You are on page 1of 34

1 Test per tube

                Product Catalog No: 25239­00

    ReaPan 34845
         Reagent
                                                                     

      Manufactured by 
                                        

2
ReaPan 34845 Reagent
INTENDED USE

The ReaPan 34845 reagent is a four color immunofluorescence stain for 
the   labeling   and   identification   of   helper/inducer   (CD4+) 
cytotoxic/suppressor   (CD8+)   cells   and   total   T­lymphocytes   (CD3+) 
combined with a precise number of fluorescent counting beads for absolute 
and   percentages   of   CD4+,   CD8+   and   CD3+   T­Cells   and   absolute 
lymphocyte counts. This reagent is intended to be used in a “lyse­no wash” 
protocol   for   flow   cytometry   analysis   of   erythrocyte­lysed   human   whole 
blood. 

SUMMARY AND EXPLANATION

The ReaPan 34845 reagent contains fluorescently labeled antibodies that 
bind   to   CD45,   CD3,   CD4   and   CD8   antigens   found   on   the   surface   of 
circulating leukocytes. 

The CD3 antigen is a complex of at least six proteins known collectively as 
3
the T­cell receptor (TCR) complex. The antibody used in this reagent binds 
to the 20kDa ε  chain of this complex (1).

4
The CD4 antigen is a 59kDa protein. It interacts with class II molecules of 
the  major histocompatibility  complex  and  is  the  primary  receptor  for  the 
Human Immunodeficiency Virus (HIV) (2, 3).

The CD8 antigen is a complex consisting of two disulfide linked subunits. 
The   antibody  used   in   this  reagent   binds  to   the   32kDa   α   subunit   of   the 
complex.   CD8   interacts   with   class   I   major   histocompatibility   complex 
molecules (2,3).

The CD45 antigen is a complex 180­220kDa transmembrane glycoprotein 
which   is   expressed   in   high   levels   on   leukocyte   cell   surfaces   and   its 
presence distinguishes leukocytes from non­haematopoietic cells (1).

Clinical Relevance
Cells   that   are   both   CD3+   and   CD4+   are   identified   as   helper/inducer 
lymphocytes. Decreased CD4+CD3+ T­cell counts have been associated 
with some forms of immunodeficiency (such as HIV). Suppressor/cytotoxic 
lymphocytes are the subset of cells that have both CD3 and CD8 receptors 
(5­7).   Increased   CD8+CD3+   T­cell   counts   have   been   observed   in   some 
5
cases of immunodeficiency (8)

PRINCIPLE OF THE PROCEDURE

The ReaPan 34845 reagent consists of murine monoclonal antibodies that 
specifically  recognize   the   human  leukocyte   surface  antigens  CD3,   CD4, 
CD8 and CD45. Each of the monoclonal antibodies is labeled with a unique 
fluorochrome.   Specific cell subsets are stained when blood is combined 
with the reagent and each monoclonal antibody binds to the binds to the 
cell determinant molecules on the cell surface. Specific cell subsets are 
identified when passed through a flow cytometer laser beam.

The ReaPan 34845 reagent also contains a precise number of fluorescent 
beads. When the reagent is combined with a known volume of blood the 
reagent provides for the single platform determination of the absolute cell 
concentrations of the stained subsets. The volume of sample analyzed can 
be determined by multiplication of the total sample volume by the fraction 
of total beads that were detected during the analysis.

