CROMATOGRAFA

Prof. Francisco Rojo Callejas

GENERALIDADES:

Tiempo de retencin (t
r
, fig 1)
El tiempo que un soluto permanece en la columna. Se mide desde el momento de la inyeccin hasta
la elucin del mximo del pico. Es caracterstico del soluto para condiciones de operacin
constantes. Auxiliar en la identificacin de los solutos.

Tiempo muerto (t
o
, fig 1)
El tiempo requerido para eluir un soluto que no se retiene en la fase estacionaria. Tiempo que
cualquier soluto permanece en fase mvil. Representa el espacio vaco de la columna.

Tiempo de retencin ajustado( t
r
, fig 1)
Mide el tiempo que el componente permanece en fase estacionaria.
= t t t
r r o


Ancho a la base (w
b
, fig 1)
Es la porcin de la lnea base intersectada por las tangentes al pico. Para un pico gaussiano es igual a
4. Tradicionalmente usado en el clculo de la eficiencia del sistema

Ancho a la mitad de la altura (w

, fig 1)
Una medida mas reproducible, adecuada para evaluar manualmente la eficiencia del sistema (platos
tericos).



Nmero de platos tericos (N)
Cada plato terico representa un equilibrio terico de distribucin del soluto entre las fases. El
nmero total de platos tericos de una columna representa el poder de separacin de la columna. Una
buena columna tiene un nmero alto de platos tericos. se calcula con cualquiera de las ecuaciones:

N 16
t
w
5.545
t
w
2
t
Area
Altura
r
b
2
r

2
r
2
=

donde t
r
y w
b
o w

se deben expresar en las mismas unidades, por ser N adimensional.

Altura equivalente a un plato terico (H, AEPT, HETP)
Segmento de columna que representa un plato terico. Es la medida inversa de la eficiencia del
sistema, entre menor sea H el sistema es mas eficiente (se tienen mas platos tericos en la misma
longitud de columna). se calcula como: H
L
N
=
usualmente H y L se expresan en mm.


1
Factor de capacidad (k')
Se define como la razn de la cantidad de soluto en fase estacionaria entre la cantidad en fase mvil
al equilibrio. Es igual a la relacin del tiempo que el soluto permanece en fase estacionaria respecto
al tiempo en fase mvil:

=

k
t
t
r
o

Selectividad (, fig 2)
Mide las diferencias relativas entre la interaccin de dos solutos con la fase estacionaria. Un valor
mayor de significa una columna mas selectiva y mejor separacin entre solutos. Se calcula como el
tiempo de retencin corregido del soluto mas retenido entre el del menos retenido.

=

k
k
t
t
r
r
2
1
2
1
1
,
,

Resolucin (Rs, fig 2)
Es la medida cuantitativa del grado de separacin entre dos solutos. Se calcula con:

( )
( )
Rs
2 t t
w w
r,2 r,1
b,2 b,1
=

+

donde los tiempos de retencin y los anchos se expresan en las mismas unidades. La resolucin
mnima aceptable en mezclas sencillas es 1.0 (ver fig 3), una resolucin de 1.5 representa separacin
a la lnea base.






Figura 3. Ejemplos de resolucin entre dos picos cromatogrficos

Ecuacin maestra de la resolucin
Analiza las variables primarias de control de la resolucin, la ecuacin tiene la forma:

R
L H
4
k
1 k
s
=

+

1

2
Las tres conclusiones que se obtienen son:
1. A mayor retencin (k'), mejor resolucin (fig 4), pero le curva es asinttica. Para tener buenas
separaciones se necesita un factor de capacidad k'>2. En mezclas sencillas un k' mayor de seis solo
aumenta el tiempo de anlisis sin mejorar apreciablemente la separacin.


2. A mayor selectividad mayor resolucin (fig 5). Nuevamente la grfica es asinttica, por lo que no se
necesitan selectividades muy grandes. Generalmente se trabaja en la zona cercana a =1, por lo que
cualquier aumento en la selectividad mejora sustancialmente la separacin.


3. Entre mayor sea el nmero de platos tericos, mejores separaciones (fig 6). La forma de la grfica
( N) indica que se deben de buscar cambios sustanciales (de varios rdenes de magnitud) para que
esta mejora sea importante. El aumentar ligeramente este valor no representa cambios apreciables (p.
ej. duplicar N mejora solo 30% la Rs). Se debe de buscar mejorar N con sistemas mas eficientes (H
pequeo) y solo en casos especiales con columnas mas largas (anlisis mas lentos).



FUNDAMENTOS

Eficiencia

Flujo de fase mvil (F
o
)
Se mide a las condiciones de salida de la columna (P yT ambientes). Comnmente se emplean
caudalmetros de burbuja, por lo que el clculo del valor medio de la columna involucra la
correccin por la temperatura de operacin de la columna, la cada de presin en la misma y la
presin de vapor del agua. Se expresa en ml/min.

3
Velocidad lineal promedio de la fase mvil (v)
Se calcula con: v=L/t
o
. Un estimador exacto involucra la evaluacin matemtica de to con series
homlogas. Generalmente se calcula aproximando el tiempo muerto (t
o
) con un compuesto poco
retenido (por ejemplo el metano).Se expresa en cm/seg.

