You are on page 1of 28

1 Test per tube

Product catalog #: 25118­00

Dry Tri T­STAT 
(CD3/CD4/CD8)
Reagent 
 For In Vitro Diagnostic Use
                   

Manufactured by   
                                          

2
Dry Tri T­STAT (CD3/CD4/CD8) Reagent

INTENDED USE

The Dry Tri T­STAT (CD3/CD4/CD8) reagent is a three color immuno­fluorescence 
stain for the labeling, identification, and enumeration of helper/inducer (CD3+CD4+) 
and   cytotoxic/suppressor   (CD3+CD8+)   T   lymphocytes   combined   with   a   precise 
number of fluorescent counting beads for absolute CD4+ and CD8+ T­Cell counts. 
This   reagent   is   intended   to   be   used   in   a   “no   wash”   protocol   for   flow   cytometric 
analysis of erythrocyte­lysed human whole blood. 

SUMMARY AND EXPLANATION

The Dry­Tri T­STAT reagent contains fluorescently labeled antibodies that bind to 
CD3, CD4, and CD8 antigens found on the surface of circulating leukocytes. The 
CD3 antigen is a complex of at least six proteins known collectively as the T­cell 
receptor (TCR) complex.   The  antibody used in this reagent binds  to the  20kDa 
chain of this complex (1). The CD4 antigen is a 59kDa protein. It interacts with class 

3
II molecules of the major histocompatibility complex and is the primary receptor for 
the Human Immunodeficiency Virus (HIV) (2, 3).

The   CD8   antigen   is   a   complex   consisting   of   two   disulfide   linked   subunits.   The 
antibody   used   in   this   reagent   binds   to   the   32kDa   subunit   of   the   complex.   CD8 
interacts with class I major histocompatibility complex molecules (4).

Clinical relevance
Cells that are both CD3+ and CD4+ are identified as helper/inducer lymphocytes. 
Decreased   CD4+CD3+   T­cell   counts   have   been   associated   with   some   forms   of 
immunodeficiency (such as HIV). Suppressor/cytotoxic lymphocytes are the subset 
of cells that have both CD3 and CD8 receptors (5­7). Increased CD8+CD3+ T­cell 
counts have been observed in some cases of immunodeficiency (8).

PRINCIPLES OF THE PROCEDURE

The   Dry   Tri   T­STAT   (CD3/CD4/CD8)   reagent   consists   of   murine   monoclonal 


antibodies that specifically recognize the human leukocyte surface antigens, CD3, 
CD4,   and   CD8.     Each   of   the   monoclonal   antibodies   is   labeled   with   a   unique 
4
fluorochrome.   Specific cell subsets are stained when blood is combined with the 
reagent and each monoclonal antibody binds to the binds to the cell determinant 
molecules  on   the  cell  surface.     Specific  cell  subsets  are   identified   when   passed 
through a flow cytometer laser beam.

The  Dry  Tri  T­STAT (CD3/CD4/CD8)  reagent  also  contains  a precise  number of 


fluorescent beads.   When the reagent is combined with a known volume of blood 
the   reagent   provides   for   the   single   platform   determination   of   the   absolute   cell 
concentrations   of   the   stained   subsets.     The   volume   of   sample   analyzed   can   be 
determined by multiplication of the total sample volume by the fraction of total beads 
that were detected during the analysis.

REAGENT

The Dry­Tri T­STAT reagent is formulated in buffered saline with sodium azide and 
stabilizers.  It contains ATTO 488 – labeled CD4 monoclonal antibody, clone RPA­
T4; phycoerythrin (PE) – labeled CD8 monoclonal antibody, clone LT8; and PE­DY­
649 –  labeled  CD3  monoclonal  antibody,  clone  UCHT1.    The  specificities  of  the 
monoclonal antibodies used in the Dry Tri T­STAT (CD3/CD4/CD8) were confirmed 
by the Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA) Workshops (9).  A precise 
5
number of fluorescent counting beads are included in the Dry Tri T­STAT reagent to 
allow single­platform determination of absolute CD4+ and CD8+ T­cell counts.  The 
Dry­Tri T­STAT reagent is provided in dried form and dispensed in flow cytometer 
compatible sample tubes with each tube containing one ready­to­use test.  Fifty (50) 
tests are supplied in each Dry Tri T­STAT (CD3/CD4/CD8) package.