REAGENT
6
The ReaPan 34845 reagent is formulated in buffered saline with sodium 
azide and stabilizer. It contains Allophycocyanin (APC)– labeled anti­CD4 
monoclonal   antibody,   clone   RPA­T4;   R­Phycoerythrin(PE)–   labeled   anti­
CD8   monoclonal   antibody,   clone   LT8;   Atto™488–   labeled   anti­CD3 
monoclonal   antibody,   clone   UCHT1;   and   Peridinin­chlorophyll­protein 
Complex   (PerCP)–   labeled   anti­CD45   monoclonal   antibody,   clone 
HI30.The monoclonal antibodies used in the ReaPan 34845 were assigned 
these specificities at the 8th International Workshop on Human Leukocyte 
Differentiation   Antigens  (9).   A   precise   number   of   fluorescent   counting 
beads are included in the ReaPan 34845 reagent to allow single­platform 
determination   of   absolute   CD4+,   CD8+,   CD3+   T­cell   and   absolute 
lymphocyte counts.  The ReaPan 34845 reagent is provided in dried form 
and dispensed in flow cytometer compatible sample tubes with each tube 
containing   one   ready­to­use   test.  Fifty   (50)   tests   are   supplied   in   each 
ReaPan 34845 reagent package.

Precautions

1. Warning: The ReaPan 34845 reagent contains Sodium azide. 
7
Sodium   azide   is   harmful   if   swallowed  (R22).   Wear   suitable 
protective   clothing  (S36).   If   swallowed,   seek   medical   advice 
immediately (S46). Contact with acids liberates toxic gas (R32). 
Azides should be flushed with large amounts of water during 
disposal to avoid deposits in lead or copper plumbing.
2. Warning:   All   blood   specimens   are   considered   biohazards. 
Handle   them   as   if   they  are   capable   of   transmitting   infection 
and dispose off with proper precautions and accordance with 
governmental regulations.
3. The addition of the precise volume of blood is critical to obtain 
correct results. Use a calibrated pipette and operate according 
to the manufacturer’s instructions.

Storage and Handling 

1. Store the reagent at room temperature in a dry place. Do not 
use the reagent after the expiry date mentioned on the label.
2. Do not freeze or refrigerate the ReaPan 34845 reagent.
3. The ReaPan 34845 reagent is light sensitive. Do not expose to 
direct light either during storage or when mixed with blood.
8
4. Use the zip lock to reseal the reagent pouch after you have 
removed the desired number of tests. Do not use the tubes 
beyond the expiration date indicated on the packaging.

Indication of Instability

The ReaPan 34845 reagent is a dry glassy coating at the bottom of the 
reaction tube.   Do not use if the reagents appears to be moist or it has 
become dislodged from the bottom of the reaction tube.

INSTRUMENT

The   ReaPan   34845   reagent   is   designed   for   use   on   a   flow   cytometer 


equipped   with   appropriate   computer   hardware   and   software.   ReaMetrix 
recommends the BD FACSCalibur™ or Accuri™ flow cytometer; however, 
results can be achieved using other platforms. The flow cytometer must be 
equipped with 488 nm and 635 nm lasers and must be capable of detecting 
light scatter (forward and side) and four­color fluorescence with emission 
detectable in four ranges: 515–545 nm, 562–607 nm, >650 nm, and 652–
668 nm. It must be able to threshold or discriminate using the >650 nm 
9
channel.  Instrument   should   be   calibrated   by   setting   photomultiplier   tube 
voltages,  fluorescence compensation,  and checking instrument  sensitivity 
before use according to the manufacturer’s guidelines.

The user is responsible to optimize the performance of the reagent for use 
in   flow   cytometers   other   than   that   mentioned   above.  For   other   flow 
cytometers,   set   up   the   cytometer   for   four­color   acquisition   following   the 
manufacturer’s recommendations. Setup should include setting or checking 
PMT voltages, fluorescence compensation, and instrument sensitivity.

SPECIMEN COLLECTION

The   blood   sample   should   be   collected   in   a   sterile   blood   collection   tube 


containing K3EDTA. Follow the collection tube manufacturer’s guidelines for 
the minimum volume of blood to be collected.

The   anti­coagulated   blood   must   be   stored   at   room   temperature   (20°C   ­ 


25°C) and should be stained and analyzed within 24 hours of draw.  

Interfering conditions
10
Refrigerated   or   previously   fixed   blood   specimens   can   yield   erroneous 
results and should be rejected. Hemolyzed, aged, or partially clotted blood 
specimens can affect flow cytometer performance.

