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LICENCIATURA EN CIENCIA Y

TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS


NALISIS DEL CONTENIDO
O S DE PROTENAS
EN LOS ALIMENTOS EN LOS ALIMENTOS
2013
Dra. Roxana Verdini
Mtodos de anlisis del contenido
protenas en alimentos
La determinacin de la CANTIDAD DE PROTENA
de un alimento no es sencilla y el valor obtenido en
cada caso depende del MTODO utilizado.
Muchos ensayos dependen de la presencia de Muchos ensayos dependen de la presencia de
una determinada cadena lateral aminoacdica
(Lowry, Biuret).
los resultados analticos se vern
condicionados por la proporcin del condicionados por la proporcin del
aminocido en cuestin en las protenas
sometidas al ensayo y necesitarn ser
referidos a alguna protena estndar.
Otros mtodos se basan en la determinacin del Otros mtodos se basan en la determinacin del
contenido de nitrgeno total (Kjeldahl).
Mtodos de anlisis del contenido
protenas en alimentos
Existen numerosas fuentes de NITRGENO NO
PROTEICO que pueden interferir en algunos
mtodos de anlisis:
aminocidos libres pptidos pequeos aminocidos libres, pptidos pequeos,
cidos nucleicos, fosfolpidos,
aminoazcares, porfirina, algunas
vitaminas, alcaloides, cido rico, urea,
iones amonio, etc.
Otras fuentes de interferencia pueden ser los
otros macronutrientes presentes en los alimentos
como hidratos de carbono y lpidos.
Mtodos de anlisis del contenido
protenas en alimentos
Los mtodos mas comnmente empleados son:
Kjeldahl,
Kjeldahl/Bethelot Kjeldahl/Bethelot,
Biuret,
Lowry,
absorbancia a 280 nm,
fijacin de colorantes,
turbidimtrico turbidimtrico.
Mtodos de anlisis del contenido
protenas en alimentos
Estos mtodos se fundamentan en:
determinaciones de nitrgeno,
enlaces peptdicos enlaces peptdicos,
aminocidos aromticos,
absortividad UV de las protenas,
grupos amino libres,
propiedades de dispersin de la luz,
capacidad de adhesin de colorantes capacidad de adhesin de colorantes.
Mtodo de Kjeldahl j
Es un mtodo oficial descrito en mltiples
normativas: AOAC, ISO, Farmacopeas y distintas
Directivas Comunitarias.
El mtodo de Kjeldahl se basa en los siguientes
supuestos:
la proporcin de nitrgeno no protenico en
un producto alimenticio es demasiado pequea
i ifi ti para ser significativa,
una determinacin del contenido de
it t t l ( fl j fi i t i i nitrgeno total (refleja con suficiente precisin
el contenido de protena del alimento,
l i t l it la proporcin que representa el nitrgeno en
la mayor parte de las protenas alimenticias es
de 16%. de 6%
Mtodo de Kjeldahl j
FUNDAMENTO
Involucra la conversin del nitrgeno presente a
sulfato de amonio por OXIDACIN HMEDA con sulfato de amonio por OXIDACIN HMEDA con
cido sulfrico.
Posteriormente el sulfato de amonio se
descompone por ALCALINIZACIN con hidrxido
de sodio y DESTILACIN del amonaco liberado de sodio y DESTILACIN del amonaco liberado
captndolo en una solucin cida.
Finalmente se realiza una VALORACIN del
amonaco.
Esta determinacin incluye todo el nitrgeno
reducido presente (-NH
2
y =NH), de modo que los
compuestos amoniacales, urea y aminocidos
libres son tambin valorados.
Mtodo de Kjeldahl j
UN POCO DE HISTORIA
En 1883 el investigador dans Johann Kjeldahl
desarroll el proceso bsico del conocido mtodo desarroll el proceso bsico del conocido mtodo
actual de anlisis de protenas por el mtodo
Kjeldahl, ms propiamente, para analizar nitrgeno
orgnico.
El mtodo original fue sufriendo luego algunas El mtodo original fue sufriendo luego algunas
modificaciones.
Wilforth (1885)
Gunning (1889)
Arnold Arnold
Winkler
Mtodo de Kjeldahl j
