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1 Tube per test

Product catalog No: 25242­00

Rea T­Count
CD4/CD3
Reagent
                                                                    

   Manufactured by 
     Rea T­Count Reagent­ CD4/CD3

1. INTENDED USE

The Rea T­Count reagent is a two color immunofluorescence reagent 
for   the   labeling   and   identification   of   helper/inducer   (CD3+CD4+)   T 
lymphocytes combined with a precise number of fluorescent counting 
beads   for   absolute   CD4+   and   CD3+   T­Cell   counts.     This   reagent   is 
intended   for   flow   cytometry   based   analysis   in   unlysed   human   whole 
blood samples.

2. BACKGROUND

The Rea T­Count reagent contains fluorescently labeled antibodies that 
bind   to   CD3   and   CD4   antigens   found   on   the   surface   of   circulating 
leukocytes. The CD3 antigen is a complex of at least six proteins known 
collectively as the T­cell receptor (TCR) complex. The antibody used in 
this   reagent   binds   to   the   20kDa  ε   chain   of   this   complex.   The   CD4 
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antigen is a 59kDa protein. It interacts with class II molecules of the 
major   histocompatibility   complex   and   is   the   primary   receptor   for   the 
Human Immunodeficiency Virus (HIV).
Cells   that   are   both   CD3+   and   CD4+   are   identified   as   helper/inducer 
lymphocytes. Decreased CD4+CD3+ cell counts have been associated 
with some forms of immunodeficiency. 

3. Rea T­Count Reagent

The Rea T­Count reagent contains dried down reagents formulated in 
buffered   saline,   sodium   azide   and   stabilizers.   The   reagent   has   CD4 
monoclonal  antibody  (clone  RPA­T4)  labeled  with  Phycoerythrin   (PE) 
and   CD3   (clone   UCHT1)   monoclonal   antibody   labeled   with   PE­
Dyomics649.

The   monoclonal   antibodies   used   in   the   Rea   T­Count   were   assigned 


these   specificities   at   the   8th   International   Workshop   on   Human 
Leukocyte   Differentiation   Antigens.   A   precise   number   of   fluorescent 
counting   beads   are   included   in   each   tube   to   allow   single­platform 
determination of  absolute CD4+  and  T­cell counts. The  Rea T­Count 
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reagent   is   provided   in   dried   form   and   dispensed   in   FACSCount TM 
compatible   sample   tubes   with   each   unit   containing   one   ready­to­use 
test.
Precautions

1. Warning: The Rea T­Count reagent contains sodium azide. Sodium 
azide is harmful if swallowed. Wear suitable protective clothing. If 
swallowed,   seek   medical   advice   immediately.   Contact   with   acids 
liberates toxic gas. Azides should be flushed with large amounts of 
water during disposal to avoid deposits in lead or copper plumbing.

2. Warning:   All   blood   specimens   are   considered   bio­hazardous. 


Handle   them   as   if   they   are   capable   of   transmitting   infection   and 
dispose   off   with   proper   precautions   and   in   accordance   with 
governmental regulations.

3. The addition of precise volume of blood is critical to obtain correct 
results.   Use   a   calibrated   pipette   and   operate   according   to   the 
manufacturer’s instructions.

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Storage and Handling

1. Store the reagent at room temperature in a dry place. Do not use 
the reagent after the expiry date on the label.
2. Do not freeze Rea T­Count reagent.
3. The Rea T­Count reagent is light sensitive. Do not expose to direct 
light either during storage or when mixed with blood.

4. INSTRUMENT

The   Rea   T­Count   reagent   is   designed   to   be   used   on   FACSCount TM 


manufactured by Becton Dickinson equipped with a convection cooled 
540nm   laser   that   is   capable   of   detecting   two   fluorescent   colors   and 
measures relative cell size. The CD3 cells fluoresce red and CD4 cells 
fluoresce yellow. This instrument can be used for enumerating absolute 
lymphocyte   counts   namely;   helper/inducer   (CD3+CD4+).Instrument 
should   be   calibrated   by   setting   photomultiplier   tube   voltages, 
fluorescence   compensation,   and   checking   instrument   sensitivity 
according to the manufacturer’s guidelines.

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5. SPECIMEN COLLECTION

The blood sample should be collected in a sterile blood collection tube 
containing   K3EDTA.   Follow   the   collection   tube   manufacturer’s 
guidelines for the minimum volume of blood to be collected.

The anti­coagulated blood must be stored at room temperature (20°C ­ 
25°C) and should be stained and analyzed within 24 hours of draw.  

Refrigerated,   hemolyzed,   and   previously   fixed   blood   specimens   can 


yield erroneous results and should be rejected.

