2 Tubes per test

Product Catalog No: 25124­00

Rea T­Count
CD4/CD3
&
CD8/CD3
Reagent
                                                                    

                             Manufactured by 
2
                  Rea T­Count Reagent

1. INTENDED USE

The Rea T­Count reagent is a two color immunofluorescence reagent 
for   the   labeling   and   identification   of   helper/inducer   (CD3+CD4+)   and 
cytotoxic/suppressor   (CD3+CD8+)   T   lymphocytes   combined   with   a 
precise number of fluorescent counting beads for absolute CD4+,CD8+ 
and  Average   CD3+   T­Cell  counts.     This  reagent   is  intended   for  flow 
cytometry based analysis in unlysed human whole blood samples.

2. BACKGROUND

The Rea T­Count reagent contains fluorescently labeled antibodies that 
bind to CD3, CD4, or CD8 antigens found on the surface of circulating 
leukocytes. 
The CD3 antigen is a complex of at least six proteins known collectively 
as the T­cell receptor (TCR) complex. The antibody used in this reagent 
3
 binds to the 20kDa ε  chain of this complex.

The CD4 antigen is a 59kDa protein. It interacts with class II molecules 
of the major histocompatibility complex and is the primary receptor for 
the Human Immunodeficiency Virus (HIV).

The   CD8   antigen   is   a   complex   consisting   of   two   disulfide   linked 

subunits.   The   antibody   used   in   this   reagent   binds   to   the   32kDa   α 
subunit   of   the   complex.   CD8   interacts   with   class   I   major 
histocompatibility complex molecules.

Cells   that   are   both   CD3+   and   CD4+   are   identified   as   helper/inducer 
lymphocytes. Decreased CD4+CD3+ cell counts have been associated 
with   some   forms   of   immunodeficiency.   Suppressor/cytotoxic 
lymphocytes   are   the   subset   of   cells   that   have   both   CD3   and   CD8 
receptors.   Increased   CD8+CD3+   cell   counts   have   been   observed   in 
some cases of immunodeficiency.  

3. Rea T­Count Reagent

4
 The Rea T­Count reagent consists of a single unit comprising of two 
tubes, with dried down reagents formulated in buffered saline, sodium 
azide   and   stabilizers.   One   tube   contains   CD4   monoclonal   antibody 
(clone RPA­T4) labeled with Phycoerythrin (PE) and CD3 monoclonal 
antibody  (clone   UCHT1)  labeled   with   PE­Dyomics649.The   other  tube 
contains   CD8   monoclonal   antibody   (Clone   LT8)   labeled   with 
Phycoerythrin   (PE)   and   CD3   monoclonal   antibody   (clone   UCHT1) 
labeled  with PE­Dyomics649.  The  monoclonal antibodies used  in  the 
Rea T­Count were assigned these specificities at the 8th International 
Workshop   on   Human   Leukocyte   Differentiation   Antigens.   A   precise 
number of fluorescent counting beads are included in each tube to allow 
single­platform   determination   of   absolute   CD4+   and   CD8+   T­cell 
counts.   The   Rea   T­Count   reagent   is   provided   in   dried   form   and 
dispensed   in   FACSCountTM  compatible   sample   tubes   with   each   unit 
containing one ready­to­use test.

Precautions

1. Warning: The Rea T­Count reagent contains sodium azide. Sodium 
azide is harmful if swallowed. Wear suitable protective clothing. If 
5
 swallowed,   seek   medical   advice   immediately.   Contact   with   acids 
liberates toxic gas. Azides should be flushed with large amounts of 
water during disposal to avoid deposits in lead or copper plumbing.

2. Warning:   All   blood   specimens   are   considered   bio­hazardous. 

Handle   them   as   if   they   are   capable   of   transmitting   infection   and 
dispose   off   with   proper   precautions   and   in   accordance   with 
governmental regulations.

3. The addition of precise volume of blood is critical to obtain correct 
results.   Use   a   calibrated   pipette   and   operate   according   to   the 
manufacturer’s instructions.

Storage and Handling

1. Store the reagent at room temperature in a dry place. Do not use 
the reagent after the expiry date on the label.
2. Do not freeze Rea T­Count reagent.
3. The Rea T­Count reagent is light sensitive. Do not expose to direct 
light either during storage or when mixed with blood.
6
 4. INSTRUMENT

The   Rea   T­Count   reagent   is   designed   to   be   used   on   FACSCount TM 

manufactured by Becton Dickinson equipped with a convection cooled 
540nm   laser   that   is   capable   of   detecting   two   fluorescent   colors   and 
measures relative cell size. The CD3 cells fluoresce red and CD4 and 
CD8   cells   fluoresce   yellow.   This   instrument   can   be   used   for 
enumerating   absolute   lymphocyte   counts   namely;   helper/inducer 
(CD3+CD4+)   and   cytotoxic   /suppressor   (CD3+CD8+).   Instrument 
should   be   calibrated   by   setting   photomultiplier   tube   voltages, 
fluorescence   compensation,   and   checking   instrument   sensitivity 
according to the manufacturer’s guidelines.
 
5. SPECIMEN COLLECTION

The blood sample should be collected in a sterile blood collection tube 
containing   K3­EDTA.   Follow   the   collection   tube   manufacturer’s 
guidelines for the minimum volume of blood to be collected.

7
 The anti­coagulated blood must be stored at room temperature (20°C ­ 
25°C) and should be stained and analyzed within 24 hours of draw.  

Refrigerated,   hemolyzed,   and   previously   fixed   blood   specimens   can 

yield erroneous results and should be rejected.

