , se obtuvieron de callo embriognico desarrollado en embriones cigticos maduros, en un medio de cultivo MS (1962) suplementado con 2 mglitro-1 de ANA, BAP y AIA, de cada uno, en un perodo de aproximadamente tres meses a partir de la siembra in vitro. Estos embriones somticos se utilizaron como explantes para la encapsulacin y produccin de semilla sinttica. Con la finalidad de obtener resultados confiables, se seleccionaron aqullos que se encontraban cercanos al estado de plmula (Figura 1), carentes de raz, los cuales se cosecharon a los 40 das de su desarrollo in vitro.

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FIGURA 1. Embrin somtico de Laelia anceps ssp. dawsonii, en estadio de plmula, encapsulado en matriz de alginato de sodio en complejo con cloruro de calcio.

Preparacin de la matriz de encapsulacin. Para la encapsulacin de los embriones somticos se utiliz una matriz que contena alginato de sodio (Compaa Qumica Sigma, St. Louis, MO) en complejo con cloruro de calcio di hidratado (CaCl 2 2H 2 O). Las dos soluciones fueron preparadas como se describe a continuacin: 1) Alginato de sodio en concentraciones de 2, 3 y 4 % disuelto en solucin de sales MS al 100, 50 y 37.5 % sin cloruro de calcio (CaCl 2H O).
2 2

FIGURA 2. Seleccin y encapsulacin de embriones somticos para la creacin de semilla sinttica: A) embriones somticos desarrollados en medio de cultivo MS suplementado con ANA, BAP, AIA (2 mglitro-1 c/u); B) embrin somtico en estadio de plmula; C) embriones somticos encapsulados suspendidos en la solucin de cloruro de calcio; D) cajas de petri con semillas sintticas de Laelia anceps ssp. dawsonii .

2) CaCl 2H O a una concentracin de 75 mM disuelto 2 2 en solucin de sales MS al 100, 50 y 37.5 % adicionadas con la concentracin normal de cloruro de calcio di hidratado. Proceso de encapsulacin. Los embriones somticos fueron colectados (Figura 2 A, B) de las cajas de petri (100 x 15 mm) y en condiciones aspticas, se suspendieron en la solucin de alginato de sodio, y con micro pipeta de 5.0 500 l, se tomaron y suspendieron en la solucin de cloruro de calcio (Figura 2 C), contenida en un matraz erlenmeyer de 500 ml, gotendolos de manera individual. Una vez suspendidos, se coloc el matraz erlenmeyer en un agitador rotatorio, a 150 rpm durante 30 min para ayudar a dar forma esfrica al cotiledn de la semilla sinttica. Para la recuperacin de las semillas se decant el cloruro de calcio y se efectuaron dos lavados con agua destilada esterilizada. Las semillas sintticas se almacenaron en cajas de petri previamente esterilizadas (Figura 2 D) y se sellaron, mantenindolas en refrigeracin a 3.0 1 C. Condiciones de incubacin. Los experimentos para la determinacin de viabilidad, desarrollo, porcentaje y

