BIOQ121 - Replicacin del ADN

4 de mayo de 2011


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En esta clase veremos cmo se mantiene la informacin, o tambin llamado, proceso de
replicacin gnica.
La replicacin consiste en la sntesis de DNA.
Mecanismo de replicacin gnica

a. Conservativo; en la que la hebra parental es la pauta y, de la cual, se sintetizan dos hebras
nuevas [las hebras paps juntas y las hebras hijas juntas].
b. Mixto; donde las cadenas hijas constan de fragmentos de la cadena antigua y fragmentos
de la nueva.
c. Semiconservativo; En cada una de las molculas hijas se conserva una de las cadenas
originales [*una hebra nueva y una hebra parental]
Para demostrar el mecanismo de replicacin Meselsohn y Stahl realizaron un experimento, donde
se puso E. coli en un medio con radioistopo de N (
15
N), que es ms pesado que el normal.
Entonces todas las molculas de E. coli tenan incorporado este
15
N; luego aislaron el DNA y lo
fraccionaron en un gradiente de cloruro de cesio (CsCl), que tiene la densidad parecida al ADN.
Fue posible, entonces que todo el DNA se ordene en
una banda correspondiente a su densidad. Como el
15
N es ms pesado, queda una banda bastante abajo.
Luego este cultivo con
15
N lo pusieron en un medio
que tena un radioistopo normal (
14
N), entonces
todas las molculas incorporan el normal y por lo
tanto su DNA ser ms liviano.
Despus de una preparacin, aislaron nuevamente el
DNA y encuentran que la banda se encuentra al
medio, es decir, entre las bandas del DNA con
15
N y
del DNA con
14
N.
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Este experimento develo que el mecanismo de la duplicacin gnica es semi-conservativo [Nota:
Hganse del mono y la pgina web para tenerlo clarito].
El mecanismo de replicacin gnica consiste
en que una hebra es la pauta de la nueva
hebra, y por lo tanto se dice que es semi-
conservativo.
-Una hebra es la pauta de la nueva hebra
-En la F1 hbridos, parental/nueva hebra
-En la F2 parental/nueva, nueva/nueva,
nueva/parental
Biosntesis de acido nucleico:
- iniciacin
- elongacin
- terminacin
Si hablamos de replicacin, nos referimos a la sntesis de DNA. Este es un polmero, que se
compone de subunidades parecidas y por lo tanto, la replicacin se puede explicar como una
reaccin en cadena: Como cualquier otra reaccin, en algn momento tendremos que iniciarla, as
que hay tenernos la etapa de iniciacin; despus debe venir la fase donde se deben cortar y unir
nuevas unidades, lo que correspondera a la parte de la elongacin; y por ltimo debe finalizar con
la etapa de terminacin.
Para estas tres etapas tendremos distintos ayudantes que nos permitan que la polimerizacin
ocurra y vamos a destacar en grande cuales son las caractersticas de los complejos enzimticos
que permiten sintetizar DNA y para entender esto necesitamos, tambin, saber las caractersticas
como para sintetizar RNA.
Recordar que la clula solo sintetizara DNA cuando necesite entrar en el ciclo celular,
especficamente antes de la mitosis (fase M), o sea, en la fase S .
Replicacin procariotas
En el caso de las procariotas, el DNA es doble hebra circular. Aqu hay una regin (secuencia
especfica) que se llama origen de replicacin.
Si la clula esta en ese momento lista para replicarse, va a iniciar todo este proceso. En este caso
tenemos un producto del gen DnaA, que junto con ATP ayuda a abrir las hebras. Una vez abiertas
las hebras, se unen al instante otras protenas que hacen que estas no vuelvan a juntarse y as
mantener el DNA en estado hebra simple. Luego de esto, ocurre la fase de elongacin.
Se pueden ver fotografas con microscopia electrnica, donde se visualiza el ADN circular. Todo
empieza con una burbuja, donde comienza a abrirse; despus se observa hlice, hlice, hlice y
en base a esto se hacen los esquemas interpretativos.

