Trabajo Prctico Optativo

Extraccin de ADN y condensacin

alcohlica.
B101
Biologa General
INTRODUCCION

El cido desoxirribonucleico es un tipo de cido nucleico, una macromolcula
que forma parte de todas las clulas. Contiene la informacin gentica usada
en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de
algunos virus, y es responsable de su transmisin hereditaria.
Muchas de las tcnicas de biologa molecular incluyen algn tipo de
manipulacin del material gentico. Hoy da podemos obtener suficiente ADN y
de buena calidad de manera sencilla y en poco tiempo.
Algunas preguntas para pensar acerca del trabajo prctico
Una manera de purificar una molcula es deshacerse de todas las
molculas, excepto la de inters. Si queremos extraer ADN de una fruta
como kiwi De que molculas piensas que deberamos deshacernos?
Qu sustancias son necesarios para lograr purificar ADN de acuerdo a
sus propiedades qumicas y la de las dems molculas?
HISTORIA DEL DESCUBRIMIENTO DEL ADN
El ADN lo aisl por primera vez en 1869, el mdico suizo Friedrich Miescher.
Miescher realizaba experimentos acerca de la composicin qumica del pus de
vendas quirrgicas desechadas, cuando not un precipitado de una sustancia
desconocida que caracteriz qumicamente ms tarde
.
La llam nuclena,
debido a que lo haba extrado a partir de ncleos celulares. Se necesitaron
casi 70 aos de investigacin para poder identificar los componentes y la
estructura de los cidos nucleicos.
En 1930 Levene y su maestro Albrecht Kossel probaron que la nuclena de
Miescher es un cido desoxirribonucleico (ADN) formado por cuatro bases
nitrogenadas, el azcar desoxirribosa y un grupo fosfato, y que, en su
estructura bsica, el nucletido est compuesto por un azcar unido a la base y
al fosfato. Sin embargo, Levene pensaba que la cadena era corta y que las
bases se repetan en un orden fijo.
La funcin biolgica del ADN comenz a dilucidarse en 1928, con una serie
bsica de experimentos realizados por Frederick Griffith, quien estaba
trabajando con cepas "lisas" (S) o "rugosas" (R) de la bacteria Pneumococcus
(causante de la neumona), segn la presencia (S) o no (R) de una cpsula
azucarada, que es la que confiere virulencia. La inyeccin de neumococos S
vivos en ratones produce la muerte de stos, y Griffith observ que, si
inyectaba ratones con neumococos R vivos o con neumococos S muertos por
calor, los ratones no moran. Sin embargo, si inyectaba a la vez neumococos R
vivos y neumococos S muertos, los ratones moran, y en su sangre se podan
aislar neumococos S vivos. Como las bacterias muertas no pudieron haberse
multiplicado dentro del ratn, Griffith razon que deba producirse algn tipo de
cambio o transformacin de un tipo bacteriano a otro por medio de una
transferencia de alguna sustancia activa, que denomin pr i nci pi o
transformante. Esta sustancia proporcionaba la capacidad a los neumococos R
de producir una cpsula azucarada y transformarse as en virulentas.
Curtis H & Barnes NS (2001) Biologa. (6 edicin). Ed. Mdica Panamericana
La bsqueda del factor transformante que era capaz de hacer virulentas a
cepas que inicialmente no lo eran continu hasta 1944, ao en el cual Oswald
Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty extrajeron la fraccin activa (el factor
transformante) y, mediante anlisis qumicos, enzimticos y serolgicos,
observaron que no contena protenas, ni lpidos, ni polisacridos activos, sino
que estaba constituido principalmente por "una forma viscosa de cido
desoxirribonucleico altamente polimerizado", es decir, ADN.
Finalmente, el papel exclusivo del ADN en la heredabilidad fue confirmado en
1952 mediante los experimentos de Alfred Hershey y Martha Chase, en los
cuales comprobaron que el fago T2 (virus que infecta bacterias) transmita su
informacin gentica en su ADN, pero no en su protena. El fago consiste
nicamente en una cubierta proteica o cpside que contiene su material
gentico, e infecta a una bacteria cuando se adhiere a su membrana externa,
inyecta dicho material y le deja acoplada la cpside. Como consecuencia, el
sistema gentico de la bacteria reproduce el virus.