tiempo de germinacin, se llevaron a cabo utilizando cajas de petri (100 x 15 mm) previamente preparadas con papel filtro Nm. 541, humedecido con agua destilada esterilizada al momento del establecimiento de las semillas, preparadas de acuerdo a los diferentes experimentos establecidos; una vez que las semillas fueron sembradas, las cajas de petri se sellaron y colocaron en cuarto de incubacin a fotoperiodo de 16 h y flujo fotnico de 33.78 mm-2s-1 en las diferentes temperaturas probadas para cada uno de los experimentos. Efecto de la concentracin de alginato de sodio y BAP sobre el desarrollo y germinacin de embriones somticos encapsulados de Laelia anceps ssp. dawsonii Para determinar la consistencia adecuada de la matriz de encapsulacin de las estructuras somticas, que permitiera su germinacin y desarrollo para facilitar el transporte y distribucin de las mismas, se probaron concentraciones de alginato de sodio al 2, 3 y 4 % en combinacin con BAP a 0.5, 1.0 y 2.0 mglitro-1, en un diseo completamente al azar con arreglo factorial y 15 repeticiones por tratamiento, considerando como unidad experimental a cada embrin somtico encapsulado. Se utiliz el medio de cultivo MS suplementado con 5 mllitro-1 de solucin de vitaminas MS, 100 mglitro-1 de myo-inositol y 1.0 mglitro-1 de ANA. Se utilizaron embriones somticos en la fase de plmula no desarrollada, los cuales una vez encapsulados con el tratamiento correspondiente fueron colocados en cajas de petri de 100 x 15 mm conteniendo papel filtro Nm. 541, humedecido con agua destilada esterilizada. Se evalu el
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36 porcentaje de germinacin y el tiempo en das requerido para la iniciacin de la primera hoja y la primera raz, en 15 semillas sintticas por tratamiento, efectuando el registro del incremento en masa embrionaria con ayuda de un microscopio estereoscpico Motic modelo: SMZ-143. Tambin se registraron los cambios de coloracin durante el desarrollo y germinacin de los embriones somticos. Efecto de la concentracin de sales minerales, temperatura y tiempo de almacenamiento sobre el desarrollo y germinacin de embriones somticos encapsulados de Laelia anceps ssp. dawsonii Para determinar la concentracin de nutrimentos minerales, el tiempo y la temperatura de almacenamiento ptimos para la conservacin y eventual viabilidad de las estructuras encapsuladas, se estableci un experimento completamente al azar, arreglo factorial 3 x 3 x 2 y tres repeticiones consistentes cada una en cuarenta y cinco semillas sintticas, donde se probaron tres concentraciones de las sales inorgnicas de Murashige y Skoog: 100, 50 y 37.5 %, tres temperaturas de incubacin: 4, 20 y 25 C y dos tiempos de almacenamiento: 15 y 30 das, sobre el desarrollo y la viabilidad de los embriones somticos de Laelia anceps ssp. dawsonii. Para realizar las evaluaciones, se observ el proceso de germinacin en las semillas sintticas, a los 15 y 30 das de su desarrollo in vitro bajo las condiciones particulares de cada uno de los tratamientos probados, con ayuda de microscopio estereoscpico Motic modelo SMZ143, realizando el registro fotogrfico correspondiente, y considerando para el recuento, la aparicin del primer primordio foliar en cada semilla sinttica. Condiciones de cultivo El experimento se llev a cabo en todos los casos bajo condiciones de fotoperiodo de 16 h y flujo fotnico de 33.78 mm-2s-1. Para la matriz de encapsulacin se utiliz alginato de sodio al 3 % (P/V), previamente determinado como concentracin ptima, disuelto en el medio lquido de MS a las concentraciones probadas, y suplementado con 1 mglitro-1 de BAP y 1 mglitro-1 de ANA, que prob ser la mejor combinacin de reguladores de crecimiento para la germinacin de las semillas sintticas, en el experimento anterior. Anlisis estadstico de los datos Los datos fueron procesados mediante un anlisis de varianza, utilizando el paquete estadstico SAS System, 1989-1997, Versin 6.12, SAS Institute INC. Cary, NC, USA, y discriminados con la prueba de comparacin de medias de Tukey P0.05 (Steel y Torrie, 1980). RESULTADOS Efecto de la concentracin de alginato de sodio y BAP
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sobre el desarrollo y germinacin de embriones somticos encapsulados de Laelia anceps ssp. dawsonii. Se encontr una relacin directa entre la concentracin de BAP y el porcentaje de germinacin; y una relacin inversa entre la concentracin de alginato y el porcentaje de germinacin. En el primer caso, a medida que aument la concentracin de alginato de sodio a 4 %, disminuy el porcentaje de germinacin a 30 % (Figura 3). Conforme la concentracin de BAP aumentaba, se observ un incremento en el porcentaje de germinacin, independientemente de la concentracin de alginato (Figura 4); se encontr diferencia significativa entre 0.5 mglitro-1 de BAP, con un 66.6 %, de germinacin, y las concentraciones de 1.0 y 2.0 mglitro-1, con el 76.6 y 80 % de germinacin, respectivamente, aunque entre stas no hubo diferencia significativa. El anlisis de la interaccin entre los factores, permiti constatar, que 2.0 mglitro-1 de BAP, estimularon un 100 % de germinacin de las semillas, cuando la concentracin de alginato era del 2 y 3 %, disminuyendo a 97 %, al bajar la concentracin de BAP a 1.0 mglitro-1, cuando se utiliz el 2 % de alginato de sodio, sin embargo, esta diferencia no fue estadsticamente significativa (5.644, 18,0.004).

