UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

CENTRO UNIVERSITARIO DE SUR OCCIDENTE

TECNICO EN PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS
MICROBIOLOGIA I
PRACTICA DE LABORATORIO No.5
TINCION SIMPLE Y TINCION DIFERENCIAL DE GRAM
INTRODUCCION
Para teir los microorganismos se is!one e "n gran n#mero e
com!"estos org$nicos coloreaos %colorantes&' En general( estos com!"estos
son "n tanto com!le)os en c"anto a s" estr"ct"ra molec"lar' De ac"ero con
esto se !"een clasi*icar en gr"!os como colorantes e tri*enilmetano(
colorantes e o+acina , colorantes e tiacina'
Una clasi*icaci-n m$s !r$ctica es e ac"ero con el com!ortamiento
."/mico el colorante( es ecir $cio( 0$sico , ne"tro' Un colorante $cio %o
ani-nico& es a."el one la 0alan1a e la carga so0re el ion colorante es
negati2a3 "n colorante 0$sico %o cati-nico& es a."el one la carga lle2aa !or
el ion colorante es !ositi2a' Un colorante ne"tro es "na sal com!"esta e "n
colorante $cio , "n colorante 0$sico( como el eosinato e a1"l e metileno'
En general( los colorantes $cios tien a los com!onentes cel"lares 0$sicos ,
los colorantes 0$sicos a los com!onentes cel"lares $cios'
El !roceso e la tinci-n s"!one "na reacci-n e intercam0io e iones
entre el colorante , los sitios acti2os e la s"!er*icie o el interior e la c4l"la'
Los iones teios el colorante reem!la1an a otros iones en los com!onentes
cel"lares'
TINCIONES/COLORACION SIMPLE:
La coloracin de las bacterias por la aplicacin de una solucin
colorante simple en preparaciones i!as " te#idas se conoce como
coloracin simple$ El rote i!o se inunda con la solucin colorante
durante un periodo establecido% despu&s de lo cual el colorante se
arrastra con a'ua " la l(mina se seca con papel secante$
)tili*an un solo colorante$ Se basan en el +ec+o de ,ue las
c&lulas tienen una composicin ,u-mica dierente a la de su entorno%
de modo ,ue ambos se comportan de orma dierente rente a un
colorante$ E!em: A*ul de metileno% saranina% etc$
TINCIONES/COLORACION .I/ERENCIAL:
Los procedimientos de coloracin ,ue ponen de maniiesto
dierencias entre las c&lulas bacterianas o en partes de una c&lula
bacteriana se conocen como t&cnicas de coloracin dierenciales$
Son al'o m(s elaborada ,ue la t&cnica simple en la ,ue las c&lulas se
someten a una sola solucin colorante o reacti0o colorante$
En las tinciones i*erenciales se em!lean m$s e "n colorante( ,a sean
)"ntos o se!araamente( seg#n la t4cnica e ."e se trate'
Las os coloraciones i*erenciales e ma,or im!ortancia en
0acteriolog/a son las e Gram , la e $cio5resistencia'
La tinci-n e Gram( e0e s" nom0re al Bacteri-logo Dan4s C6ristian
Gram ."e la esarrollo en 7899'
En la coloraci-n e Gram se a!lica al *rotis "na sol"ci-n e colorante
!rimario( cristal 2ioleta o 2ioleta genciana( seg"ia e l"gol como moriente3 se
la2a l"ego la !re!araci-n con alco6ol5acetona o alco6ol al :;<( , *inalmente se
a!lica "n colorante e contraste( como la sa*ranina o *"s6ina' Alg"nas
0acterias al ser la2aas con alco6ol5acetona retienen el !rimer colorante(
."eano e color a1"l( , se les enomina Gram5!ositi2o' Otras en cam0io(
!ieren el !rimer colorante al ser la2aas con alco6ol5acetona sieno l"ego
teias con el seg"no colorante e "n color ."e 2a e rosao a ro)o( a estas
#ltimas e les enomina Gram5negati2o'
Es "na tinci-n diferencial e gran im!ortancia en Micro0iolog/a !or."e
!ermite i*erenciar os granes gr"!os e 0acterias( Gra!"o#i$i%o & Gra!
