You are on page 1of 25

                                                                              

1 Test per tube

Product catalog No: 25323­00

ReaPan S34
                                                                     

            Manufactured by   

                                          
    11/10/2009 2
 
ReaPan S34
1. INTENDED USE
The ReaPan S34    reagent uses principle of Immuno­fluorescence to enumerate 
Hematopoietic   stem   cells   in   cell   preparations.   It   is   available   in   a   unitized, 
dried­down   format   and   is   ideal   for   enumerating   viable   CD34+   cells   in 
peripheral blood, cord blood, and mobilized stem cell preparations on a flow 
cytometry platform. This reagent is intended for specific use on open system 
flowcytometer. (Eg.BDFACScan™, BDFACSCalibur™ ,FACSCanto™)

2.BACKGROUND
The ReaPan S34 allow for flow cytometry based rapid and accurate assessment of 
live hematopoietic progenitor cells in accordance with the International Society of 
Hematotherapy   and   Graft   Engineering   (ISHAGE)   guidelines.   Success   of 
Hematopoietic transplantations and hematopoietic progenitor cell storage is relative 
to the absolute live CD34+ hematopoietic progenitor cells (HPC’s).
    11/10/2009 3
 
The ReaPan S34 reagent facilitates a robust, single platform method of enumerating 
viable human CD34+ cells. The CD34 antigen is  an 110Kda single chain type1 
trans­membrane glycoprotein, associated with human hematopoietic progenitor cells 
(1).   Reagent   contains   workshop   approved   anti   mouse   anti­human   monoclonal 
antibody specific to the CD45 antigen, CD34 specific Class III mouse anti­human 
monoclonal antibody, and 7­Amino Actinomycin­D (7­AAD) dye (for the detection 
of dead cells). 
Viability dye 7­ Amino Actinomycin D is a DNA intercalating agent that stains only 
cells in the late phases of cell death when the integrity of both the cell and nuclear 
membranes is lost(6). It is important to exclude CD34 dead cells to assist in counting 
true live CD34+ cells (5). Investigators have demonstrated  that graft containing 4­
5X 106     CD34+ cells /Kg recipient ideal body weight(IBW) will result in rapid, 
durable, trilineage engraftment(4).

3. REAGENT

    11/10/2009 4
 
The ReaPan S34 reagent is formulated in buffered saline with sodium azide 
and   stabilizers.   R­Phycoerythrin   (PE)   –   is   labeled   to   mouse   anti­human 
monoclonal CD34 antibody (clone­581), Atto­488 labeled mouse Anti­human 
CD45   antibody (clone­H130) and optimized concentrations of 7­AAD (1,7). 
7AAD is important to exclude CD34 dead cells to assist in counting true live 
CD34+ cells (5).  Specificity of the reagent enhanced by the use of class III 
mouse   monoclonal   antibody   to   CD34.   Class   III   epitopes   have   broader 
distribution on both normal HPC’s and blast cells (3, 4).    A precise number of 
fluorescent beads are included to facilitate reference number for absolute cell 
count. Reagent is provided as a ready­to­test, in flow cytometer compatible 
sample tubes.
4.  Precautions
• Warning: The ReaPanS34 reagent contains Sodium azide. Sodium azide is 
harmful   if   swallowed.   Wear   suitable   protective   clothing.   If   swallowed, 
seek medical advice immediately. Contact with acids liberates toxic gas. 

    11/10/2009 5
 
Azide should be flushed with large amounts of water during disposal to 
avoid deposits in lead or copper plumbing.
• Warning: All blood specimens are considered biohazards. Handle them as 
if they are capable of transmitting infection and dispose off with proper 
precautions in accordance with governmental regulations.
• Warning:  The ReaPan  S34 reagent  contains  7AAD­  viability dye.  Pure 
7AAD   is   a   potential   carcinogen,   although   this   compound   is   highly 
diluted in the reagent it is recommended to avoid contact with eyes and 
skin.
• The addition of the precise volume of blood is critical to obtain correct 
results.   Use   a   calibrated   pipette   and   operate   according   to   the 
manufacturer’s instructions.
• The ReaPanS34 reagent and the reference count beads are in dried form. 
It is critical to ensure vigorous vortexing after addition of blood sample 