PROCEDURE

Reagent Provided
ReaPan 34845 reagent in a dried format

Reagents and materials required but not provided
1. Blood collection tube containing K3EDTA
2. Calibrated pipettes
3. Vortex mixer
4. Lysing SolutionA or similar blood fix/lyse solution 
5. Sheath fluidB
6. 0.2µm filtered, deionized distilled water or Milli­Q waterC
7. Flow cytometer Calibration BeadsD

11
A. ReaLyse Lysing solution: ReaMetrix Catalog No: 25237­00

B. Sheath fluid: BD Catalog No.342003
C. Accuri Flow cytometer uses Milli­Q water/Distilled deionized water instead of 
Sheath fluid 
D. Calibration Beads: BD Catalog No. 340486

Assay Protocol
1. Mix   blood   sample   (invert   blood   tube   at   least   10   times)   and 
reverse pipette  50µL of blood into the correctly labeled tube 
that contains the dry down reagent.
2. Gently vortex each tube for 30 seconds. Incubate for 30 
minutes at room temperature. Protect the tube from direct 
light.
3. Add 450µL  of 1X  ReaLyse  lysing  solution  to  each tube  and 
vortex for 10 seconds. Return tubes to the dark for at least 15 
minutes.
4. Vortex sample tube thoroughly (at low speed) and load onto 
cytometer for analysis.

12
Quality Control
Commercially available quality control whole blood control cells can be run 
each day. Established values can be used to assess reagent and system 
performance.

FLOW CYTOMETER ACQUISITION AND ANALYSIS

Start flow cytometer according to manufacturer’s instructions  (In the case 
of   FACSCalibur™,   the   instrument   should   be   setup   and   calibrated   using 
CaliBRITE™   beads   and   FACSComp™   software;   For   Accuri™   flow 
cytometer   instruments,   the   performance   of   the   instrument   should   be 
checked by Validation beads provided by Accuri.)

For BD FACSCalibur™ Flow Cytometer Instruments

1. Draw five dot­plot views – Refer Figure 1
• View 1: Anti­CD45 PerCP (FL3) versus side scatter (SSC– 
Linear scale) 

13
• View   2:  Anti­CD3   Atto488   fluorescence   (FL1)   versus   side 
scatter (SSC– Linear scale) of events gated as CD45+ (R1) 
from the View 1. 
• View   3:  CD4   APC   (FL4)   versus   CD3   Atto   488   (FL1)   of 
events gated as CD45+ (R1) from the View 1.
• View 4: CD8 PE (FL2) versus CD3 Atto 488 (FL1) of events 
gated as CD45+ (R1) from the View 1.
• View 5: Anti­CD8 PE (FL2) versus Anti­CD3 Atto488 (FL1). 
View­5   will   have   a   gate   (R3)   to   capture   the   fluorescent 
reference beads.  The beads have a high FL1 and FL2 Mean 
Fluorescence Intensity
2. Before acquisition adjust the FL3 threshold to minimize debris.
3. Set the number of events to capture at 3000 for R­3 gate (View 
5) and start data acquisition. When 3000 beads are acquired in 
the gate R3, acquisition stops.
4. Gate   the   brightest   CD45+   cell   cluster   in   View­1   and   gate   the 
population   as   R1.   This   CD45+   cell   cluster   is   that   population 
which   has   the   lower   SSC   intensity   and   higher   FL3   mean 

14
fluorescence intensity. It represents the lymphocyte population. 
The Gate R1 is applied on View 2, 3 & 4.
5. Total CD3+ events can be identified in View 2 in R2.
6. The CD4+ and CD8+ cell populations can be identified in View 3 
and View 4 in the upper right quadrants.
7. The absolute count for each cell type can be calculated using the 
following equation, 

(Gated Cell Count) x(Bead Count per te


Absolute CellCount / µL =
(Gated Bead Count) x(Test Volumein µL

Where the Gated Cell count and Bead count are obtained from the Flow 
Cytometer analysis, and the Bead count per test from the test kit provided.
Example:
If   the   bead   count   per   ReaPan   34845   test   is   50,000,   the   volume   of 
blood tested is 50µl, the number of gated beads is 3,000 (Figure 1, 
View 5, R3 gated events), and the number of gated CD4+ T­cells is 
1,500 (Figure 1, View 3, UR quadrant) then the absolute CD4+ T­cell 
count is 500 cell/µl.