The absolute number of counting beads in each test was set by determining the 
number   of   beads   in   a   representative   number   of   tubes   after   the   reagent   was 
dispensed.     The   reagent   was   solubilized   with   a   precise   volume   of   fluid   and 
transferred   to   a   chamber  where   the   number   of   beads  per  unit   volume   dould   be 
counted.  
ATTO   488   (Atto­Tec   GmbH,   Germany)   is   a   water   soluble   fluorescent   dye   with 
excitation/emission maxima of 501nm/523nm and spectral qualities similar to FITC. 
DY­649   (Dyomics   GmbH,   Germany)   is   a   water   soluble   fluorescent   dye   with 
excitation/emission maxima of 655nm/676nm and spectral qualities similar to Alexa 
Flour® 647.  

Precautions
1. Warning: The Dry­Tri T­STAT reagent contains sodium azide. Sodium 

6
azide   is   harmful   if   swallowed.   Wear   suitable   protective   clothing.   If 
swallowed,   seek   medical   advice   immediately.   Contact   with   acids 
liberates toxic gas. Azides should be flushed with large amounts of 
water during disposal to avoid deposits in lead or copper plumbing.
2. Warning:   All   blood   specimens   are   considered   biohazards.   Handle 
them as if they are capable of transmitting infection and dispose off 
with proper precautions and accordance with governmental 

regulations.
3. The addition of precise volume of blood is critical to obtain correct 
results.   Use   a   calibrated   pipette   and   operate   according   to   the 
manufacturer’s instructions.

Storage and Handling
1. Store the reagent at room temperature in a dry place. Do not use 
the reagent after the expiry date on the label.
2. Do   not   freeze   or   refrigerate   Dry­Tri   T­STAT   (CD3/CD4/CD8) 
reagent.
3. The Dry­Tri T­STAT (CD3/CD4/CD8) reagent is light sensitive. Do not 
7
expose to direct light either during storage or when mixed with 
blood.
4.   Use the ziplock to reseal the reagent pouch after you have removed 
the desired number of tests.  When stored below 40ºC sealed in the 
ziplock pouch and protected from moisture and light the reagent is 
stable for 12 months.

Indication of Instability

The Dry Tri T­STAT (CD3/CD4/CD8) reagent is a dry glassy coating at the bottom of 
the reaction tube.  Do not use if the reagents appears to be moist or it has become 
dislodged from the bottom of the reaction tube.

INSTRUMENT

The   Dry­Tri   T­STAT   (CD3/CD4/CD8)   reagent   is   designed   to   be   used   on   flow 


8
cytometers equipped with a 488nm laser, that are capable of detecting forward and 
side   scatter,   and   detecting   3   color   fluorescence:   515­545nm,   562­607nm,   and 
>650nm. Examples of flow cytometers with the above features are the FACScan™, 
FACSCalibur™   and   EPICS­XL™   systems.   Calibrate   the   instrument   for   setting 
photomultiplier tube voltages, fluorescence compensation, and checking instrument 
sensitivity according to the manufacturer’s guidelines. 

Refer   to   the   manufacturer’s   instructions   for   setting   up   three   color 


immunophenotyping, principles of operation, operating instructions, and operating 
precautions, limitations, and hazards.

SPECIMEN COLLECTION

The blood sample should be collected in a sterile blood collection tube containing 
K3EDTA.   Follow   the   collection   tube   manufacturer’s   guidelines   for   the   minimum 
volume of blood to be collected.