    11/10/2009 6
 
to ensure solubilization of the reagent and the beads. (Note: Vigorous 
Vortexing will not affect the CD34+ population).
• The  Total leukocyte count should Not exceed 30X103   cells/µL and 
CD34+ cell count should not exceed 2000 cells/ µL( Please perform 
Dilution if the Count exceeds  above the mentioned value)
• Stained samples must be analyzed within Three hours to ensure precise 
viable cell counting.
• The   use   of   temperatures   condition,   Incubations   time   and   mixing 
(Vortex) other than specified, may give erroneous results.
5.  Storage and Handling
• Store the reagent at room temperature in a dry place. Do not use the 
reagent after the expiry date. (Refer the label)
• Do not freeze the ReaPan S34™.
• The ReaPanS34 reagent is light sensitive.  Do not  expose to direct 
    11/10/2009 7
 
light either during storage or sample processing.
6.Indication of Stability :
       ReaPan S34 reagent is a dry glassy coating at the bottom of the reaction tube.  Do not 
        use if the reagents appears to be moist or it has become dislodged from the bottom of 
        the reaction tube.
7. Instrument
The   ReaPanS34   reagent   has   been   tested   on   the   FACScan™   and 
FACSCalibur™,FACSCanto™   systems   manufactured   by   Becton­Dickinson 
and other open Flow Cytometers. ReaMetrix recommends running this reagent 
on   these   instruments.   The   instrument   should   be   calibrated   for   setting 
photomultiplier   tube   voltages,   fluorescence   compensation,   and   checking 
instrument sensitivity according to the manufacturer’s guidelines.
It is the responsibility of the user to optimize the performance of the reagent 
for use in flow cytometer other than those mentioned above. 

    11/10/2009 8
 
8.    SPECIMEN COLLECTION
Universal   precautions   and   good   laboratory   practice   (GLP)   should   be   adopted 
while processing blood and human tissue samples.
The peripheral  Blood, Placental  blood, Apheresis  sample or bone marrow 
sample should be collected in a sterile blood collection tube containing K3­
EDTA.   Follow   the   collection   tube   manufacturer’s   guidelines   for   the 
minimum volume of blood to be collected.
The   anti­coagulated   sample   must   be   stored   at   room   temperature   (20°C   ­ 
25°C)   and   should   be   analyzed   ideally   within   24   hours   of   collection   and 
within three hours of staining.
Cryopreserved   blood   and   bone   marrow   should   be   processed   preferably 
within 30 minutes after thawing (7).

    11/10/2009 9
 
9. PROCEDURE

Reagent Provided
ReaPan S34 reagent 

            Reagents and materials required but not provided

• Blood collection tube containing K3­EDTA
• Calibrated pipettes
• Vortex mixer
• ReaLyse   Lysing  Solution  (RMX  Catalog  No.  25237­00)   or  similar 
blood fix/lyse solution.
• Sheath fluid (BD FACSFlow™ Catalog No. 340398 or equivalent)
• Calibrite Beads
    11/10/2009 10
 
Assay Protocol

• Mix blood sample (invert blood tube at least 10 times) and pipette 
50µL of blood into the single use ReaPanS34 reagent tube.
• Vortex each tube thoroughly for 30 seconds. Incubate for 30 minutes 
at room temperature. Protect the tube from direct light.
• Add 450µL of ReaLyse™ or equivalent fix/lyse solution to each tube 
and vortex for 20 seconds. Return tubes to the dark for at least 15 
minutes to ensure complete lysis.
• Vortex sample tube thoroughly (at low speed) and load onto cytometer 
for analysis.
• Analyze   the   sample   within   3.0   hrs   from   staining   and   fixing   the 
sample.