120 100

ES=0.73

% Germinacin

80 60 40 20 0 2 3 4

Concentracin de alginato de sodio (%)

FIGURA 3. Efecto de concentraciones de alginato de sodio sobre el porcentaje de germinacin en semillas sintticas de Laelia anceps ssp. dawsonii. Medias con diferente letra son diferentes (P0.05 %). E.S. = Error estndar.
100 90 80
ES=0.73*

a b

% Germinacin

70 60 50 40 30 20 10 0

0.5

Concentracin BAP

(mg.L-1)

FIGURA 4. Efecto de concentraciones de BAP sobre el porcentaje de germinacin en semillas sintticas de Laelia anceps ssp. dawsonii. Medias con diferente letra son estadsticamente diferentes (P 0.05 %). E.S. = Error estndar.

37 Una concentracin del 3 % de alginato de sodio en la matriz de encapsulacin, indujo igualmente, el 100 % de germinacin de las semillas sintticas, cuando se utilizaban 1.0 y 2.0 mglitro-1 de BAP. Cuando se utiliz el alginato de sodio al 2 %, nicamente se lograba el 100% de germinacin con 2.0 mglitro-1 de BAP, disminuyendo al 97 % cuando la concentracin de BAP descenda a 1.0 mglitro-1, sin apreciarse diferencias significativas entre estos cuatro tratamientos; sin embargo, a la concentracin de alginato de 4 %, independientemente de la concentracin de BAP, el porcentaje de germinacin descendi a un 30, 31 y 41.6 % con 0.5, 1.0 y 2.0 mglitro-1 de BAP, respectivamente (Figura 5). El alginato fue el factor que tuvo mayor influencia sobre el porcentaje de germinacin, existiendo diferencias significativas entre estos tres ltimos tratamientos y todos los tratamientos que contenan 2 y 3 % de alginato de sodio en la matriz de encapsulacin (7532, 18,0.001). De igual forma, en relacin al tiempo requerido para la germinacin se detect una interaccin entre las concentraciones de alginato de sodio con la concentracin de BAP utilizada en la matriz de encapsulacin; as, se observ que a mayor dureza de la cpsula (% alginato de sodio), aument el tiempo de germinacin a 57 das en combinacin con 0.5 mglitro-1 de BAP y hasta 54 das con 2.0 mglitro-1 de BAP. En contraste, cuando se utiliz un 2 % de alginato de sodio, en combinacin con 1.0 y 2.0 mglitro-1 de BAP en la matriz de encapsulacin, el tiempo de germinacin fue de 14 y 12 das, respectivamente (2.254,18,0.104). La concentracin de alginato de sodio utilizada al 3 % indujo la germinacin de las semillas sintticas en 25, 31 y 37 das, cuando se utilizaron concentraciones de BAP de 2.0, 1.0 y 0.5 mglitro-1, respectivamente (Cuadro 1). Influencia de la concentracin de sales minerales, temperatura y tiempo de almacenamiento sobre el desarrollo y germinacin de embriones somticos encapsulados de Laelia anceps ssp. dawsonii. Se observ interaccin entre el porcentaje de germinaCUADRO 1. Efecto de concentraciones de Alginato de sodio y BAP sobre el tiempo de germinacin de Laelia anceps ssp. dawsonii. Alginato de sodio (%) 2 2 2 3 3 3 4 4 4
Z

Concentracin BAP (mglitro-1) 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0 0.5 1.0 2.0

Tiempo de germinacin (das) 14 b 14 a 12 a 37 b 31 a 25 a >57 d 56 d 54 c D.M.S. 4.489

Valores con la misma letra dentro de factor en cada columna son iguales a una P0.05 de acuerdo con la prueba de Tukey de comparacin de medias. DMS: diferencia mnima significativa.