The anti­coagulated blood must be stored at room temperature (20°C ­ 25°C) and 
should be stained and analyzed within 24 hours of draw.  
9
Interfering conditions
Refrigerated or previously fixed blood specimens can yield erroneous results and 
should be rejected. Hemolyzed, aged, or partially clotted blood specimens can affect 
flow cytometer performance.

PROCEDURE

Reagent Provided
Dry Tri T­STAT (CD3/CD4/CD8) reagent in a dried format

Reagents and materials required but not provided
1. Blood collection tube containing K3EDTA
2. Calibrated pipettes
3. Vortex mixer
4. Lysing SolutionA or similar blood fix/lyse solution
5. Sheath fluidB
6. Flow cytometer Calibration BeadsC 

A. Lysing solution: 
10
(BD Catalog No. 349202 / BC Catalog No. A11895) or equivalent
B. Sheath Fluid:
(BD Catalog No.342003/ BC Catalog No. 8546859) or equivalent
C. Calibration Beads:
(BD Catalog No. 340486/ BC Catalog No. 6605359) or equivalent

Assay Protocol
1. Start flow cytometer according to manufacturer’s instructions.
2.    In the case of FACScan™ or FACSCalibur™ , the instrument should 
be set up and calibrated using CaliBrite™ beads and FACSComp™ 
software.   For   Beckman   Coulter   EPICS   instruments,   the   instrument 
should be set up using the Flow­Check™ fluorospheres provided by 
Beckman Coulter.
3. Mix blood sample  (invert  blood  tube  at  least  10 times) and  pipette 
50µL of blood into the correctly labeled tube that contains the reagent.
4. Gently vortex each tube for 30 seconds. Incubate for 30 minutes 
at room temperature. Protect the tube from direct light.
5. Add 450µL of lysing solution to each tube and vortex for 30 seconds. 
Return tubes to the dark for at least 15 minutes.
6. Vortex   sample   tube   thoroughly   (at   low   speed)   and   load   onto 
cytometer for analysis.
11
Note – Once the sample has been stained and processed it can be held of 3 days 
before analysis on the flow cytometer 

Quality Control
Commercially   available   quality   control   cells   can   be   run   each   day.     Established 
values can be used to assess reagent and system performance.

RESULTS

For BD instruments

1. Draw three dot­plot views
2.  View 1 :
Display   FL3   [Anti­CD3­PE­Dy­649   fluorescence]   vs   SSC   [side 
scatter]. Refer Figure 1. 
View 2:
Display FL1 vs FL2. This view will have events gated as CD3+ from 
View 1. Refer Figure 2.

12
View 3: 
Display  FL1 [Anti­CD4­Atto 488 fluorescence] vs  FL2 [Anti­CD8­PE 
fluorescence]. This is not gated. Refer Figure 3.
3. Set the instrument Threshold on FL3. Before acquisition, adjust the 
FL3 threshold to minimize debris. Ideally, the CD3+ cells in the first 
view should account for one third of total events.
4. Set  the   number  of   events  to  capture  10,000  events  and  start  data 
acquisition. In the case of low CD4 counts, it is recommended that at 
least 3000 bead events are captured. 
5. Gate the CD3+ cells in View 1 (Refer Figure 1) as R1. The CD3+ cells 
will have low SSC intensity and high mean fluorescence intensity on 
FL3. 
6. Apply   the   gate   R1   in   View   2   (Refer   Figure   2)   to   identify   the 
CD4+CD3+ and CD8+CD3+ cell populations. The CD4+CD3+ T­cells 
can   be   identified   as   the   population   with   the   highest   mean 
fluorescence   intensity   on   FL1.   The   CD8+CD3+   T­cells   can   be 
identified   as   the   population   with   the   highest   mean   fluorescence 
intensity on FL2.
7. Gate the absolute counting beads in View 3 (Refer Figure 3) as R2. 
The beads will show high mean fluorescence intensities on FL2 and 

13
FL1.
8. The   absolute   CD4+CD3+   and   CD8+CD3+   T­cells   counts   can   be 
calculated using the following equation. 