6. PROCEDURE

Reagent Provided

1. Rea­T Count Reagent­ Part No: 25242­00
2. ReaFix Fixative solution (10X concentrate)­ Part No.:25325­00
3. ReaFix Diluent Solution­ Part No.:25326­00

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Refer to the ReaFix Fixative solution (10X) package insert for 
dilution instructions and warnings.

Reagents and materials required but not provided

1. Blood collection tube containing K3EDTA
2. Calibrated pipettes
3. Vortex mixer
4. Becton Dickinson FACSCountTM  Instrument (Becton Dickinson Cat 
No: 337858)
5. Sheath fluid (Becton Dickinson FACSFlow™ Catalog No. 340398 or 
equivalent)
6. BD FACSCountTM Control kit (Becton Dickinson Cat No: 340166)
7. BD FACSCountTM Reagent CD4/CD3 Kit to set up controls (Becton 
Dickinson Catalog No. 342512)

Preparation of Control Samples

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Follow   Manufacturer   instructions   for   setting   up   the   control   in   the 
FACSCountTM  Instrument  (Use BD FACSCountTM  Reagent  for setting 
the control)

Preparation of the patient samples

1. Blood samples must be collected in a (K3EDTA) vacutainer tube and 
be stored no longer than 48 hours at room temperature.
2. Take one reagent tube per patient from the foil bag containing the 
Rea T­count tubes. Reseal the foil bag and return unused reagent 
pairs to the appropriate place. DO NOT refrigerate the reagents.
3. Label the reagent with the sample number found on the blood tube.
4. Mix patient blood by inverting the tube 5 times.
5. Reverse Pipette 50 µL of whole blood into the reagent tubes. Use a 
new pipette tip for each tube.
6. Cap the tubes and vortex vigorously for 30 seconds.
7. Incubate   for   60   minutes   at   room   temperature.   Place   the   reagent 
tubes in the workstation and close the cover to protect the reagents 
from light.

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8. Uncap tubes and pipette 450 µL of ReaFix fixative solution into the 
reagent   tube.   Use   a   new   pipette   tip   for   each   tube.  Refer   to   the 
ReaFix Fixative solution (10X) package insert for dilution instructions 
to prepare 1X working ReaFix Fixative Solution
9. Recap the tubes and vortex for 15 seconds.
10. Run the tubes on the FACSCountTM within 24 hours of preparation. 
Store samples at room temperature in the workstation until they are 
run on the instrument. Vortex upright for 5 seconds before running.

Entering patient information

1. Press [sample].
2. Enter or verify reagent lot code and bead counts as provided on Rea T­
Count pouch.
3. Press [confirm]
4. Enter the patient accession number

Running patient samples

1. Vortex the reagent pairs for 15 seconds.
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2. Uncap the reagent tube and place the reagent tube in the sample 
holder so the CD4 tube is in the run position.
3. Press [run]
4. After a successful run the results will print out. If the sample fails 
review reported error and refer to BD FACSCountTM guide to rectify 
problem.
5. The patient results are displayed on the screen and automatically 
printed.
6. The sample printout contains the following information:

7. Reagent information­reagent lot code and reference bead counts entered 
for the sample run.  (This number should match the reagent lot code for 
the control run.)
8. Date (mm / dd / yy) and time the patient sample was run
9. Control information­control run results, date controls were run, reagent lot 
code entered for the control run, control lot code.
10. Patient accession number
11. Patient results 
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12. Absolute Counts ­ cells/µl of CD4 & CD3
13. A sample report is attached below (Figure 1)
14. Remove the reagent tube, recap the reagent tube and discard in the 
biohazard waste container.
15. Repeat above steps until all patient samples have been run.
16. Discard the reagent pair in an appropriate biohazard container.
17. Shut down instrument as per manufacturer’s instructions.
18. A sample report is generated after every sample run. The sample 
report is attached below (Refer Figure 1).

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Figure 1: Patient Sample Report
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7. LIMITATIONS

   1. The Rea T­Count reagent has only been validated with K3EDTA or 
K2EDTA treated whole blood.

8. WARRANTY

This product is warranted only to conform to the quantity and contents 
stated on the label at the time of delivery to the customer. There are no 
warranties, expressed or implied, that extend beyond the description on 
the label of the product. ReaMetrix sole liability is limited to replacement 
of   the   product.   ReaMetrix   is   not   liable   for   property   damage,   personal 
injury, or economic loss caused by the product. 

Note: FACSCountTM is a registered trade name of Becton­Dickinson. 

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Manufactured by ReaMetrix India Pvt. Ltd.
Manufacturing License Number: KTK/25/519/2006
50­B, II Phase, Peenya Industrial Area
Peenya, Bangalore 560058, India
Ph: +91­80­28378693/5, Fax: +91­80­41172451
E­mail: info@reametrix.com, 

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www.reametrix.com
Rev No. 3.0,  14­Oct­09