1 Test per tube

Product catalog No: 25238­00

ReaPan B27
                                                                     

Manufactured by 
                                          

2
 ReaPan B27
1. INTENDED USE

The   ReaPan   B27   Reagent   is   a   two­color   immunofluorescence   stain, 

suitable for determining HLA­B27 antigen expression by flow cytometry 
in   lysed   human   whole   blood   samples   (lyse­no   wash   technique).   This 
reagent is intended for specific use on open system flow cytometers (Eg. 
BD FACScan™ and BDFACSCalibur™ cytometers).
3
2. SUMMARY AND EXPLANATION

Human Leukocyte Antigen B27, a class I surface antigen encoded by the 
B   locus   in   the   major   histocompatibility   complex   (MHC)   presents 
microbial   antigens   to   T­Lymphocytes.   The   onset   of   seronegative 
spondylo­arthropathies   that   includes   ankylosing   spondylitis,   Reiter’s 
disease, psoriatic arthritis and inflammatory bowel disease (1,2,3,4) is 
associated with the expression of HLA­B27 antigen on T­Lymphocytes. 
Screening for HLA­B27 is thus of clinical relevance in conjunction with 
the symptomatic presentation of the disorder. Micro­lymphotoxicity tests 
are conventionally used in HLA­typing but are typically time­consuming 
and expensive. Flow cytometry has gradually evolved into a faster and 
reliable method for screening samples for HLA­B27 antigen (5,6).

Commercially   available   reagents   for   flow   cytometry   based   HLA­B27 

typing   either   immunospecifically   select   T­Lymphocyte   population   to 
screen for HLA­B27 antigen so as to increase the specificity or minimize 
the cross­reactivity of the Anti­B27 antibody to B7 antigen in order to 
reduce false positives.

4
3. PRINCIPLES OF THE PROCEDURE

T­lymphocytes selected through gating of CD3 specific populations are 
analyzed for staining by HLA­B27 conjugates. It has been demonstrated 
that the preselection of T­Lymphocytes increases the specificity of the 
test   by   eliminating   the   background   caused   from   other   leukocyte 
populations   (8).   Another   method   to   reduce   false­positives   is   by   the 
addition of anti­B7 antibody to the reagent cocktail. The anti­B7 antibody 
competes with the B27 antibody for the B7 antigen and in this manner 
suppresses the incidence of cross­reactivity of anti­B27 antibodies to B7 
antigens (1).

The ReaMetrix reagent for HLA­B27 typing improves the specificity by 
having two clones of the anti­HLA­B27 antibody and an antibody against 
the B7 antigen.   By having two clones, multiple epitopic regions of the 
B27 antigen are targeted ensuring that more B27 antigens are identified. 
The   anti­B7   antibody   binds   preferentially   to   the   B7   antigen   thereby 
reducing cross­reactivity. 

5
The   test   result   is   a   direct   extrapolation   of   the   fluorescent   staining 
intensity of the HLA­B27 conjugates with respect to a cut­off value.

4. REAGENT

The ReaPan B27 reagent is formulated in buffered saline with sodium 
azide   and   stabilizers.   It   contains   R­Phycoerythrin   (PE)   –   labeled 
monoclonal Anti­HLA­B27 antibodies (clones FD705 and HLA­ABC­m3), 
PE­Dyomics649 – labeled Anti­CD3 monoclonal antibody (clone UCHT1) 
and unlabeled Anti­B7 antibody (clone BB7.1) (1,7). A precise number of 
fluorescent   beads   are   included   to   facilitate   internal   calibration   of   the 
reagent and determine RMX value. The ReaPan B27 reagent is provided 
as a ready­to­use test, dried down in flow cytometer compatible sample 
tubes.