UN POCO DE HISTORIA
En el mtodo original la digestin se efectuaba
con una mezcla de cido sulfrico y anhdrido con una mezcla de cido sulfrico y anhdrido
fosfrico y la oxidacin se completaba mediante la
adicin de permanganato de potasio.
Las modificaciones del mtodo que han
resultado ms tiles emplean: resultado ms tiles emplean:
xido de mercurio como catalizador de
oxidacin (Wilfoth).
K
2
SO
4
para aumentar el punto de
ebullicin del cido sulfrico (Gunning) ebullicin del cido sulfrico (Gunning).
CuSO
4
tambin como catalizador de
oxidacin (Arnold).
Mtodo de Kjeldahl j
UN POCO DE HISTORIA
Los catalizadores permiten acortar el tiempo de
digestin y actan como transportadores de O digestin y actan como transportadores de O
2
.
Otra modificacin ampliamente aceptada es la
introducida en la etapa de destilacin propuesta por
Winkler:
originalmente se utilizaba cido sulfrico
valorado para captar el amonaco,
titulando posteriormente su exceso con
NaOH valorado NaOH valorado.
Mtodo de Kjeldahl j
UN POCO DE HISTORIA
La modificacin consiste en:
recibir el NH
3
sobre una solucin de
cido brico,
valorarlo directamente con solucin
valorada de H
2
SO
4
(Winkler) o HCl.
Ventajas: la solucin de cido brico no necesita
ser exactamente medida eliminando los errores en ser exactamente medida, eliminando los errores en
la medicin del cido valorado en el colector y por
otra parte slo se requiere una solucin valorada
H
2
SO
4
(Winkler) o HCl.
El uso de perlas de vidrio sirve de ncleo para la El uso de perlas de vidrio sirve de ncleo para la
formacin de burbujas.
Mtodo de Kjeldahl j
ESQUEMTICAMENTE
Mtodo de Kjeldahl j
ALGUNOS EQUIPOS
Mtodo de Kjeldahl j
ALGUNOS EQUIPOS
Los equipos mas modernos viene con un sistema os equ pos as ode os e e co u s ste a
de extraccin y neutralizacin de gases:
una unidad Scrubber que bloquea el paso y u a u dad Sc ubbe que b oquea e paso y
neutraliza las condensaciones cidas,
una bomba de recirculacin de agua que
proporciona un gran caudal de vaco para la
aspiracin de los gases.
Mtodo de Kjeldahl j
VENTAJAS DEL MTODO
Apropiado para varios tipos de productos.
Alta fiabilidad.
Usado como mtodo de referencia Usado como mtodo de referencia.
DESVENTAJAS DEL MTODO DESVENTAJAS DEL MTODO
Interfieren compuestos nitrogenados no Interfieren compuestos nitrogenados no
proteicos.
Uso de catalizadores txicos o caros Uso de catalizadores txicos o caros.
Eleccin del factor de conversin.
Mtodo de Kjeldahl j
FACTOR DE CONVERSIN
El contenido porcentual promedio de N en las
protenas de diversos alimentos es de 16% protenas de diversos alimentos es de 16%.
El factor para convertir N en protenas sera
entonces 100/16 = 6,25.
Este factor general de conversin no es sin Este factor general de conversin no es sin
embargo exacto, ya que las protenas de origen
animal contienen generalmente menos nitrgeno y
las de origen vegetal ms.
As el factor de conversin para la protena del As, el factor de conversin para la protena del
trigo es 5,7 y para la de productos lcteos es 6,38.
Mtodo de Kjeldahl j
FACTOR DE CONVERSIN
Actualmente se conoce el contenido de N, y por
lo tanto el factor apropiado de una gran cantidad lo tanto el factor apropiado, de una gran cantidad
de productos agrcolas.
Debido a la confusin que podra derivarse del
hecho de utilizar el factor general de conversin
6 25 o el especfico para la protena en estudio 6,25 o el especfico para la protena en estudio
Es necesario aclarar siempre en los informes
el factor de conversin utilizado para el clculo
de protenas.
Mtodo de Kjeldahl j
FACTOR DE CONVERSIN
Mtodo de Kjeldahl j
ECUACIONES
Digestin: g