Absolute Cell Count per µ L = Gated Cell Count x Bead Count per test
         Gated Bead Count x Test volume (in µ L)

where   the   Gated   Cell   count   and   Bead   count   are   obtained   from  the   flow 
cytometer analysis, the bead count per test from the test kit provided

Example: 
If the bead count per Dry Tri T­STAT CD3/CD4/CD8 test is 50,000, the 
volume of blood tested is 50µl, the number of gated beads is 3,000 (Figure 
3 gated events), and the number of gated CD4+ T­cells is 1,500 (Figure 2 
LR quadrant) then the absolute CD4+ T­cell count is 500 cell/µl.

Absolute CD4+ T­cell count = 1500 x 50,000  = 500 cells/µl
   3,000 x 50

14
Figure   1.    Scatter   plot   of   FL3   vs.   side   Figure   2.   Scatter   plot   of   FL1   versus   FL2 
scatter.  This view allows the gating of the   (gated).     This   view   is   used   to   determine   the 
CD3+ population absolute count of CD4+CD3+ and CD8+CD3+ 
T­cells.

15
Figure 3.  Scatter plot of FL1 versus FL2 (ungated).  This view can be used to determine the  
absolute number of beads 

16
For Beckman­Coulter instruments (Epics™ series)
1.   Draw three dot­plot views
2.   View 1:
Display   FL4   [Anti­CD3­PE­Dy­649   fluorescence]   vs   SSC   [side 
scatter]. Refer Figure 4. 
View 2:
Display FL1 vs FL2. This view will have events gated as CD3+ from 
View 1. Refer Figure 5.
View 3: 
Display  FL1 [Anti­CD4­Atto 488 fluorescence] vs  FL2 [Anti­CD8­PE 
fluorescence]. This is not gated. Refer Figure 6.
3. Before   acquisition,   adjust   the   FL4   threshold   to   minimize   debris. 
Ideally, the CD3+ cells in the first view should account for one third of 
total events.
4. Set the number of events to 10,000 and start data acquisition. In the 
case of low CD4 counts, it is recommended that at least 3000 bead 
events are captured. 
5. Gate the CD3+ cells in View 1 (Refer Figure 4) as R1. The CD3+ cells 

17
will have low SSC intensity and high mean fluorescence intensity on 
FL4. 
6. Apply   the   gate   R1   in   View   2   (Refer   Figure   5)   to   identify   the 
CD4+CD3+ and CD8+CD3+ cell populations. The CD4+CD3+ T­cells 
can   be   identified   as   the   population   with   the   highest   mean 
fluorescence   intensity   on   FL1.   The   CD8+CD3+   T­cells   can   be 
identified   as   the   population   with   the   highest   mean   fluorescence 
intensity on FL2.
7. Gate the absolute counting beads in View 3 (Refer Figure 6)  as R2. 
The beads will show high mean fluorescence intensities on FL2 and 
FL1.
8. The   absolute   CD4+CD3+   and   CD8+CD3+   T­cells   counts   can   be 
calculated using the following equation. 

Absolute Cell Count per µ L = Gated Cell Count x Bead Count per test
         Gated Bead Count x Test volume (in µ L)

where   the   Gated   Cell   count   and   Bead   count   are   obtained   from  the   flow 
cytometer analysis and the bead count per test is obtained from the test kit 
provided
18
Example: 
If the bead count per Dry Tri T­STAT CD3/CD4/CD8 test is 50,000, the 
volume of blood tested is 50µl, the number of gated beads is 3,000 (Figure 
6 gated events), and the number of gated CD4+ T­cells is 1,500 (Figure 5 
LR quadrant) then the absolute CD4+ T­cell count is 500 cell/µl.