ne'a$i%o( seg#n se com!orten ante esta tinci-n'
La teor/a act"al so0re el Gram( es ."e las i*erencias tintoriales se
e0en !rinci!almente a los i*erentes graos e !ermea0ilia en las !arees
cel"lares e las istintas 0acterias( "rante el tratamiento con alco6ol al :;< o
alco6ol5acetona'
El *"namento raica en la i*erente estr"ct"ra e la !are cel"lar e
am0os gr"!os= las 0acterias Gram> tienen "na gr"esa ca!a e !e!tioglicano
en s" !are( mientras ."e las 0acterias Gram5 tienen "na ca!a e
!e!tioglicano m$s *ina , "na ca!a li!o!olisacar/ica e+terna' Tras la tinci-n
con el !rimer colorante %Cristal 2ioleta& se e*ect#a "n la2ao con etanol ."e
arrastrar$ al colorante s-lo en las Gram %5&( mientras ."e en las Gram %>& el
colorante ."ea
retenio , las c4l"las !ermanecer$n a1"les' Las c4l"las Gram %5& se teir$n
es!"4s con "n colorante e contraste %sa*ranina& !ara ."e !"ean
o0ser2arse'
Como res"ltao el tratamiento con alco6ol( la !are e las 0acterias
Gram negati2o es is"elta o esorgani1aa( !ermitieno ."e el com!le)o ,oo5
cristal 2ioleta( ."e es sol"0le en alco6ol( esca!e e la c4l"la' En cam0io en las
0acterias Gram !ositi2o !or tener "na com!osici-n i*erente( en l"gar e
isol2erse o esorgani1arse la !are cel"lar( 4sta ismin",e e !orosia(
re"cieno as/ s" !ermea0ilia , !or consig"iente el com!le)o ,oo5cristal
2ioleta es i*/cil e e+traerse' E+isten moi*icaciones e la coloraci-n e Gram(
como la e ?o!elo**( "saa !ara 0acterias anaer-0icas'
El e+amen con microsco!io -!tico e !re!araci-n con tinci-n e Gram
se em!lea e r"tina !ara eterminar la *orma e las 0acterias' Las *ormas
com"nes son cocos %es*4ricas&( 0acilos %alargaas& , *ormas es!iralaas'
OB(ETI)OS
7' Em!lear t4cnicas 0acteriol-gicas sim!les'
@' Conocer el *"namento estr"ct"ral e la Tinci-n e Gram
A' Utili1ar colorantes , conocer s" "tili1aci-n'
UTENSILIOS Y MATERIALES

Materiales=
UBC en Agar PCA
Bac$eria# del Yo'*r$ +lle%ar *n &o'*r$ na$*ral,
Mec6ero
Asa
Desin*ectante
Microsco!io
Cron-metro
Portao0)etos
Go$ero#
Bane)a !ara 6acer tinci-n'
A1"l e metileno
Sol"ci-n Cristal 2ioleta
Sol"ci-n e l"gol
Alco6ol5acetona
Sol"ci-n sa*ranina
Aceite e inmersi-n
PROCEDIMIENTO -=
7' La2ar con )a0-n , ag"a "n !ortao0)etos'
@' Secar' Rot"lar e ienti*icar la m"estra 6acieno "n c/rc"lo en el
!ortao0)etos %como le e+!licar$ el ocente&'
3. Desin*ectar el asa %ag")a e inoc"lar& en el mec6ero. Blamear el asa e
siem0ra 6asta ."e ao!te "n color ro)o( ,a ."e e esa manera se
esterili1a'
9' Pre!araci-n el *rotis= con "n asa e siem0ra se toma "na !e."ea
cantia e ,og"rt , se me1cla so0re "n !ortao0)etos con "na gota e
