UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUADALAJ ARA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS

BIOTECNOLOGA

PRACTICA 1. COMPARACION DE LA RESPIRACIN Y LA
FERMENTACIN

OBJETIVO. El alumno analizar y distinguir el comportamiento de una levadura
cuando su metabolismo se desarrolla bajo condiciones aerobias y bajo condiciones
anaerobias, relacionando los resultados de la produccin de biomasa con la eficiencia en
cada proceso.

INTRODUCCION.
Las levaduras son microorganismos eucariotes ubicuos encontrados en diversos
ambientes naturales. Esta capacidad de colonizacin est relacionada con su alta
adaptabilidad fisiolgica. Las rutas metablicas entre diferentes especies de levaduras son
bsicamente idnticas, sugiriendo la conformacin de un grupo metablicamente
homogneo. Sin embargo, los mecanismos para la toma de nutrientes, el nmero de
diferentes isoenzimas, y sobretodo la regulacin de fermentacin y respiracin difieren
sustancialmente.
En las levaduras, como otros organismos heterotrficos, el metabolismo de la
energa y el carbono estn ntimamente interconectados, es decir, el anabolismo est
acoplado al catabolismo. El ATP provee la energa para toda clase de trabajo celular y es
provisto por la oxidacin de molculas orgnicas que tambin sirven como fuente de
carbono para la biosntesis. En la naturaleza, las diferentes especies de levaduras utilizan
un espectro de fuentes de carbono, tales como polioles, alcoholes, cidos orgnicos,
aminocidos, pero prefieren los carbohidratos.
Enfocando la atencin sobre la levadura Saccharomyces cerevisiae, es un
microorganismo facultativo que emplea la respiracin aerobia al igual que la
fermentacin alcohlica para metabolizar la glucosa como fuente de energa y de
carbono. La glucosa inicialmente es transformada a travs de la gliclisis hasta la
formacin de piruvato, el cual es un punto de ramificacin del flujo metablico,
dependiendo de la presencia o no de oxgeno.
En la presente prctica, se tiene como objetivo que el alumno determina la
cantidad de biomasa producida, la velocidad de consumo de glucosa y formacin
evidente de metabolitos bajo condiciones de aerobiosis y anaerobiosis, para establecer la
diferencia del crecimiento de la levadura.


MATERIAL.
Medio de extracto de malta
Glucosa
Agua destilada
Levadura seca
Solucin de azul de metileno 0.01%
Solucin de DNS
Microscopio de campo claro
Microscopio de contraste de fases
Hematocitmetro
Pipeta Pasteur
Tubos de vidrio
Etanol
Bao mara
Termmetro


METODOLOGIA.
Medio de cultivo.
1.- Prepare 1 matraz erlenmeyer de 500 mL con 50 mL de medio extracto de malta
2.- Prepare 1 matraz erlenmeyer de 125 mL con 50 mL de medio extracto de malta
3.- Preparacin del medio extracto de malta: pese 35 g de extracto de malta, 20 g de
glucosa, disolver el extracto de malta y la glucosa en 1 L de agua destilada.
4.- Esterilizar en un tubo de ensayo 10 mL de agua destilada
4.- Colocar el medio en los matraces y esterilizar por calor.

Suspensin de levadura.
1.- Pesar 0.5 g de levadura seca y adicionar a 10 mL de agua destilada en un tubo de
ensaye, mezclar hasta obtener una suspensin uniforme.
2.- Realizar conteo en cmara de Neubauer
3.- Anotar la cuenta de levaduras y calcular el nmero de clulas por mL.

Incubacin.
1.- Tome uno de los matraces y transfiera 1 mL de suspensin de levaduras, etiquete
como fermentacin y coloque en una incubadora a 30C.
2.- Tome el segundo matraz y transfiera 1 mL de suspensin de levaduras, etiquete como
respiracin y coloque en una agitadora a 30C y 200 rpm.
3.- Realice observaciones en 1 hora, 12 horas y 24 horas. Tome muestre en cada matraz y
gurdelos en refrigeracin.
4.- Determine el nmero de levaduras para cada muestra.
5.- Determine la cantidad de glucosa en cada muestra.

Conteo de levaduras.
A la muestra de 1 mL con levaduras adicionar 0.1 mL de azul de metileno y
homogenizar. De la solucin homognea, colocar una alcuota en el hematocitmetro y
realice el conteo al microscopio. En el apndice 1 encontrar informacin acerca del uso
del hematocitmetro o de la cmara de Neubauer.
1. Verifique que el microscopio est alineado, y en su caso haga la correccin necesaria.
2. El conteo se realiza en 5 cuadros grandes, considerando que estos formen una cruz.
3. Realice el clculo del nmero de clulas/mL.