Absolute CD4+ T­cell count = 1500 x 50,000  = 500 cells/µl
   3,000 x 50

Figure 4.  Scatter plot of FL4 vs. side scatter.   Figure 5.   Scatter plot of FL1 versus FL2  


This   view   allows   the   gating   of   the   CD3+   (gated).   This view is used to determine  
population the   absolute   count   of   CD4+CD3+   and  
CD8+CD3+ T­cells.

(FL2) CD8­PE
Side Scatter

19

(FL4) CD3­PE­Dy649 (FL1) CD4­Atto488
Figure 6.  Scatter plot of FL1 versus FL2 (ungated).  This view can be used to determine the  
absolute number of beads 
(FL2) CD8­PE

(FL1) CD4­Atto488
20
LIMITATIONS
1. The Dry Tri T­STAT CD3/CD4/CD8 reagent has only been validated 
with K3EDTA treated whole blood.
2. Laboratories   should   establish   their   own   reference   ranges   for   the 
absolute   counts   obtained   using   the   Dry   Tri   T­STAT   CD3/CD4/CD8 
reagent.

EXPECTED RESULTS

The absolute CD4+ and CD8+ T lymphocyte concentrations were measured for a 
normal population of adults in southern India, unselected gender and ages ranging 
from 21 to 80 years old, using the Dry Tri T­STAT (CD3/CD4/CD8) reagent.  Values 
obtained from this diverse population are displayed below and consistent with the 
reported normal range (10).
We  recommend that  each  laboratory establish its own expected  range of  values 
from the local population of normal donors.
Minimu
  n m Maximum Mean±SD
21
CD3+CD4+ T­cells 114 457 2888 1015±348
CD3+CD8+ T­cells 114 195 1402 645±256

PERFORMANCE CHARACTERISTICS

Correlation
The   absolute   CD3+CD4+   and   CD3+CD8+   T­cells   concentrations   for   96   blood 
samples   determined   using   the   Dry   Tri   T­STAT   (CD3/CD4/CD8)   reagent   were 
compared   to   those   values   determined   using   the   Beckman   Coulter   Cyto­Stat® 
tetraCHROME™   and   Becton   Dickinson   TriTest™   reagents.     The   Deming   linear 
regression analysis reported in the table below indicates substantial equivalence.

22
Deming Linear Regression 95% CI
Parameter Slope Y­intercept X­intercept Slope Y­intercept
Site 1
CD3+CD4+ T­cell 
0.868 ­3.28 3.78 0.841 ­ 0.896 ­16.5 – 10.0
Regression
CD3+CD8+ T­cell 
0.899 35.0 ­38.9 0.845 – 0.954 ­30.7 – 100
Regression
Site 2
CD3+CD4+ T­cell 
0.970 ­8.47 8.73 0.917 – 1.02 ­34.7 – 17.7
Regression
CD3+CD8+ T­cell 
1.044 ­58.3 55.8 0.978 – 1.11 ­136 – 19.3
Regression
Site 3
CD3+CD4+ T­cell 
0.982 5.85 ­5.95 0.922 – 1.04 ­20.0 – 31.7
Regression
Site 4
CD3+CD4+ T­cell 
0.901 12.99 ­14.42 0.871 – 0.931 ­2.67 – 28.7
Regression
CD3+CD8+ T­cell 
0.884 2.49 ­2.82 0.831 ­ 0.936 ­64.3 – 69.3
Regression

23
Linearity
Assay   linearity   was   determined   by   testing   six   point   dilution   series,   64­1680 
CD3+CD4+   T­cells/µl   and   32­1640   CD3+CD8+   T­cells/µl.     The   measurement   at 
each level was performed in triplicate.  The assay was determined to be linear for 
both CD3+CD4+ and CD3+CD8+ T­cells with correlation coefficients (R2) of 0.995 
and 0.999, respectively.

The two dilution series spanned the specified reportable ranges of 65­1500 
CD3+CD4+ T­cells/µl and 40­1500 CD3+CD8+ T­cells/µl.

