ATLAS de HISTOLOG

IA
VEGETAL y ANIMAL
T

ECNICAS HISTOL

OGICAS
1. FIJACI

ON
Pilar Molist
Manuel A. Pombal
Manuel Megas
Depto. de Biologa Funcional y Ciencias de la Salud
Facultad de Biologa
Universidad de Vigo
(Version: Noviembre 2011)
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paginas que tratan de la celula eucariota.
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E
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1. Tecnicas histologicas
Denominamos proceso histologico a una serie de metodos y tecnicas
utilizados para poder estudiar las caractersticas morfologicas y moleculares
de los tejidos. Hay diversos caminos para estudiar los tejidos, es decir,
series de tecnicas que se utilizaran dependiendo de que caracterstica
deseemos observar. En el siguiente esquema se muestran los metodos y
tecnicas com unmente empleados para el procesamiento de los tejidos. Sin
embargo, hay que tener en cuenta que existen muchas variantes a estos
caminos
2
su eleccion dependera del resultado nal que queramos obtener.
Figura 1: Esquema del proceso histol ogico dicotiled onea.
El proceso histologico comienza con la obtencion del tejido objeto de
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estudio. En el caso de los tejidos vegetales se toman muestras de los
distintos organos que componen el cuerpo de la planta, mientras que para
los tejidos animales podemos optar por dos opciones: coger una porcion de
dicho tejido o procesar una parte, organo o parte corporal, o el animal
completo. En cualquier caso las muestras son habitualmente jadas con
unos soluciones lquidas que contienen unas sustancias denominadas
jadores, las cuales mantienen las estructuras celulares y moleculares en
sus posiciones iniciales durante el procesamiento posterior. Tambien
podemos jar las moleculas de los tejidos por congelacion rapida. Fijar un
tejido es como si hiciesemos una fotografa del tejido que se
mantendra hasta su observacion. Sin embargo, el uso de jadores o medios
de inclusion afectan a veces las caractersticas tisulares que queremos
observar y por tanto tenemos que recurrir a la congelacion para endurecer
el tejido para despues poder obtener secciones del mismo.
Normalmente, tras la jacion se procede a incluir el tejido para
posteriormente obtener secciones. Cuanto mas delgada queramos que sea
nuestra seccion mas tenemos que endurecer nuestra muestra. Esto se
consigue embebiendo el tejido con sustancias lquidas que posteriormente
polimerizaran (resinas) o se volveran consistentes (ceras). Tambien se
puede conseguir el mismo efecto mediante congelacion rapida. Cortes mas
gruesos de 40 m se pueden cortar sin necesidad de inclusion usando el
vibratomo. Los medios de inclusion son normalmente no hidrosolubles por
lo que tenemos que sustituir el agua de los tejidos por solventes organicos
liposolubles y posteriormente a nadir el medio de inclusion.
Tras la inclusion o la congelacion se procede a cortar los tejidos. Existen
diferentes aparatos de corte que permiten conseguir secciones ultranas
(del orden de nanometros), seminas (de 0.5 a 2 m), nas (entre unas 3 y
10 m) y gruesos (mayores a 10 m). Estas secciones hay que procesarlas
para poder observarlas, aunque ciertos tipos de microscopa, por ejemplo
con contraste de fase, permiten observar tejidos sin te nir. Normalmente las
secciones se ti nen con colorantes que son hidrosolubles, por lo que hay que
eliminar el medio de inclusion para que los colorantes pueden unirse al
tejido. Las secciones, secciones ultranas, que se observan con el
microscopio electronico se pueden contrastar con metales pesados, opacos a
los electrones, sin eliminar la resina.
Los tejidos procesados se observan con los microscopios. Existen dos
tipos basicos de microscopios: electronico y optico. Los primeros permiten
un gran poder de resolucion, pudiendose observar caractersticas
ultraestructurales, mientras que los segundos, con menor poder de
resolucion, ofrecen una gran versatilidad en cuanto a modos de observar los
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tejidos : uorescencia, contraste de fase, polarizacion o contraste de
interferencia diferencial.
Como dijimos al comienzo existen m ultiples variaciones sobre este
esquema general. Por ejemplo, se pueden observar tejidos con el
microscopio electronico de barrido sin necesidad de incluir ni cortar, pero
solo observaremos supercies. En las siguientes paginas veremos con cierto
detalle algunas de las tecnicas mas empleadas para la observacion de los
tejidos.
5
2. FIJACI