ag"a( 6acieno "na e+tensi-n o "n *rotis( ."e se e)a secar'
;' Bi)aci-n= Se calienta s"a2emente el !ortao0)etos con "n mec6ero
%alco6ol&( !or la cara o!"esta a la ."e contiene la e+tensi-n %sin ."e el
!ortao0)etos lleg"e a ."emar so0re el orso e la mano&
Antes e aair el colorante 6a, ."e eliminar la grasa el ,og"rt( !ara lo
c"al se la2a la !re!araci-n con la me1cla e alco6ol5cloro*ormo o con
metanol ."e se aiciona con "n gotero'
C' Tinci-n= Se c"0re el *rotis con a1"l e metileno "rante 75@ min"tos(
l"ego la2ar con ag"a !ara eliminar el e+ceso e colorante' Se e)a
secar la !re!araci-n'
D' Aicionar 7 gota e aceite e inmersi-n so0re la m"estra'
8' O0ser2ar al microsco!io( "tili1ano el o0)eti2o e inmersi-n' Anotar los
res"ltaos'
PROCEDIMIENTO .=
7' Lim!iar el !ortao0)etos con ag"a , )a0-n' Secar' Rot"lar e ienti*icar la
m"estra 6acieno "n c/rc"lo en el !ortao0)etos %como le e+!licar$ el
ocente&'
2. Desin*ectar el asa %ag")a e inoc"lar& en el mec6ero. Blamear el asa e
siem0ra 6asta ."e ao!te "n color ro)o( ,a ."e e esa manera se
esterili1a'
A' Pre!araci-n el *rotis %c"lti2o con los microorganismos&= so0re "na
l$mina lim!ia , *i)arlos a la llama' Estos !"een estar en calo %t"0o con
l/."io& o !"een estar sem0raos en agar n"triente %!laca Petri con
meio ."e se 2e s-lio&' Con el asa %esin*ectaa& o0tener "na gota e
estos %si los mismos est$n en "n calo n"triente& o !"ee o0tener con la
ag")a e inoc"lar en !"nta "na !e."ea m"estra el c"lti2o si est$n en
agar' Trans*iera a la laminilla lim!ia la m"estra el c"lti2o' Desin*ecte el
asa n"e2amente'
9' Si las 0acterias est$n en agar e0er$ agregar "na gota e ag"a est4ril al
!ortao0)etos antes e trans*erir las 0acterias el agar a la laminilla'
;' Bi)aci-n= Pasar el !ortao0)etos !or la *lama 2arias 2eces m", r$!io ,
es!erar ."e la m"estra se se."e' La *lama e0e !asar !or la !arte e
a0a)o el !ortao0)etos %la m"estra ."ea en la !arte e arri0a el
!ortao0)etos&'
C' Tinci-n=
a'& C"0rir los *rotis con sol"ci-n e cristal 2ioleta "rante 7 min"to'
La2ar m", 0re2e , s"a2emente con ag"a corriente'
0'& Esc"rrir la l$mina , c"0rirla con sol"ci-n l"gol "rante "n min"to'
La2arla con ag"a el c6orro'
c'& Agregar gotas e alco6ol5acetona so0re la !re!araci-n 6asta ."e
4sta e)e e soltar color 2ioleta %e 9 a C gotas&( , la2ar inmeiatamente
con ag"a corriente'
'& C"0rir la l$mina con sol"ci-n e sa*ranina "rante "n min"to' La2ar
con ag"a( esc"rrir , secar c"iaosamente con !a!el secante o al aire'
e'& Aicionar "na gota e aceite e inmersi-n'
e'& E+aminar la !re!araci-n( em!leano el o0)eti2o e inmersi-n ,
anotar a contin"aci-n los res"ltaos'