En un primer experimento, marcaron el ADN de los fagos con el istopo
radiactivo fsforo-32 (P-32). El ADN contiene fsforo, a diferencia de los 20
aminocidos que forman las protenas. Dejaron que los fagos del cultivo
infectaran a las bacterias Escherichia coli y posteriormente retiraron las
cubiertas proteicas de las clulas infectadas mediante una licuadora y una
centrfuga. Hallaron que el indicador radiactivo era visible slo en las clulas
bacterianas, y no en las cubiertas proteicas. En un segundo experimento,
marcaron los fagos con el istopo azufre-35 (S-35). Los aminocidos cistena y
metionina contienen azufre, a diferencia del ADN. Tras la separacin, se hall
que el indicador estaba presente en las cubiertas proteicas, pero no en las
bacterias infectadas, con lo que se confirm que es el material gentico lo que
infecta a las bacterias
Hershey y Chase encontraron que el S-35 queda fuera de la clula mientras
que el P-32 se lo encontraba en el interior, indicando que el ADN era el soporte
fsico del material hereditario.
Curtis H & Barnes NS (2001) Biologa. (6 edicin). Ed. Mdica Panamericana
En cuanto a la caracterizacin qumica de la molcula, en 1940 Chargaff realiz
algunos experimentos que le sirvieron para establecer las proporciones de las
bases nitrogenadas en el ADN. Descubri que las proporciones de purinas eran
idnticas a las de pirimidinas, la "equimolecularidad" de las bases ([A]=[T],
[G]=[C]) y el hecho de que la cantidad de G+C en una determinada molcula de
ADN no siempre es igual a la cantidad de A+T y puede variar desde el 36 hasta
el 70 por ciento del contenido total.
Con toda esta informacin y junto con los datos de difraccin de rayos X
proporcionados por Rosalind Franklin, James Watson y Francis Crick
propusieron en 1953 el modelo de la doble hlice de ADN para representar la
estructura tridimensional del polmero
ESTRUCTURA DEL ADN.
Cada molcula de ADN est formada por dos polmeros extremadamente
largos sostenidos entre s por enlaces puente de hidrgeno y enrollados en lo
que se conoce como doble hlice. Cada uno de los dos polmeros est formado
por numerosas subunidades llamadas nucletidos, enlazadas covalentemente
formando las cadenas.
Cada nucletido est compuesto por tres partes: un compuesto de fsforo
llamado fosfato, un azcar de 5 carbonos simples (la desoxiribosa) y una base
nitrogenada (puede ser adenina_A, timina_T, citosina_C o guanina_G). Debido
a la estructura qumica que presentan, Adenina de una cadena siempre se
aparea con Timina y Citocina con Guanina. Adenina se une a Timina mediante
2 puentes de hidrgeno y Citocina se une a Guanina mediante 3 puentes de
hidrgeno
La disposicin secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena (el
ordenamiento de los cuatro tipos de nucletidos) es la que codifica la
informacin gentica.
Las secuencias de ADN que constituyen la unidad fundamental, fsica y
funcional de la herencia se denominan genes. Cada gen contiene una parte
que se transcribe a ARN y otra que se encarga de definir cundo y dnde
deben expresarse. La informacin contenida en los genes se emplea para
generar ARN y protenas.
Dentro de las clulas, el ADN est organizado en estructuras llamadas
cromosomas que, durante el ciclo celular, se duplican antes de que la clula se
divida. Los organismos eucariotas almacenan la mayor parte de su ADN dentro
del ncleo celular y una mnima parte mitocondrias, y en los plastos, en caso
de tenerlos. Los organismos procariotas (bacterias y arqueas) lo almacenan en
el citoplasma de la clula, y, por ltimo, los virus ADN lo hacen en el interior de
la cpside de naturaleza proteica.
Existen multitud de protenas, como por ejemplo las histonas y los factores de
transcripcin, que se unen al ADN dotndolo de una estructura tridimensional
determinada y regulando su expresin. Los factores de transcripcin reconocen
secuencias reguladoras del ADN y especifican la pauta de transcripcin de los
genes. El material gentico completo de una dotacin cromosmica se
denomina genoma y, con pequeas variaciones, es caracterstico de cada
especie
FUNDAMENTO DEL PRCTICO
La extraccin de ADN requiere una serie de etapas bsicas. En primer lugar
tienen que romperse la pared celular y la membrana plasmtica para poder
acceder al ncleo de la clula. A continuacin debe romperse tambin la
membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por ltimo hay que proteger el ADN
de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite
en alcohol.