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El avance de la elongacin es en los dos sentidos, es decir, es bidireccional. Como en este caso el
ADN es circular, cuando terminamos la elongacin quedaran dos anillos uno dentro del otro
(concatenado) y es por esto que existen enzimas que catalizan la reaccin de soltura o liberacin
de los dos anillos, llamadas topoisomerasas, porque cambian la forma de las molculas. Estas
enzimas necesitan energa, porque su funcin implica cortar y ligar y es por esto que tambin se
gasta ATP.
[Nota: No encontre necesario colocar imgenes, si quieren las pueden ver en las paginas 4 y 5 del pdf
BIOQ121_DNA- 3]

En resumen, en procariotas tenemos un
origen de replicacin
(1)
. En el caso de
bacteria, por molcula de genoma circular
doble hebra, hay un origen de replicacin.
En el caso de la E. coli, su genoma son
ms de 4 millones de pares de bases; su
origen de replicacin esta del lado
opuesto de la terminacin y demora
alrededor de 20 minutos en replicarse
[Pagina 4 del pdf].

Replicacin eucariotas
Nosotros tenemos metros de ADN, por lo
tanto si tuviesemos un origen de replicacin,
como procariotas, el proceso de replicacin
demorara das; as que no puede ser.
En eucariotas, existen mltiples orgenes de
replicacin y demora aproximadamente 1
da.
Como es el ADN ms largo, se hacen
experimentos que incorporen nucletidos
con radioistopos y se visualiza primero una
parte pequea, despus ms largo, despus
ms pequeo esto se interpreta as, se
llama estructura ojo.
(1)
Origen de replicacin = Secuencia especifica del DNA, donde comienza la replicacin.
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Replicacin in vivo
In vivo es importante saber que
ocurre, en que cantidad, donde
ocurre y en que momento.
La replicacin se hace con el fin
de mantener la informacin.
La clula tiene un genoma y cada
clula debe tener su genoma,
una vez; cada secuencia debe
sintetizarse solamente una vez
en la fase S del ciclo celular.
La sntesis de DNA funciona en la direccion de 5 a 3; el seguimiento de las hebras es bidireccional,
pero si observo una hebra la sntesis es siempre de 5 3. En eucariotas tenemos mltiples
orgenes de replicacin y, adems, veremos que el DNA es lineal y por ese problema que existen
enzimas que solamente que sinteticen el DNA de 5 3 y para replicar los trminos necesitamos
una solucin especial.
Si nosotros necesitamos sintetizar DNA, que es un polmero, se agrega una nueva subunidad, que
se unen a las polimerasas. Estas polimerasas utilizan los nucletidos trifosfato como sustrato; de
estos tres fosfatos se incorpora solo el del 5 o el , los otros dos se liberaran como pirofosfato
(PP
i
), los que se hidrolizan al instante, llevando a la reaccin siguiente. Entonces en el 3 OH de la
cadena del cido nucleico se forma el enlace fosfodister y ganamos energa, porque el precursor
es un nucletido trifosfato y la energa liberada anteriormente se usa para generar este enlace.
Este mecanismo funciona tanto para DNA como para RNA.




Si sintetizamos DNA, el precursor es el desoxinucletido trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Las
enzimas que catalizan la reaccin son las llamadas DNA polimerasas.




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Si sintetizamos RNA, el mecanismo es el mismo el precursor es el nucletido trifosfato (ATP, CTP,
GTP, UTP). La enzima que cataliza la reaccin se llama RNA polimerasa.
La DNA polimerasa debe sintetizar
todo el genoma; si hacemos
transcripcin para expresar la
informacin gnica. Entonces las
RNA polimerasas deben saber iniciar,
es decir, deben saber poner el
primer nucletido para iniciar. Para
esto necesitan de un templado o
template (molde), que sera la hebra
que est delante y poniendo la
secuencia.
Esta parte del 3 OH, porque ya hay un par de nucletidos se llama partidor
(2)
. Lo que ocurre con
las DNA polimerasas, es que solo saben hacer esta reaccin (unir nuevas unidades) en presencia de
un partidor y un templado; sin embargo, las RNA polimerasas saben empezar solas la reaccin, es
decir, saben poner ellas mismas el primer nucletido. Entonces:
Las DNA polimerasas necesitan un templado y partidor.
Las RNA polimerasas necesitan un templado, pero no un partidor (saben iniciar solas).
Ambas enzima sintetizan en direccin 5 3.
Las nuevas unidades siempre se unen en el 3 OH.
Para sintetizar DNA, mi pauta es DNA y mi producto es DNA, por lo tanto la enzima se llama DNA
polimerasa; sin embargo, cuando mi pauta es RNA y el producto es DNA (retrovirus), la enzima es
una DNA polimerasa dependiente de RNA (transcriptasa reversa).
En base a estos antecedentes, se vera como funciona la horquilla de replicacin.