6. PROCEDURE

Reagent Provided

1. Rea­T   Count   Reagent   in   a   dried   format   (10   units/pack,   each   unit 

contains two tubes)­Part No: 25124­00
2. ReaFix Fixative solution (10X concentrate)­ Part No.:25325­00
3. ReaFix Diluent Solution­ Part No.:25326­00

8
 Refer   to   the  ReaFix   Fixative   solution   (10X)  package   insert   for 
dilution instructions and warnings.

Reagents and materials required but not provided
1. Blood collection tube containing K3EDTA
2. Calibrated pipettes
3. Vortex mixer
4. Becton Dickinson FACSCountTM Instrument 
(Becton Dickinson Cat No: 337858)
5. Sheath fluid (Becton Dickinson FACSFlow™ Catalog No. 340398 
or equivalent)
6. BD FACSCountTM Control kit (Becton Dickinson Cat No: 340166)
7.   BD   FACSCountTM  Reagent   Kit   to   set   up   controls   (Becton 
Dickinson Catalog No. 340167)
8.   BD   FACSCount™   CD4   Software   and   User’s   Guide   Assembly 
(Becton Dickinson Catalog No. 339011)

Preparation of Control Samples

9
 Follow   Manufacturer’s   instructions   for   setting   up   the   control   in   the 
FACSCountTM  Instrument  (Use BD FACSCountTM  Reagent  for setting 
the control)

Preparation of the patient samples

1. Blood samples must be collected in a (K3EDTA) vacutainer tube and 
be stored no longer than 48 hours at room temperature.
2. Place the samples in the workstation.
3. Take one reagent pair per sample from the foil bag containing the 
Rea T­Count tubes. Reseal the foil bag and return unused reagent 
pairs to the appropriate place. DO NOT refrigerate the reagents.
4. Label the tab of each reagent pair with the sample number found on 
the blood tube.
5. Mix blood sample by inverting the tube 5 times.
6. Reverse   Pipette  50µL  of   whole   blood   into   each   of   the   2   reagent 
tubes. Use a new pipette tip for each tube.
7. Cap the tubes and vortex vigorously for 30 seconds each.

10
 8. Incubate for 60 minutes to 120 minutes at room temperature. Place 
reagent pairs in the workstation and close the cover to protect the 
reagents from light.
9. Uncap   tubes   and   pipette   450µL   of   1X   Working   ReaFix   fixative 
solution into each reagent tube. Use a new pipette tip for each tube. 
Refer to the ReaFix Fixative solution (10X) package insert for dilution 
instructions to prepare 1X working ReaFix Fixative Solution.
10.Recap the tubes and vortex for 15 seconds each.
11. Run the tubes on the FACSCountTM within 24 hours of preparation. 
Store samples at room temperature in the workstation until they are 
run on the instrument. Vortex upright for 5 seconds before running.

Entering patient information

1. Press [sample].
2. Enter or verify reagent lot code and bead counts as provided on Rea 
T­Count pouch.
3. Press [confirm]
4. Enter the patient accession number

11
Running patient samples

1. Vortex the reagent pair for 15 seconds.
2. Uncap the CD4 tube and place the reagent pair in the sample holder 
so the CD4 tube is in the run position.
3. Press [run]
4. Remove reagent pair and recap CD4 tube.
5. Uncap CD8 tube and place so the CD8 tube is in the run position.
6. Press [run]
7. After a successful run the  results will print out. If the  sample fails 
review reported error and refer to BD FACSCountTM guide to rectify 
problem.
8. The patient results are displayed on the screen and are automatically 
printed.
9. The sample printout contains the following information:

12
10. Reagent   information­reagent   lot   code   and   reference   bead 
counts entered for the sample run.  (This number should match the 
reagent lot code for the control run.)
11. Date (mm / dd / yy) and time the patient sample was run
12. Control information­control run results, date controls were run, 
reagent lot code entered for the control run, control lot code.
13. Patient accession number
14. Patient results 
15. Absolute Counts ­ cells/µl of CD4 & CD8
16. Total CD3 Average
17. CD4/CD8 ratio
18. Remove the reagent pair, recap the CD8 tube and discard in the 
biohazard waste container.
19. Repeat above steps until all patient samples have been run.
20. Discard the reagent pair in an appropriate biohazard container.
21. Shut down instrument as per manufacturer’s instructions.

13
22. A sample report is generated after every sample run. The sample 
report is attached below (Refer Figure 1)

14
Figure 1: Patient Sample 
15
Report
7. LIMITATIONS

1. The   Rea   T­Count   reagent   has   only   been   validated   with 

K3EDTA or K2EDTA treated whole blood.

8. WARRANTY

This product is warranted only to conform to the quantity and contents 
stated on the label at the time of delivery to the customer. There are no 
warranties, expressed or implied, that extend beyond the description on 
the label of the product. ReaMetrix sole liability is limited to replacement 
of   the   product.   Reametrix   is   not   liable   for   property   damage,   personal 
injury, or economic loss caused by the product. 

Note: FACSCountTM is a registered trade name of Becton­Dickinson. 

16
Manufactured by ReaMetrix India Pvt. Ltd.
Manufacturing License Number: KTK/25/519/2006
50­B, II Phase, Peenya Industrial Area
Peenya, Bangalore 560058, India
Ph: +91­80­28378693/5, Fax: +91­80­41172451
E­mail: info@reametrix.com, 
17
www.reametrix.com
Rev No. 3.0,  29­Sep­09

18