Precision
The repeatability of measurement was determined for three levels of CD3+CD4+ 
and   CD3+CD8+   T­cells   counts   analyzed   in   replicates   of   ten.     The   results   are 
tabulated below.

  Level Mean SD %CV


CD3+CD4+ T­ Low 29 1.7 6
Medium 607 23.6 3.9
24
High 1173 66.3 5.7
cells
Low 655 45.1 6.9
CD3+CD8+ T­
Medium 770 37.1 4.8
cells
High 1557 30 1.9
Specificity
The antigen specificities for the CD3, CD4, and CD8 monoclonal antibodies used in 
the   Dry   Tri   T­STAT   (CD3/CD4/CD8)   reagent   were   confirmed   by   the   Human 
Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA) Workshops.
After conjugation of the antibodies no additional cross­reactivity was observed.

BIBLIOGRAPHY

1. Knapp W, Dorken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE, Stein H, & von dem 
BorneAEGKr,   eds.   Leukocyte   typing   IV.     White   cell   differentiation   antigens. 
Oxford university press 1989
2. Reinherz   EL,   Meuer   SC,   and   Schlossman   SF.   The   delineation   of   antigen 
receptors on human T lymphocytes. Immunology Today, 1983, 4:5­8.
3. Fauci   AS:   The   human   deficiency   virus:   Infectivity   and   mechanism   of 
pathogenesis. Science, 1988, 239:617­622.
4. Reinherz EL and Schlossman SF. The differentiation and function of human T 
25
lymphocytes. Cell, 1980, 19:821­827.
5. Phillips   A,   Lee   C,   Elford   J,   et   al.     Serial   CD4   lymphocyte   counts   and   the 
development of AIDS.  Lancet 1991, 337:389­392.
6. Nicholson J.  Use of flow cytometry in the evaluation and diagnosis of primary 
and   secondary  immunodeficiency  diseases.     Arch.   Pathol.   Lab.   Med.     1989, 
113:598­605.
7. Yarchoan R, Venzon D, Pluda J, et al.   CD4 count  and the risk  of  death in 
patients infected with HIV receiving antiretroviral therapy. 1991, 115:184­189.
8. Giorgi J & Detels R.  T­cell subset alterations in HIV­infected homosexual men: 
NIAID multicenter AIDS cohort study.  1989, 52:10­18.
9. Heddy   Z,   Swart   B,   Nicholson   I,   &   Voss   E,   eds.   Leukocyte   and   stromal   cell 
molecules; the CD markers.  John Wiley & Sons 2007
10. Uppal SS, Verma S, Dhot PS.  Normal values of CD4 and CD8 lymphocyte 
subsets in healthy Indian adults and the effects of sex, age, ethnicity, and 
smoking.  Cytometry Part B 2003, 52B:32­36

WARRANTY

This product is warranted only to conform to the quantity and contents stated on 
the   label   at   the   time   of   delivery   to   the   customer.   There   are   no   warranties, 
26
expressed or  implied, that  extend beyond the  description on the label  of the 
product.   ReaMetrix’s   sole   liability   is   limited   to   replacement   of   the   product. 
Reametrix is not liable for property damage, personal injury, or economic loss 
caused by the product. 
Note:   FACScan,   CaliBRITE,   FACSLyse,   FACSComp,   FACSCalibur   are   all   registered  
trade names of Becton­Dickinson. Alexa Fluor® 647 is a registered trade nameof Invitrogen.  

ReaMetrix Inc.
1585 Industrial Rd.
San Carlos, CA 94070
27
(650)620­9253

Manufactured by ReaMetrix India Pvt. Ltd.
Manufacturing License Number: KTK/25/519/2006
50­B, II Phase, Peenya Industrial Area
Peenya, Bangalore 560058, India
Ph: +91­80­28378693/5, Fax: +91­80­41172451
E­mail: info@reametrix.com, 
www.reametrix.com
Rev No. 4.0, 08­May­09

28