Flow Cytometer Acquisition and Analysis
    11/10/2009 11
 
This protocol assumes that the flow cytometer has been setup according to the 
manufacturer’s   instructions   (For   example,   In   the   case   of   FACScan™,   the 
instrument   should   be   setup   and   calibrated   using   CaliBrite™   beads   and 
FACSComp™ software). Open the CellQuest™ Pro software and connect to 
the cytometer. 
The fluorescence filters referred to in the subsequent sections are given below:
• FL1 – 530 ± 30 nm
• FL2 – 585 ± 42 nm
• FL3   –   670   nm   LP   (BD   FACSCalibur™)   or   650   nm   LP(BD 
FACScan™)
Instrument Setting:
Before   collecting   the   sample   data   it   is   necessary   to   optimize   instrument 
electronics   for   acquiring   good   quality   data.   Instrument   controls   (detectors, 
compensation, threshold and amplifiers) are adjusted optimally to display cell 

    11/10/2009 12
 
population of interest (This step is critical and must not be skipped to ensure 
the accuracy of the test results).
• Follow manufacturer’s guidelines to calibrate the system.
• Change the threshold channel From FL3 to FL1 (300±50)
ISHAGE recommended cell enumeration strategy: 

CD45+   events   are   selected   precisely   to   include   all   the   CD45+   cells   to 
establish   the   minimum   size   range   for   lymph   blast   region   (R1).The   lower 
extremity of R1 is set low enough to include all CD45+ dim CD34+events. It 
has been demonstrated that the pre­selection of Lymphocytes increases  the 
specificity   of   the   test   by   eliminating   nonspecifically   stained   debris   and 
platelets  (1).  Region­2 is  adjusted to select  all  the CD34+  dim  and  bright 
population to include all CD34+ cells. Region 3 is created as an amorphous 
region   to   best   delineate   live   from   dead   cells.   Region   ­4   is   gated   on   the 
cumulative regions R1, R2&R3 which demonstrates CD34+ cells which CD45 
    11/10/2009 13
 
dim and are live.CD34+ positive cells share the morphological characters of 
lymphocytes.   True   live   CD34+   cells   are   selected   on   Region­6(R6)   by 
Intersecting   R1*R2*R3*R4   cell   population   with   respect   to   lymphocyte 
population (View­5) and by eliminating platelet aggregates and monocytes (1)
Draw dot­plot (View­1 View­2, View 3, View­4, View­5, View 6, View­7, and View­8

• View­1: CD45­A488 fluorescence (FL1) versus side scatter (SSC­Lin ­
                     scale).
• View­2: CD34­PE Fluorescence (FL2) versus side scatter(SSC­Lin­  
                     scale)  
• View­3: 7­AAD fluorescence (FL3) versus side scatter(SSC­Linear 
                    scale) 
• View­4:CD45­A488 Fluorescence(FL1) versus side scatter(SSC­
                    Linear scale)
    11/10/2009 14
 
• View­5 Forward scatter(Linear) versus Side scatter (Linear)­ for CD45 
                    reference
• View­6 Forward scatter(Linear) versus Side scatter (Linear)­ for 
                    Absolute CD34+ cell counting
• View­7 Forward scatter(Linear) versus Side scatter (Linear)­ For   
                     selection of beads.
• View­8 CD45­A488 Fluorescence (FL1) versus 7­AAD Fluorescence   
                     (FL3) For selection of beads.
 Set the number of events to capture at 3000 for R8 gate (View8)

    11/10/2009 15
 
     
View­1 View­2 View­3
Dot plot views:
• View­1 CD45­A488 fluorescence (FL1 ­ log scale) versus side­scatter (SSC – Lin scale) 
to establish lymph blast region. 
• View­2  CD34­PE   fluorescence   (FL2­log)   versus  –side   scatter  (SSC   –  Lin   scale),   to 
capture CD34+ cells (R2),  

    11/10/2009 16
 
• View­3  7­AAD   fluorescence   (FL3­log)   versus   –side   scatter   (SSC   –   Lin   scale),   to 
eliminate dead cells from live cells (R3)  

View­4 View­5 View­6


Dot plot views: 
• View­4  Intersection population of (R1*R2*R3) fluorescence (FL1 ­ log scale) versus 
side­scatter (SSC – Linear scale) to capture CD34+ cells (R4).
    11/10/2009 17
 
• View­5 CD45­A488 (R5) population plotted on forward scatter (FSc­Lin) versus –side 
scatter (SSC – Lin) as a reference plot for scatter properties.
• View­6 R4 gate applied on forward scatter (FSc­Lin) versus –side scatter (SSC – Lin). , 
to eliminate non CD34+ cells (R3).  
 