Precautions
1. Warning:   The   ReaPan   B27   reagent   contains   Sodium   azide. 
Sodium azide is harmful if swallowed. Wear suitable protective 

6
 clothing. If swallowed, seek medical advice immediately. Contact 
with   acids   liberates   toxic   gas.   Azides   should   be   flushed   with 
large amounts of water during disposal to avoid deposits in lead 
or copper plumbing.
2. Warning:   All   blood   specimens   are   considered   biohazards. 
Handle them as if they are capable of transmitting infection and 
dispose   off   with   proper   precautions   in   accordance   with 
governmental regulations.
3. The addition of the precise volume of blood is critical to obtain 
correct results. Use a calibrated pipette and operate according 
to the manufacturer’s instructions.
4. The   ReaPan   B27   reagent   and   the   control  beads   are   in   dried 
form. It is absolutely critical to ensure vigorous vortexing after 
addition of blood sample to ensure solubilization of the reagent 
and the beads.

Storage and Handling
1. Store the reagent at room temperature in a dry place. Do not 
use the reagent after the expiry date on the label.
7
 2. Do not freeze the ReaPan B27.
3. The ReaPan B27 reagent is light sensitive. Do not expose to 
direct light either during storage or when mixed with blood.

3. INSTRUMENT

The   ReaPan   B27   reagent   has   been   tested   on   the   FACScan™   and 
FACSCalibur™ systems manufactured by Becton­Dickinson. ReaMetrix 
recommends running this reagent on these instruments. The instrument 
should   be   calibrated   for   setting   photomultiplier   tube   voltages, 
fluorescence   compensation,   and   checking   instrument   sensitivity 
according to the manufacturer’s guidelines.

It   is   the   responsibility  of   the   user   to   optimize   the   performance   of   the 

reagent for use in flow cytometers other than those mentioned above. 

4. SPECIMEN COLLECTION

Follow   the   collection   tube   manufacturer’s   guidelines   for   the   minimum 

8
 volume of blood to be collected.

The anti­coagulated blood must be stored at room temperature (20°C ­ 
25°C) and should be stained and analyzed  ideally  within 24 hours of 
draw.

Important!

Refrigerated,   hemolyzed,   and   previously   fixed   blood   specimens   can 

yield erroneous results and should be rejected.

5. PROCEDURE
Reagent Provided
ReaPan B27 reagent 
Reagents and materials required but not provided
1. Blood collection tube 
2. Calibrated pipettes
3. Vortex mixer
9
 4. ReaLyse Solution
5. Sheath   fluid   (BD   FACSFlow™   Catalog   No.   340398   or 
equivalent)
6. Calibrite Beads

Assay Protocol

1. Mix   blood   sample   (invert   blood   tube   at   least   10   times)   and 

pipette   25µL   of   blood   into   the   single   use   HLA   B27   reagent 
tube.
2. Vortex each tube thoroughly for 30 seconds. Incubate for 30 
minutes   at   room   temperature.   Protect   the   tube   from   direct 
light.
3. Add  300µL  of  FACSLyse™  or  equivalent  fix/lyse  solution  to 
each tube and vortex for 20 seconds. Return tubes to the dark 
for at least 15 minutes to ensure complete lysis.
4. Vortex sample tube thoroughly (at low speed) and load onto 
cytometer for analysis.

10
Flow Cytometer Acquisition and Analysis

This protocol assumes that the flow cytometer has been setup according 
to   the   manufacturer’s   instructions   (For   example,   In   the   case   of 
FACScan™,   the   instrument   should   be   setup   and   calibrated   using 
CaliBrite™ beads and FACSComp™ software). Open the CellQuest™ 
Pro software and connect to the cytometer. 

The fluorescence filters referred to in the subsequent sections are given 
below:

• FL1 – 530 ± 30 nm
• FL2 – 585 ± 42 nm
• FL3   –   670   nm   LP   (BD   FACS   Calibur™)   or   650   nm   LP   (BD 
FACScan™)
Open a new document (File>New document) and select the option to 
view instrument settings:

11
 • Set   the   compensation   settings   on   all   channels   to  
zero
• Set the threshold on FL3
• Set   Intensity   to   Channel   values   (CellQuest   Pro  
toolbar>Plots>Log Data Units>Channel Values)