La extraccin de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los
iones salinos son atrados hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su
disolucin y posterior extraccin de la clula. Se empieza por lisar (romper) las
clulas mediante un detergente, vacindose su contenido molecular en agua,
en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el agua contiene ADN y todo
un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, protenas y otras
sustancias en menor proporcin. Las protenas asociadas al
ADN, de gran longitud, se habr fraccionado en cadenas ms pequeas y
separadas de l por accin del detergente. Slo queda, por tanto, extraer el
ADN de esa mezcla para lo cual se utiliza alcohol.
Actividad de Laboratorio
Parte Prctica:
Objetivo
Extraer ADN a partir vegetales.
Materiales
Hojas de acelga Sal
Agua fra Detergente lquido
Licuadora Jugo de kiwi o anan
Vaso de precipitado 2 tubos de ensayo
Cuchara Colador
Protocolo
1) Se coloca medio vaso de hojas de acelga fresca, un vaso de agua fra y
una pizca de sal en la licuadora
2) Licuar 15 segundos a mxima velocidad.
3) Colar el contenido de la jarra en un vaso limpio
4) Agregar 2 cucharadas de detergente, mezclar bien sin hacer espuma y
dejar reposar 10 minutos
5) Colocar 1-2 ml de mezcla en cada tubo de ensayo
6) Agregar unas gotas de jugo de kiwi o anan en uno de los tubos y
mezclar bien pero sin hacer espuma. Dejar reposar 2 minutos.
7) Inclinar el tubo y agregar un volumen de alcohol lentamente por el borde
hasta que se vea una capa sobre la mezcla.
8) Dejar reposar unos minutos hasta que el ADN se visualice en la
interfase.
Glosario
Bacterifagos o fagos: Virus que infecta a bacterias. Son empleados
por los ingenieros genticos para introducir genes en clulas bacterianas
Clon: Copia genticamente idntica de un gen, una clula o un
organismo.
Cromatina Es el conjunto de ADN, histonas y protenas no histnicas
que se encuentra en el ncleo de las clulas eucariotas y que constituye
el cromosoma eucaritico.
Cromosoma: Cada uno de los pequeos cuerpos en forma de
bastoncillos en que se organiza la cromatina del ncleo celular durante
las divisiones celulares (mitosis y meiosis).
Cdigo gentico: Conjunto de tripletas o codones que codifican los
distintos aminocidos que forman las protenas. Existen 64 tripletas o
codones para codificar los veinte aminocidos, por lo que un aminocido
est codificado en la mayora de los casos por varias tripletas o
codones, por eso decimos que el cdigo gentico es un cdigo
degenerado.
Factor de transcripcin: es una protena que participa en la regulacin
de la transcripcin del ADN, pero que no forma parte de la ARN
polimerasa.
Gen: Unidad fsica de la herencia, formada por una secuencia de
nucletidos en una determinada localizacin de un cromosoma
especfico. Puede definirse tambin como un fragmento de ADN que
lleva la informacin para la sntesis de una protena (o enzima).
Genoma : Todos los genes includos en un conjunto completo de
cromosomas
Histonas: Protenas bsicas de baja masa molecular muy conservadas,
evolutivamente entre los eucariotas y en algunos procariotas. Forman la
cromatina junto con el ADN.
Istopos: Diferentes tipos de tomos de un mismo elemento cuyos
ncleos difieren en su nmero de neutrones.
Radioistopo: istopo de algn elemento capaz de emitir
radioactividad.
Radiactividad: fenmeno fsico natural, por el cual algunos cuerpos o
elementos qumicos llamados radiactivos, emiten radiaciones que tienen
la propiedad de impresionar placas fotogrficas, ionizar gases, producir
fluorescencia, atravesar cuerpos opacos a la luz ordinaria, etc.
Virulencia: Grado de patogenia (capacidad de un microorganismo) para
producir una enfermedad y su poder de multiplicacin en el organismo
afectado.
Bibliografia
CAMPBELL N, Biologa, Sptima edicin. Editorial Panamericana. Madrid,
Espaa, 2007.
CURTIS H, BARNES S, Biologa Sptima edicin. Editorial Panamericana,
Buenos Aires, 2008.
es.wikipedia.org