15
1500 x 50000
Absolute CD4 CellCount= = 500cells / µL
3000 x 50

View 1 View 2

View 5

16
View 3 View 4

Figure 1. Dot plot views:  View 1:  CD45 PerCP fluorescence (FL3 ­ log scale) versus side 


scatter (SSC – Linear scale) View 2: CD3 Atto488 fluorescence (FL1­ log scale) versus side 
scatter (SSC– Linear scale) View 3: CD4 APC fluorescence (FL4– log scale) versus CD3 Atto 
488 (FL1– log scale) of events gated as CD45+ from View 1 View 4:  CD8 PE fluorescence 
(FL2­ log scale) versus CD3 Atto488 (FL1­ log scale) of events gated as CD45+ from View 1. 
View  5:  CD8 PE  fluorescence  (FL2­   log  scale)  versus  CD3 Atto488   (FL1  ­log  scale).  R3 
captures the fluorescent reference beads

For Accuri™ Flow Cytometer Instruments

1. Draw five dot­plot views – Refer Figure 2.
• View 1: CD45 PerCP (FL3­Log scale) versus side scatter 
(SSC – Linear scale)

17
• View 2: CD3 Atto488 fluorescence (FL1­Log scale) versus 
side   scatter   (SSC  –   Linear  scale)  of   events  gated   as  CD45+ 
(P1) from the View 1.
• View 3:  CD4 APC (FL4­ Log scale) versus CD3 Atto 488 
(FL1­ Log scale) of events gated as CD45+ (P1) from the View 
1.
• View   4:  CD8   PE   (FL2­  Log   scale)   versus  CD3   Atto   488 
(FL1­ Log scale) of events gated as CD45+ (P1) from the View 
1.
• View   5:   CD8   PE   (FL2­   Log   scale)   versus   CD3   Atto488 
(FL1­ Log scale) of all events from View 1. View­5 will have a 
gate (P2) to capture the fluorescent reference ReaCount beads.

Following table (Table­1) represents the Plot Specification Value to set 
the scales:
Table­1: Dot Plot View X & Y­Axis Scale Specifications
Dot Plot Views Axis Scale Min Value Max value
View 1 X­Axis FL3­Log scale 500 200,000

18
Y­Axis SSC­Linear scale 0 175,000
X­Axis FL1­Log scale 500 500,000
View 2
Y­Axis SSC­Linear scale 0 120,000
X­Axis FL4­Log scale 50 1,000,000
View 3
Y­Axis FL1­Log scale 200 1,000,000
X­Axis FL1­Log scale 50 500,000
View 4
Y­Axis FL2­Log scale 500 500,000
X­Axis FL1­Log scale 50 500,000
View 5
Y­Axis FL2­Log scale 500 500,000

2. In the Run Limit section of the Instrument template panel, set the 
instrument   Threshold   on   FL3   and   set   the   value   to   1000. 
Before/After acquisition adjust the FL3 Threshold value to minimize 
debris.
3. Click on the Set Colour Compensation to open the compensation 
matrix and set the compensation values as per Figure 3.
4. In the Run Limit section of the Instrument template panel, set the 
fluidics Flow rate on MEDIUM. Set the number of events to capture 
at 3000 for P2 gate bead events (Figure 2; View 5)