View­7 View­8 View­9


Dot plot views:
    11/10/2009 18
 
• View­7  Beads (R7) population is selected on forward scatter (FSC­Lin) versus –side  
scatter (SSC – Lin).
• View­8  Beads   (R7)   population   plotted   on   forward   scatter   (FSC­Lin)   versus   –side 
scatter (SSC – Lin)to eliminate any cell contamination and get absolute beads count. 
• View­9 population plotted on forward CD45­A488 (FL1­Log) CD34­PE (FL2­Log) to 
refer the threshold on FL1 Channel and avoid any loss of CD34+ cells. 

10. Calculations for CD34+ Counts:

      Use the following Equation to enumerate absolute live CD34+ cell events 
      Acquire the regional stats for R6 on View ­6 for CD34+ live    Cells.
      Acquire Gate Stats for G8 for bead events (R8) on view8.

      Viable CD34+ cells/µl = 

    11/10/2009 19
 
                             CD34+ events in region R6       Beads per Test
                           ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­X ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ X Dilution    
                          Bead events in ( R8)                Sample Volume µl (50)

*The bead per test value is provided on the reagent pouch and varies form lot to 
lot.

11. WARRANTY.

This product is warranted only to conform to the quantity and contents stated 
on the label at the time of delivery to the customer. There are no warranties, 
expressed or implied, that extend beyond the description on the label of the 
product. ReaMetrix’s  sole liability is limited to replacement  of the product. 
Reametrix is not liable for property damage, personal injury, or economic loss 
caused by the product. 
    11/10/2009 20
 
Note: FACScan, CaliBRITE, FACSLyse, FACSComp, FACSCalibur are all registered  
trade names of Becton­Dickinson. 

    11/10/2009 21
 
12. REFERENCES
1. Sutherland DR., Marsh J.C. , David J. et al, Differential sensitivity 
of   CD34   epitopes   to   cleavage   by  pasteurella   hemolytica 
glycoproteases   implication   for   purification   of   CD34     Positive 
progenitor cells. Exp Hematol 1992;20;590­599.
2. Michael  Keeney,Ian  Chin Yee,  Karin  Weir,  Jan Popma, Rakash 
Nayar   and   D.Robert   Sutherland.Single   platform   cytometric 
absolute   CD34+   cell   counts   based   on   the   ISAGE   guidelines. 
Cytometry (Communications in clinical cytometry) 34:61­70(1998) 
3. Mario   Otto,Xiaohua   Chen,William   J.Martin,Wing   Leung,James 
Knowles,Marti  Holladay,Jim  Houston, Rupert  handgretinger  and 
Raymond C. Barfield.­Selection of stem cells by using antibodies 

    11/10/2009 22
 
that target  different  CD34 epitopes yields different patterns of T 
cell differentiation Stemcells :2007:25:537­542. 
4.
5. SJ Noga,GB Vogelsang, SC Miller, S Meusel, K Loper, R Case, B 
Myers,  L  Rogers,   I  Flinn,  M  Borowitz   and  PO  Donnell.  Using 
point   of   care   CD34   enumeration   to   optimize   PBMC   collection 
conditions. CytoTherapy(2001) vol 3, No.1, 11­18.
6. P.Pranke, J.Hendrikx, G.Alespeiti,N.Nardi, P.Rubinstein, J.Visser­
Comparative  quantification of Umbilical  cord blood CD34+ and 
CD34+   bright   cells   using   the   Procount™   BD   and     ISHAGE 
protocols.­Brazilian   journal   of   medical   and   biological  
research(2006)39:901­906.

7. Heeje Kim, Katharine A. Whartenby, Robert W. Georganatas III, 
John Wingard, Curt I. Civin. Human CD34+ Hematopietic stem / 
    11/10/2009 23
 
Progenitor cells express high levels of FLIP and are resistant to Fas 
mediated Apoptosis. Stem Cells 2002; 20; 174­182.
8. AFCG Guidelines 2006

             

          

    11/10/2009 24
 
Manufactured by ReaMetrix India Pvt. Ltd.               
50­B, II Phase, Peenya Industrial Area
Peenya, Bangalore 560058, India
Ph: +91­80­28378693/5, Fax: +91­80­41172451
E­mail: info@reametrix.com
www.reametrix.com
Rev No. 2.0,  14­Apr­09

    11/10/2009 25