cin y la temperatura y tiempo de almacenamiento; el 100 % de las semillas germinaron a 25 C, que fue la temperatura ms alta, a los 11 das de incubacin, con las sales MS al 100 % de concentracin, lo cual demuestra que las mayores concentraciones de stas, produjeron mayores porcentajes de germinacin, disminuyendo a medida que la concentracin de sales era menor, a excepcin del tratamiento con 37.5 % de sales MS y 4 C, en que se observ una diferencia en el tiempo de germinacin, que fue desde 9 y 10 das con las sales MS al 100 %, hasta 28 y 25 das con las sales al 37.5 % en perodos de almacenamiento de 15 y 30 das, respectivamente (Cuadro 2). Los resultados indican que las concentraciones de 100 y 50 % de las sales MS, estimularon los mayores porcentajes de germinacin de 64.54 y 62.77 %, respectivamente, sin existir diferencia significativa entre ellas; sin embargo, en la Figura 6 se puede apreciar que cuando la concentracin de sales MS disminuy al 37.5 %, el porcentaje de germinacin tambin disminuy hasta el 51.55 %, existiendo diferencia significativa respecto a las mayores concentraciones de 100 y 50 % (0.136, 36,0.992)). Una tendencia similar a la anterior se observ con las diferentes temperaturas de incubacin, es decir, a mayor temperatura se eleva el porcentaje de germinacin; en la Figura 7 se puede apreciar que la mayor temperatura (25 C), tuvo 85.8 % de germinacin en las semillas sintticas; a medida que la temperatura disminuy hasta 4 C, se observ un descen-so en el porcentaje de germinacin a 18.5 %; con una temperatura de 20 C, se registr un 74.3 % de germinacin. La temperatura de incubacin fue el factor determinante sobre el porcentaje de germinacin de las semillas sintticas, con una casi imperceptible diferencia en su desarrollo, en funcin del tiempo de almacenamiento. Los embriones somticos encapsulados mostraron una apariencia translcida y poco vigor cuando se almacenaron a 4 C aunque en este caso las sales MS al 37.5 % de su
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a b

a b

ES=0.718*

cd

FIGURA 5. Efecto de concentraciones de alginato de sodio (2, 3 y 4 %) y 6-bencilaminopurina (BAP: 0.5, 1.0 y 2.0 mglitro -1 ) sobre el porcentaje de germinacin de semillas sinttica de Laelia anceps ssp. dawsonii. Medias con letras diferentes son estadsticamente diferentes (P 0.05). E.S. = Error estndar.

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CUADRO 2. Efecto de la temperatura de almacenamiento, duracin del almacenamiento y concentracin de sales MS sobre la germinacin (%) y tiempo para la observacin de primera hoja de Laelia anceps ssp. dawsonii. Germinacin (%) a diferentes temperaturas de almacenamiento Concentracin Sales MS 100 100 50 50 37.5 37.5 Duracin del almacenamiento (d) 15 30 15 30 15 30 4 C 10 d 9 21 18 d 28 25 d 20 C 89 ab 84 83 ab 84 59 c 53 25 C 100 a 100 95 ab 89 75 bc 69 25 15 Iniciacin Tiempo (d) la hoja 25 C 11

Z Valores con la misma letra dentro de factor en cada columna son iguales de acuerdo con la prueba de Tukey a una P0.05. DMS: diferencia mnima significativa.

90 80 70 % Germinacin 60 50 40 30 20 10 0 100 50 37.5

a b

de las primeras hojas a los 15 das de cultivo y su desarrollo posterior a los 30 das (Figura 8) lo que permite definir posteriormente el criterio a seguir en cuanto a la temperatura que debe utilizarse para desarrollar sistemas de conservacin. Germinacin de semillas sintticas de Laelia anceps ssp. dawsonii Los embriones encapsulados continuaron su desarrollo con la conversin a plntula, y una vez desarrolladas las primeras hojas, se transfirieron a un sustrato, compuesto por peat moss y agrolita en proporcin 1:1 y desinfectado con vapor de agua durante 15 minutos, contenido en cajas de petri de 150 x 15 mm, que previamente fueron esterilizadas, y bajo condiciones aspticas, continuaron su desarrollo hasta plantas completas, observndose la aparicin de la primera raz eficiente, a los diez das a partir del trasplante (Figura 9 A).