1. Draw two dot­plot (View­1 and View­2) and four histogram (View 
­3,
View­4, View­5, View­6) views – 
• View­1 (Dot Plot): CD3  PE­Dy649  fluorescence  (FL3) 
versus side scatter (SSC – Linear scale). 
• View­2 (Dot Plot): FL2 versus FL1 of events gated as 
beads from the first view to capture the fluorescent reference 
beads.   The   beads   have   a   high   FL1   and   FL2   Fluorescence 
Intensity
• View­3   (Histogram):   HLA­B27­PE   fluorescence   (FL2) 
versus   counts   of   events   gated   as   CD3   positive   (R1)   from 
View­1. 
12
 • View­4, View­5, and View­6 (Histogram): Fluorescent 
bead intensity (on FL1, FL2 & FL3) obtained from R3 of View 
2 versus Counts.
• Set   the   number   of   events   to   capture   at   4000   for   R­3 
gate (View 2) before data acquisition. When 4000 beads are 
acquired in the gate, acquisition stops.
• Select the histogram statistics option for View­3, View­4 
and View­5 & View­6
2. Adjust the Side­scatter and FL3 voltage settings on View 1 to 
acquire   CD3   positive   (R1)   and   bead   populations   (R2)   as 
shown.   Ensure   that   both   the   beads   and   the   lymphocyte 
populations are acquired and can be visualized as separate 
from the background.(Note: Multi­colored gating can be used 
to prevent unintentional thresholding out beads)
3. Adjust the FL2 voltage settings to position R3 gated beads to 
600±10   channels   (Histogram   stats   –   M1   –   Median 
Fluorescence Intensity) on View 

13
4. Similarly adjust FL1 and FL3 voltage gain to set the R3 gated 
beads   on   FL1   at   a   MdFI   of   600±10   and   400±10   channels 
respectively. (The above steps are critical for the accuracy of  
the test results and must not be skipped)
5. Obtain the R1­gated HLA­B27 population on View 3 to record 
the fluorescence intensity on histogram stats (of all events).
6. Enter the K value for the particular batch of reagent from the 
label on the pouch and calculate RMX value as shown.

MdFIsample – K x MdFIbeads on FL2
RMX Value* =
MdFIbeads on FL2
*K is a constant unique to each reagent lot given on the Reagent Pouch Label
If RMX Value ≤0, then sample is HLA B27 negative
If RMX Value >0, then sample is HLA B27 positive

14
 View 1           View 2
Dot plot views: View­1: CD3­PE­Dy649 fluorescence (FL3 ­ log scale) versus side­scatter  
(SSC – Linear  scale) to capture CD3+ (R1) and fluorescence beads  (R2)  View­2:  FL1  
versus FL2 (both on log scale) and R2 gate applied to obtain a clean reference beads  
population (R3) 

15
       View 3  

View 4           View 5            View 6 

Histogram views:    View­3:  HLA­B27­PE (gated from R1 of View 1) fluorescence (FL2)  
versus Counts View­4 View­5 View­6: MdFI of bead intensity on FL1, FL2 & FL3

16
6. LIMITATIONS
1. The   ReaPan   B27   reagent   has   only   been   validated   with   K 3EDTA 
treated whole blood.
2. It is the responsibility of the user to ensure that the flow cytometer 
instrument is calibrated according to manufacturer’s instructions. 
3. It   is   important   that   the   gain   settings   are   adjusted   to   position   the 
fluorescent beads as described in Section 6.0. The R­1 gate must be 
visually checked to ensure adequate T­lymphocyte gating. 
4. The   test   result   bears   a   direct   relation   to   the   intensity   of   the 
Phycoerythrin (PE) in the reagent. Exposure of reagent to direct light 
or use of expired reagents may prove detrimental to the accuracy of 
the test results.
5 The HLA­B27 test result is not indicative of the presence or absence 
of a disease condition. HLA­B27 expression along with symptomatic 
presentation   and  clinical  history  of   the   patient   should   be   carefully 
considered by the physician in making a diagnosis (7).