ON.
Todos los tejidos, cuando se extraen del organismo o el organismo
muere, sufren dos tipos de procesos degradativos: autolisis (accion de
enzimas intracelulares, es decir, autodigestion) y putrefaccion (accion
bacteriana). Ademas, el procesamiento histologico posterior del tejido para
poner de maniesto y observar determinadas estructuras supone una
metodologa que puede degradar las estructuras tisulares. Fijar un tejido es
preservar sus caractersticas morfologicas y moleculares lo mas parecidas
posibles a las que posea en estado vivo. Es como hacer una fotografa del
tejido vivo y poder observarla, tras cierto tratamiento, con el microscopio.
As, los jadores deben proteger frente a ataques bacterianos, evitar
autolisis, insolubilizar elementos solubles que se quieren estudiar, evitar
distorsiones y retracciones tisulares, prenetrar y modicar el tejido para
poder llevar a cabo tinciones especcas posteriores, si es necesario,
etcetera.
No existe un jador universal, ni un metodo de jacion unico. Incluso
podemos usar varios jadores secuencialmente seg un nuestras necesidades.
La eleccion depende de las caractersticas jadoras que necesitemos. Por
ejemplo, si queremos estudiar actividades enzimaticas debemos usar un
jador que no nos altere el centro activo de dichas enzimas, y quiza para
ello tengamos que sacricar en cierta medida la morfologa tisular. Si
queremos estudiar la ultraestructura celular debemos usar jadores que la
preserven y que protejan a las membranas celulares durante el
procesamiento de inclusion en resinas, y quiza esto altere su apetencia por
los colorantes generales. Si queremos te nir un determinado componente
celular difcilmente te nible quiza debamos usar un jador que lo modique
para que sea reconocido mas facilmente por los colorantes.
En cualquier caso, hay caractersticas de los jadores que tenemos que
tener en cuenta antes de su uso:
Velocidad de penetracion. El proceso de jacion ha de ser rapido y la
velocidad de difusion de la sustancia jadora en los tejidos es un factor
determinante. Este parametro condiciona el tama no de la pieza que
queramos jar, mas peque na cuanto menor la velocidad de difusion, y el
tiempo de jacion, mayor cuanto menor tiempo de difusion.
Velocidad de jacion. Esta caracterstica no dependen de la velocidad
de difusion sino de las propiedades qumicas del jador y condiciona el
tiempo que debe permanecer el tejido en contacto con el jador.
Endurecimiento. Los jadores generalmente endurecen los tejidos, lo
cual depende del tipo de jador y del tiempo que el tejido haya estado
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expuesto a el.

Osmosis y pH. Es indispensable evitar cambios de volumen en la celulas

producidos por una osmolaridad del jador diferente a la del tejido. Por
tanto, hay que equilibrar la osmolaridad de las soluciones jadoras y la de
los tejidos a jar. No es necesario a nadir sustancias complejas. Por
ejemplo, para los tejidos de animales terrestres basta con a nadir 0.9 % de
cloruro sodico. Son sales que no afectan a la capacidad del jador.
Normalmente se suelen usar soluciones tamponadas a un pH semejante al
del tejido e isoosmoticas con dicho tejido.
Efecto mordiente. Algunas estructuras tisulares son difciles de te nir
puesto que tienen poca apetencia por los colorantes, pero puede ser
incrementada con un tratamiento previo. Algunos jadores, ademas de
jar, modican qumicamente a ciertas estructuras celulares para que
posteriormente puedan unirse a ellas los colorantes. Este este tipo de
modicacion qumica se le denomina efecto mordiente.
Artefactos. Los procesos de jacion pueden acarrear alteraciones
tisulares como variaciones morfologicas, cristalizacion de compuestos,
desplazamiento de sustancias, etcetera. Estos cambios pueden producirse
por las caractersticas del jador o por un mal uso de este. En cualquier
caso deben tenerse en cuenta para no describir como caractersticas
tisulares lo que es un artefacto introducido durante la jacion.
7
3. M