Concentracin de sales MS
FIGURA 6. Efecto de concentraciones de sales MS (37.5, 50 y 100 %) sobre el porcentaje de germinacin de semillas sintticas de Laelia anceps ssp. dawsonii. Medias con letras diferentes son estadsticamente diferentes (P 0.05). E.S. = Error estndar.
120 100 a b

% Germinacin

80 60 40 20 0 25 20

D
4

Temperatura de almacenamiento (C)


FIGURA 7. Efecto de la temperatura de incubacin (T1= 25, T2=20 y T 3=4 C) sobre el porcentaje de germinacin de semillas sintticas de Laelia anceps ssp. dawsonii. Medias con letras diferentes son estadsticamente diferentes (P 0.05). E.S. = Error estndar.

concentracin tuvieron un mejor efecto sobre el desarrollo de los embriones encapsulados. Se puede apreciar el desarrollo de semillas sintticas cuando fueron incubadas a 20 C durante 15 y 30 das, donde se observa la proyeccin
Encapsulacin de embriones...

FIGURA 8. Germinacin de los embriones somticos encapsulados a los 30 das de almacenamiento: A) 4C y sales MS a 37.5 %; B) 4C y sales MS a 50 %; C) 4 C y sales MS a 100 %; D) 20 C y sales MS a 37.5 %; E) incubados a 20 C y 50 % sales MS; F) 20 C y sales MS a 100 %; G) 25C y sales MS a 37.5 %; H) 25 C y sales Ms a 50%; I) 25C y sales MS a 100%.

39 y rpida gelificacin, esta ltima muy importante cuando se utiliza el mtodo de endurecimiento por goteo. Patel (2000), evalu el mtodo de encapsulacin en camas huecas, donde el material vegetal, consistente en embriones somticos de Daucus carota es suspendido en una solucin de carboximetilcelulosa y cloruro de calcio dihidratado, y posteriormente se deja caer en una solucin de alginato de sodio en agitacin, la cpsula producida por ste mtodo, contena una cubierta rgida y el centro permaneca en estado lquido, con lo cual lograban la germinacin del 100 % de las semillas dentro de la cubierta, despus de 14 das en cultivo, y solamente el 13 % de las mismas rompi las cpsulas al germinar; comparativamente, la encapsulacin utilizando nicamente alginato de sodio en la matriz de encapsulacin en complejo con cloruro de calcio di hidratado, estimula la germinacin hacia el exterior de la cubierta, acortando los periodos de germinacin al material an poco desarrollado y frgil; el mtodo de camas huecas, resulta ventajoso por brindar una mayor proteccin al material vegetal encapsulado, y ms an, esta tcnica de encapsulacin permiti el desarrollo de callo embriognico y la formacin de embriones somticos a partir del mismo, an dentro de la cubierta, debido a una proteccin que por el mtodo convencional de encapsulacin no se logra, provocando que el callo se separe de la cubierta en fases tempranas de su desarrollo, sin ocurrir la formacin de embriones somticos. M.B.A. Report que la germinacin de semillas sintticas y su conversin a plntulas todava no se compara con la que posee la semilla natural, ya que los principales obstculos parecen ser la ausencia de tejido nutritivo equivalente al endospermo de las semillas naturales y la dificultad para la emergencia de brote y raz a travs de las cpsulas de alginato. Sin embargo, el presente estudio no se encontr esta situacin, en principio debido a que no utilizaron callos embriognicos como material de encapsulacin, adems de lograr una germinacin adecuada de los embriones somticos encapsulados, principalmente en embriones encapsulados con 2 % de alginato de sodio en la matriz de encapsulacin, sin que ocurriera su separacin prematura de la cpsula. Por otra parte, existen estudios (Saiprasad, 2002) acerca del efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la germinacin, en diferentes gneros de orqudea; as, a 4 C los protocormos encapsulados en una matriz de encapsulacin constituida por alginato de sodio al 3 % en complejo con 75 mM de cloruro de calcio dihidratado, y suplementada con 0.1 mglitro-1 de BAP, lograron el 100 % de germinacin despus de 60 das de almacenamiento para Dendrobium Sonia, despus de 45 das para Oncidium Grower Ramsay y despus de 15 das para Cattleya leopoldii. En todos los casos, a medida que se incrementaba
Revista Chapingo Serie Horticultura 15(2): 33-40, 2009.