(2)
Partidor: nucletido que provee el 3OH para unir los dems nucletidos
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Proceso general de la Replicacin
Se abren las dos hebras y se empieza ac (en el 5). El apareamiento es complementario; mi nueva
hebra tendria el 5 y ac el 3.
1er Problema: Tengo mi pauta, mi
hebra nueva crece de 5 3
bidireccionalmente (1 horquilla por
all y la otra por ac). Sin embargo, si
se fijan, una de las horquillas se
sintetizara de 3 5; esto no puede
ocurrir, porque no hay enzimas que
trabajen de esa forma. Esto se
soluciona sintetizando esa cadena en
forma discontinua, formando los
fragmentos de Okazaki.

2do Problema: La DNA polimerasa no sabe iniciar la sntesis, porque esta necesita un 3 OH
predispuesto. En consideracin a la horquilla discontinua, debera estar poniendo a cada rato un
3OH, pero no sabe; por lo tanto lo que ocurre es que primero se hace una pequea fraccin de
RNA con una RNA polimerasa; esto provee el 3OH y ah una DNA polimerasa sintetiza DNA.
La DNA polimerasa necesita de un 3OH, porque no entiende como poner el primer nucletido y
ac a cada instante debera poner uno. Entonces, lo que ocurre es lo siguiente:
Como una RNA polimerasa sabe
empezar sola (poner el primer
nucletido), una RNA primasa
(3)

sintetiza primero un pequeo RNA; con
esto se provee un 3OH para que la DNA
polimerasa pueda continuar poniendo
los nucletidos a partir de la pequea
fraccin de RNA.




(3)Primasa: tipo de RNA polimerasa, porque su pauta es DNA y su producto es RNA.
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3er Problema: Se necesita sintetizar dos
molculas de DNA a partir de DNA; una
de las cadenas hijas est bien, pero la
otra es una mezcla de DNA con RNA, lo
que no sirve. Aqu hace su aparicin la
DNA polimerasa I (DNA Pol I), que posee
una caracterstica especial. Esta enzima,
adems de catalizar la sntesis (unir
nuevas unidades), posee una actividad
exonucleasa 5 3, es decir, que corta
nucletido por nucletido. Entonces est
eliminando las fracciones de RNA y al
mismo tiempo se avanza con su sntesis
(rellenando con DNA).

4to Problema: En el 3er problema se
eliminan los RNA y los reemplazamos
por DNA; el ltimo que queda, es que
queda un nick.
Si se observan las bases de la pauta y
las de la nueva, vern que lo nico que
falta es un enlace fosfodister; esto es
lo que se conoce con el nombre de nick
(dibujo anterior).

No falta ningn nucletido, pero falta ese enlace y ni la DNA polimerasa ni la RNA polimerasa
saben cmo hacerlo, puesto que demandara un gasto de energa cuantioso y no estn capacitadas
para crearlo. Para eso existe otra enzima, conocida como DNA ligasa, la que es capaz de hacer el
enlace fosfodister a expensas de ATP.
Entonces se hablo de la sntesis de una hebra continua y de la sntesis de una hebra discontinua Si
tienen alguna duda pueden buscar videos en youtube y google en ingls xD