Ecuacin de Van Deemter
Analiza las variables que afectan la eficiencia de los sistemas cromatogrficos. La forma
simplificada de la ecuacin es:
H A B v C v = + +
En la ecuacin anterior los trminos empricos representados son:
A es el efecto multicanales. En sistemas empacados analiza el efecto del tamao y forma de las
partculas y de la densidad de empacado.
B representa la difusin axial, la que depende de la movilidad de las molculas en las fases.
C representa la resistencia a la transferencia de masa. Este trmino permite concluir que para obtener
sistemas eficientes se necesitan fases poco viscosas (helio o hidrgeno en lugar de nitrgeno, fases
estacionaras fluidas en lugar de gomas), espesores de pelcula delgados (dcimas de m) y columnas
de poco dimetro (capilares en lugar de "megabore").
v la velocidad afecta la altura del plato terico de modo que existe un flujo ptimo (fig 7) en que se
obtiene el mximo de eficiencia. En la prctica se trabaja a flujos mayores del ptimo para reducir el
tiempo de anlisis.





Ecuacin de Golay
En columnas capilares no existe el efecto multicanales (A=0), por lo que la ecuacin de Van
Deemter se reduce a:
H B v C v = +
La frmula anterior es la forma simplificada de la ecuacin de Golay. A diferencia de Van Deemter
esta es una ecuacin exacta deducida tericamente y comprobada experimentalmente. El que no haya
efecto multicanales indica que las columnas capilares son inherentemente mas eficientes. Adems, la
restriccin al flujo es mucho menor por lo que las columnas pueden ser mucho mas largas (10 a 60m
comercialmente) y con mucho mayor poder de separacin. En la figura 8 se muestran las grficas
tpicas de los tres gases ms empleados como fase mvil en Cromatografia de gases.



4
ELUCIN PROGRAMADA

En cromatografa se denomina el anlisis de mezclas complejas como problema general de elucin.
En condiciones de trabajo isotrmicas (cromatografa de gases, CG) o isocrticas (cromatografa de
lquidos, CL) la ecuacin general de la resolucin permite optimizar la separacin de una pareja de
compuestos. En particular se puede optimizar la separacin de los solutos menos retenidos (fig. 9, temperatura
T
1
), pero en estas condiciones los solutos con mayor retencin tardaran mucho en eluir, las seales seran
muy anchas y por lo tanto pequeas, inclusive podran no eluir o no ser detectados.



Se puede fijar las condiciones de trabajo de modo que se observe la separacin de los ltimos solutos
en eluir (fig. 10). Para ello en CG se necesita una temperatura mayor que la anterior (T
3
>T
1
). En CL se usara
un disolvente con mayor poder de elusin . Los resultados obtenidos son tales que se observa la separacin de
los ltimos solutos, pero los primeros se retienen tan poco (k~0) que no se separan.




El utilizar condiciones de trabajo intermedias (fig.11, T
1
<T
2
<T
3
) proporciona resultados intermedios.
Ni se logra separar por completo los primeros solutos ni se logra eluir la totalidad de los compuestos de la
mezcla.
5

La solucin al problema anterior es la elusin programada. En cromatografa de gases se programa
linealmente la temperatura y el lquidos se programa exponencialmente la proporcin de disolventes
(mezclas). Los resultados de un anlisis programado se observan en la fig.. 12.






Se observan dos comportamientos importantes. Primero se logra eluir perfectamente separados a la
totalidad de los solutos. En particular para las series homlogas el espaciamiento entre picos es casi constante,
a diferencia de los anlisis isotrmicos en que el espaciamiento crece exponencialmente. Segundo, el ancho de
los picos es prcticamente constante, por lo que los ltimos picos son mucho ms altos que en un anlisis
isotrmico, se detectan con mayor facilidad.
En cromatografa de gases de temperatura programada el caso mas sencilla y comn es la
monorampa lineal (fig. 13).







6


Los tres parmetros bsicos de la misma son:

1. Temperatura Inicial (T
i
). Debe ser la mnima necesaria para lograr separar los primeros solutos
sin que se retengan en exceso. Generalmente el mnimo alcanzable se encuentra limitado
instrumentalmente (T
i
>(T
amb
+20
o
C) excepto en equipos criognicos. Muchas fases poseen una
temperatura mnima de operacin por debajo dela cual solidifican y dan malas separaciones.
Cuando por cualquier de estas causas no se pueda lograr una temperatura suficientemente baja,
se deber permanecer el tiempo necesario (Ti) para lograr separar los primeros solutos T1.
Cuando ni as se logre separarlos, la nica solucin es emplear una columna con mayor
retencin (e.g. ms fase estacionaria).


2. Temperatura final (T
f
). La mxima necesaria para eluir los ltimos solutos. Una vez que estos
salieron, no tiene caso seguir calentando. Nunca se debe sobrepasar la temperatura mxima de
operacin de la columna. Si se llega a esta y an faltan solutos por eluir se deber permanecer a
temperatura constante (T
f
) el tiempo necesario(T
f
) para terminar de eluir los solutos. Si este
tiempo es excesivo, se necesitar una columna con menor retencin (e.g. menos fase).



3. Velocidad de calentamiento (T/t). Depende de la complejidad de la mezcla. En mezclas no
muy complejas puede ser alto (hasta 20
o
C/min) para acortar el tiempo de anlisis. En mezclas
muy complejas puede ser necesario un calentamiento muy lento (2
o
C/min) para lograr la
separacin. Usualmente se emplean gradientes de 5
o
a 10
o
C/min.










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