FIGURA 9. Conversin a plntula de las semillas sintticas de Laelia anceps ssp. dawsonii: A) germinacin de las semillas sintticas a los 10 das de su transferencia a sustrato desinfectado (peat-moss: agrolita, 1:1) bajo condiciones aspticas; B) plantas de L. anceps ssp. dawsonii , producidas a partir de semillas sintticas, en sustrato desinfectado, bajo condiciones de invernadero, mostrando las primeras hojas eficientes y abundantes races.

Aclimatizacin de plantas de Laelia anceps ssp. dawsonii Las plantas desarrolladas, mostrando hojas y races eficientes, fueron transferidas al mismo sustrato utilizado durante la germinacin de las semillas sintticas, contenido en macetas de 12.5 cm de dimetro, y bajo condiciones de invernadero, a una temperatura de 30 C con humedad relativa de ~90 %, fueron aclimatizadas durante seis semanas ( 4 cm de altura), periodo en que se observ la aparicin de la primera hoja eficiente; en este momento se efectu su transferencia a condiciones de vivero, aplicando riegos manuales durante su posterior desarrollo (Figura 9 B).

DISCUSIN Se encontr que el material de encapsulacin y su consistencia influyen sobre el tiempo de germinacin y la conservacin de las semillas sintticas, como lo indican Barbotin et al., 1993, quienes han demostrado que la dureza de la cpsula puede variar con la concentracin de alginato y la concentracin de la solucin de cloruro de calcio, influyendo de manera importante sobre la germinacin. As, cuando la consistencia de la cpsula es blanda, se facilita la germinacin temprana de las semillas sintticas en condiciones de vivero comercial, sin embargo, cuando se eleva la concentracin de alginato, se pueden disear sistemas eficientes de conservacin a mediano plazo, para mantener los embriones somticos viables durante periodos considerables, pues de acuerdo a nuestros resultados, cuando el porcentaje de alginato de sodio se eleva al 4 %, tambin aumenta el tiempo de germinacin. Onishi et al., 1994, sugirieron la utilizacin de alginato de sodio como material de encapsulacin, trabajando con embriones somticos encapsulados de apio y zanahoria. Ellos encontraron que el alginato de sodio es un hidrogel seleccionado como componente de la matriz de encapsulacin de semillas sintticas, debido a sus caractersticas, como viscosidad moderada, baja toxicidad

40 la duracin del almacenamiento, los porcentajes de germinacin descendan considerablemente. Un efecto similar se observ en este estudio, con la misma temperatura de incubacin, es decir, a 4 C, se logr retrasar la germinacin de las semillas sintticas hasta 57 das, nicamente aumentando la concentracin de alginato de sodio al 4 % y disminuyendo la concentracin de BAP a 0.5 mglitro-1; aunque el porcentaje de germinacin, en este ltimo caso, fue del 30 %, se logr elevar hasta 41 % aumentando la concentracin de BAP a 2.0 mglitro-1 en la matriz de encapsulacin, y adicionalmente, fue notorio el efecto de la menor concentracin de sales MS (37.5 %) en la matriz de encapsulacin, la cual mejor el porcentaje de germinacin, respecto a la concentracin media (50 %) de sales MS, a la temperatura de 4 C. Al parecer, el efecto de la temperatura y el periodo de almacenamiento dependen de la especie en estudio, de acuerdo a Bapat y Rao (1988), quienes germinaron unos cuantos embriones encapsulados de Santalum album almacenados durante 45 das a 4 C en el medio MS, y embriones de Medicago sativa, madurados en acido abscsico y almacenados a esta misma temperatura durante dos meses, sin detectar prdida de viabilidad, lo cual coincide con los reportes de Barbotin (1993), quien afirma que la germinacin rpida de las semillas sintticas, depende en particular de la fisiologa de los embriones y clulas inmovilizados. CONCLUSIONES Se logr determinar la influencia de los factores que afectan el desarrollo y germinacin de embriones somticos para la produccin de semilla sinttica de Laelia anceps ssp. dawsonii, encontrando que mediante la variacin en las concentraciones de alginato de sodio en complejo con cloruro de calcio, es posible la conservacin de germoplasma. La concentracin de 4 % de alginato de sodio en la matriz de encapsulacin en combinacin con 0.5 mglitro-1 de BAP, a 37 C de temperatura de almacenamiento, permiti la conservacin de semillas sintticas de L. anceps ssp. dawsonii durante periodos de tiempo de hasta 57 das, manteniendo la viabilidad de las semillas. El alginato de sodio a 2 y 3 % en la matriz de encapsulacin en combinacin con 1.0 y 2.0 mglitro -1 de BAP a temperatura de almacenamiento de 25 C result la combinacin ms apropiada para la induccin de germinacin rpida en las semillas sintticas de L. anceps ssp. dawsonii, en perodos de 15 das. El manejo adecuado de combinaciones de factores fsicos y qumicos, permite la produccin de semillas sintticas de Laelia anceps ssp. dawsonii, en condiciones de laboratorio, probando su germinacin eficiente. Es recomendable realizar experimentos de germinacin en diferentes sustratos, con endospermos adicionados con nutrientes, fungicidas y bactericidas, para demostrar su germinacin en condiciones de invernadero. AGRADECIMIENTOS Los autores desean agradecer al Bilogo Antonio Bustos Melgarejo, por proporcionar las plantas de Laelia anceps ssp. dawsonii utilizadas como fuente de explantes en este estudio, a la Universidad Veracruzana por el soporte financiero para la realizacin del presente trabajo y a la ayuda del PROMEP como patrocinador de la beca para estudios doctorales.