n-C-NH
2
+ mH
2
SO
4 +
catalizadores CO
2
+ (NH
4
)
2
SO
4
+ SO
2



Neutralizacin y destilacin

(NH
4
)
2
SO
4
+ 2 NaOH 2 NH
3
+ Na
2
SO
4
+ 2 H
2
O (
4
)
2 4 3 2 4 2

NH
3
+ H
3
BO
3
NH
4
+
+ H
2
BO
3
-


Titulacin

H
2
BO
3
-
+ H
+
H
3
BO
3

Mtodo de Kjeldahl j
CLCULOS
%N = V x N x 14 x 100 %N V x N x 14 x 100
1000 p
%N = V x N x 0,014 x 100
p
V: mL de cido
N: normalidad del cido
P: gramos de muestra
0,014: equivalente volumtrico del N , q
Mtodo de Kjeldahl j
Mtodo de Kjeldahl /Berthelot
Este mtodo combina la digestin hmeda del
mtodo de Kjeldahl con la reaccin colorimtrica de mtodo de Kjeldahl con la reaccin colorimtrica de
Bethelot.
El producto de la digestin se neutraliza se lleva El producto de la digestin se neutraliza, se lleva
a volumen final y luego una alcuota se somete a la
reaccin colorimtrica.
El NH
4
+
presente en la digestin sulfrica
reacciona con el fenol e hipoclorito de sodio en
medio alcalino, formndose un complejo de color
azul.
La intensidad del color producido es
directamente proporcional a la cantidad de N
amoniacal presente en la muestra amoniacal presente en la muestra.
Mtodo de Kjeldahl j
Mtodo de Kjeldahl /Berthelot
La absorbancia del complejo de se lee a 540 nm.
Se calibra con solucin de sulfato de amonio.
Por lo tanto lo que se determina por este mtodo
es nitrgeno total.
Otros mtodos
Mtodos qumicos
Los alimentos son una matriz compleja por lo
que se sugiere que estos mtodos empricos e que se sugiere que estos mtodos empricos e
indirectos sean calibrados con el mtodo de
Kjeldahl.
Se espera una buena correlacin entre estos dos
tipos de determinaciones de protena cuando la tipos de determinaciones de protena cuando la
relacin N no proteico/N proteico es baja y
constante
Son satisfactorios para leche y cereales e
insatisfactorios para la mayora de los vegetales y insatisfactorios para la mayora de los vegetales y
mezclas de alimentos.
Otros mtodos
Mtodo de absorbancia a 280 nm
El mtodo se basa en la medicin de
absorbancia a 280 nm.
Las protenas poseen una banda de absorcin en
el UV entre190 y 290 nm debida fundamentalmente
a la presencia de aminocidos aromtcos (tirosina,
triptofano y fenilalanina) triptofano y fenilalanina).
Es un mtodo simple, rpido y no destructivo.
Es un mtodo directo para la determinacin de
protenas que puede aplicarse en algunos sistemas
alimenticios alimenticios.
Es necesaria la calibracin con una protena
estndar estndar.
Otros mtodos
Mtodo de absorbancia a 280 nm
La solucin debe ser clara e incolora, la turbidez
puede afectar los resultados.
El contenido de aminocidos aromticos difiere
considerablemente entre las distintas protenas.
Los cidos nucleicos interfieren, no as el
amonio.
Otros mtodos
Mtodo de Biuret
Las protenas y pptidos reaccionan con iones de
cobre en solucin alcalina, formando un quelato
color violeta de configuracin desconocida.
La intensidad de color del complejo a 550 nm es
directamente proporcional a la concentracin de
protenas presente en la muestra protenas presente en la muestra.
Es rpido, simple y no detecta nitrgeno de
fuentes no proteicas o no peptdicas fuentes no proteicas o no peptdicas.
Es necesaria la calibracin con una protena
estndar estndar.
Otros mtodos
Mtodo de Biuret
Altas concentraciones de carbohidratos, lpidos
pueden causar opalescencia en la solucin final.
Las sales de amonio tambin interfieren en la
reaccin.
Se ha encontrado poca aplicacin en anlisis de
alimentos debido a la presencia de interferentes
como azcares reductores que reducen el ion
cprico en medio alcalino produciendo resultados cprico en medio alcalino produciendo resultados
insatisfactorios. Ejemplo: leche.
Otros mtodos
Mtodo de Lowry
Cuando se agrega reactivo de Folin a una
protena, sta se reduce a un complejo azul de
molibdeno por la oxidacin de los aminocidos
tirosina triptfano cistina cistena e histidina tirosina, triptfano, cistina, cistena e histidina.
La absorbancia del complejo se lee a 750 nm
(mayor sensibilidad) o a 500 nm (mayor sensibilidad) o a 500 nm.
Tiene mayor sensibilidad que el mtodo del
Biuret Biuret.
La respuesta del color vara de acuerdo al tipo de
protena protena.
La intensidad del color no es estrictamente
proporcional a la concentracin de protena proporcional a la concentracin de protena.
Otros mtodos
Mtodo de Lowry
Los iones potasio, magnesio, EDTA e hidratos de
carbono interfieren en la reaccin.
Es menos afectado por la turbidez de la muestra.
Es afectado por la presencia de azcares
reductores al igual que el mtodo de Biuret.
Otros mtodos
Mtodos de adhesin de colorante
Los iones potasio, magnesio, EDTA e hidratos de
carbono interfieren en la reaccin.
Es menos afectado por la turbidez de la muestra.
Es afectado por la presencia de azcares
reductores al igual que el mtodo de Biuret.
Pueden adherirse colorantes ANINICOS o
CATINICOS (BRADFORD).
Sus fundamentos son diferentes.
Otros mtodos
Mtodos de adhesin de colorante aninico
El COLORANTE ANINICO se une a los grupos
catinicos de los residuos bsicos de las protenas
(histidina, arginina, lisina) y forman un complejo
insoluble insoluble.
El colorante en exceso permanece soluble y se
relaciona inversamente con la concentracin de relaciona inversamente con la concentracin de
protenas.
El mtodo con el colorante NARANJA 12 est El mtodo con el colorante NARANJA 12 est
descripto en la AOAC para leche fluida, helados,
leche en polvo descremada (=480 nm).
Algunos compuestos no proteicos como almidn
o metales pueden unirse al colorante.
Otros mtodos
Mtodos de Bradford
El Se basa en la unin del colorante Coomassie
Blue G-250 a las protenas.
Las protenas (aminocidos bsicos y
aromticos) se unen a la forma azul para formar un
complejo protena-colorante con un coeficiente de
extincin mayor que el colorante libre extincin mayor que el colorante libre.
Este mtodo es sensible, simple, rpido, barato y
pocas sustancias interfieren en su determinacin pocas sustancias interfieren en su determinacin.
Entre las sustancias que interfieren estn los
detergentes y las soluciones bsicas detergentes y las soluciones bsicas.
No interfieren los carbohidratos.

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