Determinacin de glucosa.
La determinacin de glucosa se realiza utilizando el mtodo del DNS (apndice 2).
1) Diluir la muestra, calculando que la concentracin de glucosa se encuentre en el rango
de 0 a 1 mg/mL de glucosa. Anotar dilucin.
2) Tomar un alcuota de 0.5 mL de muestra diluida, si es el caso
3) Agregar 1.5 mL de solucin de DNS y agitar
4) Calentar en agua hirviendo por 5 minutos
5) Aforar a 10 mL adicionando 8 mL de agua destilada y homogeneizar
6) Dejar enfriar y leer absorbancia en el espectofotmetro a 550 nm, calibrando con el
blanco.
7) Interpolar lectura en la curva patrn para determinar la concentracin de glucosa.


CUESTIONARIO
1.- Cul es el papel del azul de metileno en la tincin de levaduras?
2.- Qu es fermentacin desde el punto de vista bioqumico?
3.- Cuntas y cules son formas de reproduccin tiene Saccharomyces cerevisiae?
4.- Explique cmo se coloca la muestra para el conteo en la cmara de Neubauer
5.- Qu es respiracin celular?
6.- Dnde se obtiene mayor biomasa, en la respiracin o en la fermentacin? Explique
por qu
7.- La tcnica del DNS es til para cuantificar sacarosa, por qu
8.- Qu es la gluclisis?
9.- Qu es el catabolismo?
10.- Durante los experimentos que desarroll, Saccharomyces cerevisiae realiz
anabolismo, explique.


REPORTE.
Realice un reporte por equipo que contenga: Titulo de la prctica, objetivo, introduccin
breve, metodologa, resultados, discusin, conclusin, bibliografa. Como gua puede
utilizar el formato de cualquier artculo cientfico.
APENDICE 1. CUANTIFICACION DE LEVADURAS
OBJETIVO. El alumno cuantificar levaduras mediante la tcnica de conteo directo al
microscopio.

CONTEO EN CMARA DE NEUBAUER.
La cmara de Neubauer es una cmara de conteo que se utiliza para determinar el
nmero de clulas.

Figura 1. Cmara de Neubauer.
Para utilizar la cmara de Neubauer realice el siguiente procedimiento:
Limpie la cmara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.
Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada.
Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cmara en forma vertical, esta debe quedar
centrada.
Proceda a llenar la cmara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribucin
de las clulas. Es recomendable llenarla con micropipeta pequea o con una jeringa ya
que la cmara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento.
La cmara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de
llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cmara es
de lquido abundante en las terminaciones del recuadro.

Para el conteo: Lleve la cmara al microscopio y enfoque el cuadro de conteo con
el ocular de 4X. Al hacerlo observar en el campo una imagen parecida a la figura 2.


Figura 2. Cmara de Neubauer en 4X

Si las clulas que va a contar son pequeas como son las levaduras, bacterias, etc.,
ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. Se visualizar de la siguiente
manera:


Figura 3. Cmara de Neubauer en 10X

En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las clulas
presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central,
lo que garantiza un conteo aleatorio.

Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de los
campos y con ayuda de el carro del microscopio se desplaza la cuadricula hasta contar en
todos los cuadros. El conteo en estos campos de la cmara de conoce como AP (alto
poder). Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la siguiente manera:


Figura 4. Cmara de Neubauer en 40X

Las clulas se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda realizar el
conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las clulas dos veces o no que no
se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres lneas que delimitan el
cuadro, que son fundamentales en el momento del conteo ya que definen cuales clulas
son contables o cuales estn fuera del campo de conteo. Las clulas que no tocan la
segunda lnea son contables, si la tocan o estn encima de ella no se incluyen.
Grficamente se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las clulas que tiene una X
son las que no se deben contar.

Figura 5. Conteo en cmara de Neubauer.

Despus de contar las clulas se procede a calcular el nmero de clulas por unidad de
volumen. Para esto se utiliza el rea de cada cuadro, el espacio ocupado por el lquido en
el que estn las clulas que es el mismo espacio que hay entre la cuadricula de la cmara
y la laminilla de cuarzo. La cmara de Neubauer tiene las siguientes dimensiones, y su
profundidad es de 0.1 mm.
Las suspensiones celulares deben ser diluidas lo suficiente para que las clulas u
otras partculas no se sobrepongan, y deben estar uniformemente distribuidas. Para
clulas pequeas se recomienda contar cuatro esquinas 1/25 mm
2
y el cuadro del centro.
Por ejemplo, si se cuentan 187 clulas en los cinco cuadros descritos. Cada cuadro tiene
un rea de 1/25 mm
2
, y 0.1 mm de profundidad. El volumen total en cada cuadro es de
(0.04x0.1 =0.004) 0.004 mm
3
. Si se contaron 5 cuadros, entonces se tiene un volumen de
0.02 mm
3
. Por lo tanto, se tienen 187 clulas en 0.02 mm
3
, que equivale a 9350
clulas/mm
3
. Hay 1000 mm
3
en 1 cm
3
, por lo que la cuenta es de 9 350 000 cluals/mL.
Para fines prcticos, si se cuentan 5 cuadros como los indicados anteriormente:
Clulas/mL =Total de clulas contadas * 50000
Para determinar el nmero de clulas en la muestra original hay que multiplicar
por la dilucin.