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Una cosa que no se menciono
Para abrir las hebras se tiene una enzima llamada helicasa (abre la hlice); al abrir las hebras, lo
que puede ocurrir es que hacia atrs se puede generar un sobreenrollamiento (porque todas las
hebras estn enrolladas) y para que no se genere ms y ms tensin, existe otra enzima llamada
girasa, que libera esa energa para que no se enrede ms de la cuenta. Estas dos enzimas son
topoisomerasas, las que necesitan cortar y ligar para poder cumplir su funcin, por lo tanto, gastan
ATP.
Por lo tanto, durante la replicacin hay dos momentos donde existe gasto de energa:
1. Al abrir las hebras de DNA con las topoisomerasas
2. La DNA ligasa, gasta energa en formar el enlace fosfodister. (Nota: la profe dijo: eso
gastamos antes en producir los NTP, no durante la replicacin. As que no entend xD)
Eso del nick y de las caracteristicas de la DNA Pol son de las cosas ms estudiadas. As que veremos
otras caracteristicas de esta enzima.
La DNA polimerasa, como se dijo, necesita de un partidor (3OH) de donde sea (de DNA, RNA, etc.)
y de ese 3OH (primer nucletido) que se encuentra ah, puede seguir sintetizando. Entonces, hay
un nick que ve la DNA Pol, es decir, ve que hay un templado y ve que hay un 3OH; eso representa
un sustrato para la DNA Pol y con su actividad 5 3 exonucleasa, elimina hacia adelante,
reemplaza y sintetiza los nuevos.
Eso se aprovecha en metodologia para marcar ADN.
Si alguno de esos desoxirribonucletidos trifosfato (dNTP) lo marcamos con un radioistopo en
alguno de los tres fosfatos. Para efectos de incorporacin, el fosfato marcado ha de ser el (el
ms cercano al azcar), puesto que es el nico que se incorpora. Entonces, uno elige un nucletido
que est marcado con un radioistopo, que en general es tetra () en el fosfato . Esta reaccin
es llamada nick translation.
Lo que ocurre es que se reemplaza una parte, se incorpora ese nucletido marcado, pero no se
elimina el nick. Si eso se hace en un tubo de ensayo, eso no importa, pero si se est in vivo y se
tiene que replicar el genoma completo, si importa mucho el nick y por tanto, es importantsimo
ligarlo, porque se necesita el DNA entero.
El mecanismo de la ligacin, consiste en que la enzima forma un intermediario unido directamente
al DNA y a partir de eso, se apoyan las formaciones de enlaces.
La terminacin en procariotas consiste en separar las cadenas concatenadas.