ETODOS de FIJACI

ON.
Existen diferentes formas de jar los tejidos, dependiendo del tipo de
jador, de la estructura a jar y de lo queramos observar. Los metodos de
jacion se pueden clasicar en dos tipos: fsicos y qumicos.
Los jadores fsicos estan basados en una congelacion muy rapida del
tejido, en la aplicacion de calor o microondas. Se utilizan cuando el tipo de
muestra lo requiere, cuando los jadores qumicos alteran la estructuras
que queremos observar, o cuando necesitamos una jacion muy rapida. La
congelacion rapida es un buen metodo de preservacion de las caratersticas
moleculares y es conveniente que sea rapida puesto que as se impide la
formacion de grandes cristales de hielo que nos destrozaran la estructura
del tejido. Existen variantes de esta tecnica como son la criodesecacion o
liolizacion y la criosustitucion. La criodesecacion parte de tejido
previamente congelado, pero posteriormente se realiza una sublimacion del
hielo, es decir, el agua pasa de estado solido a gaseoso sin pasar por estado
lquido. Al eliminar el agua se impide que se den reacciones qumicas por lo
que ademas de la jacion preserva el tejido en el tiempo. La criosustitucion
tambien parte de tejido congelado pero en este caso se produce una
sustitucion lenta del hielo por una solucion jadora. Con ello se posibilita
una jacion qumica sobre un material que no ha sufrido deterioro puesto
que esta congelado. Los metodos de jacion por calor de jacion no son
frecuentemente usados, excepto para observar microorganismos.
Los metodos qumicos utilizan soluciones acuosas compuestas por
moleculas jadoras que establecen puentes entre las moleculas celulares,
manteniendolas en sus lugares originales e impidiendo su degradacion. Hay
dos metodos de jacion con jadores lquidos: inmersion y perfusion. En
cualquier caso el jador debe entrar en contacto con el tejido lo mas
rapidamente posible.
Inmersion. Por el metodo de inmersion las piezas de tejido se sumergen
en la solucion jadora. Tenemos que tener en cuenta algunas precauciones.
1) Las piezas de tejido no deberan superar los 0.5 cm de espesor para
que el jador alcance el interior de la pieza antes de que esta comience a
deteriorarse. Esto depende de la velocidad de penetracion del jador y de
las caractersticas del tejido, por ejemplo, si tiene cavidades por donde
penetre la solucion jadora.
2) El volumen recomendado de jador debe ser 20 veces superior al
volumen de la pieza.
3) La osmolaridad entre tejido y solucion jadora deben estar
equilibradas.
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4) El pH del jador debe ser proximo al siologico.
5) El tiempo de jacion depende de cada tipo de jador, pero
generalmente existe un tiempo maximo para cada uno de ellos que no debe
ser excedido.
Figura 2: Fijaci on por inmersi on.
Perfusion. Por este procedimiento la solucion jadora se introduce a
traves del sistema circulatorio mediante el cual accede a todas las celulas
del tejido gracias a la red de capilares. Mediante este metodo se puede jar
un animal completo introduciendo la solucion jadora a traves del
ventrculo cardiaco, con lo que el jador llegara a todas las celulas
irriegadas por la sangre bombeada por dicho ventrculo (circuito pulmonar
o corporal). Tambien podemos jar un unico organo en el caso de que
podamos aislar e introducir la solucion jadora en la arteria principal que
irriga dicho organo. La perfusion no siempre es posible llevarla a cabo,