METODOLOGIA.
A la muestra de 1 mL con levaduras adicionar 0.1 mL de azul de metileno y
homogenizar. De la solucin homognea, colocar una alcuota en la cmara de Neubauer
y realice el conteo al microscopio.
APENDICE 2. DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES POR DNS
OBJETIVO: Determinar el contenido de azcares reductores en mosto fermentado
mediante el uso del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) mediante espectroscopia visible.

INTRODUCCION
El mtodo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) se basa en la reduccin del DNS
(de color amarillo) al reaccionar con un azcar reductor para formar cido 3-amino-5-
nitrosaliclico (de color rojo ladrillo), cuya presencia puede detectarse por lectura de la
absorbancia en la zona de 540-570 nm.



MATERIALES.
DNS (cido 3,5-dinitrosaliclico)
Fenol
Sulfito de sdio
Hidrxido de sodio
Agua destilada
2 Vasos de precipitado de 600 mL
1 Matraz aforado de 100 mL
1 Matraz aforado de 1 L
Tubos de ensaye
Espectrofotmetro
Pipetas volumtricas de 1 mL
Pipeta volumtrica de 2 mL
Pipeta volumtrica de 5 mL

PROCEDIMIENTO.
Preparacin de la solucin de DNS.
1) Pesar 1 g de hidrxido de sodio y disolverlo en 70 mL de agua destilada en un matraz
Erlenmeyer con agitacin. CUIDADO EL HIDRXIDO DE SODIO IRRITA LA PIEL.
2) Pesar 1 g de DNS y adicionar por porciones a la solucin de hidrxido de sodio con
agitacin, para lograr una disolucin rpida y completa.
3) Esperar a que la solucin se enfri a temperatura ambiente
4) Pesar 0.2 g de fenol y adicionar a la solucin anterior con agitacin.
5) Pesar 0.05 g de sulfito de sodio y adicionar a la solucin anterior con agitacin.
6) Una vez que todo este bien disuelto y mezclado, transferir cuantitativamente a un
matraz aforado de 100 mL y aforar con agua destilada. Homogeneizar la solucin.
7) Guardar la solucin en un frasco mbar para proteger de la luz.

Preparacin de curva patrn.
1) Preparar una solucin estndar de 1 mg/mL de glucosa
2) Preparar una serie de tubos con las cantidades indicadas en el cuadro siguiente:

Tubo
Nmero
Concentracin Glucosa
(mg/mL)
mL de
Solucin
Estndar
mL de
agua
destilada
1 0 0 1
2 0.1 0.1 0.9
3 0.2 0.2 0.8
4 0.3 0.3 0.7
5 0.4 0.4 0.6
6 0.5 0.5 0.5
7 0.6 0.6 0.4
8 0.7 0.7 0.3
9 0.8 0.8 0.2
10 0.9 0.9 0.1
11 1.0 1.0 0

3) Tomar una alcuota de 0.5 mL de la solucin de glucosa para cada dilucin
4) Agregar 1.5 mL de solucin de DNS y agitar
5) Calentar en agua hirviendo por 5 minutos
6) Aforar a 10 mL adicionando 8 mL de agua destilada y homogeneizar
7) Dejar enfriar y leer absorbancia en el espectofotmetro a 550 nm, calibrando con el
blanco.

Preparacin de muestras.
1) Diluir la muestra si el contenido de azcares reductores es mayor a 1 mg/mL, para que
se encuentre en el rango de 0 a 1 mg/mL de glucosa. Anotar dilucin.
2) Tomar un alcuota de 0.5 mL de muestra diluida, si es el caso
3) Agregar 1.5 mL de solucin de DNS y agitar
4) Calentar en agua hirviendo por 5 minutos
5) Aforar a 10 ml adicionando 8 mL de agua destilada y homogeneizar
6) Dejar enfriar y leer absorbancia en el espectofotmetro a 550 nm, calibrando con el
blanco.

Clculos
1) Con las lecturas de la curva patrn hacer una regresin lineal de concentracin de
glucosa contra absorbancia y calcular la ecuacin de regresin lineal correspondiente.
2) Sustituir el valor de absorbancia de la muestra en la ecuacin de regresin y calcular la
concentracin de azcares reductores expresados como glucosa. Al dato obtenido
multiplicarlo por la dilucin.