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Respecto a la DNA Pol I se mencionara una actividad ms. Se comento, que las bases nitrogenadas
tienen la caracterstica pueden formarse en ms de una forma; en una forma ceto; aldol o, en
veces, una forma tautomrica. Entonces, por ejemplo: si la DNA polimerasa se encuentra
sintetizando DNA y se encuentra con una T a la forma tautomrica, en vez de aparearla con A, la
aparea con G.
Lo que sucede, es que la forma tautomrica no calza tan bien como la correcta, por tanto, la DNA
polimerasa se alcanza a dar cuenta; entonces, va a frenar y lo va desviar a otra parte de su
molcula, donde tiene la actividad 3 5 exonucleasa, y ese ltimo que puso an puede repararlo;
as que corta el enlace hacia atrs y puede poner el prximo.
Por tanto la actividad 3 5 exonucleasa, es de correccin.
El nombre que se relaciona con la
DNA Pol I es el de Sir Arthur
Kornberg, quien se gan dos
premios Nobel, porque realmente
devel con muchos experimentos
geniales el mecanismo de la DNA
Pol I. Esta enzima tambin se ha
utilizado mucho en el laboratorio,
por la nick translation y un
montn de cosas.
Y eso es como la interpretacin de la polimerasa. Es una cadena de aminocidos y tiene la forma
de una mano (imaginacin!); se puede ver como avanza la hebra... se puede ver el 3OH de la
hebra nueva; se ve el lugar donde entra el NTP y si se equivoc, se da cuenta porque no calza tan
bien y lo desva hacia otra seccin, donde tiene la actividad de sacar el nucletido.
Entonces, una imagen ms sobre la DNA Pol III Imagnenselo que tiene que cumplir la enzima:
por un lado estas enzimas deben reconocer el DNA y unirse a l relativamente fuerte (Nota:
Acordarse que todas las molculas interactan con fuerzas no covalentes), pero para polimerizar
requiere moverse a lo largo de todo el DNA, as que este debiera estar un poco suelto, para
permitir un correcto desplazamiento de la DNA Pol. Es por esto, que existen variadas partes de la
molcula que actan como ayudantes, para que se
una al DNA y no se suelte tan fcilmente.
En la imagen se pueden observar las muchas
subunidades presentes: delante se encuentra la
helicasa; despus viene una forma de media luna,
que ayuda a que abrace al DNA; despus tiene esos
dos clamps, que ayudan a que se forma la
horquilla.
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En el caso de las eucariotas hay ms DNA Pol, cada una con distinto nombre, pero en principio
cumplen la misma funcin. Mecnicamente funciona igual, pero solo tienen otros nombres.
La gran diferencia en eucariotas es que en la clula tenemos los metros y metros de DNA en forma
de cromatina; esta se compone de histonas y DNA y se encuentra en el ncleo. Mientras que las
procariotas, no tienen histonas; esto no quiere decir, que no est ordenado, porque si lo est
La doble hlice de DNA, presenta hacia afuera un extremo hidroflico, otorgado por la carga
negativa de los grupos fosfato. Imagnense que tienen metros de un hilo que posee carga negativa,
este deben empaquetarlo y meterlo en un ncleo pequeo, pero carga negativa con carga
negativa se repelen.
Para solucionar esto existen las histonas, las que poseen carga positiva, otorgada principalmente
por los grupos R presentes en ellas (lisina y arginina bsicos a pH normal). Las histonas, adems,
corresponde a las molculas mejor conservadas, porque el DNA es igual en muchas especies.
Entonces es muy pequeo, muy bsico y sobre un octmero (8 de estas histonas) enrolla el DNA; a
esto lo llamamos nucleosoma.
H1 est como un gancho y hace el nucleosoma ms compactado. Entonces, el primer nivel de
empaquetamiento del DNA es a travs del nucleosoma; se enrolla hacia la izquierda 1,8 vueltas y
hacia el prximo. La parte que se encuentra entre medio de dos nucleosomas, se llama DNA linker
(Nota: viene de la palabra unir).
El nmero de pares de bases, que se encuentra enrollando en el nucleosoma, son 147. Este
nmero es independiente de la especie, siempre es el mismo, pero el linker depende de cada
especie: algunos son ms largos, otros ms cortos; en nosotros son alrededor de 50 pares de bases
los que componen el linker. Por lo tanto, el nucleosoma entero es 200 pares de bases y 8 histonas
(2x H2A, H2B & 2x H3, H4).
H1
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Luego el collar de perlas se
sobreenrollan, formando estructuras
de mayor orden, donde participan
otras protenas ms y, por ltimo, se
forma la cromatina; esta es DNA y
protenas, una parte de las protenas
son histonas, pero tambin existen
otras.
La funcin de la cromatina es
empaquetar el DNA para que pueda
calzar en la clula. Adems, es un
mecanismo de proteccin, porque el
DNA es muy largo y delgado, as que
evita su rompimiento; mecanismo de
ordenamiento y puede permitir o
denegar el acceso a secuencias
especificas.
Los procesos de replicacin, transcripcin y traduccin ocurren solo si el ADN se encuentra
accesible.
En eucariotas se tiene primero que desempaquetar la cromatina; aqu nos ayudan
topoisomerasas.
Las lisinas y argininas, que tienen las
cargas positivas, estn en la parte amino
terminal de las histonas. Estas histonas,
tienen la caracterstica de ser chasconas,
entonces este complejo amino terminal
sale como aparece en la imagen.
Entonces, si tienen una carga positiva
(estado normal) se abrazaran muy fuerte
al DNA y la cromatina estar
relativamente compactada.

Si se quiere abrir la cromatina, hay que sacar las cargas positivas y poner grupos qumicos
funcionales que no tengan carga, como acetilos, para que acten con la lisina y arginina. Entonces
hay enzimas que son acetiladas de histonas y como ya no tienen carga, la unin al DNA no ser tan
fuerte; as el ADN se soltar ms, dejando las secuencias libres.
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Entonces si las histonas estn muy acetiladas, el ADN estar ms abierto y activo
transcripcionalmente.
Si existe poca acetilacin (Nota: Tambin existen enzimas que desacetilan) la cromatina
estar ms empaquetada y menos activa transcripcionalmente.
Les dejo una tarea
En algn momento se llegar al trmino de la replicacin
En el lado de la hebra continua, todo bien con la DNA Pol III sper fine.
En el lado de la hebra discontinua, se llegara a sintetizar el ultimo fragmento de Okasaki, pero
quin replica esto?
Como DNA Pol no puedo hacer nada, y me est quedando un RNA, que no tiene nada que ver con
mi DNA que estoy sintetizando Cmo soluciono esto?
Respuesta: Primero ocurre la sntesis de telmeros, luego acta la telomerasa, permitiendo que se
sintetice la ltima parte.
Verifiquen esta ltima respuesta, la deduje en base a mis apuntes de clase xD