LITERATURACITADA
BAPAT, V. A.; RAO, P. S. 1988. Sandalwood plantlets from synthetic seeds. Plant Cell Reports (7): 434-436. BARBOTIN, J. N; NAVA, S. J. E.; BAZINET, C.; KERSULEC, A.; THOMASSET, B.; THOMAS, D. 1993. Immobilization of whole cells and somatic embryos: coating process and cell-matrix interactions, pp. 65-95. In: Synseeds: Applications of Synthetic Seeds to Crop Improvement. REDENBAUGH, K.; C. R. C. Press (eds.). Boca Ratn, FL. BORNMANN, C. 1993. Maturation of somatic embryos, pp. 105-114. In: Synseeds: Applications of Synthetic Seeds to Crop Improvement. REDENBAUGH, K.; C. R. C. Press (eds.). Boca Ratn, FL. GANAPATHI, T. L. 2001. Regeneration of plants from alginateencapsulated somatic embryos of banana cv. rasthali ( Musa spp. AAB group). In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. (37): 178-181. HALBINGER, F. 1993. Laelias de Mxico. Pp. 71. Asociacin Mexicana de Orquideologa, A.C. (Ed.) Mxico, D.F. LEE, E. H.; LAGUNA, A.; MURGUA, J.; ELORZA, P.; IGLESIAS, L.; GARCA, B.; BARREDO, F. A.; SANTANA, N. 2007. Regeneracin in vitro de Laelia anceps ssp dawsonii. Revista UDO Agrcola 7(1): 58-67. MARTIN, K. P.; PRADEEP, A. K. 2003. Simple strategy for the in vitro conservation of Ipsea malabarica an endemic and endangered orchid of the Western Ghats of Kerala, India. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 74: 197-200. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-059-ECOL-2001.2002. Proteccin ambiental-especies nativas de Mxico de flora y fauna silvestres: Categoras de riesgo y especificaciones para su inclusin, exclusin o cambio: Lista de especies en riesgo. Diario Oficial (6 de marzo 2002), Mxico, D.F. ONISHI, N. Y. 1994. Synthetic seeds as an application of mass production of somatic embryos. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (39): 137-145. PATEL, A. I. W. 2000. A novel encapsulation technique for the production of artificial seeds. Plant Cell Reports (19): 868-874. REDENBAUGH, K. 1993. Synseeds: application of synthetic seeds to crop improvement. Primera ed. CRC Press, Inc. (Ed). Corportate Blvd., Boca Raton, Florida, Estados Unidos de Norteamrica. 129 p. SAIPRASAD, G. Y. 2002. Propagation of three orchid genera using encapsulated protocorm-like bodies. Indian Journal of Plant Physiology, 42-48. SAS SYSTEM. 1989-1997. Version 6.12, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA. STEEL, R. G.; TORRIE, J. H. 1980. Principles and Procedures of Statistics a Biometrical Approach. 2nd Mc Graw Hill (Eds.). New York. 633 p.

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