como es el caso de biopsias o tejidos vegetales. Este metodo es mucho mas
efectivo que el de inmersion, ya que la solucion jadora llega a escasa
distancia de todas las celulas de la estructura perfundida. Por tanto, la
velocidad de penetracion del jador no es una condicion limitante. El
volumen de jador necesario tambien es menor puesto que la solucion
jadora se va renovando constantemente y por tanto no se diluye con el
medio acuoso del tejido y no pierde potencial jador.
Antes de introducir el jador en el sistema de vasos sanguneos hay
eliminar previamente la sangre con una solucion de lavado oxigenada, de
otra manera su interaccion con el jador produce trombos que impediran
la jacion de determinadas zonas del animal o del organo. Respecto a las
precauciones mencionadas anteriormente en el metodo de inmersion
debemos cuidar aqu tambien la osmolaridad, el pH y el tiempo de jacion.
Este metodo de jacion requiere conocer la presion a la que se va a
introducir la solucion jadora en el animal o estructura, la cual debe ser
similar a la que posee la presion sangunea normal en estado vivo. La
presion que ejercera la solucion jadora se puede regular mediante bombas
peristalticas (ver gura) o por gravedad, es decir, variando la altura a la
9
Figura 3: Fijaci on por inmersi on.
cual se coloca la solucion jadora respecto a la del animal. Esto es
importante porque una presion muy baja prodra impedir que la solucion
jadora alcanzara todas las partes de la estructura y un presion muy alta
podra provocar roturas de los vasos sanguneos y de la propia estructura
tisular.
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Figura 4: Fijaci on por perfusi on de un organismos completo. Mediante este tipo de
perfusi on se introduce la soluci on jadora en el sistema sanguneo. La bomba perist altica
aporta la presi on suciente permitiendo al jador entrar a traves del ventrculo izquierdo
(Vi) y pasar a la aorta, desde la cual se distribuye por todo el cuerpo (excepto por el
circuito pulmonar). Tras pasar por la red capilar, la soluci on jadora pasa a los vasos
venosos que terminan por verter su contenido en la aurcula derecha (Ad). A esta cavidad
hay que hacerle una abertura para que la soluci on jadora, una vez realizada su funci on,
salga del circuito. Ai: aurcula izquierda; Vd: ventrculo derecho.
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4. FIJADORES.
Existen multitud de jadores en los manuales de tecnicas histologicas.
Aqu solo trataremos aquellos que consideramos de uso mas com un para la
observacion de tejidos al microscopio, es decir, aquellos que mejor
preserven la estructura celular. Los jadores qumicos son los mas
frecuentemente empleados, bien con un solo tipo de sustancia jadora o
con mezclas de varias de ellas.
Atencion! La mayora de las sustancias jadoras son toxicas por
inhalacion o por contacto, algunas de ellas cancergenas. Hay que seguir las
indicaciones de seguridad para su manejo y utilizacion.
Fijadores simples
Figura 5: Etanol: CH3-CH2-OH
Alcohol etlico. Fija por deshidratacion y se usa entre el 70 y 90 %. Es
un buen elemento para preservar moleculas, como ciertas enzimas,
propiedades antigenicas, glucogeno, pigmentos y para las extensiones
citologicas. Debido a que deshidrata, a la vez que ja, se puede usar
tambien como un conservante de las muestras. Tiene inconvenientes como
el endurecimiento y la retraccion de los tejidos. Carece de efecto mordiente.
Figura 6:

Acido acetico: CH3COOH
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Acido acetico. Su proceso de jacion consiste en cambiar el estado

coloidal de las protenas. Se utiliza a una concentracion que vara entre el 1
y el 5 %. Es el jador ideal para acidos nucleicos y nucleoprotenas. Como
inconvenientes cabe destacar la destruccion de las mitocondrias y mala
jacion de membranas y citoplasma. Se suele usar en combinacion con
otros jadores
Figura 7:

Acido pcrico: C6H2OH(NO2)3

Acido pcrico. La jacion la produce porque sales del tipo picrato

coagulan con las protenas de los tejidos. Se suele usar el 2 % de una
solucion saturada de acido pcrico. Preserva bien la estructura celular, no
produce retracciones cuando el tiempo de jacion es optimo, preserva bien
glucogeno y lpidos. Es un buen jador para tinciones generales puesto que
favorece la union de los colorantes. Hay que eliminarlo completamente
antes de proceder a la inclusion en ceras como la parana. Se suele usar
combinado con otros jadores.
Figura 8: Formaldehdo: CH2=O
Formaldehdo. Act ua mediante la formacion de puentes entre las
moleculas tisulares. Se utiliza a concentraciones proximas al 4 %. Es un
jador ampliamente usado por la buena preservacion del tejido, act ua
como conservante, produce poca retraccion tisular, es un buen jador para
lpidos, es compatible con la mayora de las tinciones histologicas, incluidas
las de inmunocitoqumica e hibridacion de acidos ribonucleicos.
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Normalmente se usa en solucion tamponada e isotonica.
Figura 9: Glutaraldehdo
Glutaraldehdo. Forma puentes entre las moleculas de los tejidos. Se usa
a una proporcion de entre el 0,5 y el 3 %. Tiene una alta capacidad para
preservar la estructura celular, por lo que es el jador de referencia para
observacion de ultraestructuras celulares con el microscopio electronico.
Pero hay que tener cuidado con su baja penetracion tisular y puede
producir retracciones. Se usa en soluciones tamponadas isotonicas.
Figura 10: Tetr oxido de osmio. OsO4
Tetroxido de osmio. Forma puentes entre moleculas. Se emplea al 1 %
en soluciones tamponadas. Es buen jador de la ultraestructura de la
celula por lo que se emplea habitualmente para las observaciones con el
microscopio electronico. Es un buen jador para grasas y membranas
celulares. Por su fuerte caracter oxidante no se usa para tinciones
convencionales, excepto para las impregnaciones argenticas como el
metodo de Golgi.
Mezclas jadoras
La mayor parte de los procesos de jacion usan distintas sustancias
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jadoras, bien mezcladas en la solucion acuosa inicial o utilizadas
sucesivamente en el tiempo. Con ello se aprovechan las ventajas de cada
una de ellas y se pueden contrarrestar sus desventajas. Hay multitud de
formas de usar los diferentes jadores, tanto en sus componentes como en
las proporciones de estos, dependiendo de las necesidades posteriores, es
decir, que tipo de tejido queremos jar y que queremos ver de dicho tejido.
A continuacion vamos a mencionar algunas combinaciones usadas
frecuentemente porque tienen unas propiedades de jacion que las hace
apropiadas para las observacion de una gran variedad de tejidos y de
tecnicas de tincion.
Lquido de BOUIN: Est a formado por acido pcrico, formaldehdo y
acido acetico glacial. Es una solucion muy utilizada para el procesamiento
de tejidos que se incluiran en parana (ver captulo de inclusion) y a cuyas
secciones se le pueden aplicar un amplio espectro de tinciones. Es muy util
para tejidos blandos y embriones, y preserva bien el n ucleo y el glucogeno.
Hay que tener cuidado con el tiempo de jacion, que no debe exceder de 48
h en el caso de jaciones por inmersion. Tras la jacion las muestras de
tejido se pueden conservar en alcohol de 70

. No esta recomendado para el

ri non ni para el estudio de mitocondrias. Antes de la inclusion en parana
es conveniente eliminar el acido pcrico mediante lavados en alcohol de 70

porque puede hacer que no se produzca una buena inclusion o que las
tinciones no sean adecuadas.
Karnoy: Es un buen jador para el glucogeno, para los hidratos de
carbono simples y para las protenas brosas. Es bueno para visualizar los
acidos nucleicos, aunque no la morfologa nuclear, y para los grumos de
Nissl del sistema nervioso. Puede producir retracciones tisulares.
Esta formado por etanol absoluto 60 %, cloroformo 30 % y acido acetico
glacial 10 %.
Mezclas con formaldehdo: El formaldehdo es quiza el jador mas
usado hoy en da, tanto para tecnicas histologicas rutinarias como para
otras como la inmunocitoqumica o la hibridacion de acidos nucleicos. Lo
mas frecuente es utilizarlo en solucion al 4 % junto con otros jadores. Por
ejemplo, el Bouin. Se suelen disolver en soluciones tamponadas que tienen
una osmolaridad similar a la del tejido que se pretende jar. Para jaciones
de tejidos destinados a microscopa electronica se suelen utilizar soluciones
jadoras que contienen formaldehdo y glutaraldehdo. La funcion del
formaldehdo es iniciar una jacion rapida, por su mayo capacidad de
penetracion, mientras que el glutaraldehdo realizara una jacion mas
poderosa, pero mas lenta que afectara a la estructura tisular puesto que el
formaldehdo ya ha realizado una jacion previa.
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Glutaraldehdo-tetroxido de osmio:Los jadores en combinacion no
tienen necesariamente que usarse al mismo tiempo. Es habitual que los
tejidos destinados a microscopa electronica sean inicialmente jados en
glutaraldehdo (1 al 3 %) y paraformaldehdo (2 al 4 %), para
posteriormente ser postjados en tetroxido de osmio al 1 % en solucion
tamponada. Este ultimo es un buen preservador de la ultraestructura
celular, sobre todo membranas, en cooperacion con los aldhedos. Esto es
importante porque el proceso para microscopa electronica supone incubar
el tejido en solventes organicos y polimerizacion de resinas a 60

C,
durante las cuales el tejido debe ser preservado.
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