19
5. Vortex   sample   tube   thoroughly   at   low   speed   and   load   onto   flow 
cytometer for acquisition. When 3000 bead events are acquired in 
the gate P2, acquisition stops.
6. Gate the brightest CD45+ cell cluster in View­1 and adjust the P1 
gate around the lymphocyte population. This CD45+ cell cluster is 
that population which has the lower SSC intensity and higher FL3 
mean   fluorescence   intensity.   It   represents   the   lymphocyte 
population. The Gate P1 is applied on View 2, 3 and 4.
7. CD3+ cell clusters are separated using gate R1 (View­2, Figure 2). 
The CD3+ cell population has the lower SSC intensity and higher 
FL1 mean fluorescence intensity.
8. In View­3 (Figure 2) cell clusters are separated using quadrant gate 
Q1.   The   CD4+CD3+   cell  populations  can   be   identified   in   View­3 
(Figure 2) in the upper right quadrant Q1­UR as double positives.
9. In View­4 (Figure 2) cell clusters are separated using quadrant gate 
Q1.   The   CD8+CD3+   cell  populations  can   be   identified   in   View­4 
(Figure 2) in the upper right quadrant Q1­UR as double positives
10. View­5 (Figure 2); fluorescent reference beads are separated using 
gate P2. The beads have a high FL1 and FL2 Mean Fluorescence 
20
Intensity.
11. The absolute count for each cell type can be calculated using the 
following equation.
(Gated Cell Count) x(Bead Count per test)
Absolute CellCount / µL =
(Gated Bead Count) x(Test Volumein µL)

Where the Gated Cell count and Bead count are obtained from the Flow 
Cytometer analysis and the Bead count per test from the test kit provided.
Example:
If the bead count per ReaPan 34845 test is 50,000, the volume of blood 
tested is 50µl, the number of gated beads is 3,000 (Figure 2, View 5, P2 
gated events), and the number of gated CD4+ T­cells is 1,500 (Figure 2, 
View   3,   Q1­UR   quadrant)   then   the   absolute   CD4+   T­cell   count   is   500 
cell/µl.
1500 x 50000
Absolute CD4 CellCount= = 500cells / µL
3000 x 50
View 1 View 2

21
View 5

View 3 View 4
22
Figure   2.   Dot   plot   views:  View   1:  CD45   PerCP   fluorescence   (FL3   ­   log   scale) 
versus side scatter (SSC – Linear scale); View 2: CD3 Atto488 fluorescence (FL1­ 
log scale) versus side scatter (SSC– Linear scale) of events gated as CD45+ (P1) 
from the View 1;  View 3: CD4 APC fluorescence (FL4– log scale) versus CD3 Atto 
488 (FL1– log scale) of events gated as CD45+ (P1) from the View 1; View 4: CD8 
PE fluorescence (FL2­ log scale) versus CD3 Atto488 (FL1­ log scale)  of events 
gated as  CD45+  (P1) from  the View  1;  View 5:  CD8 PE fluorescence (FL2­ log 
scale) versus CD3 Atto488 (FL1 ­log scale). R3 captures the fluorescent reference 
beads

23
Figure 3: Accuri Flow cytometer Compensation settings for ReaPan 34845 Reagent
24
PERFORMANCE CHARACTERISTICS

The performance data for ReaPan 34845  reagent was generated by 
undertaking clinical validation.

Accuracy

The absolute counts for CD4+, CD8+ and CD3+ T­Cells determined 
using   ReaPan   34845   reagent   were   compared   with   Dry­Tri   T­STAT 
CD3/CD4/CD8 reagents (Figure 4, Figure 5 and Figure 6 ) using a BD 
FACSCalibur™ flow cytometer.

The absolute counts for CD45+ (Absolute Lymphocyte Count – ALC) 
determined by the ReaPan 34845 were compared with a hematology 
counter (Figure 7). 