17
7. WARRANTY

This product is warranted only to conform to the quantity and contents 
stated on the label at the time of delivery to the customer. There are no 
warranties, expressed or implied, that extend beyond the description on 
the   label   of   the   product.   ReaMetrix’s   sole   liability   is   limited   to 
replacement of the product. Reametrix is not liable for property damage, 
personal injury, or economic loss caused by the product. 
Note:   FACScan,   CaliBRITE,   FACSLyse,   FACSComp,   FACSCalibur   are   all  
registered trade names of Becton­Dickinson. 

8. REFERENCES

1. Wilfried H. B. M. Levering, Henk Wind, Kees Sintnicolaas, Herbert 
Hooijkaas,   and   Jan   W.   Gratama.   Flow   Cytometric   HLA­B27 
Screening: Cross­ReactivityPatterns of Commercially Available Anti–
HLA­B27   Monoclonal   Antibodies   With   Other   HLA­B   Antigens. 
Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 54B:28–38 (2003)
18
2. Michael J. Warzynski. HLA­B27 TESTING: MEAN CHANNELS, QC, 
AND SURVEYS. Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 
30:208–211 (1997)

3. Jenn   C.   Chen,   Bruce   H.   Davis,   Nancy   C.   Bigelow,   Carole 

Ceckowski,   JoAnne   Robinson,Cynthia   Sounart­Miscovich,   and 
Kame A. Steel. Flow Cytometric HLA­B27 Typing Using CD3 Gating 
and   Molecules   of   Equivalent   Soluble   Fluorochrome   (MESF) 
Quantitation.   Cytometry   (Communications   in   Clinical   Cytornetry) 
26:286­292 (1996)
4. P. S. Dhurandhar and U. Shankarkumar. HLA Association in 
Seronegative Spondyloarthritis Patients From Mumbai, India. Int J 
Hum Genet, 7(3): 235­239 (2007)

5. Michael T. Seipp, Maria Erali, Rae Lynn Wies, and Carl Wittwer. HLA­
B27 Typing: Evaluation of an Allele­Specific PCR Melting Assay and 
Two Flow Cytometric Antigen Assays. Cytometry Part B (Clinical 
Cytometry) 63B:10–15 (2005)

19
6. W.H.B.M. Levering, H. Wind, H. Hooijkaas, K. Sintnicolaas, B. 
Brando, J.W. Gratama. Flow cytometric screening for HLA­B27 on 
peripheral blood lymphocytes. J Biol Regul Homeost Agents 2003; 
17: 241­6

7. Johannes   J.M.L.   Hoffmann   and   Willy   C.M.   Janssen   HLA­B27 

phenotyping   with   flow   cytometry:further   improvement   by   multiple 
monoclonal antibodies. Clinical Chemistry 43:10, 1997
8. Anne M. Ward and Afzal Nikaein. Comparison of Monoclonal 
Antibodies for Flow Cytometric Analysis of HLA­B27 Antigen. 
Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 22:65­69 (1995)

9. Wendy M. Reynolds, Philip R. Evans, Andrew C. Lane, W. Martin 
Howell, Peter J. Wilson, Raymond Wong, and John L. Smith 
Automated HLA­B27 Testing Using the FACSPrep/FACScan 
System.  Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 18: 109­
1 15 (1994)

20
10. Wilfried Levering External quality assessment in flow cytometry. 
Educational aspects and trends toward improvement. Doctoral 
Thesis

11. Wilfried H.B.M. Levering, Rene van den Beemd, Jeroen G. te Marvelde, 
Wil A.M. van Beers, Herbert Hooijkaas, Kees Sintnicolaas, and Jan W. 
Gratama. External Quality Assessment of Flow Cytometric HLA­B27 
Typing. Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 42:95–105 
(2000)

21
Manufactured by ReaMetrix India Pvt. Ltd.
50­B, II Phase, Peenya Industrial Area
Peenya, Bangalore 560058, India
22
Ph: +91­80­28378693/5, Fax: +91­80­41172451
E­mail: info@reametrix.com
www.reametrix.com
Rev No. 2.0,  21­Apr­09

23