25
Figure4:   Correlation   of   absolute   CD4+   T­Cell   counts  determined  using  ReaPan 
26
34845   compared   to   a   commercially   available   reagent   Dry   Tri   T­STAT 
CD3/CD4/CD8

27
Figure   5:   Correlation   of   absolute   CD8+   T­Cell   counts   determined   using   the 
ReaPan 34845 compared to a commercially available reagent Dry Tri T­STAT CD3/
CD4/CD8

28
Figure 6: Correlation of absolute CD3+ T­Cell counts (Total T­Cells) determined 
using the ReaPan 34845 compared to a commercially available reagent Dry Tri T­
STAT CD3/CD4/CD8

29
Figure 7:  Correlation of CD45+ cell counts (ALC) determined using the ReaPan 
34845 compared to the lymphocyte count obtained from a Hematology analyzer

Specificity

The  antigen   specificities  for  the  CD3,   CD4,   CD8  and  CD45   monoclonal 
antibodies   used   in   the   ReaPan   34845   reagent   were   confirmed   by   the 
Human   Leukocyte   Differentiation   Antigens   (HLDA)   Workshops.   After 
conjugation of the antibodies no additional cross­reactivity was observed.

LIMITATIONS

1. The ReaPan 34845 reagent has only been validated with K3EDTA 
treated whole blood.
2. Laboratories   should   establish   their   own   reference   ranges   for   the 
absolute counts obtained using the ReaPan 34845 reagent.

BIBLIOGRAPHY
30
1. Knapp W, Dorken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE, Stein H, & 
von   dem   BorneAEGKr,   eds.  Leukocyte   typing   IV.     White   cell 
differentiation antigens.  Oxford university press 1989
2. Reinherz   EL,   Meuer   SC,   and   Schlossman   SF.  The   delineation   of 
antigen   receptors   on   human   T   lymphocytes.   Immunology   Today, 
1983, 4:5­8.
3. Fauci AS: The human deficiency virus: Infectivity and mechanism of 
pathogenesis. Science, 1988, 239:617­622.
4. Reinherz EL and Schlossman SF. The differentiation and function of 
human T lymphocytes. Cell, 1980, 19:821­827.
5. Phillips A, Lee C, Elford J, et al.  Serial CD4 lymphocyte counts and 
the development of AIDS.  Lancet 1991, 337:389­392.
6. Nicholson J.  Use of flow cytometry in the evaluation and diagnosis 
of primary and secondary immunodeficiency diseases.  Arch. Pathol. 
Lab. Med.  1989, 113:598­605
7. Yarchoan R, Venzon D, Pluda J, et al.   CD4 count and the risk of 
death  in patients infected with  HIV receiving  antiretroviral therapy. 
1991, 115:184­189.
31
8. Giorgi   J   &   Detels   R.     T­cell   subset   alterations   in   HIV­infected 
homosexual   men:   NIAID   multicenter   AIDS   cohort   study.     1989, 
52:10­18.
9. Heddy   Z,   Swart   B,   Nicholson   I,   &   Voss   E,   eds.   Leukocyte   and 
stromal cell molecules; the CD markers.  John Wiley & Sons 2007.

WARRANTY

This   product   is  warranted   only  to   conform   to   the   quantity   and   contents 
stated on the label at the time of delivery to the customer. There are no 
warranties, expressed or implied, that extend beyond the description on the 
label of the product. ReaMetrix’s sole liability is limited to replacement of 
the product. ReaMetrix is not liable for property damage, personal injury, or 
economic loss caused by the product. 
Note:   FACSCalibur,   CaliBRITE,   FACSComp   are   all   registered   trade   names   of  
Becton­Dickinson; Accuri C6 flow cytometer is the trade name of Accuri.

32
33
Manufactured by ReaMetrix India Pvt. Ltd.
Manufacturing License Number: KTK/25/519/2006
50­B, II Phase, Peenya Industrial Area
Peenya, Bangalore 560058, India
Ph: +91­80­28378693/5, 
Fax: +91­80­41172451
E­mail: info@reametrix.com, 
www.reametrix.com
Rev No. 3.0,  22­Sep­09

34